Das Proteasomsystem ist die Hauptquelle von Peptiden für die MHC Klasse I Antigen-Präsentation. In Vertebraten kann dieses durch die Expression verschiedener Subtypen des 20S Proteasoms moduliert werden. Die häufigsten Subtypen sind konstitutive Proteasomen (c20S) mit den katalytischen Untereinheiten beta1, beta2 und beta5 und Immunoproteasomen (i20S) mit den Immunountereinheiten beta1i, beta2i und beta5i. Die Expression von i20S optimiert in der Regel die MHC Klasse I Antigen-Präsentation, indem die Bildung von Peptiden mit hoher Affinität zu MHC I Molekülen verstärkt wird. Die Bildung von i20S wird momentan durch ein Modell der kooperativen Assemblierung erklärt, das auf der präferentiellen Interaktion zwischen den Immunountereinheiten beruht. In dieser Arbeit wurde die Assemblierung von 20S Proteasomen in beta5i defizienten Mäusen nach Infektion mit Listeria monocytogenes analysiert. In diesem Modell konnte keine präferentielle Interaktion zwischen den Untereinheiten festgestellt werden. Stattdessen zeigen die Ergebnisse, daß die Integration von konstitutiven oder Immunountereinheiten durch direkte Kompetition reguliert wird. Des Weiteren wurde während der Infektion eine beta5i-abhängige Zunahme der zellulären Proteasommenge festgestellt und somit ein neuer Mechanismus zur Regulation des zellulären Proteasomgehaltes entdeckt. Funktionell führt die beta5i-Defizienz zu einer verringerten MHC I Expression auf antigenpräsentierenden Zellen und zu einer verminderten Prozessierung des bakteriellen Antigens LLO296-304. Bei der Analyse der LLO296-304 spezifischen CD8 T Zell Antwort konnte jedoch kein Unterschied zwischen Wildtyp- und beta5i defizienten Mäusen festgestellt werden .Die Kontrolle der Infektion in den beta5i defizienten Mäusen ist jedoch in der Leber verzögert. Dies deutet darauf hin, dass die Erkennung und Elimination infizierter Zellen durch cytotoxische CD8 T Zellen auf Grund der geringeren MHC Klasse I Präsentation bakterieller Antigene behindert wird. / The proteasome-system is the main source of peptides for MHC class I antigen presentation. In vertebrates this system can be modulated by the expression of different subtypes of the 20S proteasome. The most common subtypes are constitutive proteasomes (c20S) with the catalytic subunits beta1, beta2 and beta5 and immunoproteasomes (i20S) with the immunosubunits beta1i, beta2i and beta5i. Expression of i20S generally optimizes MHC class I antigen presentation by increasing the generation of peptides with high affinity to MHC class I molecules. Currently, the formation of i20S is explained by a model of cooperative proteasome assembly, which is based on preferential interactions among the immunosubunits. Here, the assembly of 20S proteasomes was analysed in beta5i deficient mice during an ongoing infection with Listeria monocytogenes. In this model, no preferential interactions among constitutive subunits or immunosubunits could be determined. Instead, the results show that the integration of constitutive subunits or immunosubunits is regulated by direct competition. Further, a beta5i-dependent increase in cellular proteasome quantity was observed following infection. This reveals a novel mechanism for the regulation of cellular proteasome quantity, which is based on the differential expression of beta5i. Functionally, the deficiency in beta5i results in a reduced MHC class I cell surface expression on professional antigen presenting cells and a drastically diminished processing of the bacterial antigen LLO296-304. However, the analyses of LLO296-304 specific CD8 T cells did not reveal differences in the frequencies of these T cells between wild-type and beta5i deficient mice. Still, the control of infection in the liver of beta5i deficient mice was delayed. This phenotype suggests that the recognition and elimination of infected target cells by cytotoxic CD8 T cells is constrained due to the lowered MHC class I presentation of bacterial antigens.

CD1 Moleküle spielen eine wichtige Rolle in der Lipidpräsentation und T-Zell-Aktivierung. CD1d fungiert als Restriktionselement für NKT-Zellen, eine T-Zell-Untergruppe, die nach Erkennung von Glykosphingolipide (GSL), IFN-gamma und IL-4 produziert. NKT Zellen steuern folglich anschliessende Immunantworten. Den meisten infektiösen Mikroorganismen mangelt es jedoch an GSL-Antigenen zur Stimulation von NKT-Zellen. Der Wirtsorganismus hat daher einen Mechanismus entwickelt, der die Aktivierung der NKT-Zellen dennoch gewährleistet. NKT-Zellen erkennen auch endogene GSL, die in dendritischen Zellen (DZ) infolge von Toll-like-Rezeptor (TLR)-Stimulation durch Pathogene produziert werden. Bislang war unklar, wie genau TLR-Aktivierung zur Produktion von Selbst-GSL-Antigenen führt. Ziel dieser Arbeit war es die Verknüpfung der beiden Prozesse aufzudecken. Diese Dissertation zeigt, dass alpha-Galaktosidase A (a-Gal A) als lysosomales Schlüsselenzym für den konstitutiven Abbau von Selbst-GSL-Antigenen in DZ fungiert. NKT-Zellen antworteten auf CD1d-restringierte Antigene, die von DZ, denen a-Gal A-Aktivität fehlte, präsentiert wurden. Ferner expandierten NKT-Zellen nach adoptiven Transfer in a-Gal A-defiziente Mäuse in Abhängigkeit von CD1d-Expression im Wirtsorganismus. Diese Arbeit zeigte auch, wie GSL-Antigene dem Abbau durch a-Gal A entkommen und für die NKT-Zell-Aktivierung bei Infektionen verfügbar werden. Unter normalen Bedingungen wurden die GSL durch a-Gal A abgebaut. TLR-vermittelte Signale führten jedoch zu Inhibierung der a-Gal A-Aktivität in DZ und resultierten somit in einer GSL-Akkumulation in den Lysosomen. Wir identifizierten einen neuen Regulationsmechanismus der NKT-Zell-Aktivierung bei Infektionen, der auf der Induktion von lysosomalen GSL-Antigenen durch TLR-vermittelte Hemmung der a-Gal A-Aktivität beruht. Diese Dissertation beantwortet fundamentale Fragen der NKT-Zell-Biologie und ebnet den Weg dieses System für therapeutische Ansätze zu nutzen. / CD1 molecules are pivotal for lipid presentation to T lymphocytes. Notably, CD1d functions as a restriction element for NKT cells, a T-cell lineage that produces IFN-gamma and IL-4 following recognition of glycosphingolipids (GSL). Consequently, NKT cells exert decisive regulatory functions on downstream immune responses. Most microbes potentially causing infection of the host lack GSL antigens to stimulate NKT cells. However, facing this challenge, the host developed a mechanism to ensure NKT-cell activation. This pathway exploits the property of NKT cells to react with self GSLs produced in dendritic cells (DCs) stimulated by pathogens through Toll-like receptors (TLR). How TLR engagement leads to production of self GSL antigens remains elusive. The aim of this study was to provide a mechanistic link between these two processes. Here, we identified alpha-galactosidase A (a-Gal A) as a key lysosomal enzyme required for constitutive degradation of self GSL antigens in DCs. Accordingly, NKT cells exposed to DCs lacking a-Gal A activity were activated in the context of CD1d-presented antigens. In addition, NKT cells underwent robust expansion upon transfer to a-Gal A-deficient mice that required CD1d expression by the host. This study further addressed the critical question as to how GSL antigens escape degradation by a-Gal A, and thus become available for presentation to NKT cells in infection. Accordingly, we found that TLR signaling targeted a-Gal A activity for negative regulation in DCs. Consequently, GSLs degraded by a-Gal A in steady-state conditions were induced in lysosomes. Based on these findings, we propose a new pathway that warrants the activation of NKT cells in infection by self GSL antigens induced through TLR-mediated inhibition of a-Gal A activity. Overall, this dissertation answers fundamental questions in the NKT field, and paves the way toward exploring this antigen presentation axis for therapeutic use.

Das Proteasomensystem der Zelle ist für die Degradation von Proteinen verantwortlich und spielt eine zentrale Rolle bei der Generierung von Epitopen, die auf MHC-Klasse-I Molekülen den cytotoxischen T-Lymphozyten (CTLs) präsentiert werden. Die Stimulation von Zellen mit Interferon-gamma (IFNgamma) führt zu der Bildung von Immunoproteasomen, die im Vergleich zu den konstitutiven Proteasomen eine verbesserte Generierung vieler MHC-Klasse-I Epitope aufweisen. In gesunden Mäusen werden Immunoproteasomen vorwiegend in den lymphatischen Geweben exprimiert, wohingegen nicht-lymphatische Gewebe hauptsächlich konstitutive Proteasomen enthalten. In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss der Listeria monocytogenes Infektion auf die aus der Leber, der Milz, dem Dünndarm und dem Colon stammenden murinen 20S Proteasomen untersucht. Die Struktur der isolierten 20S Proteasomen wurde mittels zweidimensionaler Gelelektrophorese und Westernblot ermittelt, während die Funktion durch in vitro Prozessierung von drei oligomeren Peptidsubstraten analysiert wurde. Die Prozessierungsprodukte wurden mittels HPLC-ESI-Ionenfalle massenspektrometrisch identifiziert sowie quantifiziert. Die vorliegende Arbeit zeigt zum ersten Mal, dass nach einer Infektion die aus den nicht-lymphatischen Organen und Zellen isolierten 20S Proteasomen eine strukturelle und funktionelle Plastizität aufweisen: Nach der Infektion wurde die Bildung von Immunoproteasomen induziert, was mit der gesteigerten Generierung der immunrelevanten Fragmente korreliert werden konnte. Dies verlief unabhängig von der direkten Präsenz von Listeria monocytogenes in den Organen und wurde ausschließlich durch das Cytokin IFNgamma reguliert. Es konnte außerdem eine Zunahme der posttranslationalen Modifikation von Leberproteasomen mit dem Monosaccharid N-Acetylglucosamin nach der Infektion nachgewiesen werden. Des Weiteren wurde eine detaillierte Analyse der massenspektrometrischen Daten hinsichtlich des Schnittverhaltens der konstitutiven und Immunoproteasomen etabliert. Die Auswertung ergab, dass die Immunoproteasomen nach der Infektion durch schnellere und veränderte Nutzung bestehender Spaltstellen an der verbesserten Epitoppräsentation beteiligt sind. / The proteasome system of the cell is responsible for the degradation of proteins and plays a central role in the generation of epitopes which are presented to cytotoxic T-lymphocytes (CTLs) on MHC-class-I molecules. The stimulation of cells by interferon-gamma (IFNgamma) leads to the formation of immunoproteasomes that show an improved generation of many MHC-class-I epitopes compared to constitutive proteasomes. In healthy mice, immunoproteasomes are mainly expressed in the lymphatic tissues, whereas the non-lymphatic organs predominantly contain constitutive proteasomes. In this project the effect of Listeria monocytogenes infection on murine 20S proteasomes derived from the liver, spleen, small intestine and colon were investigated. The structure of the isolated proteasomes was analyzed by two-dimensional gel electrophoresis and western blots while the function was studied by in vitro processing of three oligomeric peptide substrates. Identification and quantification of the processing products was performed by HPLC-ESI-ion trap mass spectrometry. The project showed for the first time, that after infection 20S proteasomes isolated from non-lymphatic organs as well as from non-lymphatic cells displayed structural and functional plasticity: immunoproteasomes were induced post infection which could be correlated with the enhanced generation of immuno-relevant fragments. This was independent of the direct presence of Listeria monocytogenes in the organs and solely controlled by the cytokine IFNgamma. In addition, an increased posttranslational modification with the monosaccharide N-acetylglucosamine could be detected in liver-derived proteasomes after infection. Furthermore, a detailed analysis of the mass spectrometry data was established according to the cleavage site usage of constitutive and immunoproteasomes. The result was that immunoproteasomes are involved in improved generation of the immuno-relevant fragments by the faster cleavage and the changed usage of existing cleavage sites after infection.