Dans le cadre d'infections ostéo-articulaire (IOA), l'utilisation de matériels étrangers peut, en cas de contamination, aboutir à la formation d'un biofilm associé à un risque plus important d'échec du traitement et de récidive. Les bactéries sous forme de biofilm sont en effet protégées de l'action du système immunitaire et ont une tolérance plus importante aux antibiotiques. A l'heure actuelle, l'activité des antibiotiques est déterminée par la CMI (Concentration Minimale Inhibitrice), mais cette valeur ne tient pas compte de la forme sessile des bactéries. C'est pourquoi, la société BioFilm Control a développé un nouveau test, l'Antibiofilmogramme®, permettant de déterminer la CMI biofilm (CMIb) reflétant la capacité préventive des antibiotiques sur l'installation des microorganismes en biofilm. L'objectif de ma thèse a été dans un premier temps de participer à la démonstration de la valeur clinique de ce nouveau test dans le cadre des IOA à Staphylococcus aureus. Nous avons pu mettre en place un recueil prospectif et réaliser les premiers essais in vitro. Nos résultats obtenus pour la cloxacillin ont pu par la suite être confirmés sur un modèle in vivo d'infection sur matériel. Dans un second temps, nous avons pu caractériser la capacité de formation de biofilm des souches cliniques en fonction des profils de résistance obtenus en Antibiofilmogramme®. Nous avons pu mettre en évidence des profils différents liés à la clonalité des souches. Enfin, nous avons pu mettre au point une nouvelle méthode de rinçage et de quantification des biofilms pour les modèles en microplaque via l'utilisation de vapeur. Cette approche simple améliore grandement la reproductibilité des résultats et préserve l'intégrité structurelle des biofilms / In the context of Bone and Joint Infections (BJIs), the orthopedic devices are preferential surface for microorganisms to adhere and form biofilm associated with high rates of failures and relapses. Within biofilm, bacteria are protected from the host immune response and are able to survive in the presence of high concentration of antibiotics. The standard Minimal Inhibitory Concentration (MIC) informs on the antibiotic susceptibility of planktonic bacteria, but is not suited for biofilm. The company BioFilm Control developed a new test named Antibiofilmogram® which measures early-stage biofilm growth in presence of antibiotics, and provides a biofilm Minimal Inhibitory Concentration (bMIC). The aim of my PhD research was first to take part in the demonstration of the clinical value of this new test for Staphylococcus aureus BJIs. We established a prospective collection of data and strains and realized the first in vitro assays. Our results for cloxacillin were confirmed in an in vivo model of catheter-associated infection. Second, we characterized the biofilm formation capacity of various clinical isolates based on the Antibiofilmogram® resistance profile. We showed that the biofilm formation capacity is correlated with clonal lineage. Finally, we were able to develop a new method of washing and quantifying biofilms for microplate system using steam. This simple approach preserves the biofilm integrity and lead to highly reproducible data

L'objectif global de ma thèse a été d'étudier un mécanisme cellulaire qui intervient dans la traduction des protéines : la trans-traduction. Nous avons étudié le rôle de ce mécanisme chez notre modèle d'étude, la bactérie pathogène de l'homme Legionella pneumophila, l'agent étiologique de la Légionellose. Ce travail a été réalisé sous forme de deux axes majeurs. D'abord, nous avons démontré l'essentialité de ce mécanisme pour la viabilité de cette bactérie et pour sa capacité à se multiplier intracellulairement dans des cellules eucaryotes. Puis nous avons évalué l'efficacité d'un nouvel antibiotique décrit comme étant un inhibiteur de la trans-traduction, pour le traitement de la Légionellose. Ces deux axes ont été complétés par un troisième axe qui visait la mise en place de la technique de Tn-seq chez L. pneumophila et l'archée Pyrococcus furiosus. Cet axe a permis l'ouverture de mes travaux à la recherche d'autres mécanismes essentiels dont nous ignorons le potentiel comme cible antibiotique, et à l'étude des mécanismes de transfert de gène horizontaux / The global objective of my thesis work was the study of a cellular mechanism involved in protein translation: trans-translation. We studied the role of that mechanism in a model organism, the human bacterial pathogen Legionella pneumophila that causes Legionnaire's disease. This work was performed under two principal axes. First, we demonstrated the essentiality of this mechanism for the growth in vitro and the intracellular multiplication of this bacterium in eukaryotic cells. Then, we assessed the efficiency of a new antibiotic compound described as an inhibitor of trans-translation against the etiologic agents of Legionnaire's disease. These two axes were then completed by a third axis, which aimed at implementing the Tn-seq technique in L. pneumophila and the archaea Pyrococcus furiosus. This approach allowed to open my work to the reseach of other essential mechanisms that could be used as antibiotic targets, and to the study of a mechanism of horizontal gene transfer

L’ARN polymérase (ARNP) est l'enzyme centrale d'expression des gènes. Toutes les formes de vie possèdent de l’ARNP. C’est un complexe protéique formé de plusieurs sous-unités responsables du processus de transcription qui aboutit à la synthèse de l’ARN à partir d’une matrice ADN. Les procaryotes possèdent un seul type d’ARNP responsable de la synthèse de tous les ARNs de la cellule, alors que les eucaryotes possèdent trois types d’ARNPs pour la synthèse des différents types d’ARNs.L’ARNP est la cible d’un grand nombre de protéines et de petites molécules de régulation dont certains antibiotiques utilisés en première ligne pour le traitement de diverses maladies infectieuses. La sous-unité sigma de l’ARN polymérase bactérienne est impliquée dans toutes les étapes de l'initiation de la transcription qui est le point crucial de l'expression des gènes. Les sous-unités sigma activent par exemple les gènes de virulence des bactéries pathogènes et sont impliquées dans la persistance qui est une forme de survie aux traitements antibiotiques.Ce projet a permis de déterminer le rôle de la sous-unité sigma de l'ARN polymérase bactérienne dans la résistance à la lipiarmycine (Fidaxomicin). Nous avons utilisé des approches biochimiques, biophysiques et génétiques pour l’étude de la dynamique des interactions ADN-protéine dans les complexes formés par l’ARN polymérase, l’antibiotique et de l’ADN des promoteurs.Les résultats de cette étude montrent que la sensibilité de l’ARNP dépend fortement de la structure de la région 3.2 de sigma et que les régions 1.2 et 3.2 de la sous-unité sigma sont impliquées dans la formation du complexe d’initiation de la transcription. Les mutations au niveau de ces régions affectent allostériquement l'action de la lipiarmycine en compromettant la formation du complexe ouvert. Ces résultats suggèrent que la conformation et la mobilité de la région 3.2 dépendent fortement de sa séquence. Ces travaux contribueront de manière significative à la compréhension des bases moléculaires de la résistance aux antibiotiques; Les approches méthodologiques développées pendant ce projet pourront être étendues à l'analyse d’autres antibiotiques ciblant l’ARNP bactérienne et à l’analyse des autres facteurs de transcription. / The RNA polymerase (RNAP) is the central enzyme for genes expression. All forms of life own RNAP. It is a multi-protein complex composed of several subunits responsible of the process of the transcription. The prokaryotes have only one type of RNAP responsible of synthesis of all RNAs in the cells, whereas eukaryotes have three types of RNAPs for the synthesis of the various types of RNAs.RNAP is the target of a large number of proteins and small regulatory molecules including antibiotics used the treatment of various infectious diseases. The sigma subunit of the bacterial RNAP is implicated in all steps of transcription initiation which is the crucial point of genes expression.For example some of the sigma subunits activate genes of virulence in pathogenic bacteria and are implied in the persistence which is a form of survival to the antibiotic treatments.This project aimed to explore the role of the sigma subunits of RNAP bacterial polymerase in resistance to the lipiarmycine (Fidaxomicin). We used biochemical approaches, biophysics and genetics for the study of the dynamic of the interactions DNA-protein in the complexes formed by RNA polymerase, the antibiotic and the promoter DNA. The results of our study show that sensitivity of RNAP to the drug strongly depends on the structure of the sigma region 3.2 and that the regions 1.2 and 3.2 of the sigma subunit are implied in the formation of the RNAP-promoter open complex. Mutations in these regions allosterically affected action of lipiarmycin by impairing the formation of the open complex.These results suggest that conformation and mobility of the region 3.2 depend on its sequence. The outcomes of our work could be used for development of new more effective drugs and could help to progress the studies of the fundamental mechanisms of the transcription.

D'après la littérature, la prescription empirique des antibiotiques en soins dentaires est quasi-systématique bien que leur indication soit restreinte à des diagnostics spécifiques de certaines infections. En effet, le traitement d'une infection dentaire sans expression systémique, ni signe de gravité nécessite rarement la mise en place d'une antibiothérapie. Ainsi, son instauration doit être réfléchie et envisagée seulement en tenant compte du rapport bénéfice/risque apporté au patient. Car, au-delà du risque d’un mésusage relatif à un mauvais choix de la molécule ou à une inadéquation de dose, il est aussi important de considérer avec force le risque d'émergence de souches résistantes souvent à l'origine de complications majeures et parfois fatales. Très souvent les soins dentaires sont prodigués sans véritable considération de l'état général du patient et l’attitude des praticiens dentistes est assez volontariste quant à l’antibiothérapie.Ainsi, le but de cette étude est d'optimiser la pertinence des attitudes thérapeutiques des praticiens dentistes face un abcès dentaire aigu ou chronique.Prospective et multicentrique, l'étude s'est déroulée à la clinique dentaire de l'université libanaise ainsi qu’auprès de 24 cabinets dentaires situés à la ville de Beyrouth.Les résultats obtenus montrent que 48,2% des praticiens dentistes avaient une attitude inadéquate en termes de prescription d’antibiotiques. L’intérêt de notre étude est de favoriser la mise en place d’une nouvelle approche d’antibiothérapie moins basée sur l'empirisme. / Although, antibiotics prescription is restricted to specific diagnosis of some infections, in dental care; it is empirical and almost systematic. Indeed, the treatment of a dental infection without a systemic expression or severity signs rarely requires an antibiotic prescription. Furthermore, this latter must only be well thought-out and planned taking into account the benefit / risk for the patient. For, beyond the risk of misuse of antibiotherapy relative to the bad choice of molecules or inadequation in dosage, it is important to consider with strength the risk of resistant strains emergence manifestation often at the origin of major complications and sometimes fatal. Hence, very often dental care is provided without real consideration of the patient's general state. Thus, the aim of this study is to optimize the relevance of therapeutic attitudes dentists regarding acute or chronic abscess.Prospective and multicenter, the study took place at the dental clinic of the Lebanese University and in 24 private dental clinics.The results showed that 48.2% of the dentist’s practitioners had an inadequate therapeutic attitude concerning antibiotherapy prescriptions.These works could help set up a new therapeutic approach less based on empiricism.

Chez les patients traités par un régime posologique, La concentration sérique moyenne et l'écart type de la concentration SMX était 161,01 ± 69,154 mg/L et de 5,788 ± 2,74 mg/L pour le TMP. La concentration minimale inhibitrice 90% (CMI 90) était de 10 mg/L pour le cotrimoxazole et la sulfadiazine contre Mycobacterium tuberculosis. Toutes les mycobactéries étaient inhibées par 20 mg/L de cotrimoxazole et de sulfadiazine. Les CMI de l'ivermectine contre 13 souches complexe M. tuberculosis ont varié entre 10 et 40 mg/L. En outre, tous isoler M. tuberculosis étaient résistants à la squalamine avec CMI > 100 mg/L. Dans une autre partie nous avons montré que tous les isolats du complexe Mycobacterium avium étaient résistants au triméthoprime avec une CMI > 200 mg/mL. Le cotrimoxazole, le sulfaméthoxazole et la sulfadiazine ont montré une CMI respectivement de 10 mg/L, 25 mg/L et 20 mg/L, à l'exception de Mycobacterium chimaera qui présentait une CMI de 10 mg/L pour ces molécules. La comparaison de la séquence du gène de la dihydroptéroate synthase de M. intracellulare et M. chimaera a montré seulement quatre changements d'acides aminés. / Firstly, we measured the serum concentration of Sulfamethoxazole (SMX)-Trimethoprim (TMP) in patients treated with high dosage regimen. The mean values and standard deviation for SMX concentration was 161.01± 69.154 mg/L and of 5.788 ± 2.74 mg/L for TMP. Susceptibility testing yielded a minimum inhibitory concentration 90% (MIC90) of 10 mg/L for cotrimoxazole and sulfadiazine. All M. tuberculosis complex mycobacteria (MTC) were inhibited by 20 mg/L cotrimoxazole and sulfadiazine. Also, the MICs of ivermectin varied between 10 and 40 mg/L, against 13 MTC mycobacteria. Moreover, all M. tuberculosis isolate were resistant to squalamine with MIC > 100 mg/L. Also, all Mycobacterium avium complex (MAC) isolates were resistant to trimethoprim with MIC > 200 mg/L. Cotrimoxazole, sulfamethoxazole and sulfadiazine exhibited MIC of 10 mg/L, 25 mg/L and 20 mg/L, respectively against all tested MAC isolates except for Mycobacterium chimaera which exhibited MICs of 10 mg/L for these molecules. Comparing the DHPS gene sequence in M. intracellulare and M. chimaera type strains and clinical isolates yielded only four amino acid changes.

Les opérations chirurgicales pour le traitement des défauts de soutènement d'organes dans les pays industrialisés sont des actes de plus en plus fréquents, et requièrent l'implantation de plus d'un million de prothèses par an. Même si l'usage des prothèses de soutènement a permis de diminuer les complications postopératoires, les taux de réinterventions restent très élevés. Ces travaux présentent différentes stratégies permettant d'apporter de nouvelles propriétés à des treillis en polypropylène, afin d'améliorer leur résistance à l'infection et de permettre leur suivi postopératoire en IRM. Des treillis anti-infectieux sont développés en enrobant les filaments de treillis d'un réservoir de polymère dégradable et biocompatible contenant des agents anti-infectieux, par une technique de pulvérisation à l'aide d'un aérographe. L'association ofloxacine – rifampicine incorporée présente une excellente activité antibactérienne in vitro, et la cinétique de libération prolongée des agents actifs permet d'inhiber la contamination des treillis pendant au moins 72 heures. Les techniques de stérilisation par rayonnement Gamma n'impactent ni la stabilité des agents actifs, ni l'efficacité antibactérienne des treillis anti-infectieux.Afin de permettre une visualisation en IRM des treillis implantés, des polymères ont été synthétisés par greffage d'agent de contraste (DTPA-Gd) sur de la poly(ε-caprolactone) (dégradable) et du poly(acrylate de méthyle) (biostable). Après enrobage des prothèses par ces polymères, le rehaussement du signal induit par la présence du gadolinium permet de visualiser les prothèses à la fois in vitro et in vivo sur différents types d'appareils d'IRM. La stabilité de l'agent de contraste est suffisante pour pouvoir visualiser les treillis pendant plusieurs mois, quelle que soit la technique de stérilisation utilisée. / Soft tissue reinforcement surgical operations in industrial countries are common and require annually at least one million of prostheses for treating this problem. Even if meshes used for organ prolapse surgical procedures allow decreasing postoperatory complications, reinterventions ratio is still relevant. This work present several strategies to bring new properties to polypropylene meshes in order to improve their resistance to infection and enable their postoperative MRI follow-up. Anti-infective meshes are developed by coating the filaments of the meshes with an antibiotics drug reservoir based on degradable and biocompatible polymers, using an airbrush system. Dual ofloxacin-rifampicin antibiotics incorporation on these coated meshes shows an excellent antibacterial activity in vitro and sustained release of the drugs can inhibit meshes contamination for at least 72 hours. Sterilization procedures using Gamma-ray irradiation impact neither the drugs stability nor the anti-infective meshes activity. In order to visualize by Magnetic Resonance Imaging (MRI) meshes after implantation, a contrast agent (DTPA-Gd) is covalently grafted onto the polymeric backbone of poly(ε-caprolactone) (degradable) or poly(methyl acrylate) (biostable). Meshes were coated with these new polymers and MR signal enhancement induced by the presence of gadolinium allows the visualization of the meshes in vitro and in vivo with several MR equipments. Coated meshes are visible during several months, whatever the sterilization procedures, showing the stability of the contrast agent.

Les intégrons sont des supports génétiques bactériens de capture, d’expression et de dissémination de gènes de résistance aux antibiotiques sous forme de cassettes. Ils sont majoritairement décrits chez les bactéries à Gram négatif chez qui ils confèrent généralement un phénotype de multirésistance. Les intégrons de résistance (IR) jouent un rôle majeur dans l’acquisition de la résistance dans le monde bactérien. Il existe 3 principales classes d’IR ; les IR de classe 1, les IR de classe 2 et les IR de classe 3 (IR3). Contrairement aux 2 premières classes, les IR3 représentent la classe d’intégrons de résistance la moins étudiée. Très peu de travaux s’intéressent à leur étude et on dénombre actuellement moins de 10 IR3 entièrement caractérisés. Les objectifs de ce travail de thèse étaient (i) d’effectuer une étude épidémiologique des IR3 en France et au Cameroun et (ii) d’étudier les modalités d’expression de l’intégrase et des cassettes de ces intégrons. Nos travaux ont permis d’isoler puis de décrire 3 nouveaux IR3 présents au sein de bactéries environnementales appartenant aux genres Aeromonas, Acinetobacter et Citrobacter. Les cassettes de ces IR3 codent des résistances aux bétalactamines, aminosides et ammoniums quaternaires. De plus, nous avons caractérisé des IR3 dans 3 souches de Delftia spp. (2 D.acidovorans et 1 D. tsuruhatensis) isolées en Afrique ; les cassettes de ces intégrons ne codent pas de résistance aux antibiotiques. L’axe plus fondamental de ce travail de thèse a permis de montrer que le PintI3(1) est le promoteur impliqué dans l’expression du gène intI3. De plus, nous avons montré que les variants du promoteur Pc, ainsi que les variants du promoteur PintI3(1) sont fonctionnels et de force différente. Il ressort de nos travaux que l’environnement constituerait un réservoir d’intégrons de classe 3 et que ces supports génétiques pourraient jouer un rôle important dans la dissémination de la résistance au sein de cet écosystème. / Integrons are bacterial genetic elements able to capture and express genes embedded within gene cassettes. They are widely described among Gram-negative bacteria and generally confer a multidrug resistance phenotype. Resistance integrons (RI) play an important role in the acquisition of antibiotic resistance. There are 3 main classes of RI. Class 3 RI has been poorly studied class with less than ten fully IR3 characterized. Objectives of this thesis were (i) to conduct an epidemiological study of class 3 RI in France and Cameroon and (ii) to better understand the modes of expression of the integrase and cassettes of IR3. We described 3 new class 3 RI isolated from environmental bacteria belonging to genus Aeromonas, Acinetobacter and Citrobacter. Gene cassettes encoded resistance to betalactams, aminoglycosides and quaternary ammonium compounds. We also described IR3 from three Delftia strains (2 D.acidovorans and 1 D.tsuruhatensis) in Africa containing cassettes that do not encode antibiotic resistance. The fundamental part of the work showed that the PintI3(1) promoter is involved in the expression of the intI3 gene. Furthermore, we demonstrated that variants of the Pc promoter and variants of the PintI3(1) promoter are functional with different strengths. These results showed that the environment may constitute a reservoir of class 3 integrons and that these genetic elements could play an important role in the spread of the resistance in this ecosystem.

Staphylococcus aureus est une bactérie pathogène responsable de nombreuses infections communautaires et nosocomiales contre laquelle il est indispensable d'envisager de nouvelles stratégies de traitements du fait de l'émergence de résistances aux antibiotiques. La synthèse bactérienne des acides gras (FASII Fatty Acid Synthesis II) fut proposée comme une nouvelle cible. Cependant, malgré l'enthousiasme suscité par cette approche, sa réalisation est compromise car de nombreux pathogènes à Gram positif peuvent utiliser des acides gras de l'hôte rendant ainsi la voie FASII non essentielle à la croissance bactérienne in vivo. Cependant le statut de S. aureus était encore controversé.S. aureus peut contourner l'inhibition de la voie FASII par deux stratégies. La première consiste à muter des enzymes de l'initiation de FASII, facilitant l'incorporation d'acides gras exogènes. La peau de l'hôte, riche en FA et souvent colonisée par des staphylocoques pourrait constituer une niche favorable au développement de tels mutants lors de l'utilisation ectopique d'un anti-FASII. Nous avons recherché la présence de ce type de résistance dans des souches cliniques et montré que les FA augmentaient de 58% le taux de résistance dans un échantillonnage de 700 isolats. De plus, les substitutions facilitant le contournement de la voie FASII mise en évidence in vitro ont été retrouvées dans des isolats naturels. La seconde stratégie consiste en une adaptation non mutationnelle qui implique une phase de « dormance » après laquelle S. aureus s'est affranchi de sa voie FASII et est capable d'incorporer les FA. L'adaptation mutationnelle est stable alors qu'en l'absence de mutation, la résistance est réversible. Nous avons montré l'importance du stress cellulaire dans l'adaptation et une corrélation entre l'adaptation et des changements de l'enveloppe bactérienne. Enfin, nous avons réalisé une analyse RNAseq qui constituera une base de données utile à de futurs travaux. En conclusion, dans l'état actuel des connaissances, le traitement d'infections staphylococciques par des inhibiteurs de FASII n'est pas souhaitable car leur effet peut être contourné par mutation et/ou par adaptation. Cependant, il est possible qu'une combinaison entre un anti-FASII et d'autres cibles métaboliques ait un effet synergique. / Staphylococcus aureus is a major cause of hospital and community acquired infections of major concern due to the increasing rate of antibiotic resistance, making the development of new treatments a priority. One target actively developed over several years is the fatty acid (FA) synthesis (FASII) pathway. However, despite widespread publicity of this strategy, it is deeply compromised, as numerous Gram positive pathogens use exogenous FA, as available in the host, making FASII nonessential for growth in vivo. Nevertheless, the status of S. aureus remained controversial.The main result of this work is that S. aureus overrides FASII inhibition by two strategies: the first involves high frequency mutations in FASII initiation enzymes, which facilitate exogenous FA incorporation. Such mutants may be selected on skin when exposed to FASII inhibitors, as skin is often colonized by staphylococci and is FA-rich. We searched for the presence of such resistance in clinical isolates and found that FA increased resistance frequencies by 58 % in a screen of 700 clinical isolates. Importantly, the point substitutions allowing FASII bypass described in vitro are present among natural isolates. The second strategy involves adaptation without detectable mutation, in which S. aureus undergoes transient "dormancy", followed by a FASII-bypass-proficient state. Mutational adaptation is stable, whereas non-mutational adaptation is reversible. We demonstrated the importance of stress and found that FASII bypass is favored when stress is reduced. We showed that FASII bypass is accompanied by envelope changes and we performed an RNAseq analysis that will serve as a database for future studies. We conclude that in its present state, FASII inhibition is not a suitable strategy for treating staphylococcal infections, as a FASII block can be bypassed by mutation and/or adaptation. However, our data also suggest that major physiological changes during treatment may lead to essentiality of a different gene set, a finding that might be used to develop a combinatorial drug approach. We propose that anti-FASII drugs might be used in association with other antibiotics (to be identified) that could lead to a synergistic anti-S. aureus effect.

Staphylococcus aureus est un agent pathogène opportuniste responsable d’infections communautaires et nosocomiales pour lesquelles les traitements sont compliqués du fait de l'émergence de souches multi-résistantes. L’adaptation rapide de S. aureus à de multiples conditions de croissance contribue à sa virulence ; elle dépend de nombreux facteurs incluant la régulation des petits ARN (ARNrég). Nous avons réalisé une étude précise de tous les petits ARN de la souche modèle HG003, un dérivé de la souche NCTC8325 couramment utilisé pour les études de régulation génétique chez S. aureus. C'est une tâche complexe qui est essentielle pour réaliser des études moléculaires et fonctionnelles. Nous avons trouvé environ 50 authentiques (bona fide) petits ARN, un nombre beaucoup plus faible que précédemment rapporté. Comme la plupart des ARNrég contribuent à une « régulation fine » de l'expression génique, les phénotypes dépendants des ARNrég sont généralement difficiles à détecter. Cependant, ces phénotypes peuvent apparaître comme un caractère important après plusieurs générations sous une pression sélective. Nous avons développé une stratégie expérimentale pour mesurer l’évolution de la quantité de mutants d’ARNrég dans une population de mutants de S. aureus. Nous avons construit une collection de quatre-vingts mutants d’ARNrég dans la souche HG003. Chaque gène d’ARNrég est remplacé par une séquence d'ADN « code-barres » spécifique pour l’identification des mutants. La bibliothèque de mutants est cultivée dans différentes conditions de croissance, les codes-barres sont amplifiés par PCR et comptés par séquençage massif. Nous pouvons ainsi déterminer les mutants qui diminuent ou s'accumulent pendant une condition de stress et inférer une fonction à certains ARNrég. L'utilisation d'amorces spécifiques permet de multiplexer 50 conditions expérimentales. Nous nous sommes posés la question suivante : les ARNrég de S. aureus participent-t-ils à la résistance aux antibiotiques ? Dans ce mémoire, nous présentons des données en utilisant la méthode décrite ci-dessus. La bibliothèque de mutants d’ARNrég a été testée en présence de 10 antibiotiques ciblant les enveloppes, la synthèse des protéines, la réplication de l'ADN ou la synthèse de l'ARN. Plusieurs mutants sont affectés par les conditions de croissance testées. Par exemple, la proportion du mutant sau6836 augmente considérablement en présence de vancomycine et est réduite en présence de flucloxacilline, cloxacilline ou céfazoline. La proportion du mutant ARNIII-agr augmente progressivement en présence de gentamicine, de linézolide et de clindamycine. La proportion de mutant d'ARN 6S diminue significativement en présence de rifampicine. Il est important de noter que l'ARN 6S et la rifampicine ciblent l'ARN polymérase. L’ARNrég RsaA est un régulateur des autolysines dont l’absence affecte la survie en présence de ciprofloxacine. Ces exemples illustrent la puissance des expériences de compétition pour identifier les phénotypes dépendants des ARNrég et révèlent que plusieurs ARNrég contribuent à moduler la résistance aux antibiotiques. / Staphylococcus aureus is an opportunistic pathogen and one of the major bacteria responsible for community-acquired and nosocomial infections for which the treatment is complicated by the emergence of multidrug resistant strains. Its adaptation to multiple growth conditions, which contributes to its virulence, is under the control of numerous factors including regulatory RNAs, often called sRNAs for small RNAs. We performed an accurate survey of all sRNAs from the model strain HG003, a NCTC8325 derivative commonly used for S. aureus genetic regulation studies. It is a complex task, essential to accomplish molecular and functional studies. We found about 50 bona fide sRNAs, a number much lower than previously reported.As most sRNAs contribute to the "fine-tuning" of gene expression, sRNA-dependent phenotypes are generally difficult to detect. However, sRNA-mediated phenotypes may emerge as dominant traits after a few generations under selective pressure. We set up an experimental strategy to evaluate the fitness of S. aureus sRNA mutants within a population of sRNA mutants. A library of eighty HG003 mutants with sRNA genes replaced by specific DNA “barcode” sequences to allow the identification of each mutant was constructed. The mutant library was grown in different conditions, DNA barcodes were PCR and counted by DNA-seq. Mutants diminishing or accumulating during a stress condition provide information on sRNA functions. The use of specific primers allows multiplexing 50 experimental conditions in one DNA-seq library. We questioned whether sRNAs could affect the antibiotic resistance in S. aureus. Here, we present data using the above-described method with the sRNA mutant library tested in the presence of 10 antibiotics (targeting the cell wall and cell membrane, inhibiting the biosynthesis of protein, interrupting DNA replication and RNA synthesis of bacteria). Several mutants were affected by the tested growth conditions. For examples, the proportion of mutant sau6836 increases dramatically in vancomycin and reduces in flucloxacillin, cloxacillin and cefazolin. The proportion of RNAIII-agr mutant increases progressively in the presence of gentamicin, linezolid and clindamycin. The proportion of 6S RNA mutant decreases significantly in the presence of rifampicin. Interestingly, the 6S RNA and the rifampicin are targeting the RNA polymerase. The sRNA RsaA targets a regulator of autolytic activities and its corresponding mutant is remarkably reduced in the presence of ciprofloxacin. These examples illustrate the power of fitness experiments to identify phenotypes and reveals that several sRNAs contribute to modulate the resistance to antibiotics.

Les microARN (miARN) constituent une classe de petits ARN non-codants qui jouent un rôle clé dans la régulation de l’expression des gènes au niveau post-transcriptionnel. De nombreuses études ont démontré que la surexpression de certains miARN est liée au développement de plusieurs types de cancer. C’est pour cette raison les miARN représentent une nouvelle classe de cibles thérapeutiques à haute potentielle. Dans ce contexte, l’objectif de mon travail de thèse était la découverte de nouveaux inhibiteurs de la production de miARN oncogène. Dans ce but, j’ai suivi deux approches, différentes mais complémentaires : (i) le criblage d’une petite librairie de composés et (ii) la conception et la synthèse de nouveaux conjugués en tant que ligands de précurseurs de miARN (pré-miARN). En particulier, nous avons ciblé les miARN-372 et -373 qui sont oncogènes dans plusieurs cancers, tels que le cancer gastrique. Nous avons ainsi démontré que certains des composés criblés ou synthétisés sont capables de se lier efficacement à la structure secondaire en tige-boucle de pré-miARN avec une haute affinité, conduisant à l’inhibition de la production des miARNs correspondants. Par ailleurs, nous avons montré que certains composés possèdent une activité anti-proliférative spécifique pour les cellules de cancer gastrique et que cette activité est directement liée à une diminution de la production de miARN ciblés et au rétablissement de la traduction de ARN messenger / MicroRNAs (miRs) are a class of small non-coding RNAs that act as regulators of gene expression at the post-transcriptional level. Increasing evidence has indicated that the deregulation of miR expression is linked to various human cancers and therefore, miRs represent a new class of potential drug targets. In this context, my PhD project focused on the discovery of new inhibitors of oncogenic miRs production. Toward this aim, two different but complementary approaches were followed: (i) the screening of small libraries of compounds and (ii) the design and synthesis of new classes of conjugates as binders of miRNA precursors (pre-miRs). In particular, we focused our attention on miR-372 and miR-373, two oncogenic miRs overexpressed in various cancers, such as gastric cancer. We showed that some of the screened or of the newly synthesized compounds are able to efficiently bind to stem-loop structured precursors of the targeted miRs with high affinity, thus inhibiting the production of their corresponding mature miRs at the level of Dicer cleavage. Moreover, we found compounds bearing a specific anti-proliferative activity in gastric cancer cells overexpressing targeted miRs and this activity is directly linked to a decrease in the production of oncogenic miR-372 and -373 and to the restoration of normal mRNA translation.