As espécies reativas de oxigênio (EROs) são intermediários de vias de sinalização que regulam eventos celulares relevantes na função de células musculares lisas vasculares como migração, proliferação e contração. A NADPH oxidase é a principal fonte enzimática de EROs com finalidade sinalizadora no sistema cardiovascular. Estudos do nosso grupo demonstraram que a proteína dissulfeto isomerase (PDI), uma chaperona redox do retículo endoplasmåtico é capaz de modular a geração de EROs e a ativação de vias de sinalização redox dependentes pela Ang II. Apesar dos recentes avanços na compreensão dos mecanismos que regulam a interação entre a PDI e NADPH oxidase, o papel desta chaperona nos efeitos biológicos relacionados a EROs, como a contração vascular, não estão esclarecidos. A inibição da resposta contrátil pelo DTNB, um oxidante de tióis sugere o envolvimento de proteínas contendo tióis como a PDI e a NADPH oxidase na contração de aortas isoladas estimuladas com Ang II. Estes resultados foram confirmados por experimentos que demonstraram a expressão de PDI em todas as camadas vasculares da aorta de ratos Wistar e uma co-localização desta proteína com a isoforma NOX-1. A inibição da PDI diminuiu a geração de EROs e a reatividade vascular induzida por Ang II e NOR independente da presença do endotélio. A investigação dos mecanismos envolvidos sugere um papel da PDI na mobilização de cálcio dos estoques intracelulares via NADPH oxidase. A ativação de MAP quinases contribuiu para aumentar a mobilização de cálcio intracelular em aortas estimuladas com Ang II e NOR. No entanto, a inibição da PDI reduziu a fosforilação da ERK 1/2 em aortas estimuladas com Ang II, mas não com NOR. A análise conjunta dos nossos resultados sugere que mecanismos redox dependentes e independentes estariam envolvidos na regulação da resposta contrátil à Ang II e NOR pela PDI. / The reactive oxygen species (ROS) are intermediates of signaling pathways which regulates cellular events relevant for the vascular smooth cells function as migration, proliferation and contraction.The NADPH oxidase is the main enzimatic source of ROS with the signaling purpose on the cardiovascular system. We previously demonstrated that the protein disulfide isomerase (PDI), a redox chaperone of endoplasmic reticulum, is able to modulate the ROS generation and the activation of signaling redox ways dependent of Ang II. Although the recent advances in the understanding of mechanisms that regulate the interaction of PDI and NADPH oxidase, the role of this chaperone in the biological effects related to ROS, as vascular contraction, are not well clarified. The inhibition of the contractile response by DTNB, an oxidant thiol, suggest the involvement of proteins containing thiols as the PDI and NADPH oxidase in the contraction of isolated aortas stimulated with Ang II. These results were confirmed by experiments that demonstrated the PDI expression in Wistar rats vascular layers and a co-localization of this protein with the NOX-1 isoform. The PDI inhibition decreased ROS generation and the Ang II and NOR induced vascular reactivity endothelium independent. The investigation of involved mechanisms suggest that one PDI role is the calcium mobilization from the intracellular storage by NADPH oxidase way. The MAPkinases activation contributed to increase de intracellualar calcium in stimulated aortas with AngII and NOR. However, the PDI inhibition reduced the ERK ½ fosforilation in AngII- stimulated aorta, but not with NOR. The analyses of all of our results suggests that dependent and independent redox mechanims were involved in the regulation of contractile response to Ang II and NOR by PDI.

Existe uma associação entre hipertensão arterial e prejuízo da função reprodutiva. No modelo experimental dois-rins, um-clipe (2R1C), a hipertensão de origem renovascular é estabelecida pelo aumento na produção de angiotensina II (Ang II). O presente estudo analisou a evolução temporal dos efeitos da hipertensão promovida pelo modelo 2R1C sobre a função reprodutiva de ratos, bem como a participação dos receptores de Ang II do tipo 1 (AT1) nesse processo. Para tanto, avaliamos as manifestações do comportamento sexual, da gametogênese e das concentrações plasmáticas de Ang ll, hormônio luteinizante (LH), testosterona, prolactina e corticosterona de ratos submetidos ao modelo 2R1C (clipados) ou à cirurgia fictícia (controle) pertencentes aos grupos 7, 14, 21 e 28 dias de procedimento cirúrgico. Essas mesmas análises dos parâmetros endócrinos e do comportamento sexual foram realizadas em outros dois grupos, após 28 dias de clipamento ou cirurgia fictícia, que receberam o tratamento com losartan, um antagonista dos receptores AT1. Os ratos dos quatro grupos analisados, aos 7, 14, 21 e 28 dias de clipamento, sem o tratamento com losartan, apresentaram um aumento nas concentrações plasmáticas de Ang ll e uma resposta hipertensora, quando comparados aos seus respectivos controles. As demais análises das dosagens hormonais mostram que o emprego do modelo 2R1C promoveu redução nas concentrações plasmáticas de LH somente no grupo 7 dias de clipamento e elevação do LH circulante nos grupos 21 e 28 dias de clipamento. As concentrações plasmáticas de prolactina aumentaram nos grupos 14, 21 e 28 dias de clipamento. Além disso, ocorreu diminuição nas concentrações plasmáticas de testosterona no grupo 28 dias de clipamento. Por outro lado, não houve alterações nas concentrações plasmáticas de corticosterona em nenhum grupo. Todos os animais clipados manifestaram inibição de um ou mais parâmetros do comportamento sexual, ocorrendo maior comprometimento desta função com o avanço temporal da hipertensão. Os grupos 21 e 28 dias de clipamento também apresentaram um dano da espermatogênese. O tratamento com losartan normalizou a pressão arterial e preveniu as alterações da prolactina, do LH, do comportamento sexual e da espermatogênese de ratos clipados por 28 dias. Somado a isso, o losartan ocasionou uma elevação nas concetrações plasmáticas de testosterona no grupo clipado e produziu um aumento na Ang ll circulante nos grupos controle e clipado por 28 dias. Os resultados deste estudo evidenciam que a Ang ll exerce influência modulatória sobre parâmetros endócrinos e comportamentais da função reprodutiva, representando um dos principais elementos determinantes do comprometimento do comportamento sexual e da espermatogênese de ratos com hipertensão renovascular. / There is an association between hypertension and reproductive function impairment. In the two-kidney, one-clip model (2K1C), the renovascular hypertension is established by plasma angiotensin II (Ang II) increases. The present study aimed to analyze the temporal evolution of hypertension effects on rat reproductive function submitted to a 2K1C model. It was also analyzed the AT1 receptors participation in this process. Sexual behavior manifestations, gametogenesis and plasmatic concentrations of Ang II, luteinizing hormone (LH), testosterone, prolactin and corticosterone in rats submited to 2K1C model (clipping) or to sham surgery (control) from groups at 7, 14 , 21 and 28 days after surgery were evaluated. These endocrine parameters and sexual behavior analysis were conducted in two other groups after 28 days of 2K1C or sham surgery, which received losartan treatment - an AT1 receptor antagonist. The rats from the four groups on days 7, 14, 21, and 28 after clipping procedure, without losartan treatment, showed an increase in plasma Ang ll levels and a hypertensive response, compared to their respective control groups. The other hormonal measurements showed that the 2K1C model caused a reduction in plasma LH only in the 7 days after clipping procedure group and a plasma LH elevation in the 21 and 28 days after clipping groups. Plasma prolactin increased in 14, 21, and 28 days after clipping procedure groups. Moreover, there was a decrease in plasma testosterone in the 28 days after clipping group. On the other hand, there were no changes in plasma corticosterone in any group. All clipping animals showed inhibition of one or more sexual behavior parameters and the temporal advancement of hypertension promoted a greater impairment in this function. The 21 and 28 days after clipping procedure groups presented spermatogenesis dysfunction. Losartan treatment normalized the blood pressure and prevented the changes on plasma prolactin and LH levels, sexual behavior and spermatogenesis after 28 days clipping procedure. In addition, losartan treatment caused a rise in plasma testosterone clipping group levels and an increase in circulating Ang ll control and clipping group levels after 28 days of surgery procedure. Together, these results suggest that Ang ll acts modulating behavioral and endocrine parameters of reproductive function in a 2K1C rat model. Therefore, Ang II seems to represent one of the major elements inducing sexual behavior and spermatogenesis impairment in rats with renovascular hypertension.

A estimulação neonatal tem sido utilizada há algumas décadas como modelo experimental para analisar os mecanismos pelos quais variações precoces do ambiente do animal afetam o desenvolvimento de sistemas neurais, dando origem a alterações comportamentais e neuroendócrinas estáveis. Uma das alterações mais características é a diminuição do medo a ambientes novos e uma resposta menos acentuada da secreção de glicocorticóides pela supra-renal a estímulos estressantes. O objetivo do presente estudo foi avaliar os efeitos da manipulação neonatal sobre o sistema angiotensinérgico, sobre a regulação hídrica e o desenvolvimento renal, visto que os ratos apresentam os rins e o trato urinário imaturos ao nascimento e seu desenvolvimento depende de angiotensina II. Investigamos aspectos do desenvolvimento e também da função renal em ratos machos de diferentes idades (11, 45 e 90 dias). Para isso, ratos Wistar foram divididos em dois grupos, dos quais um deles foi submetido a 1 minuto diário de manipulação durante os primeiros 10 dias de vida (grupo manipulado), enquanto o outro grupo não sofreu nenhum tipo de intervenção (grupo não manipulado). Aos 11 dias, os animais foram pesados e em seguida decapitados para coleta de sangue, seguido de extração e pesagem dos rins e das glândulas supra-renais. Os animais de 45 e de 90 dias permaneceram por um período de 24h em gaiolas metabólicas para análise da ingestão hídrica basal, do volume urinário e para posterior cálculo da taxa de filtração glomerular (TFG). Em seguida, estes mesmos animais foram pesados e logo decapitados para coleta de sangue e extração de rins e glândulas supra-renais para serem pesados. Nos animais de 11 dias, não observamos diferenças no peso corporal, peso renal, peso das supra-renais e na espessura de córtex renal entre os grupos manipulado e não manipulado. Os animais manipulados de 11 dias exibiram um aumento nas concentrações plasmáticas de angiotensina II, associada a uma redução de corticosterona plasmática, quando comparados aos animais não manipulados de mesma idade. Nos animais de 90 dias manipulados, quando comparados aos não manipulados, observamos uma redução de peso renal, embora não tenhamos observado redução da espessura do córtex renal. Esses animais apresentaram também uma redução de ingestão hídrica basal e de volume urinário, bem como redução de TFG. Ainda, apresentaram concentrações reduzidas de angiotensina II plasmática, acompanhadas de redução na concentração de corticosterona. Não foram encontradas diferenças significativas em nenhum dos parâmetros analisados nos animais de 45 dias de idade. Este conjunto de resultados sugere que a manipulação neonatal produz efeitos sobre osistema angiotensinérgico, manifestados através das diferentes concentrações plasmáticas de angiotensina II observadas entre os animais manipulados e não manipulados. Ainda, que estes efeitos podem estar envolvidos nas alterações dos mecanismos que permeiam a regulação do equilíbrio hidroeletrolítico, observadas na idade adulta desses animais.

Este trabalho testa a hipótese de que a inibição da enzima conversora da angiotensina (ECA), mesmo em doses baixas que não causam alteração de pressão, é capaz de influenciar nos processos de hipertrofia cardíaca, estresse oxidativo e controle autonômico em animais espontaneamente hipertensos (SHR). Os animais foram tratados com um inibidor da enzima conversora da angiotensina (iECA) e foram quantificados a hipertrofia e o estresse oxidativo cardíacos. Também foi avaliado o controle autonômico através da análise espectral de séries temporais de pressão arterial sistólica e freqüência cardíaca. Além disso, foram investigadas as características não-lineares das series de freqüência cardíaca envolvidas na hipertensão arterial sistemica e o efeito do tratamento sobre estes parâmetros através de um teste de irreversibilidade desenvolvido para detectar dinâmicas não-lineares independentemente da escala temporal de ação. Neste contexto, o primeiro estudo (artigo 1) objetivou o desenvolvimento do novo método para análise de irreversibilidade estatística (IE) capaz de detectar inclusive a presença de dinâmicas não-lineares mais lentas das observadas pelos métodos tradicionais. A nova técnica, denominada irreversibilidade bidimensional múltipla (IBM), foi validada e mostrouse útil quando aplicada a séries fisiológicas exibindo um padrão de não-linearidade aumentado em situações de predominância simpática. No segundo momento (artigo 2) o novo método foi aplicado a séries temporais de freqüência cardíaca em situações em que a ativação simpática foi provocada. Após demonstrar a associação entre a irreversibilidade e a modulação simpática em situação fisiológica, usando um protocolo de estimulação simpática gradual, o método também foi aplicado a uma situação patológica, caracterizada pela hipertensão espontânea em ratos. Nesta situação, houve um aumento da IE e o mecanismo não-linear envolvido na referida patologia possui ação mais lenta, sendo possível de ser detectado apenas com o uso de técnicas de alta dimensionalidade, como a irreversibilidade bidimensional múltipla. Além disso, foi verificado o efeito do tratamento com iECA, que reduziu a modulação simpática e restaurou o padrão de irreversibilidade a percentuais semelhantes aos do grupo controle. O terceiro estudo (artigo 3) teve como objetivo avaliar o efeito da inibição da ECA sobre a hipertrofia cardíaca, estresse oxidativo e controle autonômico em doses não anti-hipertensivas. Os resultados demonstraram uma redução da hipertrofia cardíaca, do estresse oxidativo cardíaco, mesmo sem alterar a pressão arterial. Apesar de não alterar a modulação simpática vascular ou atuar na sensibilidade baroreflexa, o tratamento em baixa dose melhorou o balanço autonômico, em favor da modulação vagal. Tais resultados podem indicar uma ação central que busca restabelecer o equilíbrio cardiovascular, precedente à alteração de pressão. Assim sendo, o presente estudo poderá contribuir no desenvolvimento de novas estratégias que, num futuro próximo, permitirão não só avaliar os efeitos do tratamento, mas principalmente, prevenir o estabelecimento de novos quadros hipertensivos e de insuficiência cardíaca. / This work presents the hypothesis that inhibition of the angiotensin converting enzyme (ACE), even in low doses that do not cause decrease of pressure, is able to alter the cardiac hypertrophy, the oxidative stress and the autonomic control in spontaneously hypertensive rats (SHR). To evaluate cardiac oxidative stress and its hypertrophy, animals were treated with an angiotensin converting enzyme inhibitor (ACEi). Also the autonomic control was analyzed by the spectral analysis of systolic arterial pressure and heart rate series. Besides, non-linear characteristics present in hypertension and the ACEi treatment effect were also evaluated by an irreversibility test developed to detect non-linear dynamics independently of their temporal scale. The first study (article 1) aimed at developing a new method for analysis of statistical irreversibility (SI) which was able to detect the presence of non linear dynamic including those that were slower than the ones observed by traditional methods. The new technique, called multiple bi-dimensional irreversibility (MBI), was validated and showed to be useful when applied to physiological series, presenting an increased non linear pattern increased in situations with sympathetic predominance. This new method was also applied to time series of heart rate in situations of sympathetic activation (article 2). After the demonstration of an association between irreversibility and sympathetic modulation in a physiological condition, the method was applied to a pathological situation, in SHR. SHR data showed that there was an increase of SI. Furthermore, the non-linear mechanism wrapped in this pathology has slower action, which can be detected only with the use of multidimensional techniques, as MBI. Besides, the ACEi treatment resulted in a reduction of the sympathetic modulation and restored the irreversibility pattern to those similar to control. Finally, the third study (article 3) evaluates the effect of ACEi on the cardiac hypertrophy, oxidative stress and autonomic control in no anti-hypertensive doses. The results demonstrated a cardiac hypertrophy and cardiac oxidative stress reduction, with no alteration of blood pressure. In spite of producing no alteration in the sympathetic vascular modulation or no action in the baroreflex sensibility, the low dose of ACEi treatment improved the autonomic balance, in favour of vagal modulation. Such results can indicate a central action to re-establishing the cardiovascular balance, preceding to the pressure alterations. Thus, the present study may help to the new strategies development to treat and, mainly, to prevent the establishment of hypertension and of heart failure.

A prolactina (PRL) é um hormônio polipeptídico com múltiplas ações. Estudos têm revelado que além das funções mais conhecidas relacionadas ao desenvolvimento da glândula mamária e à síntese e manutenção da liberação de leite, esse hormônio parece ser decisivo no comportamento maternal. Nesse caso a PRL poderia atuar em sinergismo com outros hormônios, como a ocitocina (OCT) e a angiotensina II (ANG II), promovendo um ajuste fino da circuitaria neural do encéfalo que leva a rata de um estado de aversão e negligência à receptividade e cuidado maternal de filhotes. Junto da corticosterona (CORT), a ANG II é um hormônio marcador do estresse em ratos. Considerando a hiporresponsividade ao estresse e uma maior liberação de PRL basal, que se correlacionam na rata em fase de lactação, esta dissertação teve o objetivo de verificar a possível participação da ANG II na resposta da PRL e no comportamento maternal de ratas lactantes submetidas ao estresse crônico e agudo. O papel do sistema angiotensinérgico foi investigado por meio da administração crônica do antagonista losartan na água de beber. A aplicação de estresse crônico e agudo foi realizada segundo o modelo da contenção nos sete primeiros dias, e numa aplicação única no sétimo dia, respectivamente. O comportamento maternal nos diferentes grupos de ratas foi analisado mediante um protocolo padrão de registro comportamental. Esses estudos demonstraram que a ANG II basal possivelmente participa do comportamento maternal pró-ativo, como a presença da mãe no ninho e a construção do ninho, além da lactação, que é um comportamento parcialmente reflexo e pró-ativo. Por outro lado, a sobreposição entre a administração de losartan e estresse agudo ou crônico parece levar as ratas a um comportamento maternal similar ao grupo controle. O comportamento das lactantes junto aos filhotes não é influenciado pelo estresse crônico, ao contrário do estresse agudo, que estimula a mãe a permanecer mais tempo fora do ninho em relação ao controle, sem qualquer envolvimento com o cuidado maternal. A administração individual de losartan e de estresse crônico não interfere nos níveis de CORT; no entanto, quando esses fatores são somados há uma marcante elevação dos níveis plasmáticos do corticosteróide. Houve apenas uma tendência de redução da PRL nas ratas submetidas ao estresse crônico; porém, quando o estresse crônico é aplicado em ratas previamente tratadas com losartan, há uma significativa elevação da PRL em relação ao grupo que recebeu apenas o estresse. Isoladamente, o fármaco leva a uma tendência de redução dos altos níveis basais de PRL, típicos de lactantes. Assim, podemos concluir que a ANG II possivelmente modula, mediante os receptores AT1, o comportamento maternal de forma direta e indireta, interferindo nas concentrações basais de PRL e de outros hormônios, como provavelmente a OCT. Esses hormônios podem configurar as ligações sinápticas entre os neurônios hipotalâmicos responsáveis pela transdução de estímulos endógenos na mãe e nociceptivos externos dos filhotes em sinais que levam à responsividade motora e cognitiva do cuidado maternal.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / A Angiotensina II (Ang II) exerce suas aÃÃes via receptores AT1 e AT2. Estudos recentes demonstraram que o sistema-renina-angiotensina (SRA) participa da inflamaÃÃo. O objetivo desse estudo foi avaliar o efeito da Ang II em modelos de inflamaÃÃo aguda. Ratos Wistar foram separados nos grupos: salina (Sal), Ang II (1 Âg), losartan (LOS, antagonista de AT1, 62,5 Âg) e CGP42112A (agonista de AT2, 142,5 Âg). O edema de pata foi induzido pela injeÃÃo subplantar (sp) de carragenina (Cg, 100 Âg) ou dextran (DXT, 100 Âg) e foi medido com pletismÃmetro em 0, 1, 2, 3 e 4h. Nos grupos Sal e Ang II, foi colhido tecido da pata para se determinar os nÃveis de mieloperoxidase (MPO), IL-1e TNF-α . Tecidos subcutÃneo e mesentÃrico foram removidos para avaliaÃÃo da degranulaÃÃo de mastÃcitos atravÃs da coloraÃÃo com azul de toluidina. Os grupos Sal e Ang II do edema de pata induzido por DXT foram tratados com mepiramina (MEP, anti-histamÃnico, 10mg/kg) ou metisergida (MET, anti-serotonÃnico, 1,5mg/kg) 1h antes da injeÃÃo de DXT. Ang II (0,5Âg/cavidade, ip) foi injetada 1h antes da injeÃÃo ip de Cg para analisar a migraÃÃo de neutrÃfilos para a cavidade peritoneal. Ang II, LOS e CGP amplificaram o edema de pata induzido por Cg e DXT e essa amplificaÃÃo foi significativa jà na primeira hora. A administraÃÃo de Ang II nÃo alterou a dosagem tecidual de MPO, TNF-α e IL-1 e nÃo induziu ou preveniu a migraÃÃo de neutrÃfilos para a cavidade peritoneal, mas induziu amplificaÃÃo significativa da degranulaÃÃo de mastÃcitos. MEP e MET reduziram a potenciaÃÃo do edema do DXT pela Ang II. Nossos resultados sugerem que a Ang II potenciou a resposta inflamatÃria provavelmente atravÃs de receptores AT2, jà que o antagonista de AT1, o agonista de AT2 e a Ang II amplificaram o edema de pata. Os dados apresentados aqui sugerem que Ang II aumentou a permeabilidade vascular atravÃs da induÃÃo da degranulaÃÃo de mastÃcitos, uma vez que houve amplificaÃÃo precoce do edema de pata da Cg e do edema vascular do DXT, e os antagonistas de serotonina e de histamina inibiram significativamente o aumento do edema de pata. / Angiotensin II (Ang II) exerts its actions via AT1 and AT2 receptors. Recent studies have demonstrated that the renin-angiotensin system (RAS) participates in inflammation. The aim of this study was to evaluate the effect of Ang II on models of acute inflammation. Wistar rats were separated in the groups: saline (Sal), Ang II (1Âg), losartan (LOS, AT1 antagonist, 62.5Âg) and CGP42112A (AT2 agonist, 142.5Âg). Paw edema was induced by subplantar injection of carrageenan (Cg, 100Âg) or dextran (DXT, 100Âg) and was measured with a plethysmometer at 0, 1, 2, 3 and 4h. In the Sal and Ang II groups, paw tissue was taken to determine myeloperoxidase (MPO), IL-1 and TNF-α levels. Subcutaneus and mesenterium tissue were taken to evaluate mast cell degranulation through the toluidine blue staining. Sal and Ang II groups of DXT-induced paw edema were treated i.p. with mepyramine (MEP, anti-histamine, 10mg/kg) or metisergyde (MET, anti-serotonin, 1.5mg/kg) 1h prior to the injection of DXT. Ang II (0.5Âg/cavity, ip) was injected i.p. 1h before the i.p. injection of Cg to analyse the leukocytes migration to the peritoneal cavity. Ang II, LOS and CGP enhanced the Cg and DXT-induced paw edema and this enhancement was already significant at 1h. The administration of Ang II did not change the tissue content of MPO, TNF-α and IL-1 and did not induced or prevented neutrophil migration to peritoneal cavity, but induced significant enhancement of mast cell degranulation. MEP and MET reduced the Ang II-facilitated DXT-induced edema. Our results suggest that Ang II enhances the inflammatory response probably through the AT2 receptors since the AT1 antagonist, AT2 agonist and Ang II potentiated the paw edema. The data presented here also suggest that Ang II increases the vascular permeability through induction of mast cells degranulation, since there was early amplification of Cg paw edema and DXT vascular edema, and antagonists of serotonin and histamine significantly inhibited the increase in paw edema.

Em roedores, a administração de Losartan (LO) durante a nefrogênese (primeiras duas semanas de vida) leva à insuficiência renal progressiva e, mais tardiamente, à hipertensão, indicando que a Angiotensina II (AII) é indispensável a uma nefrogênese adequada. Os mediadores intracelulares desse efeito são desconhecidos. Nós investigamos se o sistema NF-kB, que tem influência na embriogênese de outros tecidos, poderia ser um desses mediadores. Trinta e duas ratas Munich Wistar, cada uma amamentando 6 filhotes, foram divididas em dois grupos: C, sem tratamento, e PDTC, que receberam o inibidor do NF-kB Pirrolidina Ditiocarbamato (PDTC), 280 mg/kg/dia na água de beber durante 21 dias. A prole (C e PDTC), constituída de ratos machos, foi acompanhada até 10 meses de vida sem qualquer tratamento. Diferentemente do observado anteriormente com o LO, o PDTC não promoveu redução do número de néfrons nem albuminúria, indicando que o sistema NF-kB não participa crucialmente da nefrogênese. No entanto, os ratos que receberam o PDTC durante a lactação apresentaram hipertensão persistente, associada a hipertrofia de miócitos e a fibrose miocárdica. Para investigar a patogênese da hipertensão (que não se pode explicar por uma redução no número de néfrons), as expressões renais dos componentes do sistema renina-angiotensina (SRA) e dos transportadores tubulares foram determinadas por PCR em tempo real (qRT-PCR) aos 3 e 10 meses de vida. Aos 3 meses, a expressão de angiotensinogênio (AGT) e renina foram significativamente aumentadas no grupo PDTC vs C, indicando que uma ativação local do SRA pode explicar o desenvolvimento da hipertensão no grupo PDTC. No entanto, a expressão de todos os componentes do SRA examinados nos animais que receberam o PDTC durante a nefrogênese estava diminuída aos 10 meses, possivelmente devido a um mecanismo compensatório, sugerindo que a hipertensão foi mantida por outros mecanismos. No túbulo proximal, observou-se um aumento da expressão do transportador sódio/glicose isoforma 1 (SGLT1) (luminal) e sódio/bicarbonato (NBC) (basolateral), bem como um aumento numérico na expressão do trocador luminal sódio/hidrogênio isoforma 3 (NHE3), sugerindo que essas anormalidades podem estar envolvidas na patogênese da hipertensão nesses animais. Aos 10 meses, a expressão de todas as moléculas estava diminuída, sugerindo a participação de outros mecanismos na manutenção da hipertensão em longo prazo. A administração de PDTC pode representar um novo modelo de hipertensão essencial, possivelmente iniciada pela ativação local do SRA e por anormalidades no transporte de sódio no túbulo proximal e mantida em longo prazo por outros mecanismos. / Losartan treatment during late murine nephrogenesis (first 2 weeks of extrauterine life) causes progressive renal injury in adult life and, at more advanced stages, hypertension, indicating a physiologic action of angiotensin II on nephrogenesis. The possible intracellular pathways that might mediate this effect are unknown. We investigated the possibility that the NF-kB system, known to participate in the embryogenesis of other tissues, could be one of these mediators. Soon after delivery, thirty-two Munich-Wistar dams, each nursing 6 male pups, were divided in 2 groups: C, untreated, and PDTC, receiving the NF-kB inhibitor pyrrolidine dithiocarbamate (PDTC), 280 mg/kg/day in drinking water during 21 days. After weaning (at 25 days), the offspring (C and PDTC) were followed until 10 months of age with no further treatment. Unlike Losartan, neonatal PDTC treatment promoted no reduction in the number of nephrons and no abnormal albuminuria, indicating that the NF-kB system does not participate decisively in nephrogenesis. Nevertheless, rats that received PDTC during lactation exhibited stable hypertension associated with myocardial hypertrophy and fibrosis. To investigate the pathogenesis of hypertension, which cannot be ascribed to number of nephrons reduction, the renal expressions of the renin-angiotensin system (RAS) components and of several molecules involved in sodium transport were determined by qRT-PCR at 3 and 10 months of life. The renal expression of renin and angiotensinogen in PDTC-treated rats at 3 months of age was significantly higher in comparison with control, but lower than age-matched controls at 10 months of age, suggesting that, although hypertension may be initiated by a derangement in the RAS, it was maintained by other mechanisms in the long run. At 3 months of age, there was upregulation of the luminal sodium/glucose transporter and the basolateral sodium/bicarbonate transporter at the proximal tubule, as well as a numerically higher expression of the luminal sodium/hydrogen exchanger, suggesting that these abnormalities might also be related to the pathogenesis of hypertension in these rats. At 10 months of age, however, the expression of all these transporters was reduced, suggesting that none of them was responsible for the long-term maintenance of high blood pressure. Neonatal PDTC administration represents a new model of essential hypertension, possibly related to local renal activation of the RAS and to deranged sodium transport at the proximal tubule. In the long run, hypertension must be maintained by other mechanisms.

Orientadores: Marilda Mazzali, José Butori Lopes de Faria / Tese ( doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-20T18:16:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Mazali_FernandaCristina_D.pdf: 2274720 bytes, checksum: ce2fe44ee92ab230ab3a6648462a850b (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: A nefrotoxicidade por ciclosporina caracteriza-se, do ponto de vista histológico, por fibrose intersticial em faixa, atrofia tubular e hialinose de arteríolas aferentes glomerulares, ou seja, um quadro compatível com doença renal isquêmica. Esta isquemia provocada pela ciclosporina leva a redução da taxa de filtração glomerular, com consequente elevação dos níveis séricos de ácido úrico. Além disto, a ciclosporina altera o transporte tubular de urato, favorecendo o desenvolvimento de hiperuricemia. No modelo experimental de nefropatia pela ciclosporina, a elevação dos níveis de ácido úrico apresenta associação com lesão túbulo intersticial mais severa, além de maior frequência de hialinose de arteríola aferente. Em estudos anteriores demonstramos que a hiperuricemia agrava a nefrotoxicidade pela ciclosporina e também que, a administração concomitante de agentes hipouricemiantes previne a lesão renal pela CsA. Assim, consideramos a hipótese de que, em um modelo experimental de nefropatia crônica pela ciclosporina, instalada, a normalização dos níveis de ácido úrico com alopurinol ou benzbromarona poderia reverter a lesão renal estabelecida. Nefropatia pela ciclosporina foi induzida em ratos Sprague Dawley com injeções subcutâneas diárias de ciclosporina, em associação com dieta hipossódica, por 5 semanas. Ao final deste período, grupos experimentais foram divididos com interrupção da ciclosporina, tratamento com CsA isolada ou em associação com alopurinol ou benzbromarona por um período adicional de 4 semanas. Ao final de 9 semanas de estudo, foram realizadas avaliações funcionais e histológicas. Neste modelo, a co-administração de alopurinol ou benzbromarona cursou com redução dos níveis de ácido úrico e minimizou o quadro de nefrotoxicidade estabelecida por ciclosporina, através da redução de hialinose arteriolar, glomeruloesclerose e fibrose intersticial, além da melhora da função renal, do estresse oxidativo e da apoptose, porém sem efeito anti inflamatório, avaliado pelo infiltrado de macrófagos e pela expressão de osteopontina. Os resultados mais significativos no grupo tratado com alopurinol sugerem que, além do efeito hipouricemiante, o alopurinol pode também apresentar um mecanismo antioxidante, conforme demonstrado pela redução da peroxidação lipídica e da geração de radicais livres, resultando em menor intensidade de apoptose de células tubulares renais. Assim, a redução dos níveis de ácido úrico neste modelo atuou como protetor na progressão da lesão de microvasculatura e na redução da área de fibrose intersticial, mas não da lesão inflamatória. No modelo de nefropatia pela ciclosporina, assim como no de hiperuricemia, ocorre elevação da atividade de renina, sugerindo a participação do sistema renina angiotensina aldosterona na fibrose renal. Para determinar este efeito, um segundo estudo utilizou a associação de um inibidor de enzima conversora da angiotensina (enalapril), um bloqueador de receptor AT1 de angiotensina (losartan) ou um inibidor competitivo da aldosterona (espironolactona) ao tratamento com ciclosporina, após a instalação da lesão. Os animais experimentais receberam ciclosporina por 5 semanas, e após a instalação da nefropatia, foram divididos em um dos grupos experimentais e acompanhados por um período adicional de 4 semanas. A utilização de moduladores do SRAA também cursou com melhora funcional e histológica da nefropatia pela ciclosporina, sem alteração dos marcadores de inflamação intersticial. A melhora da vasculopatia pode ser atribuída à redução do remodelamento vascular com estas drogas, porém com efeito limitado sobre a geração de radicais livres de oxigênio e apoptose de células tubulares. Em resumo, os resultados do presente estudo indicam que em modelo experimental de nefrotoxicidade por CsA, o uso de hipouricemiantes ou de modeladores do sistema-renina-angiotensina-aldosterona apresentaram um importante efeito renoprotetor, comparável, do ponto de vista funcional, à interrupção do tratamento com ciclosporina. As duas abordagens terapêuticas foram eficientes na limitação da progressão da nefropatia, com reversão parcial da fibrose intersticial, provavelmente mediada por melhora de oxigenação tecidual secundária à redução da vasculopatia e do remodelamento vascular. A manutenção do estímulo tóxico da ciclosporina, com manutenção da inflamação, da geração de radicais livres de O2 e da apoptose de células tubulares, entretanto, não foi completamente neutralizado pela intervenção farmacológica / Abstract: Chronic allograft nephropathy is characterized by stripped tubular atrophy and interstitial fibrosis, in presence of arteriolar hyalinosis, resembling an ischemic pattern of chronic kidney disease. Chronic ischemia is associated with reduced glomerular filtration rate, and increase in serum uric acid levels. Cyclosporine per se also has a direct effect on tubular urate handling that facilitates the development of hyperuricemia. Hyperuricemia exacerbates chronic cyclosporine nephropathy, with a more severe tubulointerstitial fibrosis and atrophy, as well as worsening of arteriolar hyalinosis. In a previous study we have shown that concomitant treatment with uric acid lowering agents limits the development of experimental CsA nephropathy. The hypothesis of the present study was that treatment with uric acid lowering agents, after the development of CsA nephropathy could reverse or reduce the severity of tubulointerstitial disease. Male Sprague Dawley rats received daily SC injections of cyclosporine in presence of low salt diet, during 5 weeks. At the end of this period, experimental groups were assigned for CsA withdrawal, maintenance of daily CsA alone or associated with allopurinol or benzbromarone in drinking water for an additional period of 4 weeks. At the end of 9 weeks of study, rats were sacrificed for functional and morphological analysis of kidneys. In this model, concomitant treatment with allopurinol or benzbromaroes was associated with reduction of serum uric acid levels, improvement in renal function and renal disease, characterized by lower arteriolar hyalinosis index, less glomerulosclerosis and significant reduction in interstitial fibrosis area. Other findings included reduction in oxidative stress markers and apoptotic cells, despite of maintenance of inflammatory status, quantified by macrophage infiltration and osteopontin expression. Allopurinol treatment was associated with more significant changes, with reduction of free radical generation, and lower grade of apoptotic cells in renal cortex, suggesting a participation of antioxidant effects in association with uric acid reduction. Taken together, these datsa suggests that reduction of serum uric acid in the stablished model of CsA nephropathy has a protective effect in microvascular lesions and progression of interstitial disease, despite the maintenance of interstitial inflammation. In cyclosporine nephropathy, as well as in the experimental hyperuricemia model, renal disease is associated with increased renin activity, suggesting the participation of renin angiotensin aldosterone system (RAS) in the mechanism of disease. In order to analyze the effect of RAS in CsA nephropathy model, a second study tested the treatment with angiotensin converting enzyme inhibitor (enalapril), a angiotensin II AT1 receptor blocker (losartan) or an aldosterone inhibitor (espironolactone) in association with cyclosporine after the development of chronic nephropathy. Experimental animals were treated with cyclosporine and low salt diet for 5 weeks, and then assigned for one treatment group, including cyclosporine withdrawal, cyclosporine alone, CsA and enalapril, CsA and losartan or CsA and espironolactone for an additional period of 4 weeks. RAS blockade in the established model of CsA nephropathy was associated with improvement in renal function and interstitial fibrosis, despite the maintenance of interstitial inflammation. The most striking finding was the improvement of arteriolar hyalinosis and glomerulosclerosis, suggesting that the most important effect was protecting against vascular remodeling. The improvement in vasculopathy was associated with reduction in tissue hypoxia, with a partial reduction in oxidative stress and tubular cell apoptosis. Both therapeutic interventions proved to be efficient in limiting progression of renal disease, with a partial reversion of interstitial fibrosis. The main mechanism is associated with improvement in renal tissue O2 delivery, as a consequence of recovery of arteriolar hyalinosis and control of vascular remodeling. However, maintenance of CsA therapy was associated with a persistent toxic effect, with maintained interstitial inflammation, free radical generation and tubular cell apoptosis that was not neutralized by intervention / Doutorado / Ciencias Basicas / Doutor em Clínica Médica

Orientador: Flavia Maria Netto / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-03T20:01:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Costa_ElizabeteLourencoda_D.pdf: 740617 bytes, checksum: 84bbcfb2ba85928bc94243a22ff7014a (MD5) Previous issue date: 2004 / Resumo: Além das propriedades funcionais tecnológicas e nutricionais, algumas proteínas apresentam atividade biológica, como por exemplo: a influência no metabolismo ósseo apresentada pelas proteínas do soro do leite; atividade antimicrobiana, apresentada pela lactoferrina e a lisozima; atividade imunoestimulante desempenhada pelas imunoglobulinas, entre outras. Essas funções também podem estar associadas aos chamados peptídeos bioativos, presentes em determinadas seqüências da proteína, liberados após a hidrólise enzimática. A industrialização deste tipo de produto está dando seus primeiros passos no sentido do desenvolvimento da produção econômica e de técnicas adequadas que preservem ou concentrem a atividade. O impacto do tratamento térmico para a produção de peptídeos imunomoduladores e caseinofosfopeptídeos tem sido bem estabelecido. No caso dos peptídeos com atividade anti-hipertensiva, ainda há controvérsias sobre a necessidade da manutenção da estrutura nativa antes do tratamento enzimático. O presente trabalho teve como objetivo avaliar a influência do tratamento térmico e enzimático na obtenção de hidrolisados derivados do isolado protéico de soro de leite com atividade anti-hipertensiva. Como matéria-prima, utilizou-se o isolado protéico de soro de leite (IPSL) Davisco¿, que foi submetido ao tratamento térmico a 65°C e 95°C, de modo a obter proteínas com dois diferentes graus de desnaturação. Os isolados protéicos nativo e desnaturados foram hidrolisados até 10% de grau de hidrólise (GH), com as enzimas Alcalase, a-quimotripsina e Proteomix. Os hidrolisados obtidos foram caracterizados e analisados quanto à capacidade de inibir a enzima conversora da angiotensina II. Estes hidrolisados foram posteriormente administrados a ratos espontaneamente hipertensos (SHR) para pesquisar a atividade anti-hipertensiva in vivo. A desnaturação parcial das proteínas do soro prévia à hidrólise enzimática, provocada pelo tratamento a 65°C, resultou em hidrolisados com melhor atividade inibitória da ACE, em comparação aos hidrolisados obtidos com a mesma enzima a partir do isolado nativo ou desnaturado a 95°C. Dentre as enzimas empregadas, a que produziu hidrolisados com melhor atividade inibitória da ACE foi a a-quimotripsina, com valores IC50 de 0,40mg/mL para os hidrolisados derivados do IPSL nativo e desnaturado a 95°C e 0,05mg/mL para o hidrolisado desnaturado a 65°C. Por outro lado, o hidrolisado obtido com Alcalase a partir do IPSL desnaturado a 65°C (65A) foi o único a induzir redução significativa da pressão arterial nos ratos SHR até 4hs após a administração por via oral, onde a diferença em relação à pressão arterial basal do grupo foi de -14,94mmHg. Os hidrolisados com melhor atividade inibitória da ACE foram administrados aos ratos SHR por via intraperitoneal. O hidrolisado 65A mostrou efeito mais intenso, observado até 6hs após a administração, onde a diferença com a pressão basal foi de -28,1mmHg. O hidrolisado de melhor atividade inibitória da ACE, 65Q, também foi eficiente na redução da pressão arterial dos ratos SHR após administração por via intraperitoneal. A redução da pressão arterial foi significativa até 4hs depois da administração, sendo a diferença de -22,9mmHg em relação à pressão basal. O hidrolisado 65A, que apresentou ação antihipertensiva mais potentes que os demais, reduziu a taxa de filtração glomerular nos ratos SHR de modo dose-dependente e provocou um aumento na reabsorção de sódio, interpretado como um mecanismo auto-regulador para conservação de fluidos e sais. Para verificar a faixa de peso molecular de maior atividade biológica do hidrolisado 65A, este hidrolisado foi ultrafiltrado em membranas de 30kDa e 3kDa, os permeatos foram analisados quanto à capacidade em inibir a ACE, observando-se que a fração de baixo peso molecular (3kDa) apresentou atividade inibitória a ACE menor do que o hidrolisado integral e do que o permeato obtido a partir da membrana de 30kDa (2,37mg/mL, 0,68mg/mL e 0,75mg/mL, respectivamente). Em conclusão, a desnaturação a 65°C do isolado protéico de soro de leite, prévia à hidrólise, promoveu o aumento da atividade inibitória da ACE. Entretanto, a maior parte destes hidrolisados, apesar de manifestar inibição satisfatória sobre a ACE, não foi eficiente em reduzir a pressão arterial dos animais, pois apenas o produto desnaturado a 65°C e hidrolisado pela Alcalase apresentou ação anti-hipertensiva significativa após a administração por via oral, sugerindo que os demais não foram resistentes / Abstract: In addition to the functional and nutritional properties, some proteins present biological activity. For instance, whey proteins influence bone metabolism, lactoferrin and lysozyme present antimicrobial activity, and immunoglobulins have immunomodulating activity. these biological functions may be associated with bioactive peptides released by enzymatic hydrolysis. the industrial manufacture of these products is beginning to develop adequate technologies to preserve or improve the biological activity in an economic manner. the impact of heat treatment on the production of immunomodulators and caseinophosphopeptides has been well established. however, for antihypertensive peptides, little knowledge is available about the necessity of using proteins in their native form before the enzymatic treatment. this thesis was aimed at studying the heat and enzymatic treatments in the production of antihypertensive hydrolysates derived from milk whey protein isolate. the raw material used was the whey protein isolate (wpi) supplied by davisco¿. the wpi was heated at 65°c and 95°c to give two different denaturation degrees. the native and denatured wpi were hydrolysed by alcalase, chymotrypsin and proteomix, up to a hydrolysis degree of 10%. the hydrolysates obtained were characterized and analyzed regarding their capacity to inhibit the angiotensin-ii converting enzyme (ace). these hydrolysates were administered to spontaneously hypertensive rats (shr) to study the in vivo antihypertensive activity. The heat treatment at 65°c, before hydrolysis, improved the ace-inhibitory activity of the hydrolysates when compared to the ones obtained by the native isolate or denatured at 95°c wpi. among the enzymes tested, chymotrypsin was the most efficient in the release of ace-inhibitory hydrolysates, with ic50 of 0.40mg/ml to products derived from native and denatured wpi at 95°c, and 0.05mg/ml to the hydrolysate derived from denatured wpi at 65°c. on the other hand, the hydrolysate by alcalase derived from denatured wpi at 65°c (65a) was the only one efficient in decreasing the arterial blood pressure on shr rats up to 4 hours after oral administration; the difference to the basal blood pressure was ¿14.94mmhg. the best hydrolysate obtained by each enzyme was administrated to the rats by intraperitoneal injection. the activity of the hydrolysate 65a was confirmed by an effective decrease in the animals¿ arterial blood pressure, observed up to 6 hours after the intraperitoneal administration; the difference to the basal blood pressure was -28.1mmhg. the hydrolysate that presented the best ace-inhibitory activity also decreased significantly the animals¿ arterial blood pressure via intraperitoneal administration up to 4 hours after the administration. the difference to the basal blood pressure was -22.9mmhg. the hydrolysate 65a with higher antihypertensive activity also induced a decrease in the glomerular filtration in a dose-dependent manner. in addition, it promoted an increase in the sodium reabsorption that can be interpreted as a mechanism for the conservation of sodium and water in response to the decrease in the blood pressure. to evaluate the molecular weight zone of the hydrolysate 65a, it was ultrafiltrated through membranes having cut-off values of 30kda and 3kda. the permeates were analyzed regarding their ace-inhibitory activity. the 3kda permeate contained the lowest percentage of ace-inhibitory activity, when compared to the activity in the unfractionated hydrolysate and the 30kda permeate (2.37mg/ml, 0.68mg/ml and 0.75mg/ml, respectively). in conclusion, the heat denaturation at 65°c in wpi, before enzymatic hydrolysis by alcalase, chymotrypsin and proteomix, improved the ace-inhibitory activity. although most of these hydrolysates present satisfactory ace-inhibitory activity, these were not efficient in reducing the arterial blood pressure of the rats, because only the 65a hydrolysate was efficient when administered orally, suggesting that the others hydrolysates didn¿t resist at gastric and pancreatic attack / Doutorado / Nutrição Aplicada a Tecnologia de Alimentos / Doutor em Alimentos e Nutrição

Memoria para optar al título de Químico Farmacéutico / Fibroblastos y miofibroblastos cardiacos son elementos claves en el desarrollo del remodelamiento cardiaco después de un infarto agudo al miocardio. Una regulación controlada en el crecimiento de la población de fibroblastos y miofibroblastos es importante para una correcta cicatrización y mantención de la función cardiaca. Distintas evidencias muestran que los niveles de angiotensina II (Ang II) y del receptor de angiotensina II tipo 1 (AT1R) aumentan después de un infarto agudo al miocardio. Por ésto, Ang II puede tener un papel central en la regulación del número y función de estas células post-infarto al miocardio. En esta memoria se realizaron ensayos de unión de radioligando, viabilidad y funcionalidad celular, en fibroblastos (FCN) y miofibroblastos cardiacos neonatos (MCN) con y sin expresión ectópica de AT1R o AT2R. Los ensayos de unión de radioligando mostraron que miofibroblastos y fibroblastos cardiacos neonatos expresaban solo AT1R. En ambas condiciones (con y sin expresión ectópica de AT1R o AT2R), los miofibroblastos mostraron mayor unión total de radioligando que los fibroblastos. Ang II (100 nM), estimuló la migración de los fibroblastos controles, y en los que expresaban ectópicamente AT1R disminuyó la viabilidad. Por otra parte, no se observaron efectos en miofibroblastos controles o que expresaban ectópicamente AT1R o AT2R. La muerte de los fibroblastos estimulados con Ang II se previno con losartán e inhibidores de fosfolipasa C (PLC) y proteína kinasa C (PKC), indicando la participación de estas vías de señales intracelulares. Los resultados obtenidos demuestran que Ang II actúa de manera selectiva sobre fibroblastos y miofibroblastos cardiacos neonatos, controlando la función celular en nuestro modelo de estudio / Cardiac fibroblasts and myofibroblasts are key elements of the development of cardiac remodeling after myocardial infarction. A tight regulation of fibroblast and myofibroblast growth is important to correct wound healing and maintain cardiac function. Several lines of evidence have showed an increase in angiotensin II and AT1R levels after myocardial infarction. Thus angiotensin II may play a pivotal role in the regulation of number and function of theses cells. Cell viability and function, and radioligand binding studies, were performed in neonate cardiac fibroblast and myofibroblast with/without ectopically expressed AT1R or AT2R. Radioligand binding studies demonstrated that neonate cardiac fibroblast and myofibroblasts expressed a single class of high affinity angiotensin II AT1R. In both conditions, myofibroblasts revealed a higher maximal binding capacity, compared to fibroblast. Angiotensin II (100 nM) increased the migration in normal fibroblast, and in ectopically expressed AT1R fibroblast reduced the cell viability. No effects were observed in normal or ectopically expressed AT1R or AT2R myofibroblast. Cardiac fibroblast cell death angiotensin II triggered was was prevented by losartan and by phospholipase C (PLC) and protein kinase C (PKC) inhibitors, indicating the participation of that intracellular signaling pathways. The data demonstrate that Angiotensin II acted in a selective manner on cardiac fibroblast and myofibroblast, controlling the cellular number and function