Le cancer du sein triple-négatif est un sous-type représentant environ 15 % des cancers du sein, qui est caractérisé par l'absence de récepteurs hormonaux aux œstrogènes et à la progestérone et l'absence d'expression du facteur de croissance HER-2. Le cancer du sein triple-négatif est également associé à un profil clinique défavorable avec un haut risque de rechute métastatique précoce. Actuellement, de nombreuses molécules sont testées comme cible thérapeutique dans ce type de cancer. La cathepsine D, une aspartyl protéase lysosome, est un marqueur de mauvais pronostic du cancer du sein associé au risque métastatique. Cette protéase est surexprimée par les cellules cancéreuses mammaires et hypersécrétée dans le microenvironnement tumoral. Notre équipe a apporté des contributions importantes pour élucider le rôle de la cath-D dans le cancer du sein. La cath-D stimule la prolifération des cellules cancéreuses, la croissance et l'angiogenèse tumorales ainsi que la formation des métastases. Au niveau moléculaire, le proenzyme sécrété par la cellule tumorale stimule la croissance invasive du fibroblaste mammaire via le récepteur LRP1 (low-density lipoprotein receptor-related protein-1). De plus, au pH extracellulaire acide des tumeurs, la pro-cathepsine D secrétée dégrade un des plus puissants inhibiteurs des cystéines cathepsines, la cystatine C, stimulant ainsi leurs activités protéolytiques.Mon travail a consisté à développer des anticorps anti-cath-D, présentant un effet thérapeutique dans le cancer du sein triple-négatif. Nous avons utilisé deux approches l'une par la technologie des hybridomes qui a permis d'isoler 50 anticorps, qui se sont avérés être des IgM. L'autre, par phage display, où 8 anticorps fragments scFv anti-cath-D ont été sélectionnés par ELISA. Ces 8 scFv ont été criblés pour leur capacité à bloquer l'activité biologique de la cathepsine D : inhibition de l'interaction avec LRP1 et inhibition du clivage d'un substrat fluorescent. Les anticorps E2 et F1 reformatés en IgG1 inhibent in vitro le phénomène de cicatrisation, la clonogénéicité, la croissance tridimensionnelle dans le matrigel et in vivo la croissance tumorale des cellules de cancer du sein triple-négatif MDA-MB-231. Cette étude est une première étape vers le développement de thérapie anti-cath-D dans le cancer du sein. / Cancer is the leading cause of death in the developed world. This project focuses t on the high incidence triple-negative breast cancers (ER- and PR-negative, HER2-non amplified) who present unsatisfactory treatments. Tumor progression is known to be due to cross-talk between cancer cells and their surrounding supporting tissue, the tumor stroma. The lysosomal aspartic protease cathepsin D is over-produced and abnormally hypersecreted by epithelial breast cancer cells. This protease is an independent marker of poor prognosis in breast cancer correlated with the incidence of clinical metastasis. Cathepsin D stimulates tumor progression by both proteolytic and non-proteolytic molecular mechanisms. Our team has shown that secreted pro-cathepsin D can alter the tumor microenvironment by interacting with partners such as the LRP1 (low-density lipoprotein receptor-related protein-1) receptor, and/or by cleaving endogenous substrates like cystatin C. My pHD project aimed to target extracellular procathepsin D released in breast cancer by developing specific therapeutic antibodies to block its catalytic and binding capacities. We have isolated 50 hybridomas, that secreted IgM, a pentameric antibody format with high avidity but low affinity, and 8 anti-cath-D scFv by phage display. The anti-human cath-D scFv were selected by functional screenings for their ability to inhibit both the proteolytic activity of Cath-D and its binding to the fibroblastic LRP1 receptor. Two scFv cloned under IgG1 format (F1 and E2) inhibited wound healing, colony formation and three-dimensional outgrowth in Matrigel of MDA-MB-231 triple-negative breast cancer cells, and their tumor growth in athymic nude mice. Our findings strongly suggest that antibody-based targeting of Cath-D within the breast tumor microenvironment may have therapeutic efficacy for breast cancer treatment.

Dans les tauopathies, telle la maladie d'Alzheimer, la protéine tau devient anormalement hyperphosphorylée ce qui conduit à son accumulation et à son agrégation intracellulaire. Ce processus aboutit progressivement à une perte neuronale et un déclin cognitif. L'immunothérapie anti-tau est de plus en plus considérée comme un traitement potentiel en vue de bloquer la progression des tauopathies.Récemment, l’entreprise UCB BioPharma a montré que l’anticorps D, anticorps ciblant la protéine tau en un épitope central (aa 235 à 250), était en mesure de bloquer, in vitro, l'agrégation intracellulaire de protéines tau, induite par des PHFs purifiés au départ de cerveaux Alzheimer. L’anticorps A, de même isotype, associé à des propriétés de liaison comparables mais reconnaissant la protéine tau en son extrémité N-terminale (aa 15 à 24), n’est pas en mesure de prévenir l’agrégation dans ce même modèle, ce qui souligne l’importance du choix de l’épitope en vue de neutraliser les amorces pathologiques issues de cerveaux Alzheimer.En vue d’étudier les propriétés de l’anticorps D in vivo, nous avons développé deux modèles murins de tauopathies. Premièrement, un modèle étudiant les phénomènes de recrutement et nucléation, basé sur l'injection unilatérale d’un homogénat de cerveau Alzheimer dans l'hippocampe de jeunes souris transgéniques (Tg30tau). Deuxièmement, un modèle permettant l’étude de la propagation intercellulaire de formes pathologiques de tau, par injection unilatérale de fibrilles P301L-K18 dans l’hippocampe de souris transgéniques (hTauP301L). Les tauopathies induites par ces injections intracérébrales ont été quantifiées dans l'hippocampe ipsi et controlatéral, en présence de traitements immunothérapeutiques utilisant les anticorps anti-tau A et D ou un anticorps témoin négatif de même isotype. La quantification des formes hyperphosphorylées et agrégées de tau a été réalisée par des approches immunohistochimique ou biochimique.Dans le modèle de nucléation, l’anticorps D est en mesure de prévenir significativement l’apparition des formes hyperphosphorylées et agrégées de tau à la fois dans l’hippocampe ipsilatéral (injecté avec l’homogénat Alzheimer) et contralatéral. A l’opposé, l’anticorps A n’est pas en mesure de prévenir l’apparition de la tauopathie dans ce modèle. Dans le modèle de propagation, basé sur l'injection unilatérale hippocampique de fibrilles P301L-K18, le traitement immunothérapeutique utilisant l’anticorps D réduit significativement la propagation d’espèces pathologiques de la protéine tau dans l'hippocampe controlatéral.De par l’utilisation de ces deux modèles murins de tauopathies, nous avons pu confirmer in vivo, la capacité de l’anticorps D à neutraliser les espèces pathologiques contenues dans un homogénat de cerveau Alzheimer et avons démontré sa capacité à s’opposer à la propagation intercellulaire de la tauopathie in vivo. Dans le modèle de nucléation, l’anticorps A n’a pas été en mesure de s’opposer à l’apparition de la tauopathie. Les résultats obtenus confirment ceux décrits par l’entreprise UCB BioPharma dans leur modèle d’agrégation in vitro et confirme l’importance considérable du choix de l’épitope en vue de prévenir efficacement le développement de tauopathies in vivo. / In tauopathies, such as Alzheimer's disease, tau protein becomes abnormally hyperphosphorylated which leads to its accumulation and intracellular aggregation. This process gradually leads to neuronal loss and cognitive decline. Anti-tau immunotherapy is increasingly considered as a potential treatment to block tauopathies’s progression.UCB BioPharma recently showed that antibody D, targeting an epitope in the central region of tau (aa 235-250), is able to block, in vitro, the intracellular seeding of tau proteins induced by PHFs purified from the brain of Alzheimer's patients. The antibody A, same isotype and associated with similar binding properties but recognizing the N-terminal region of tau (aa 15 to 24) is not able to prevent tau seeding in this cell based assay. This observation underlines the importance of the targeted epitope on tau protein in order to neutralize pathological species contained in Alzheimer's brains (Courade et al., 2018).In order to study the properties of antibody D in vivo, we developed two murine models of tauopathies. First, a seeding model based on a unilateral injection of Alzheimer's brain homogenate into the hippocampus of young Tg30tau mice. Secondly, a spreading model to study the propagation of pathological tau seeds, based on unilateral hippocampal injection of P301L-K18 fibrils in hTauP301L transgenic mice. Tauopathies induced in these models were quantified in the ipsi and contralateral hippocampus in the presence of immunotherapeutic treatments with anti-tau antibodies (D, A) or a negative control antibody. Quantification of hyperphosphorylated and aggregated tau was performed by immunohistochemical or biochemical analyses.In the seeding model, antibody D significantly reduces the appearance of hyperphosphorylated and aggregated tau both in the ipsi and contralateral CA1 regions of hippocampus. In contrast, antibody A is not able to prevent the appearance of pathological tau in this model. In the spreading model, immunotherapeutic treatments with antibody D significantly reduces the spread of pathological tau seeds in the contralateral hippocampus.From these two murine models of tauopathies, we confirmed in vivo the ability of antibody D to neutralize the pathological tau species contained in an Alzheimer's brains homogenate and demonstrated its capacity to reduce the intercellular propagation of tauopathies. In the seeding model, antibody A wasn’t able to affect the onset of tauopathy. These results confirm those described by UCB BioPharma based on their in vitro aggregation assay and confirm the importance of the targeted epitope in order to effectively prevent the development of tauopathies in vivo.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

L'objectif principal de cette étude consistait à identifier et à caractériser des inhibiteurs de l'activité enzymatique des Nucléosides Triphosphates Diphosphohydrolases (NTPDases) de la membrane cytoplasmique, soient les NTPDase 1, 2, 3 et 8. Ainsi, dans un premier temps, nous avons caractérisé l'inhibition de certains antagonistes des récepteurs P2 sur les NTPDases. Puis, nous avons produit et testé des inhibiteurs spécifiques de ces enzymes, tels des anticorps monoclonaux. Nos résultats nous permettent de conclure que certains antagonistes des récepteurs P2 tels la suramine, le NF279, le réactif bleu-2 sont aussi des inhibiteurs non sélectifs de l'activité enzymatique des formes humaines et murines des NTPDasel, 2, 3 et 8. Parmi les antagonistes testés, le plus puissant s'est avéré être le NF279. Soulignons cependant, qu'il suffit d'une modification chimique de certains de ces antagonistes pour obtenir une inhibition plus sélective de certaines NTPDases. Finalement nous avons produit et caractérisé un anticorps dirigé contre la NTPDase3 humaine qui inhibe spécifiquement cette enzyme. Ce nouvel anticorps monoclonal que nous avons produit au laboratoire représente actuellement le premier inhibiteur spécifique d'une NTPDase. Dans ce travail, nous avons également démontré que cet anticorps monoclonal est très efficace dans différents types d'expérimentation telles le Western blot, l'immunohistochimie et la cytométrie de flux. L'identification et la caractérisation de ces outils permettront une meilleure compréhension des mécanismes par lesquels les nucléotides extracellulaires, via l'activation des récepteurs P2, modulent des fonctions biologiques importantes telles le développement, la sécrétion endocrinienne, l'inflammation et les réactions immunitaires.

Thèse de doctorat : Sciences de la vie et de la santé : Tours : 2008. Thèse de doctorat : Sciences de la vie et de la santé : CHIANG MAI UNIVERSITY : 2008. / Thèse soutenue en co-tutelle. Titre provenant de l'écran-titre.

Les anticorps sont les molécules effectrices de l'immunité adaptatrice humorale. Ils se lient spécifiquement et neutralisent une large panoplie d'antigènes. Au-delà de leurs fonctions classiques, les anticorps possèdent les propriétés moins explorées que sont l'activité catalytique, qui permet aux anticorps de se comporter comme des enzymes, et la polyréactivité, qui représente la capacité d'une molécule d'anticorps à se lier à plusieurs antigènes structurellement différents. Les anticorps catalytiques sont retrouvés dans plusieurs pathologies chez l'homme, telle que l'hémophilie acquise, une maladie caractérisée par la survenue d'autoanticorps anti-facteur VIII. Dans ce travail, nous décrivons des IgG hydrolysant et activant le facteur IX de la coagulation chez les patients avec hémophilie acquise. Par ailleurs, nous avons effectué une étude longitudinale de deux ans des IgG catalytiques chez les patients subissant une transplantation rénale. Les anticorps polyréactifs représentent une proportion importante du répertoire des immunoglobulines circulantes. De plus, les sites inflammatoires sont abondants en molécules, telles que l'hème libre, capables de rendre polyréactives certaines IgG monoréactives. Nous avons étudié l'influence de la nature des régions constantes de la chaîne lourde des anticorps sur leur susceptibilité à devenir polyréactifs. Ce travail apporte un nouvel éclairage sur l'importance physiopathologique des anticorps catalytiques et polyréactifs.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Avec quatorze anticorps utilisés en oncologie, les anticorps monoclonaux ont enfin une place de choix dans l'arsenal thérapeutique anticancéreux. Cependant, l'un des modes d'action les plus importants de ces molécules, la cytotoxicité à médiation cellulaire dépendante des anticorps (ADCC), souffre de plusieurs limites en raison de la nécessité d'une interaction optimale avec le FcγRIIIA. L'équipe du Dr. Daniel Baty a conçu de nouveaux formats d'anticorps bispécifiques basés sur l'utilisation de domaine unique d'anticorps de lamas (sdAb) et capables de contourner la plupart de ces limites. Des banques de phages issus de lamas immunisés ont permis de sélectionner deux sdAbs (d'affinités différentes) dirigés contre le FcγRIIIA exprimé par des cellules NK et les macrophages, ainsi qu'un sdAb dirigé contre l'antigène tumoral carcino-embryonnaire (ACE). En utilisant les domaines CH1 et Ck d'IgG1 humaine comme motif d'hétérodimérisation et les sdabs anti-ACE et anti-FcγRIII précédemment sélectionnés, nous avons développé des formats innovants d'anticorps bispécifiques Fab-like nommés bsFabs. Ces molécules sont faciles à produire, très stables et peuvent déclencher la lyse des cellules tumorales par les cellules NK humaines à des concentrations de l'ordre du picomolaire. Elles ne se lient pas au récepteur inhibiteur FcγRIIB, n'entrent pas en compétition avec des IgG sériques pour la liaison aux récepteurs, et leur activité cytotoxique est indépendante de la glycosylation du Fc et du polymorphisme du FcγRIIIA. / With fourteen antibodies used in oncology, monoclonal antibodies finally have a place in the therapeutic arsenal against cancer. However one of the modes of action of the most important of these molecules, cell-mediated cytotoxicity antibody-dependent (ADCC), suffers from several limitations due to the need for optimal interaction with the FcγRIIIA. Daniel Baty's team has developed new formats of bispecific antibodies based on the use of single domain llama antibodies (SdAb) that are capable of circumventing most of the these limitations. Phage libraries from immunized llamas were used to select two sdAbs directed against the FcγRIIIA expressed by NK cells and macrophages (with different affinities for FcγRIII), as well as one SdAb directed against the tumor antigen carcinoembryonic (CEA). Using CH1 and Ck domains of human IgG1 as a motif for heterodimerization and sdabs previously selected, we have developed innovative anti-CEA and anti-FcγRIII formats of bispecific antibodies Fab-like named bsFabs. These molecules are easy to produce, very stable and can trigger tumor cell lysis by human NK cells at picomolar concentrations. They do not bind FcγRIIB inhibitory receptor, do not compete with serum IgG and their cytotoxic activity is independent of FcγRIIIA polymorphism. In addition, they slow tumor growth in mouse model. In terms of pharmacokinetics, although bsFabs have a reasonable tumor retention, one of the limitations of these formats is size, which leads to rapid renal elimination. Such findings led us to consider the creation of new antibody formats to both increase tumor retention and secondly the half-life of antibodies in the body.

Les anticorps sont les molécules effectrices de l’immunité adaptatrice humorale. Ils se lient spécifiquement et neutralisent une large panoplie d’antigènes. Au-delà de leurs fonctions classiques, les anticorps possèdent les propriétés moins explorées que sont l’activité catalytique, qui permet aux anticorps de se comporter comme des enzymes, et la polyréactivité, qui représente la capacité d’une molécule d’anticorps à se lier à plusieurs antigènes structurellement différents. Les anticorps catalytiques sont retrouvés dans plusieurs pathologies chez l’homme, telle que l’hémophilie acquise, une maladie caractérisée par la survenue d’autoanticorps anti-facteur VIII. Dans ce travail, nous décrivons des IgG hydrolysant et activant le facteur IX de la coagulation chez les patients avec hémophilie acquise. Par ailleurs, nous avons effectué une étude longitudinale de deux ans des IgG catalytiques chez les patients subissant une transplantation rénale. Les anticorps polyréactifs représentent une proportion importante du répertoire des immunoglobulines circulantes. De plus, les sites inflammatoires sont abondants en molécules, telles que l’hème libre, capables de rendre polyréactives certaines IgG monoréactives. Nous avons étudié l’influence de la nature des régions constantes de la chaîne lourde des anticorps sur leur susceptibilité à devenir polyréactifs. Ce travail apporte un nouvel éclairage sur l’importance physiopathologique des anticorps catalytiques et polyréactifs. / Antibodies are effector molecules of the humoral arm of the adaptive immune system that bind specifically and neutralize diverse array of antigens. Beyond the classical function of antibodies exist the relatively less explored properties, of “catalytic activity” that enable antibodies to act as enzymes and “polyreactivity” that confers the ability to bind to several structurally unrelated antigens. Catalytic antibodies have been associated with several autoimmune, inflammatory and infectious diseases. Acquired hemophilia is an autoimmune disease, reported with the presence of catalytic antibodies against coagulation factor FVIII. In the present work, we have investigated the presence of factor IX (FIX) hydrolyzing IgG in patients with acquired hemophilia. We investigated the molecular mechanism and the physiological relevance of FIX activation upon hydrolysis by patients’ IgG. In addition, a longitudinal follow-up for 2 years was done in patients undergone renal transplant to investigate the evolution of catalytic antibodies in the course of disease. Polyreactive antibodies constitute a major portion of the natural antibody repertoire. Additionally, sites of inflammation are abundant in protein destabilizing agents like free heme that can induce polyreactivity in monoreactive antibodies. We have investigated the effect of the antibody constant domain on heme-induced polyreactivity. The present work has allowed us a better understanding of the physiopathological relevance of catalytic and polyreactive antibodies.

La majorité des ADC qui sont actuellement en clinique et en développement sont produits par une conjugaison chimique via les résidus lysine ou cystéine, menant à un produit hétérogène pour leur ratio toxine sur anticorps (DAR). L'objet des travaux de thèse a pour but de décrire la caractérisation in vitro et in vivo de nouveaux ADC optimisés et construits à partir de l'anticorps anti-CD30 cAC10, ayant le même squelette polypetidique que Adcetris, et de comparer les résultats à ce dernier. La transglutaminase bactérienne (BTG) a été utilisée pour conjuguer de manière site-spécifique la MMAE aux glutamines aux positions 295 et 297 du cAC10, amenant à des ADCs homogènes de DAR 4, TG-ADC. Des travaux préliminaires ont permis d’établir les conditions optimales de conjugaison avec un procédé en deux étapes. Les tests de cytotoxicité ont révélé des EC50 comparables entre Adcetris et les TG-ADC. Les données d’efficacité in vivo montrent une efficacité équivalente voire légèrement supérieure pour les TG-ADC que Adcetris. L'étude de biodistribution in vivo dans un modèle avec et sans tumeur est réalisé avec un 125-I TG-ADC et est comparé à 125I-Adcetris. Le TG ADC site spécifique montre une meilleure distribution tumorale. Adcetris a une distribution non médiée par la cible, dans le foie et la rate, plus importante. En ligne avec ces résultats, la dose maximale tolérée des TG ADC est significativement plus élevée que Adcetris chez le rat. Ces résultats suggèrent que les ADC homogènes ont une meilleure pharmacocinétique et un meilleur index thérapeutique comparés aux ADC avec des DAR hétérogènes. / Most ADC that are currently in clinical use or development produced by chemical conjugation of a toxin via either lysine or cysteine residues, inevitably leading to heterogeneous products with variable drug-to-antibody ratios (DARs). Here, we describe the in vitro and in vivo characterization of novel ADCs that are based on the anti-CD30 antibody cAC10, which has the same polypeptide backbone as Adcetris, and compare the results with the latter. Bacterial transglutaminase (BTG) was exploited to site-specifically conjugate derivatives of MMAE to the glutamines at position 295 and 297 of cAC10, yielding homogeneous ADCs with a DAR of 4, TG-ADC. Preliminary works have led to define optimal conditions for conjugation, but also define a two step process. In vitro cell toxicity experiments revealed comparable EC50-values for Adcetris and TG-ADC. The efficacy data have shown slightly better efficacy for TG-ADC compared to Adcetris. Quantitative time-dependent in vivo biodistribution studies in normal and xenografted mice were performed with a selected 125I TG ADC and compared with 125I-Adcetris. Adcetris has an higher liver and spleen unspecific uptakes. In line with these results, the maximum tolerated dose of the BTG-coupled ADC (> 60 mg/kg) was significantly higher than that of ADCETRIS® (18 mg/kg) in rats. These results suggest that homogenous ADCs display improved pharmacokinetics and better therapeutic indexes compared to chemically modified ADCs with variable DARs.