Das Ubiquitin Proteasom System generiert die Mehrheit der antigenen Peptide, die zusammen mit MHC Klasse I Molekülen präsentiert werden, wobei durch Kooperation mit alternativen proteolytischen Systemen die Vielfalt der möglichen MHC I Liganden erhöht wird. In diesem Zusammenhang, insbesondere im Rahmen einer Immunantwort, ist die Rolle von Aminopeptidasen bislang nur ungenügend charakterisiert. In der vorliegenden Arbeit wurde der modulatorische Einfluss von zytosolischen und im ER lokalisierten Aminopeptidasen auf die Generierung des HCMV pp65495-503 Epitops durch Prozessierung von proteasomal generierten Peptidprodukten untersucht. Dafür wurde in pp65 exprimierenden Zellen die Expression einzelner Aminopeptidasen mittels siRNA inhibiert und der Effekt auf die Epitoppräsentation über die Aktivierung pp65495-503 spezifischer CTL bestimmt. Es zeigte sich, dass TPPII, LAP, AP-B und POP limitierend auf die Epitoppräsentation wirken. Damit wurden die Peptidasen AP-B und POP erstmalig in direkten Zusammenhang mit der MHC Klasse I Antigenprozessierung gebracht. Analysen weiterer zytosolischer Peptidasen wie TOP, BH und PSA zeigten keinen signifikanten Effekt auf die Epitoppräsentation, so dass diese Peptidasen an der zellulären Prozessierung des pp65 Antigens nicht beteiligt sind. Die Trimmaktivität von ERAPI und ERAPII im ER hingegen hatte einen bedeutenden Anteil an der pp65495-503 Epitopgenerierung. In Immunpräzipitationsexperimenten konnte zudem die Interaktion der ER Aminopeptidasen mit dem peptide-loading complex zum ersten Mal nachgewiesen werden. Die vorliegenden Daten geben Hinweise darauf, dass die Interaktion von ERAPI und ERAPII mit dem Komplex unabhängig von dessen vollständiger Assemblierung mit dem TAP Transporter stattfinden kann und vermutlich über Tapasin vermittelt wird. Da diese Assoziation durch IFNgamma induziert wird, könnte sie zu einer effizienteren Antigenprozessierung und -Präsentation, vor allem unter Infektionsbedingungen, beitragen. / The ubiquitin proteasome system is responsible for the generation of the majority of MHC class I presented antigenic peptides. By cooperation with alternative proteolytic systems the diversity of MHC class I ligands is increased. In this context, especially during immune response, the role of aminopeptidases is barely characterised. In this project the effect of cytosolic and ER-resident aminopeptidases on processing of proteasomal generated peptides was investigated with regard to HCMV pp65495-503 epitope generation. Therefore, expression level of single aminopeptidases was down regulated by siRNA in pp65 expressing cells and the effect of down regulation on epitope presentation was analysed by activation of pp65495-503 specific CTLs. It could be demonstrated that TPPII, LAP, AP-B and POP have negative effects on pp65 epitope presentation. With AP-B and POP two additional cytosolic aminopeptidases with a functional role in epitope processing were identified. Other aminopeptidases, that have been characterised as part of the antigen processing machinery, namely TOP, BH and PSA, did not affect pp65 epitope generation. In contrast, trimming by ERAPI and ERAPII in the ER resulted in an efficient epitope presentation. For the first time, experimental evidence was provided that the two ER-resident peptidases interact with the MHC class I peptide-loading complex (PLC). The obtained results indicate that this association takes place independently of the assembly of the entire complex including TAP and is probably mediated by tapasin. The observation that this complex formation is inducible by IFNgamma suggests that the association of ERAPI and ERAPII to the PLC accounts for a better antigen processing and presentation mainly at the site of infection.

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Les lymphocytes T cytotoxiques (CTLs) dirigés contre le VIH jouent un rôle essentiel dans la défense anti-virale. L’identification des facteurs impliqués dans la variabilité de ces réponses est indispensable à la mise au point de vaccins efficaces.Nous avons focalisé notre travail sur deux facteurs potentiellement impliqués dans la reconnaissance du virus par le HLA : le sous-type viral et la qualité de l’apprêtement antigénique. L’extrême variabilité du virus avec à ce jour 11 sous-types et 48 formes recombinantes (CRFs) circulant au sein de populations au typage HLA hétérogène implique un polymorphisme important avec des mutations d’échappement multiples.Nos résultats montrent que dans la population Vietnamienne infectée par le VIH, le CRF01_AE prédomine largement et que l’affinité pour la molécule HLA des épitopes CTL classiquement décrits dans les sous-types B est drastiquement diminuée, ce qui favorise l’échappement de ce sous-type viral au système immunitaire.Par ailleurs, nous avons montré que l’apprêtement des épitopes CTL dépend du type de cellule impliquée, les monocytes se caractérisant par une capacité de présentation significativement plus forte à l’origine d’une réponse CTL plus efficiente comparativement aux lymphocytes T CD4 . Des tests de dégradation in vitro ont démontré que la stabilité intracellulaire des épitopes est hautement variable, dépendante de la séquence en acides aminés et contribue à l’optimisation de la réponse CTL.L’ensemble de ces résultats indiquent que, au delà de l’affinité pour le HLA ou le TCR et des facteurs d’épuisement cellulaire, la réponse CTL peut aussi être modulée par le sous-type viral et l’apprêtement antigénique. / HIV-specific cytotoxic T lymphocytes (CTLs) play a critical role for clearance of virus-infected cells and induction of these cells is a necessary component of any successful vaccine strategy against AIDS. Therefore, identification of the factors defining and modulating the efficiency of these protective responses are urgently needed. We focused our study on two factors potentially involved in HLA recognition: HIV-1 sub-type and antigen processing.The extreme variability of the virus with to date 11 HIV-1 subtypes and 48 circulant recombinant forms (CRFs) circulating worlwide among heterogeneous populations imply high polymorphism and different mutational escape patterns.We demonstrate that among the HIV-1 infected Vietnamese population where the CRF01_AE is largely predominant, the HLA binding of known CTL epitopes is strongly reduced compared to the subtype B due to intraepitopic mutations, facilitating immune evasion of these viral strains.Moreover, we show that the presentation of adequate amounts of epitopes leading to CTL recognition depends on the subset cells involved in the antigen processing, monocytes having a significantly higher and more efficient proteolytic activity. Using in vitro degradation assays, we measured the intracellular HIV-1 epitope stability and demonstrated that this factor is highly variable, sequence dependent and also contributes to a more efficient presentation.Together, these data indicate that, besides HLA and TCR binding and exhaustion factors, HIV-1 CTL recognition can also be modulated by the viral sub-type and the antigen processing machinery.

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La présentation antigénique par le complexe majeur d’histocompatibilité (MHC) I est un processus ubiquitaire permettant la présentation de protéines endogènes qui reflètent l'état de la cellule à la surface cellulaire aux lymphocytes T CD8+ dans le contexte de la surveillance et la réponse immunitaires. Ainsi, l'expression des molécules du MHC I classiques est induite en réponse aux stimuli inflammatoires afin de favoriser la reconnaissance immunitaire et l'élimination des pathogènes. HFE est une molécule du MHC Ib non-classique qui sert de régulateur négatif de l'absorption du fer. HFE est associé au développement de l'hémochromatose héréditaire (HH), maladie associée au métabolisme du fer mais souvent accompagnée de défauts immunitaires. Ainsi, nous avons en premier lieu étudié l'impact de HFE sur la présentation antigénique par MHC I, afin d'expliquer en partie les défauts immunitaires liés à l'HH associée à HFEC282Y. Puis, compte tenu de l'impact de l'inflammation sur l'expression des molécules du MHC I classiques, nous avons étudié la régulation de l'expression de HFE en réponse aux stimuli inflammatoires induits par les cellules du sang périphérique mononucléées (PBMC). Nous avons mis au point un système d’expression antigénique dans lequel nous contrôlons l’expression de MHC I, de HFE et d’un antigène pour lequel nous avons généré des lymphocytes T CD8+ spécifiques. Nos résultats démontrent que la forme sauvage de HFE (HFEWT), contrairement à sa forme mutée (HFEC282Y), inhibe la reconnaissance de complexes MHC I/peptide (pMHC). Nous avons également démontré que l'inhibition de la reconnaissance est maintenue, indépendamment des niveaux d'expression de MHC I à la surface, d'une compétition pour la β2-microglobuline, de la capacité de HFE d'interagir avec le récepteur de la transferrine, de l'origine de l'antigène ou de l'affinité de celui-ci. Par ailleurs, nous avons identifié les domaines α1-2 de HFEWT comme étant responsables de l'inhibition de la reconnaissance antigénique. Par contre, la reconnaissance de peptides chargés de manière externe sur les molécules du MHC I présentes à la surface n'a démontré aucune inhibition en présence de HFEWT, suggérant que HFEWT pourrait affecter la reconnaissance en interférant avec le processus d'apprêtement antigénique intracellulaire. À l’inverse, nous avons souhaité déterminer si les lymphocytes T activés pouvaient influencer les niveaux d'expression de HFE. En termes de régulation de l'expression de HFE, nous avons établi que HFE est exprimé dans les tissus sains chez l'humain et induit chez les lignées de cancers du colon, du sein, du poumon, du rein et du mélanome. Par ailleurs, en co-cultivant des lymphocytes T activés avec ces lignées tumorales, nous avons démontré que l'expression de HFE est fortement inhibée dans toutes ces lignées tumorales lorsqu'exposées à des lymphocytes T activés. Finalement, la modulation de l'expression de HFE est indépendante du contact cellulaire et semble médiée en partie par le GM-CSF, l'IFN-γ et le TNF. En somme, ces résultats suggèrent que les lymphocytes T de l'hôte modulent l'expression de HFE dans le microenvironnement inflammatoire, ce qui pourrait promouvoir la reconnaissance des antigènes présentés sur les molécules du MHC I présentées aux lymphocytes T CD8+ antigène-spécifiques. De plus, ces études soulèvent la possibilité d'un nouveau rôle physiologique de HFEWT dans la voie de présentation antigénique par MHC I, qui pourrait moduler l'immunogénicité des antigènes et la réponse immunitaire cellulaire chez l'hôte. / MHC class I antigen presentation is an ubiquitous process by which cells present endogenous proteins to CD8+ T lymphocytes during immune surveillance and response. Accordingly, classical MHC I molecules are up-regulated in response to inflammatory stimuli to favor immune recognition and pathogen clearance. HFE is a non-classical, MHC Ib molecule which acts as a negative regulator of iron absorption. HFE has been linked to the development of hereditary hemochromatosis (HH), an iron overload disease often associated to immune defects. Firstly, we studied the impact of HFE expression on MHC I antigen presentation, as a hypothesis for HH-associated immunological defects observed in HFEC282Y-mutated HH patients. Secondly, we evaluated whether, like its classical MHC I counterparts, HFE expression could be modulated in response to peripheral blood mononuclear cell (PBMC) inflammation. We developed an antigen presentation system in which we control MHC I expression, HFE expression, and expression of a model antigen for which we have generated antigen-specific CD8+ T lymphocytes. Our results demonstrate that wild-type HFE (HFEWT), but not C282Y-mutated HFE (HFEC282Y), inhibits recognition of MHC I antigens. We further demonstrate that inhibition of antigen recognition is maintained regardless of MHC I surface levels, β2-microglobulin competition, HFE ability to interact with transferrin receptor, antigen origin, or epitope affinity. We identified the α1-2 domains of HFEWT as being responsible for inhibiting antigen recognition. However, recognition of externally peptide-pulsed 293-A2 remained uninhibited in presence of HFEWT, indicating that HFE may affect T cell recognition by interfering with intracellular antigen processing. We also questioned whether activated T lymphocytes may influence HFE expression. We established that HFE is widely expressed in healthy human tissues and induced in colon cancer, breast cancer, lung cancer, kidney cancer and melanoma cell lines. Furthermore, HFE mRNA expression was drastically inhibited in all tumor cell lines when exposed to activated T lymphocytes. Down-regulation of HFE mRNA expression was independent of cell contact and appears to be partially mediated by GM-CSF, IFN-γ, and TNF. Overall, these data suggest that host T lymphocytes may alter HFE expression levels in the inflammatory microenvironment, which could, in turn, promote recognition of MHC I antigens presented to antigen-specific CD8+ T lymphocytes. Accordingly, this could suggest a new physiological role for HFEWT in the MHC I antigen presentation pathway, which could modulate antigen immunogenicity and the cellular immune response.

Das Ubiquitin-Proteasom-System gewährleistet in eukaryontischen Zellen den regulierten Abbau der meisten intrazellulären Proteine und ist mit der Generierung von T-Zell-Epitopen grundlegend an der Immunantwort beteiligt. Wegen der Komplexität des Systems stand ein in vitro Verfahren zur 26S proteasomalen Prozessierung eines ubiquitinierten Modellsubstrates erstmals im Jahr 2000 zur Verfügung. In der vorliegenden Arbeit gelang es, diese von Thrower et al. publizierte Methode hinsichtlich einer größeren Proteinquantität zu optimieren und auf die in vitro Ubiquitinierung und Degradation von Proteinen anzuwenden, deren proteasomaler Abbau unter dem Aspekt der Epitopgenerierung immunologisch von besonderer Relevanz ist. Die biochemische und massenspektrometrische Analyse der 26S proteasomalen Degradation von penta-ubiquitinierten Derivaten des tumorassoziierten Glykoproteins Mucin1 zeigte erstens, dass die Prozessierung der Substrate zu einem 26S proteasomalen gating-Effekt führt, der von Substratbindung und -deubiquitinierung sowie von ATP-Hydrolyse abhängig ist. Zweitens ließ sich als Folge der Substratprozessierung eine Instabilisierung des 26S Proteasoms beobachten, die auf einen Assoziations-Dissoziations-Zyklus hindeutet. Drittens ergab die Untersuchung zum Einfluss des Proteasom-Aktivators PA28 auf den Abbau eines Mucin1-Polyepitops, dass PA28 eine erhöhte Quantität an 26S proteasomal generiertem Epitop verursacht. Viertens war unter Zuhilfenahme des Inhibitors clasto-Lactacystin und anhand der ubiquitinierten Mucin1-Derivate erstmals für ubiquitinierte Substrate nachweisbar, dass die proteasomale katalytische Untereinheit beta5 für die Proteindegradation durch den 26S-Komplex nicht essentiell ist. Das in der vorliegenden Arbeit etablierte Abbausystem hat zudem sein Potential unter Beweis gestellt, als ein in vivo-nahes in vitro Testsystem zu fungieren, um die Wirksamkeit von Proteasom-Inhibitoren sowie die Prozessierbarkeit von Polyepitop-Vakzinen zu bewerten. / The ubiquitin-proteasome pathway plays a major role in cellular protein degradation. By generating T-cell epitopes it contributes essentially to the immune response. The complexity of the system impeded the establishment of an in vitro approach that would make a detailed analysis of the protein degradation by the 26S proteasome possible. Finally, in 2000 Thrower et al. published an in vitro method enabling the synthesis and degradation of an ubiquitinated model substrate by the 26S proteasome. In the study presented here the approach of Thrower et al. was improved by scaling up and by the synthesis of substrates the degradation of which by the 26S proteasome is of great importance immunologically, mainly in regard to the generation of T-cell epitopes. In vitro synthesised penta-ubiquitinated versions of the tumor-associated glycoprotein mucin1 were processed by purified 26S proteasomes. The analysis of substrate degradation and product generation by biochemistry and mass spectrometry showed firstly, that substrate processing initiated a 26S proteasomal gating effect which depends on substrate binding to the proteasome, deubiquitination and proteasomal ATP-hydrolysis. Secondly, a disassembly of the 26S proteasome was observed following substrate processing which suggests a regulated association-dissociation cycle of the proteasome. Thirdly, supplementation of the degradation approach with the proteasome activator PA28 led to a higher quantity of epitope generated by the 26S proteasome out of a mucin1 polyepitope string. Fourthly, use of the proteasome inhibitor clasto-Lactacystin revealed, for the first time, that the catalytic proteasome subunit beta5 is not essential for the degradation of ubiquitinated protein substrates by the 26S proteasome. In addition, the in vitro approach established in the presented study has shown its potential to function as an in vivo-like system which helps to assess proteasome inhibitors and potential polyepitope vaccines.

Der Großteil MHC Klasse I restringierter Epitope wird bei der Proteindegradation durch das Ubiquitin Proteasom System (UPS) generiert. In der vorliegenden Arbeit wurde die Rolle des UPS in der Antigenpräsenation in einer Coxsackievirus B3 (CVB3) induzierten akuten und chronischen Myokarditis untersucht. Für in vitro Degradationsexperimente mit isolierten 20S Proteasomen wurden CVB3 Polypeptide synthetisiert und die Degradationsprodukte massenspektrometrisch analysiert. Eine erhöhte Substratumsatzrate und eine Verschiebung von Schnittpräferenzen durch Immunoproteasomen oder unter dem Einfluss von PA28 führten zu einer verbesserten Generierung immunrelevanter CVB3 Fragmente. Inflammatorische Kardiomyopathien können in Mäusen durch eine CVB3 Infektion ausgelöst werden. Resistente Stämme (C57BL/6) eliminieren das Virus vollständig, in anfälligen Mäusen (A.BY/SnJ) erfolgt keine vollständige Elimination. In Herzen gesunder Mäuse werden vorwiegend konstitutive 20S Proteasomen exprimiert. Eine myokardiale Entzündung, ausgelöst durch eine CVB3 Infektion, führte in den Herzen beider Mausstämme zu der Bildung von Immunoproteasomen, was zu einer gesteigerten Generierung immunrelevanter CVB3 Fragmente führte. Die größte Menge immunrelevanter Fragmente wurden durch Proteasomen gebildet, die am Tag vier aus den Herzen akut erkrankender C57BL/6 Mäuse und am Tag acht aus chronisch erkrankenden A.BY/SnJ Mäusen isoliert wurden. Dies korrelierte mit der Inkorporation von Immunountereinheiten in de novo assemblierende Proteasomen und einer unterschiedlichen Interferon (IFN) Typ I Kinetik. In Geweben lymphatischen Ursprungs hingegen waren Zusammensetzung und proteolytische Aktivität der Proteasomen im Verlauf der Infektion in beiden Mausstämmen unverändert. Die vorliegende Arbeit unterstreicht die Bedeutung einer zeitlich optimalen IFN Sekretion an der Infektionsstelle, die zu der Anpassung des UPS an die inflammatorischen Bedingungen führt. / The recognition of viral antigens bound to major histocompatibility complex (MHC) class I molecules by CD8+ T cells is crucial for virus elimination. Most MHC class I restricted antigenic peptides are produced by the Ubiquitin Proteasome System (UPS). In the present study, the impact of the UPS in antigen presentation during Coxsackievirus B3 (CVB3) induced acute and chronic myocarditis has been investigated. To examine whether the proteasome is involved in the generation of MHC class I ligands derived from the CVB3 polyprotein, polypeptides were synthesized for in vitro processing by 20S proteasomes. Mass spectrometry analysis demonstrated an enhanced generation of immunorelevant CVB3 fragments due to an increased substrate degradation rate and altered cleavage site preferences by immunoproteasomes or in the presence of PA28. Murine models of CVB3 induced myocarditis mimic human disease pattern with diverse outcomes. Permissive mice (A.BY/SnJ) develop chronic myocarditis with cardiac CVB3 persistence whereas resistant mice (C57BL/6) recover and eliminate the virus after acute infection. Constitutive 20S proteasomes are mainly expressed in hearts of healthy mice. Myocardial inflammation, caused by a CVB3 infection, resulted in immunoproteasome formation in hearts of both, resistant C57BL/6 and susceptible A.BY/SnJ mice, and was correlated with enhanced generation of immunorelevant CVB3 peptides. In concurrence with distinctive type I interferon kinetics, immunoproteasome formation and improved epitope generation peaked on day 4 post infection in resistant mice, and was delayed in susceptible mice. No alterations were observed in assembly and proteolytic activity of 20S proteasomes in lymphatic tissues during CVB3 infection, independent from mouse strain. The results emphasise the impact of a rapid adjustment of the UPS to viral infection due to early secretion of type I interferon at site of infection.

Das Immunsystems muss gesunde Zellen von infizierten und Krebszellen unterscheiden können, um letztere selektiv zu bekämpfen. Dies ist die Aufgabe der CTL-Zellen, die dazu auf der Zelloberfläche präsentierte Peptide die aus intrazellulären Proteinen der jeweiligen Zelle stammen untersuchen. Diese präsentierten Peptide (Epitope) werden durch den MHC-I Antigenpräsentationsweg hergestellt. Das Ziel dieser Arbeit ist es Methoden zu entwickeln die Epitope aus der großen Zahl prinzipiell in Proteinen enthaltener Peptide heraussuchen können. Dazu wird die Selektivität dreier wichtiger Komponenten des Präsentationsweges untersucht: Die Herstellung der Peptide durch das Proteasom, der Transport in das ER durch TAP, und das Binden von Peptiden an leere MHC-I Moleküle. Zur sequenzbasierten Vorhersage der Bindung von Peptiden an MHC-I Moleküle wurde ein neuer Algorithmus entwickelt. Dieser kombiniert eine Matrix, welche die individuellen Beiträge einzelner Reste zur Bindung beschreibt, mit Paarkoeffizienten, die Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Positionen im Peptid beschreiben. Dieser Ansatz macht bessere Vorhersagen als bisher publizierte Methoden, und quantifiziert erstmals den Einfluss von Wechselwirkungen innerhalb eines Peptids auf die Bindung. Die Verteilung der Werte der Paarkoeffizienten zeigt, dass sich Wechselwirkungen nicht auf benachbarte Aminosäuren beschränken. Im Vergleich zu den Matrixeinträgen sind die Werte der Paarkoeffizienten klein, was erklärt warum Vorhersagen die Wechselwirkungen komplett vernachlässigen trotzdem gut sein können. Erstmals wurde ein Algorithmus zur Vorhersage der TAP-Transportseffizienz von Peptiden beliebiger Länge entwickelt. Das ist deshalb wichtig, da viele MHC-I Epitope als N-terminal verlängerte Prekursoren in das ER transportiert werden. Für die Vorhersage der Transportfähigkeit eines potentiellen Epitopes wird deshalb über die Transporteffiziens des Epitopes selbst und seiner Prekursoren gemittelt. Mit Hilfe dieser Definition von Transportfähigkeit wird gezeigt, dass TAP einen starken selektiven Einfluss auf die Auswahl von MHC-I Epitopen hat. Indem man Peptide die als 'nicht-transportierbar' vorhergesagt werden als mögliche Epitope ausschließt, kann man die ohnehin schon hohe Qualität von MHC-I Bindungsvorhersagen weiter steigern. So eine zweistufige Vorhersage scheitert, wenn man statt des TAP Transports die Vorhersage der Generierbarkeit eines Epitopes durch das Proteasom als Filter verwenden möchte. Dieses schlechte Abschneiden der proteasomalen Schnittvorhersagen wird auf eine mangelhafte experimentelle Datenbasis zurückgeführt, da proteasomale Schnittraten schwieriger zu messen und interpretieren sind als die Affinitätsdaten für TAP und MHC-I. Um die experimentelle Datenbasis in Zukunft verbessern zu können, wurde ein neues experimentelles Protokoll entwickelt und an einer Reihe von Experimenten getestet. Dabei werden zwei Probleme behandelt: (1) Durch die Verwendung von Massenbilanzen werden MS-Signale in quantifizierte Peptidmengen umgerechnet. (2) Durch das erste kinetische Modell des Proteasomes das die Entstehung und den Abbau von Peptiden während eines Verdaus zufrieden stellend beschreiben kann, können aus den Verdaudaten Schnittraten bestimmt werden. / A major task of the immune system is to identify cells that have been infected by a virus or that have mutated, and discriminate them from healthy cells. This duty is assigned to cytotoxic T-lymphocytes (CTL), which scan epitopes presented to them on cell surfaces derived from intracellular proteins through the MHC-I antigen processing pathway. The goal of this work is to provide computational methods that allow to predict which epitopes get presented from the large pool of peptide candidates contained in intracellular proteins. This is achieved by examining the selective influence of three major steps in the pathway: peptide generation by the proteasome, peptide transport into the ER by TAP, and binding of peptides to MHC-I molecules. For peptide binding to MHC-I, a new algorithm is developed that combines a matrix-based method describing the contribution of individual residues to binding with pair coefficients describing pair-wise interactions between positions in a peptide. This approach outperforms several previously published prediction methods, and for the first time quantifies the impact of interactions in a peptide. The distribution of the pair coefficient values shows that interactions are not limited to amino acids in direct contact, but can also play a role over longer distances. Compared to the matrix entries, the pair-coefficients are rather small, explaining why methods completely ignoring interactions can nevertheless make good predictions. Next, a novel algorithm is developed to predict the TAP affinities of peptides of any length. Longer peptides are important because several MHC-I epitopes are generated by N-terminal trimming of precursor peptides transported into the ER by TAP. As the true in vivo precursors of an epitope are not known, a generalized TAP score is established which averages across the scores of all precursors up to a certain length. The ability of this TAP score to discriminate between epitopes and random peptides shows that the influence of TAP is a consistent, strong pressure on the selection of MHC-I epitopes. Using predicted TAP transport efficiencies as a filter prior to the prediction of MHC-I binding affinities, it is possible to further improve the already very high classification accuracy achieved using MHC-I affinity predictions alone. Such a 2-step prediction protocol failed when predictions of C-terminal proteasomal cleavages were combined with MHC-I affinity predictions. This disappointing result is thought to be caused by the lack of a sufficiently large set of quantitative and consistent experimental data on proteasomal cleavage rates, which are more difficult to measure and interpret than the affinity assays used to characterize peptide binding to TAP and MHC-I. Therefore, a new protocol for the evaluation of proteasomal digests is developed, which is applied to a series of experiments. This novel protocol addresses two problems: (1) Using mass-balance equations, a method is developed to quantify peptide amounts from MS-signals. (2) By introducing the first kinetic model of the 20S proteasome capable of providing a satisfactory quantitative description of the whole time course of product formation, cleavage probabilities can be extracted reliably from proteasomal in vitro digests.

Die Studie beinhaltet eine biochemisch-molekularbiologische Analyse des 20S-Proteasoms und seiner Aktivierung durch Proteine der PA28-Familie. Das 20S-Proteasom ist die zentrale Epitop-prozessierende cytosolisch-nukleäre Protease des MHC-Klasse-I-Antigenpräsentationsweges. In Mikroglia, wie auch in anderen Zellen, unterliegt das Proteasom einer Interferon-g-(IFN-g)-vermittelten strukturellen Plastizität, d.h. einer Substitution der Untereinheiten der Aktiven Zentren. Durch diesen Austauschmechanismus werden proteolytische Schnittpräferenzen modifiziert, was für die Hierarchie von cytotoxischen T-Zellantworten von Bedeutung ist. Lipopolysaccharide (LPS) bewirken in Mikroglia ebenfalls Veränderungen der proteasomalen Zusammensetzung des 20S-Komplexes und seines PA700-Aktivators. Dies ist ein Hinweis auf die Rolle des Proteasoms auch bei der Prozessierung von Antigenen des endolysosomalen Antigenpräsentationsweges. Die Modulation der Zusammensetzung des 20S-Proteasoms in Mikroglia durch IFN-g und LPS ist ein weiterer Beleg für die Rolle der Mikroglia bei der zellulären Immunantwort im Zentralnervensystem. Funktionen des Proteasoms in der MHC-Klasse-I-Antigenpräsentation werden durch den Proteasomaktivator PA28 optimiert. Die PA28-Proteinfamilie besteht aus den Proteinen PA28a, PA28b und PA28g. Diese Studie trägt - basierend auf kinetischen Modellierungen, Mutagenese- und Protein-Protein-Interaktionsstudien und Untersuchungen zur MHC-Klasse-I-Antigen-präsentation in PA28-Transfektanten - zur funktionellen Neubewertung dieser drei Proteine bei. Die drei PA28-Proteine sind autonome Aktivatoren des Proteasoms. Heteromere PA28ab-Komplexe verursachen eine stärkere Aktivierung des Proteasoms als die homomeren PA28a-oder PA28b-Komplexe. Das PA28g-Protein ist in vitro ein schwacher Aktivator verschiedener proteasomaler Peptidaseaktivitäten, der dennoch in unserem in vivo-Modell eine verbesserte MHC-Klasse-I-Antigenpräsentation bewirkt. Kinetische Argumente sprechen für Funktionen der PA28a und PA28b-Proteine als Translokasen für Peptidsubstate und -produkte des Proteasoms. Anhand des HBx-Proteins des Hepatitis B-Virus wird die Möglichkeit illustriert, das vorgestellte Modell zur Analyse viraler Faktoren anzuwenden, die mit der Aktivierung des Proteasoms durch PA28 interferieren. / The 20S proteasome is the proteolytic core complex of the main cytoplasmic and nuclear protein degradation system. One of the numerous functions assigned to the 20S proteasome is the generation of antigenic peptides from intracellular proteins. MHC class I surface presentation of antigenic peptides is one key event of the cellular immune response. The presented study was aimed on the biochemical and molecular-biological analysis of the 20S proteasome and its activation by regulatory proteins of the PA28 family. In the brain, microglial cells are the major antigen presenting cells and they respond sensitive to pathologic events. Cultured mouse microglia was used as a model to study the correlation between microglial activation parameters and structural plasticity of the 20S/26S proteasome. In response to interferon-g , constitutive active site subunits were replaced by inducible subunits as described for other cellular systems. These replacements result in altered proteolytic cleavage preferences, indicating that activated microglia adapts its proteasomal subunit composition to the requirements of an optimized MHC class I epitope processing. Since lipopolysaccharide (LPS), a glycolipid of bacterial pathogens, also alters proteasome subunit composition of the 20S proteasome and its activator PA700, a function of microglial proteasome in processing of antigens of the endolysosomal pathway has been postulated. The modulation of the 20S proteasome subunit composition indicates that microglia is part of the cellular immune response in the central nervous system. The proteasome activator PA28 has been reported to optimize MHC class I antigen presentation. The PA28 protein family is composed of three proteins: PA28a, PA28b and PA28b. Based on kinetic modelling approaches, mutagenesis of activator proteins, protein-protein interaction studies and investigation of MHC class I antigen presentation in PA28-transfected cell lines a evaluation of functions of these three proteins has been performed. In vitro investigations revealed that the recombinant PA28 proteins are activators of peptidase activities of the proteasome. Heteromeric PA28ab complexes are stronger activators than homomeric PA28a o PA28b complexes. Recombinant PA28g is a weak activator of several peptidase activities. Nevertheless, in PA28g transfected B8-fibroblasts preliminary results indicate an improved MHC class I presentation. Based on kinetic evidence, a model has been presented indicating that PA28a and PA28b proteins act as peptide translocases, performing the import of substrates or the export of products into the catalytic chamber of the 20S proteasome. Finally, as examplified with the HBx protein of Hepatitis B virus, the opportunity is presented to use an in vitro reconstitution system of proteasomal activation to examine viral proteins interfering with proteasomal activation.

The results of experiments aimed at determining whether cytotoxic T lymphocytes (CTLs) can kill keratinocytes (KCs) expressing endogenously loaded antigen indicated that antigen specific cytotoxic T lymphocytes could recognize and kill keratinocytes expressing ovalbumin (OVA) or SIINFEKL peptide. Exposure of the KCs to interferon-gamma (IFN-γ) enhanced this CTL-mediated KC lysis and increased CTL epitope presentation on the surface of target cells. Expression of HPV 16 E7 protein in KCs affected CTL-mediated lysis. Expression of HPV 16 E7 inhibited IFN-γ-mediated up-regulation of SIINFEKL/H-2Kb complexes on keratinocytes, and also inhibited IFN-γ-mediated up-regulation of IRF-1 expression, and consequent up-regulation of TAP1 transcription. Further, overexpression of IRF-1 partially corrected the HPV 16 E7-mediated inhibition of enhanced susceptibility of KC lysis induced by IFN-γ. Thus, the effects of HPV 16 E7 on CTL-mediated lysis of IFN-γ exposed KCs are likely mediated by inhibition of MHC class I antigen presentation by IFN-γ. These findings may help explain why HPV-infected epithelial cells can escape from immune surveillance mediated by CTLs in vivo and in vitro.