L’apprêtement antigénique par les protéases intracellulaires et la présentation des épitopes sont essentiels pour la reconnaissance des cellules infectées par les lymphocytes CD8+. Ici nous avons montré que certains inhibiteurs de la protéase de la VIH (IPs) modulent l’activité de la protéasome et aminopeptidase impliqué dans l’apprêtement antigénique endogène et l’activité cathepsins importante dans l’apprêtement croisée. Deux IPs agissent directement sur les cathepsins et leurs régulateurs en inhibant les activités kinase, NOX2 et en régulant le pH phagolysosomal. Les IPs ont changé la dégradation des protéines viral et la production des épitopes de façon séquence- et cellule-spécifique, ont altéré la présentation direct et croisée des épitopes, et ont partiellement changé l’auto-peptidome des cellules primaires. La modulation par les drogues de l’apprêtement et la présentation des épitopes peut fournir une approche thérapeutique alternative pour moduler la reconnaissance immunitaire. / Antigen processing by intracellular proteases and peptidases and epitope presentation are critical for recognition of pathogen-infected cells by CD8+ T lymphocytes. Here we show that several HIV protease inhibitors (PIs) prescribed to HIV-infected persons variably modulate proteasome and aminopeptidase activities involved in endogenous antigen presentation and cathepsin activities involved in antigen cross-presentation. Two HIV PIs acted directly on cathepsins and on their regulators by inhibiting kinases, NOX2 and the regulation of phagolysosomal pH, subsequently enhancing cathepsin activities. HIV PIs modified HIV protein degradation and epitope production in a sequence- and cell-dependent manner, altered direct- and cross-presentation and T cell-mediated killing, and partly changed the self-peptidome of primary cells. Drug-induced modulation of antigen processing and peptidome may provide an alternate therapeutic approach to modulate immune recognition.

T cell receptors (TCR) bind to peptides from various sources on MHC (Major Histocompatibility Complex) molecules. A long-standing goal in the field is to understand the mechanisms of MHC-peptide exchange and MHC-TCR interactions. Here, I present work from three uniquely different systems that address the following: HLA-DR1 conformational stability, self-tolerant mechanisms of TCRs isolated from self-reactive TCR transgenic mice, and TCR cross-reactivity mechanisms between LCMV and VV. First, I present a crystal structure of HLA-DR1 in complex with A1L9 peptide, a peptide with two amino acid substitutions from the parental peptide. The singly substituted A1 peptide, which has a pocket 1 alanine substitution, decreases intrinsic half-life between MHC-peptide and increases susceptibility to HLA-DM mediated peptide exchange. This data agrees with previous models of HLA-DM-mediated peptide exchange in which the major determinant is located at the HLA-DR1 pocket 1. However, the L9 substituted peptide, which has a pocket 9 leucine substitution, displays the opposite phenotype: increased intrinsic half-life and decreased HLA-DM susceptibility. The crystal structure presented here shows that HLA-DR1 in complex with a doubly substituted peptide, A1L9, is in the same conformation as HLA-DR1 with the wild-type peptide, demonstrating that pocket 9 residues can rescue pocket 1 residue binding deficiencies and that HLA-DR1 stability is determined by amino acids along the peptide, not only at pocket 1. Next, I present crystal structures of two self-tolerant TCRs in complex with IAb-3K pMHC. To elucidate molecular mechanism for self-reactivity and self-tolerance, the TCRs J809.B5 and 14.C6 are compared to each other and its parental self-reactive TCR, YAe-62.8. In comparison to YAe-62.8, J809.B5 interacts with the same pMHC, but utilizes more peptide specific interactions, a mechanism that may distinguish self-reactive receptors from self-tolerant receptors. Additionally, the crystal structure of 14.C6 TCR, which bears a different CDR3α sequence from J809.B5, demonstrates that CDR3 sequences can modulate interactions of germline encoded CDR1 and CDR2 loops. Together, these results highlight that in addition to CDR3 VDJ recombination, diversity is generated in the mature TCR repertoire by differential chain pairing, either of which can affect the interactions of germline encoded CDR loops. Next, I present a detailed analysis of cross-reactive TCRs between Kb-GP34 and Kb-A11R. The mature LCMV-immune repertoire was analyzed by DNA deep sequencing of TCRβ CDR3 sequences, which led to the identification of new cross-reactive sequence motifs. Cross-reactive sequence motifs varied by each Vβ gene, suggesting a role of CDR1, CDR2, and CDR3 loop interplay in cross-reactivity. Lastly, I present the crystal structures of a GP34/A11R cross-reactive TCR in complex with both Kb-GP34 and Kb-A11R. Analysis of the crystal structures revealed that the two complexes are largely the same, despite differences in peptide sequences. Surprisingly, the TCR to peptide interactions were dominated by three out of eight peptide side-chains. Cross-reactivity between these two complexes is likely due to a large amount of interactions from TCR to MHC compared to interactions of TCR to peptide. We note two unique MHC-peptide interactions that may allow Kb to be an allele prone to cross-reactivity. The first is an interaction at the C-terminus of the A11R peptide which pulls A11R P7 asparagine away from TCR interactions. The second interaction is from an arginine at position 155, which sits at the interface between TCRα and TCRβ , and contributes the most buried surface area in the interaction interface. Because Kb’s arginine 155 is a long side chain that hydrogen bonds with the peptide backbone, and is also at the center of the TCR-peptide interface, GP34 and A11R peptide sequence differences may be occluded from TCR discrimination by Kb presentation. The data presented in this dissertation demonstrate that interactions between MHC-peptide and MHC-TCR act harmoniously and coopertively, whereby proximal interactions are affected by interactions elsewhere. While previous models of HLA-DR/HLA-DM interactions demonstrate the importance of interactions at HLA-DR1 pocket 1, I showed that pocket 9 also contributes to HLA-DR stability and therefore, HLA-DM susceptibility. I also showed that TCR CDR3 loop sequences affect germline CDR1/CDR2 loop interactions and vice versa. Lastly, I showed that allele specific MHC side chain interactions with the bound peptide influence TCR ligand binding and hence, TCR cross-reactivity.

Le contrôle immunitaire des infections virales est effectué, en grande partie, par les lymphocytes T CD8+ cytotoxiques. Pour y parvenir, les lymphocytes T CD8+ doivent être en mesure de reconnaître les cellules infectées et de les éliminer. Cette reconnaissance des cellules infectées s’effectue par l’interaction du récepteur T (TCR) des lymphocytes T CD8+ et des peptides viraux associés au complexe majeur d’histocompatibilité (CMH) de classe I à la surface des cellules hôtes. Cette interaction constitue l’élément déclencheur permettant l’élimination de la cellule infectée. On comprend donc toute l’importance des mécanismes cellulaires menant à la génération des peptides antigéniques à partir des protéines virales produites au cours d’une infection. La vision traditionnelle de cet apprêtement protéique menant à la présentation d’antigènes par les molécules du CMH propose deux voies cataboliques distinctes. En effet, il est largement admis que les antigènes endogènes sont apprêtés par la voie dite ‘‘classique’’ de présentation antigénique par les CMH de classe I. Cette voie implique la dégradation des antigènes intracellulaires par le protéasome dans le cytoplasme, le transport des peptides résultant de cette dégradation à l’intérieur du réticulum endoplasmique, leur chargement sur les molécules du CMH de classe I et finalement le transport des complexes peptide-CMH à la surface de la cellule où ils pourront activer les lymphocytes T CD8+. Dans la seconde voie impliquant des antigènes exogènes, le dogme veut que ceux-ci soient apprêtés par les protéases du compartiment endovacuolaire. Les peptides ainsi générés sont directement chargés sur les molécules de CMH de classe II à l’intérieur de ce compartiment. Par la suite, des mécanismes de recyclage vésiculaire assurent le transport des complexes peptide-CMH de classe II à la surface de la cellule afin de stimuler les lymphocytes T CD4+. Cependant, cette stricte ségrégation des voies d’apprêtement antigénique a été durement éprouvée par la capacité des cellules présentatrices d’antigènes à effectuer l’apprêtement d’antigènes exogènes et permettre leur présentation sur des molécules de CMH de classe I. De plus, l’identification récente de peptides d’origine intracellulaire associés à des molécules de CMH de classe II a clairement indiqué la présence d’interactions entre les deux voies d’apprêtement antigénique permettant de transgresser le dogme préalablement établi. L’objectif du travail présenté ici était de caractériser les voies d’apprêtement antigénique menant à la présentation d’antigènes viraux par les molécules du CMH de classe I lors d’une infection par le virus de l’Herpès simplex de type I (HSV-1). Dans les résultats rapportés ici, nous décrivons une nouvelle voie d’apprêtement antigénique résultant de la formation d’autophagosomes dans les cellules infectées. Cette nouvelle voie permet le transfert d’antigènes viraux vers un compartiment vacuolaire dégradatif dans la phase tardive de l’infection par le virus HSV-1. Cette mise en branle d’une seconde voie d’apprêtement antigénique permet d’augmenter le niveau de présentation de la glycoprotéine B (gB) virale utilisée comme modèle dans cette étude. De plus, nos résultats décrivent la formation d’une nouvelle forme d’autophagosomes dérivés de l’enveloppe nucléaire en réponse à l’infection par le virus HSV-1. Ces nouveaux autophagosomes permettent le transfert d’antigènes viraux vers un compartiment vacuolaire lytique, action également assurée par les autophagosomes dits classiques. Dans la deuxième partie du travail présenté ici, nous utilisons l’infection par le virus HSV-1 et la production de la gB qui en résulte pour étudier le trafic membranaire permettant le transfert de la gB vers un compartiment vacuolaire dégradatif. Nos résultats mettent en valeur l’importance du réticulum endoplasmique, et des compartiments autophagiques qui en dérivent, dans ces mécanismes de transfert antigénique permettant d’amplifier la présentation antigénique de la protéine virale gB sur des CMH de classe I via une voie vacuolaire. L’ensemble de nos résultats démontrent également une étroite collaboration entre la voie classique de présentation antigénique par les CMH de classe I et la voie vacuolaire soulignant, encore une fois, la présence d’interaction entre les deux voies. / Immune control of viral infections is mainly carried out by cytotoxic CD8+ T lymphocytes. To achieve this, CD8+ T lymphocytes must be able to recognize infected cells and eliminate them. This recognition of infected cells occurs by the interaction of the T cell receptor (TCR) of CD8+ T lymphocytes and viral peptides associated with major histocompatibility complex (MHC) class I on the surface of host cells. This interaction is the key element triggering the elimination of infected cells. This emphasizes the major role of cellular mechanisms leading to the generation of antigenic peptides from viral proteins. The traditional view of antigen presentation by MHC molecules proposes two segregated pathways. Indeed, it is widely accepted that endogenous antigens are processed by the ''classical'' MHC class I presentation pathway. This pathway involves the degradation of intracellular antigens by the proteasome complex in the cytoplasm of the cell, the resulting peptides are then translocated in the endoplasmic reticulum where they are loaded on MHC class I molecules, and finally peptide-MHC complex are exported at the cell surface to activate CD8+ T lymphocytes. In contrast, exogenous antigens internalized by endocytosis or phagocytosis are processed by hydrolases in the lytic endovacuolar compartment and the resulting peptides are loaded on MHC class II molecules. Thereafter, vesicle recycling mechanisms transport the peptide-MHC class II complex on the cell surface where they can stimulate CD4+ T lymphocytes. However, the strict segregation of these two pathways has been revisited to account for the ability of antigen presenting cells to present exogenous antigens on MHC class I molecules by a process called cross-presentation. Moreover, the recent finding that intracellular peptides might also be presented by MHC class II molecules clearly emphasized the presence of interactions between these two antigen processing pathways that transgress the previously established dogma. The objective of the work presented here was to characterize the antigen processing pathways leading to antigen MHC class I presentation during herpes simplex type I (HSV-1) infection. In the results reported here, we describe a new antigen processing pathway resulting from the formation of autophagosomes in HSV-1 infected cells. This new pathway allows the transfer of viral antigens in a lytic vacuolar compartment during the late phase of infection. The development and activation of this second pathway of antigen processing leads to an increased MHC class I presentation of the viral glycoprotein B (gB) used as a model in this study. Moreover, our results describe the establishment of a new form of autophagosomes derived from the nuclear envelope in response to HSV-1 infection. This new form of autophagosomes also contributes to viral antigen transfer to lytic vacuolar compartment in parallel to the action of classical autophagy. Our results also show a close collaboration between the classical MHC class I presentation pathway and vacuolar pathway induced by the formation of autophagosomes, still reinforcing the idea that these two pathways interact together to ensure optimal antigens processing during viral infection. In the second part of the work presented here, we use HSV-1 infection and the resulting viral glycoprotein B to study membrane trafficking allowing the transfer of gB to degradative vacuolar compartments. Our results highlight the role of the endoplasmic reticulum in antigen transfer mechanisms that induce an amplified MHC class I presentation of the viral glycoprotein B.

Adenylate cyclase toxin (CyaA) produced by the causative agent of whooping cough Bordetella pertussis, is a key virulence factor important for colonization of the host. CyaA targets preferentially myeloid phagocytes expressing CD11b/CD18 integrin. By elevating cytosolic cAMP in the host cells, CyaA interferes with their phagocytic, chemotactic and oxidative burst capacities. Furthermore, CyaA modulates the secretion of cytokines and the maturation state in LPS-stimulated dendritic cells (DC) by affecting the expression of costimulatory molecules. In this study, we investigated the effects of CyaA on the capacity of murine bone-marrow DC to prime CD4+ and CD8+ T cells in response to ovalbumin epitopes delivered by the CyaA-AC- toxoid, as a model antigen. Further, we examined the possible impact of CyaA on the antigen uptake and processing for MHC class I and II-restricted presentation by DC, as we previously observed a decreased T cell stimulatory capacity of CyaA-treated DC in response to soluble ovalbumin. We found out that the high levels of cAMP generated by CyaA in LPS-stimulated DC account for the decreased presentation of ovalbumin epitopes carried by CyaA-AC- toxoid on MHC class I and II molecules, thereby impairing the CD8+ and CD4+ T cell responses. Whereas CyaA did not influence the...

Immunologische Toleranz ist eine elementare Eigenschaft des Immunsystems, die primär durch die klonale Deletion autoreaktiver T-Zellen im Thymus gewährleistet wird. Neben diesem als zentrale Toleranz bezeichneten Mechanismus, verfügt ein Organismus gleichzeitig über periphere Toleranzmechanismen wie Ignoranz, Anergie und regulatorische T-Zellen. Trotz dieser Kontrollmechanismen können in bestimmten Situationen autoreaktive CD4+ und CD8+ T-Zellen aktiviert werden und meistens zu örtlich und zeitlich begrenzten Autoimmunreaktionen führen. Ursache hierfür kann die hormonelle Regulation oder das gewebespezifische Vorkommen eines Selbsttantigens sein. Am Beispiel von HSP60-kreuzreaktiven CD8+ T-Zellen konnte gezeigt werden, dass der Transfer dieser T-Zellen in Tiere zu einer Entzündung des Dünndarms aber nicht des Dickdarms führt, obwohl das Selbstantigen im letzteren wesentlich stärker exprimiert wird. Die Gewebespezifität der Autoimmunpathologie konnte durch die in den Organen unterschiedliche, proteasomale Antigenprozessierung, erklärt werden. Proteinbiochemische und immunologische Analysen ergaben, dass sich die 20S Proteasomen verschiedener Organe strukturell und funktionell deutlich unterscheiden und somit jedes Gewebe ein individuelles Repertoire von MHC-Klasse I restringierten Peptiden präsentiert. Damit wurde ein weiterer Mechanismus entdeckt, durch den Reaktivität von protektiven und pathologischen CD8+ T-Zellen kontrolliert wird. / Immunological tolerance which is primarily mediated by the clonal deletion of autoreactive T cells in the thymus is a key feature of the immune system. Besides this central tolerance, several mechanisms act also in the periphery including ignorance, anergy and regulatory T cells. Despite all these checkpoints, autoreactive CD4+ and CD8+ T cells may still be activated causing local and time restricted autoimmune-reactions. This may refer primarily to self-antigens which are hormonally regulated or tissue-specifically expressed. Adoptive transfer of crossreactive, hsp60-specific CD8+ T cells into mice induced an local inflammation of the small intestine but not the colon despite elevated expression of hsp60 in the latter organ. The pathology could be explained by the finding that the proteasomal antigen processing varies between different organs. Biochemical and immunological analyses revealed that 20S proteasomes of different organs vary in their structural and functional properties indicating that every tissue displays an individual and distinct repertoire of MHC class I peptides. This represents a new mechanism by which the activity of protective and pathological CD8+ T cell responses may be controlled.

Das Proteasom ist eine ATP- abhängige Protease, die sich aus vielen Untereinheiten zusammensetzt. Es ist für die Generierung der MHC Klasse I- restringierten Peptide verantwortlich, die im Folgenden auf der Zelloberfläche präsentiert werden. Nicht-funktionelle Proteine, die als so genannte defective ribosomal products (DRIP) bezeichnet werden, stellen eine wichtige Quelle für die Generierung von antigenen Peptiden, insbesondere jedoch von viralen Peptiden dar. Generell wird die Lehrmeinung vertreten, dass der Abbau von polyubiquitinierten Proteinen durch das 26S Proteasom zur Generierung von MHC Klasse I- Liganden führt. Allerdings ist weiterhin unklar, ob virale Proteine Ubiquitin- abhängig vom Proteasom abgebaut werden. Demnach sollte im Rahmen dieser Arbeit der Proteasom- abhängige Abbau des mCMV ie pp89 Proteins vor allem hinsichtlich einer Ubiquitinierung untersucht werden. Folglich wurden Konstrukte sowohl für ein rekombinantes pp89 (rek pp89) als auch für ein ODCpp89 Fusionsprotein entworfen. Somit konnten sowohl der in vitro Abbau dieser Proteine als auch die Prozessierung des spezifischen MHC Klasse I H2-Ld Epitops verfolgt werden. Experimente zum Nachweis von Ubiquitin- Protein- Konjugaten wurden in vivo mit stabil transfizierten Mausfibroblasten (B8 Zellen) durchgeführt. Die experimentellen Daten sprechen für einen schnellen in vitro Abbau des rek pp89 durch das 20S Proteasom. Das MHC Klasse I pp89 Epitop bzw. dessen 11mer Precursorpeptid wurden dabei mit hoher Präzision generiert. Spezifische CTL Assays weisen auf die Generierung des korrekten Epitops bzw. des Precursors hin. Nach Verdau des ODCpp89 Fusionsproteins durch 26S Proteasomen in Anwesenheit von Antizym konnten mit diesem Test ebenfalls das 9mer Epitop respektive das 11mer des pp89 nachgewiesen werden. Eine potentielle Ubiquitinierung des pp89 wurde in vivo in Zellkulturen untersucht. Nach Gabe von Proteasomeninhibitoren zu Mausfibroblasten konnte eine starke Akkumulierung von Ubiquitin- Konjugaten beobachtet werden. Allerdings konnte in den verschiedenen Versuchsansätzen kein Nachweis von pp89- Ubiquitin- Konjugaten erbracht werden. Demzufolge ist für die Generierung von viralen Epitopen ein Proteasom- abhängiger, aber Ubiquitin- unabhängiger Abbauweg denkbar. / The proteasome, an ATP-dependent, multisubunit protease, is responsible for the generation of most MHC class I restricted epitopes presented on the cell surface. Non-functional proteins, also known as defectice ribosomal products (DRiP), represent an important source for the generation of antigenic peptides in general and of viral epitopes in particular. It is widely accepted that the degradation of polyubiquitinated proteins by the 26S proteasome is a prerequisite for the generation of MHC class I ligands. However, the ubiquitin dependence for the proteasomal degradation of viral proteins is an issue so far unresolved. Therefore, the aim of this study was to analyze the proteasomal degradation of the mCMV ie pp89 in respect to an anticipated ubiquitinylation. Thus, a recombinant pp89 (recpp89) as well as an ODCpp89 fusion protein were generated. The in vitro processing of these proteins and the generation of a MHC class I H2-Ld epitope by proteasomes was further studied. Murine fibroblast cell lines (B8 cells) were used to analyze any in vivo evidence for potentially existing ubiquitin-protein conjugates. The experiments show that the recpp89 protein is rapidly degraded in vitro by the 20S proteasomes and that the correct MHC class I pp89 epitope or its 11mer precursor are generated with high fidelity. Furthermore, CTL assays, indicating the generation of the specific pp89 epitope or the 11mer precursor, also suggested a 26S proteasome-dependent degradation of the mCMV pp89-ODC fusion protein in the presence of antizyme. Treating cell cultures with proteasome inhibitors resulted in a significant accumulation of ubiquitin-conjugates in vivo. However, higher molecular weight pp89-ubiquitin conjugates were not detectable throughout the entire experimental set-up. Consequently, a proteasome-dependent, but ubiquitin-independent pathway can be postulated for the generation of viral epitopes.

Dendritische Zellen (DCs) und Makrophagen sind spezialisierte antigenpräsentierende Zellen, die eigene und fremde Antigene prozessieren und mittels Haupthistokompatibilitätsmoleküle, humane Leukozytenantige (HLA) im Menschen, T-Zellen präsentieren, um Toleranzen zu induzieren oder T-Zell-vermittelte Immunantworten zu initiieren. Abhängig von ihrer Differenzierung haben sie spezifische Phänotypen und Funktionen undunterschiedliche Interaktionen mit Pathogenen, in dieser Arbeit durch Leishmania donovani (LD) repräsentiert, welche in Phagolysosomen der Makrophagen propagieren. Der Einfluss der Differenzierungszustände und von intrazelluläre Infektionen auf die Antigenprozessierung und -präsentation waren weitgehend undefiniert. Um hier Einblick zu gewinnen, haben wir die HLA-I-präsentierten Selbstpeptidome von menschlichen unreifen und reifen DCs, die aus der MUTZ3-Zelllinie generiert wurden, und LD-infizierte bzw. nicht-infizierte aus der THP1-Zelllinie generierte Makrophagen mittels Flüssigchromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS), sowie die Proteasom-Zusammensetzung per RT-PCR und die HLA-Expression und Aktivierungszustände der Zellen per Durchflusszytometrie analysiert und verglichen. Wir fanden, dass die HLA-I-Selbstpeptidome der Zellen heterogen und individualisiert waren, von Nonapeptiden dominiert wurden und ähnliche HLA-Bindungsaffinitäten und Ankerreste aufwiesen. Sie stammten aus Quellenproteinen aus fast allen subzellulären Lokalisationen und mit unterschiedlichen zellulären Funktionen in ähnlichen Anteilen und schlossen Tumor-assoziierter Antigene (TAAs) ein. Die Persistenz der LD hatte keinen Einfluß auf den Aktivierungszustand der Makrophagen, verursachte aber eine weitgehende Veränderungen des Peptidoms, der HLA-Bindungsaffinitäten und Ankerreste, der Quellproteine einschließlich TAAs und der HLA- und Proteasom-Expression. / Dendritic cells (DCs) and macrophages are specialized antigen presenting cells that process self and foreign antigens and present them to T cells via major histocompatibility complex molecules, human leukocyte antigens (HLA) in humans, for induction of tolerance or initiation of T cell-mediated immune responses. Related to differentiation state, they have specific phenotypes and functions, and varied interactions with pathogens herein exemplified by Leishmania donovani (LD) that parasitize macrophages and propagate within their phagolysosomes. The impact of the differentiation state and intracellular infection on antigen processing and presentation by HLA class I remained undefined. To gain insight, we analyzed and compared the HLA-I self peptidomes of MUTZ3 cell line-derived human immature and mature DCs, and THP1 cell line-derived LD-infected and none-infected macrophages by liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS), as well as proteasome compositions by quantitative RT-PCR, and HLA expression and cell activation states by flow cytometry. We found that the HLA I-presented self-peptidomes of the cells in the different states were heterogeneous and individualized, dominated by nonapeptides with similar HLA binding affinities and anchor residues. They were sampled from source proteins of almost all subcellular locations and from proteins involved in various cellular functions in similar proportion including tumour-associated antigens (TAAs). The persistence of LD within the macrophage, did not affect macrophage activation. However, its impact was observed in self-peptidome heterogeneity, HLA binding affinities, anchor residue preferences, source protein peptide sampling (including TAAs) and HLA and proteasome expression.

Im Kampf gegen eine Virusinfektion spielen CD8+ T Zellen des adaptiven Immunsystems eine besondere Rolle. Sie patroullieren im Körper und entdecken spezifische Virusepitope, welche mittels MHC Klasse I Molekülen auf der Oberfläche infizierter Zellen präsentiert werden. Wird eine virus-infizierte Zelle erkannt, kann diese schnell und effizient eliminiert. Für die Generierung viraler Peptide, welche auf MHC Klasse I Komplexe geladen werden, ist das Ubiquitin-Proteasom-System von essentieller Bedeutung. Kürzlich wurden weitere Funktionen des Immunoproteasoms aufgedeckt wie zum Beispiel der Schutz gegen oxidativen Stress. Innerhalb der vorliegenden Arbeit konnte die Fähigkeit des Immunoproteasoms gegen eine Akkumulation oxidativ geschädigter Proteine zu schützen mit der Generierung von MHC Klasse I Liganden kombiniert und neu interpretiert werden. Es konnte gezeigt werden, dass während einer Virusinfektion in Nicht-Immunzellen die Produktion reaktiver Sauerstoffspezies durch die alternative NADPH Oxidase Nox4 eine bedeutende Rolle spielt. Die Aktivierung von Nox4 resultiert in der Akkumulation oxidativ geschädigter Proteine. Innerhalb von zwei Stunden nach dem Eintreten von Viruspartikeln in die Zellen wurden strukturelle Virusproteine oxidiert und anschließend ubiquityliert. Die gleichzeitige, virus-induzierte Expression von Immunoproteasomen führte zu einem schnellen und effizienten Abbau ubiquitylierter Virusantigene. Infolgedessen konnten immundominante Virusepitope vermehrt freigesetzt werden. Folglich wurde ein soweit unbekannter Mechanismus gefunden, welcher Substrate für das Proteasom zur Generierung von MHC Klasse I Liganden bereitstellt. Zusammenfassend konnte innerhalb dieser Arbeit gezeigt werden, dass das Immunoproteasom den Schutz vor oxidativen Stress mit der Generierung antigener Peptide verbindet, wodurch eine effektive adaptive Immunantwort etabliert werden kann. / An efficient immune control of virus infection is predominantly mediated by CD8+ T cells which patrol through the body and eliminate infected cells. Infected cells are recognized when they present viral antigenic peptides on their surface via MHC class I molecules. To make antigenic peptides available for loading on MHC class I complexes, the ubiquitin proteasome system plays a crucial role. Moreover, the induction of the i-proteasome is known to support the generation of MHC class I ligands. Recently, new functions of the i-proteasome have been discovered. Evidence is increasing that the i-proteasome is involved in the protection of cells against oxidative stress. Within this thesis the characteristic of the i-proteasome to protect cells against the accumulation of oxidant-damaged proteins could be linked to its role in improving the generation of MHC class I ligands. It could be demonstrated that during a virus infection in non-immune cells the production of reactive oxygen species by the alternative NADPH oxidase Nox4 is of critical importance resulting in the accumulation of potentially toxic oxidant-damaged proteins. Indeed, within two hours of infection structural virus proteins were oxidized and subsequently poly-ubiquitylated. The concomitant formation of i-proteasomes led to a rapid and efficient degradation of ubiquitylated virus antigens thereby improving the liberation of immunodominant viral epitopes. In conclusion, a so far unknown mechanism to fuel proteasomal substrates into the MHC class I antigen presentation pathway has been revealed. A new protein pool consisting of exogenously delivered viral proteins provides proteasomal substrates in the very early phase of a virus infection. Within the scope of this thesis the i-proteasome has been shown to link the protection against oxidative stress, initiated directly by pathogen recognition, with the generation of antigenic peptides. Together, an effective adaptive immune response is triggered.

Le contrôle immunitaire des infections virales est effectué, en grande partie, par les lymphocytes T CD8+ cytotoxiques. Pour y parvenir, les lymphocytes T CD8+ doivent être en mesure de reconnaître les cellules infectées et de les éliminer. Cette reconnaissance des cellules infectées s’effectue par l’interaction du récepteur T (TCR) des lymphocytes T CD8+ et des peptides viraux associés au complexe majeur d’histocompatibilité (CMH) de classe I à la surface des cellules hôtes. Cette interaction constitue l’élément déclencheur permettant l’élimination de la cellule infectée. On comprend donc toute l’importance des mécanismes cellulaires menant à la génération des peptides antigéniques à partir des protéines virales produites au cours d’une infection. La vision traditionnelle de cet apprêtement protéique menant à la présentation d’antigènes par les molécules du CMH propose deux voies cataboliques distinctes. En effet, il est largement admis que les antigènes endogènes sont apprêtés par la voie dite ‘‘classique’’ de présentation antigénique par les CMH de classe I. Cette voie implique la dégradation des antigènes intracellulaires par le protéasome dans le cytoplasme, le transport des peptides résultant de cette dégradation à l’intérieur du réticulum endoplasmique, leur chargement sur les molécules du CMH de classe I et finalement le transport des complexes peptide-CMH à la surface de la cellule où ils pourront activer les lymphocytes T CD8+. Dans la seconde voie impliquant des antigènes exogènes, le dogme veut que ceux-ci soient apprêtés par les protéases du compartiment endovacuolaire. Les peptides ainsi générés sont directement chargés sur les molécules de CMH de classe II à l’intérieur de ce compartiment. Par la suite, des mécanismes de recyclage vésiculaire assurent le transport des complexes peptide-CMH de classe II à la surface de la cellule afin de stimuler les lymphocytes T CD4+. Cependant, cette stricte ségrégation des voies d’apprêtement antigénique a été durement éprouvée par la capacité des cellules présentatrices d’antigènes à effectuer l’apprêtement d’antigènes exogènes et permettre leur présentation sur des molécules de CMH de classe I. De plus, l’identification récente de peptides d’origine intracellulaire associés à des molécules de CMH de classe II a clairement indiqué la présence d’interactions entre les deux voies d’apprêtement antigénique permettant de transgresser le dogme préalablement établi. L’objectif du travail présenté ici était de caractériser les voies d’apprêtement antigénique menant à la présentation d’antigènes viraux par les molécules du CMH de classe I lors d’une infection par le virus de l’Herpès simplex de type I (HSV-1). Dans les résultats rapportés ici, nous décrivons une nouvelle voie d’apprêtement antigénique résultant de la formation d’autophagosomes dans les cellules infectées. Cette nouvelle voie permet le transfert d’antigènes viraux vers un compartiment vacuolaire dégradatif dans la phase tardive de l’infection par le virus HSV-1. Cette mise en branle d’une seconde voie d’apprêtement antigénique permet d’augmenter le niveau de présentation de la glycoprotéine B (gB) virale utilisée comme modèle dans cette étude. De plus, nos résultats décrivent la formation d’une nouvelle forme d’autophagosomes dérivés de l’enveloppe nucléaire en réponse à l’infection par le virus HSV-1. Ces nouveaux autophagosomes permettent le transfert d’antigènes viraux vers un compartiment vacuolaire lytique, action également assurée par les autophagosomes dits classiques. Dans la deuxième partie du travail présenté ici, nous utilisons l’infection par le virus HSV-1 et la production de la gB qui en résulte pour étudier le trafic membranaire permettant le transfert de la gB vers un compartiment vacuolaire dégradatif. Nos résultats mettent en valeur l’importance du réticulum endoplasmique, et des compartiments autophagiques qui en dérivent, dans ces mécanismes de transfert antigénique permettant d’amplifier la présentation antigénique de la protéine virale gB sur des CMH de classe I via une voie vacuolaire. L’ensemble de nos résultats démontrent également une étroite collaboration entre la voie classique de présentation antigénique par les CMH de classe I et la voie vacuolaire soulignant, encore une fois, la présence d’interaction entre les deux voies. / Immune control of viral infections is mainly carried out by cytotoxic CD8+ T lymphocytes. To achieve this, CD8+ T lymphocytes must be able to recognize infected cells and eliminate them. This recognition of infected cells occurs by the interaction of the T cell receptor (TCR) of CD8+ T lymphocytes and viral peptides associated with major histocompatibility complex (MHC) class I on the surface of host cells. This interaction is the key element triggering the elimination of infected cells. This emphasizes the major role of cellular mechanisms leading to the generation of antigenic peptides from viral proteins. The traditional view of antigen presentation by MHC molecules proposes two segregated pathways. Indeed, it is widely accepted that endogenous antigens are processed by the ''classical'' MHC class I presentation pathway. This pathway involves the degradation of intracellular antigens by the proteasome complex in the cytoplasm of the cell, the resulting peptides are then translocated in the endoplasmic reticulum where they are loaded on MHC class I molecules, and finally peptide-MHC complex are exported at the cell surface to activate CD8+ T lymphocytes. In contrast, exogenous antigens internalized by endocytosis or phagocytosis are processed by hydrolases in the lytic endovacuolar compartment and the resulting peptides are loaded on MHC class II molecules. Thereafter, vesicle recycling mechanisms transport the peptide-MHC class II complex on the cell surface where they can stimulate CD4+ T lymphocytes. However, the strict segregation of these two pathways has been revisited to account for the ability of antigen presenting cells to present exogenous antigens on MHC class I molecules by a process called cross-presentation. Moreover, the recent finding that intracellular peptides might also be presented by MHC class II molecules clearly emphasized the presence of interactions between these two antigen processing pathways that transgress the previously established dogma. The objective of the work presented here was to characterize the antigen processing pathways leading to antigen MHC class I presentation during herpes simplex type I (HSV-1) infection. In the results reported here, we describe a new antigen processing pathway resulting from the formation of autophagosomes in HSV-1 infected cells. This new pathway allows the transfer of viral antigens in a lytic vacuolar compartment during the late phase of infection. The development and activation of this second pathway of antigen processing leads to an increased MHC class I presentation of the viral glycoprotein B (gB) used as a model in this study. Moreover, our results describe the establishment of a new form of autophagosomes derived from the nuclear envelope in response to HSV-1 infection. This new form of autophagosomes also contributes to viral antigen transfer to lytic vacuolar compartment in parallel to the action of classical autophagy. Our results also show a close collaboration between the classical MHC class I presentation pathway and vacuolar pathway induced by the formation of autophagosomes, still reinforcing the idea that these two pathways interact together to ensure optimal antigens processing during viral infection. In the second part of the work presented here, we use HSV-1 infection and the resulting viral glycoprotein B to study membrane trafficking allowing the transfer of gB to degradative vacuolar compartments. Our results highlight the role of the endoplasmic reticulum in antigen transfer mechanisms that induce an amplified MHC class I presentation of the viral glycoprotein B.

Das Ubiquitin-Proteasom-System ist an der Degradation cytosolischer Proteine und der Generierung von Antigenen beteiligt, die über MHC Klasse I Moleküle CD8+ T Zellen präsentiert werden. Die Antigenprozessierung wird durch Typ I und II Interferone beeinflusst, welche die Formierung des Immunoproteasoms und des Proteasomen-Aktivators PA28 induzieren und so die katalytische Aktivität des Ubiquitin-Proteasom-Systems qualitativ verändern. In der vorliegenden Arbeit wurde im Zellkulturmodell unter dem Einfluss von IFN gamma die zunehmende Inkorporation der Immunountereinheiten in de novo assemblierende 20S Proteasomen und die daraus resultierende Veränderung der proteolytische Aktivität untersucht. Die Inkorporation der Immunountereinheiten wurde mittels 2D Gelelektrophorese und Western Blots von 20S Proteasomen untersucht, die nach unterschiedlicher Stimulationsdauer mit IFN gamma aus HeLa Zellen isoliert wurden. Es konnte gezeigt werden, dass innerhalb der ersten 24h einer IFN gamma Stimulation die strukturelle Heterogenität des zellulären Proteasomenpools zunimmt, indem sowohl intermediäre als auch Immunoproteasomen assemblieren. In der Nativ-PAGE von Lysaten IFN gamma stimulierter Zellen wurde eine Zunahme des 20S Proteasoms als freier Komplex und in Assoziation mit PA28 beobachtet, während die Menge des zum ATP-abhängigen Abbau von polyubiquitinierten Proteinen notwendigen 26S Proteasoms unverändert blieb. Die Stimulation mit IFN gamma hatte eine Steigerung der gesamtproteasomalen Aktivität zur Folge, die unter Inhibition der Interaktion zwischen 20S Proteasom und PA28 verzögert erfolgte. Die katalytischen Eigenschaften isolierter Proteasomen wurden anhand der Generierung eines immunrelevanten Hepatitis C CTL Epitops des viralen Core Proteins in vitro untersucht. Im Verlauf der IFN gamma Stimulation de novo assemblierte Proteasomen wiesen jeweils unterschiedliche Präferenzen für die Generierung des untersuchten CTL Epitops auf. Eine weitere, proteasomen-spezifische Änderung der katalytischen Aktivität bewirkte die Assoziation des Proteasomen-Aktivators. Innerhalb der ersten zwölf Stunden einer IFN gamma Stimulation wurde das Epitop vermehrt mit der Unterstützung des Proteasomen-Aktivators generiert, nach 24 Stunden zunehmend durch freies 20S Proteasom. Die Ergebnisse der vorgestellten Arbeit zeigen, dass Strukturvarianten des Proteasoms zusammen mit PA28 redundant funktionieren und eine hohe proteolytische Plastizität des UPS gewährleisten. / The ubiquitin proteasome system is responsible for the degradation of cytosolic proteins and the processing of MHC class I restricted antigens. The generation of these antigens is influenced by type I and II interferons which induce the expression of immunoproteasomes and the proteasome activator PA28; and thereby impact the quality of peptides processed by the proteasome system. The adoption of the proteasome system to a proinflammatory environment has been investigated in a cell culture model by isolating proteasomes after different stages of IFN gamma stimulation. The composition of isolated proteasomes was analysed by 2D PAGE and western blot approach. The presented work shows that within 24h of IFN gamma stimulation an increasing heterogeneity of the cellular proteasome pool is observed, resulting from the assembly of both intermediate type proteasomes and immunoproteasomes at the early stage of IFN gamma stimulation. It could be shown by native PAGE of HeLa cell lysates that IFN gamma induces increasing amounts of 20S proteasomes and PA28 associated proteasomes without decreasing the amount of 26S proteasomes that are necessary for the ATP dependent degradation of ubiquitinated proteins; and resulting in an enhanced total proteasomal activity in vitro. This increase in activity was delayed when the interaction of 20S proteasomes and PA28 was inhibited. A comparative analysis of the ability of isolated 20S proteasomes to generate a known hepatitis C virus derived CTL epitope in vitro proved that during early IFN gamma stimulation de novo assembled proteasomes exhibited a structure specific preference to generate the HCV CTL epitope either alone or in combination with the proteasome activator PA28. Within the first 12h of IFN gamma stimulation the epitope was generated with higher efficiency by 20S proteasomes in association with PA28, whereas after 24h the impact of PA28 on the proteasome pool was less pronounced. The presented work shows that IFN gamma induces a heterogeneity of 20S proteasomes in the early stage of stimulation, acting in combination with the proteasome activator in a redundant manner; and provides a high proteolytic placticity of the proteasome system.