As fosfolipases A2 (PLA2s, E.C. 3.1.1.4) pertencem a uma superfamília de enzimas que realizam a clivagem de fosfolipídios da membrana celular em ácidos graxos e lisofosfolipídios, numa reação dependente de cálcio. As PLA2s apresentam um importante papel em várias funções celulares, incluindo manutenção dos fosfolipídios celulares, geração de prostaglandinas e leucotrienos, tradução de sinais, proliferação celular e contração muscular. O presente trabalho teve como objetivo a caracterização estrutural e funcional de uma fosfolipase A2 ácida tóxica(BmooTX-I) isolada da peçonha da serpente Bothrops moojeni. A BmooTX-I foi purificada por uma combinação de cromatografias em resinas de troca iônica (DEAE-Sephacel), exclusão molecular (Sephadex G-75) e interação hidrofóbica (Phenyl-Sepharose CL-4B). A confirmação do grau de pureza foi realizada através de análise por espectrometria de massa MALDI TOF da BmooTX-I reduzida (monômero, 13.802,66 Da) e não reduzida (dímero, 27.506,38 Da), da focalização isoelétrica (pI 4,2) e de SDS-PAGE. A região N-terminal da enzima apresentou alta homologia com outras PLA2s Asp49 de peçonhas de serpentes. A BmooTX-I apresentou também elevada atividade fosfolipásica e induziu edema moderado in vivo. Além disso, foi capaz de inibir a agregação plaquetária e a coagulação do plasma, induzir a liberação de PGI2 por HUVECs e apresentar efeito citotóxico sobre células tumorais, bactérias e fungos. O tratamento da enzima com o reagente brometo de p-bromofenacila (BPB) neutralizou a atividade enzimática e de inibição da agregação plaquetária. A determinação da miotoxicidade foi realizada através da dosagem dos níveis de CK no plasma de camundongos previamente injetados com a toxina. A análise histopatológica das fibras musculares demonstrou a presença de infiltrado inflamatório e líquido intercelular, ambos confirmados pela análise ultra-estrutural. O presente trabalho deverá contribuir para a elucidação e determinação da composição bioquímica dos venenos animais, já que as fosfolipases A2 ácidas tóxicas possuem mecanismos de ação ainda não totalmente esclarecidos. / Phospholipases A2 (PLA2s, EC 3.1.1.4) belong to a superfamily of enzymes that perform the cleavage of phospholipids of cell membranes in fatty acids and lysophospholipids in a calcium dependent reaction. PLA2s have an important role in several cellular functions, including maintenance of cellular phospholipids, the generation of prostaglandins and leukotrienes, translation signals, cell proliferation and muscle contraction. This study aimed at the structural and functional characterization of an acidic and toxic phospholipase A¬2 (BmooTX-I) isolated from Bothrops moojeni snake venom. BmooTX-I was purified by a combination of chromatographic steps on resins of ion exchange (DEAE Sephacel), molecular exclusion (Sephadex G-75) and hydrophobic interaction (Phenyl Sepharose CL-4B). The confirmation of the purity degree was analyzed by MALDI TOF mass spectrometry of reduced BmooTX-I (monomer, 13,802.66 Da) and not reduced (dimer, 27,506.38 Da), by isoelectric focusing (pI 4.2) and by SDS-PAGE. The N-terminal region of the enzyme showed high homology with other Asp49 PLA2s of snake venoms. BmooTX-I also presented high phospholipase activity and induced moderate edema in vivo. Furthermore, this enzyme was capable of inhibiting platelet aggregation and plasma coagulation, inducing the release of PGI2 by HUVECs, also showing cytotoxic effects on tumor cells, bacteria and fungi. Treatment of the enzyme with the p-bromophenacyl bromide (BPB) neutralized the enzymatic activity and the inhibition of platelet aggregation. The determination of myotoxicity was accomplished through the determination of the CK levels in plasma of mice previously injected with the toxin. The histopathological analysis of muscle fibers showed the presence of inflammatory infiltration and intercellular fluid, both confirmed by ultrastructural analysis. This work contributes to the elucidation and determination of the biochemical composition of animal venoms, since the mechanisms of action of toxic acidic phospholipases A2 are not yet fully understood.

A diversidade genética dos isolados de Chromobacterium sp. foi avaliada por Multilocus sequence analysis com base nas análises dos genes conservados rpoA, lepA, gyrB, fusA e rRNA 16S. A análise do gene rRNA 16S e MLSA agrupou os isolados no gênero Chromobacterium, entretanto, cinco dos isolados estão distantes filogeneticamente das linhagens tipo, C. violaceum e C. subtsugae, sugerindo duas novas espécies. Os extratos brutos, obtidos por soxhlet, dos isolados de Chromobacterium sp., testados em ensaios in vitro em células tumorais humanas, apresentaram atividades antitumorais potenciais e seletivas para determinadas linhagens celulares. Os extratos brutos e frações foram analisados por HPLC-DAD para avaliação da presença ou ausência da violaceína. Além disso, outros metábólitos secundários que não a violaceína podem estar relacionados à atividade antitumoral. / The genetic diversity of strains of Chromobacterium sp was evaluated by Multilocus sequence analysis (MLSA) based on the analysis of conserved genes rpoA, recA, lepA, gyrB, fusA and rRNA 16S. The analysis of 16S ribosomal RNA gene grouped all isolates in the genus Chromobacterium, however, the five isolates are phylogenetically distant of type strain C. violaceum and C. subtsugae, suggesting new species. The crude extracts of the isolates from Chromobacterium sp., obtained by soxlhlet, evaluated in vitro tests on human tumor cells, showed potential and selective antitumor activities for certain cell lines. In addition, other secondary metabolites than violacein may be related with antitumor activity.

O extrato bruto da planta inteira (Peperomia trineura) foi submetido à cromatografia de adsorção em sílica gel, cromatografia em camada delgada preparativa (CCDP) e CLAE semipreparativa, resultando no isolamento de cinco policetídeos inéditos em função do comprimento ou presença da insaturação na cadeia alquílica. A elucidação estrutural destes policetídeos foi realizada com base nas analises espectroscópicas de RMN 1D e 2D, infravermelho e espectrometria de massas de baixa e alta resolução. As frações provenientes do extrato bruto foram testadas frente a duas linhagens de células leucêmicas (K-562 e Nalm 6), apresentando atividades consideráveis. Já os policetídeos tiveram seu potencial antifúngico avaliado frente a duas espécies de fungos fitopatogênicas - Cladosporium cladosporioides e C. sphaerospermum - e apresentaram atividade fraca e média variando de acordo com suas estruturas. / The crude extract of whole plant (Peperomia trineura) was subjected to adsorption chromatography on silica gel, preparative thin-layer chromatography (CCDP) and semi-preparative HPLC, resulting in the isolation of five novel polyketides with variable chain lenght or presence of unsaturation in the alkyl chain. The structural elucidation of these compounds was based on spectroscopic techniques for 1D and 2D NMR, infrared and low and high resolution mass spectrometry. The fractions from the crude extract were tested against the two leukemic cell lines (K-562 and Nalm 6), showing considerable activities. The polyketides were evaluated against the phytopathogenic fungi - Cladosporium cladosporioides and C. sphaerospermum - and displayed low and medium activity.

Os micro-organismos que habitam o interior das plantas (endofíticos ou endófitos) tornaram-se foco de interesse por estarem envolvidos na produção de compostos químicos como enzimas, alcalóides, antibióticos, anticancerígenas e diferentes metabólitos. Os ecossistemas de regiões tropicais tem sido alvo de busca de compostos naturais por causa da riqueza de espécies e nichos ecológicos presentes nestas comunidades. O objetivo deste trabalho o isolamento, identificação e a bioprospecção de fungos endofíticos obtidos de Combretum leprosum e a detecção nos extratos de planta e micro-organismos da presença do composto combretastatin (CA4). Folhas, galhos, frutos e raízes de C. leprosum foram coletados de cinco estados dentro da zona de semiárido brasileiro: Bahia, Piauí, Ceará, Paraíba, Rio Grande do Norte. Partes das amostras foram triturados e submetidos à maceração primeiramente em diclorometano, seguidos de tetrahidrofurano e acetona de acordo com Pettit et al.(1987) para possível extração da CA4. Além disso, para avaliação in vitro da atividade citotóxica e antimicrobiana foram realizadas extrações em acetato de etila, clorofórmio e metanol. Foram detectados a possível presença da CA4 em todos os órgãos das plantas extraídos com tetrahidrofurano e as maiores concentrações foram observadas nas folhas. A atividade antitumoral dos extratos vegetais apresentaram as maiores inibições contra carcinoma (ovário IC50 10µg/mL-1, rim IC50 8,7µg/mL-1 e mama IC50 14,1µg/mL-1) e glioma.IC50 13,5µg/mL-1. A outra parte das amostras (folhas, caules e raízes) foram desinfetadas, fragmentadas e colocadas em meios de cultivo (Martin, BDA, Agar água) por 60 dias, 28°C. Foram isolados 405 fungos endofíticos e 159 apresentaram atividade contra fitopatogênicos, 72% para Rhizoctonia solani e 28% para Pythium aphanidermatum. As vinte e três linhagens que apresentaram as melhores atividades antifitopatogênicas foram submetidas a crescimento em Czapec em cultura estacionaria, por 30 dias, a 28°C, os respectivos metabólitos foram obtidos em múltiplo (3.0 e 11.0) e avaliados a atividade antimicrobiana contra bactérias patogênicas e fungos. Quatro linhagens foram selecionadas, identificadas pelo sequenciamento da região 18S, CFE177 como Fusarium oxysporum, CFE03 como Hypocrea koningii, linhagem CFE108 como Aspesgillus oryzae e CFE391 como Fusarium solani e avaliadas in vitro pelos testes biológicos: atividade antitumoral, antioxidante e antimicobactéria. Os compostos produzidos por A. oryzae CFE108 apresentaram potencial para bioprospecção, e de acordo com as atividade citotóxicas as maiores ações foram contra as linhagens linfoma histiocística (J744), mieloma murino (B16F10) e baixa citotóxidade para carcinoma de bexiga (ECV304) e leucemia eritroblástica humana (k562) na concentração de 1mg/mL-1. Foram isolados dois compostos: SS-XL-32-01 identificado como bis-(2-etilhexil) ftalato (DEHP) e SS-XL-20-1 identificado como fenol, 2.2 metilenobis[6-(1,1-dimetiletil)-4- etil], ambos com atividade anticâncer para células HeLa com percentual de ate 98% e 71%, de morte, respectivamente. Alem disso, a modificação através da reação de metilação do composto SS-XL-32-1 resultou na quebra do anel aromático, formação de 4 subprodutos e perda da atividade, sendo um indicativo do sitio ativo da molécula responsável pela atividade observada. Portanto, fungos endofíticos de 18 plantas do semiárido brasileiro podem ser considerados fonte de bioprospecção para novas moléculas bioativas com atividade antitumoral. / The micro-organisms that reside in the aerial tissues and roots of plants (endophytic or endophyte) became the focus of interest for being involved in the chemical production such as enzymes, alkaloids, antibiotics, anticancer and different metabolites. The ecosystems of tropical region have been targeted search of natural compounds because of the richness of species and ecological niches present in these communities. The aim of this work was the isolation, identification and bioprospection for endophytic fungi from Combretum leprosum and detection in extracts of the plant and micro-organisms for the presence of the combretastatin (CA4). Leaves, stems, fruits and roots of C. leprosum were collected from five states within the semi-arid zone of Brazil: Bahia, Piaui, Ceara, Paraiba, Rio Grande do Norte. Part of the samples were crushed and subjected to maceration in dichloromethane, followed by tetrahydrofuran and acetone according to Pettit et al. (1987) for extracting the possible CA4. Moreover, for in vitro evaluation of the cytotoxic and antimicrobial activity extractions were carried out in ethyl acetate, chloroform and methanol. Were detected the possible presence of CA4 all plant organs extracted with tetrahydrofuran and the highest concentrations were observed on the leaves. The antitumor activity of plant extracts showed the highest inhibition against carcinoma (ovary IC50 10µg/mL-1, kidney IC50 8.7 µg/mL-1 and breast IC50 14.1 µg/mL-1) glioma IC50 and 13.5 mg-/mL-1. The other part of the samples (leaves, stems and roots) were disinfected, fragmented and placed in culture media (Martin, PDA, water agar) for 60 days, 28°C. 405 Endophytic fungi were isolated and 159 showed activity against phytopathogenic, 72% for Rhizoctonia solani and 28% for Pythium aphanidermatum. Twenty-three strains that showed good activities antiphytopathogenic, were grow on medium Czapec in static culture, for 30 days at 28°C, the respective metabolites were obtained in multiples pH (3.0 and 11.0) and evaluated the antimicrobial activity against pathogenic bacteria and fungi. Four strains were selected, identified by sequencing the 18S region, CFE177 as Fusarium oxysporum, CFE03 as Hypocrea koningii, strain CFE108 as Aspesgillus oryzae and CFE391 Fusarium solani, and evaluated by in vitro biological tests: antitumor, antioxidant and antimicobactérium activity. The compounds produced by A. oryzae CFE108 had biological potential and in accordance with the cytotoxic activity, showed the highest activities against lymphoma lines (J744), murine myeloma (B16F10) and low cytotoxicity for carcinoma of the bladder (ECV304) and leukemia erythroblastic human (K562) in 1mg/mL-1 concentration. Two compounds were isolated: SS-XL-32- 01 identified as bis-(2-ethylhexyl)phthalate (DEHP), and SS-XL-20-1 as phenol 2.2methylenobis [6-(1,1-dimethylethyl) - 4-ethyl], both with anticancer activity for HeLa cells with a percentage of up to 98% and 71%, of death, respectively. In addition, modified by methylation reaction of the compound SS-XL-32-1 resulted in the breaking of the aromatic ring and result in formation of four product and loss of activity being indicative of the active site of the molecule can be the aromatic ring. Therefore, endophytic fungi in semiarid Brazil plant can be considered a source of bioprospection for new bioactive molecules with anticancer activity.

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Esta subfração foi submetida ao fracionamento através da Cromatografia Líquida de Alta Eficiência Semipreparativa, isolando o alcaloide indólico F3F6FAGs. A atividade antitumoral e a citotoxicidade do extrato etanólico, frações, subfrações e F3F6FAGS foram avaliadas através do ensaio de viabilidade celular com o MTT (brometo de [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazólio]) em células ACP02, células de hepatoma humano (HepG2) e em linhagem de células normais de rim de macaco verde africano (VERO). Foram consideradas ativas como antitumoral as amostras com concentração inibitória (CI50) menor que 100 μg/mL em células ACP02. Foram consideradas citotóxicas as amostras com concentração citotóxica (CC50) menor que 100 μg/mL em células HepG2 e VERO. O índice de seletividade (IS) foi obtido a partir da razão entre os valores da CC50 e CI50 e foram consideradas seletivas as amostras com IS maior que 2, demonstrando que essa atividade é duas vezes mais seletiva para células tumorais. As amostras mais seletivas foram submetidas à quantificação de morte celular com corantes fluorescentes Hoechst 33342 (HO), Iodeto de Propídeo (PI) e Fluoresceína Diacetato (DAF) em 24 e 72 horas de exposição. Todas as amostras foram ativas ou moderadamente ativas para atividade antitumoral e apresentaram moderada atividade citotóxica ou não foram citotóxicas. A FAGS e F3F6FAGS tiveram menor CI50 (FAGS = 18,29 μg/mL e F3F6FAGS = 12,06 μg/mL), maior CC50 (FAGS-CC50 = 173,3 μg/mL para VERO e 299,45 μg/mL para HepG2 e F3F6FAGS CC50 476 μg/mL para células renais e CC50 503,5 μg/mL para células hepáticas) e foram mais seletivas (F3F6FAGS- IS = 39,4 para VERO e IS = 41,74 para HepG2 e FAGS- IS = 9,5 para VERO e IS = 16,37 para HepG2). A FAGS apresentou maior efeito apoptótico e necrótico em 24 e 48h, com o aumento da taxa de necrose nas maiores concentrações e no maior do tempo de exposição. Para o alcalóide, a apoptose e necrose mostraram-se concentração e tempo- dependentes, com menor índice de necrose. Esses resultados sugerem seletividade de F3F6FAGS para câncer gástrico. Porém, a maior citotoxicidade e a menor seletividade da FAGS, provavelmente, estão relacionadas ao sinergismo de seus alcaloides para apoptose e necrose. / This study evaluated the antitumor activity of G. sericeum in primary gastric adenocarcinoma (ACP02), the selectivity and the mechanism of cell death. The G. sericeum bark powder was submitted to the exhaustive maceration with ethanol, which he resultant solution was concentrated on rotaevaporator until residue. For the fractionation of G. sericeum extract was used the fractionation under reflux and acid-basic partition. The alkaloid fraction (FAGS) obtained from the acid-basic partition was submitted to the open chromatography column (OCC), using Sephadex LH – 20 as stationary fase and the methanol as mobile fase, resulting in the subfracion F6FAGS. This subfracion was submitted to semi-preparative high performance liquid chromatography (HPLC) and the indole alkaloid (F3F6FAGS) was isolated. The cytotoxicity and antitumor activity of the ethanol extract, its fractions and F3F6FAGS were assessed through cell viability assay with MTT ([3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide]) in tumor-cell lines: ACP02, hepatocellular carcinoma (HepG2) and normal VERO cells (African green monkey). The samples with inhibitory concentration (IC50) below 100 μg/mL were considered active for antitumor activity in ACP02. The samples with IC50 ≤ 100 μg/mL were considered cytotoxic for cell lines HepG2 and VERO. The selectivity index (SI) was obtained from the ratio between the CC50 and IC50 values and the samples were considered selective with SI higher than two, indicating that this activity is twice selective for tumor cells. The most selective samples were submitted to quantification of cell death with fluorescent dyes Hoechst 33342 (HO), Propionium Iodide (PI) and Fluorescein Diacetate (FDA) during 24 and 72 hours of exposure. All samples were active or moderately active for antitumor activity and exhibited moderate cytotoxic activity or were not cytotoxic. The FAGS and indole alkaloid had lower IC50 (FAGS = 18, 29 μg/mL e F3F6FAGS = 12, 06 μg/mL) bigger CC50 (FAGS-CC50 = 173, 3 μg/mL for VERO and 299,45 μg/mL for HepG2 and F3F6FAGS CC50 476 μg/mL for renal cells and CC50 503,5 μg/mL for hepatic cells) and were more selective (F3F6FAGS- SI = 39,4 for VERO and SI = 41,74 for HepG2 and FAGS- SI = 9,5 for VERO and SI = 16,37 for HepG2). The FAGS had greater apoptosis and necrosis in 24h and 48h with increased necrosis in the higher concentrations and with the increase of the exposure time. For alkaloid, apoptosis and necrosis were shown concentration and time-dependent, with a lower necrosis rate. These results suggest some selectivity of the F3F6FAGS alkaloid for gastric cancer. However, the bigger cytotoxicity and the lower selectivity of FAGS are probably related to the synergism of its alkaloids for apoptosis and necrosis.

A descoberta de fármacos a partir de produtos isolados de organismos marinhos tem apresentado um grande crescimento nos últimos anos, principalmente devido aos avanços tecnológicos analíticos, síntese química e biotecnologia. Dentre estes, as esponjas representam uma das principais fontes de metabólitos protótipos para diversas atividades, destacando-se os efeitos antitumorais. Neste contexto, este trabalho teve como objetivo a investigação química e biológica de três esponjas coletadas na costa sul-brasileira: Haliclona tubifera, Polymastia janeirensis e Scopalina ruetzleri. Considerando a correlação entre câncer, distúrbios da coagulação e desbalanço de espécies reativas de oxigênio (EROs), foram realizados ensaios visando a aquisição destas atividades e a identificação de substâncias bioativas. Para a esponja H. tubifera foram observados interessantes efeitos antitumorais em células de glioma e neuroblastoma humano (IC50 < 20 μg/ml), além das atividades antioxidante e anticoagulante para a fração acetato de etila. O composto majoritário desta fração foi isolado como um derivado N-Boc e sua configuração foi estabelecida utilizando um novo protocolo de dicroísmo circular e semissíntese de derivados. Assim, este esfingosídeo de cadeia longa isolado (2R,3R,6R,7Z)-2-amino-7-octadecene-1,3,6-triol, foi denominado halisphingosine A. Um novo composto minoritário, halisphingosine B foi obtido usando técnicas de isolamento em escala nanomolar. Sua configuração absoluta foi estabelecida por comparação com o composto A. Da mesma forma, para a esponja S. ruetzleri, a fração acetato de etila demonstrou os resultados mais promissores. Um potencial efeito anticâncer e de inibição dos radicais peroxila foi observado. Além disso, um efeito modulador da peroxidação lipídica foi evidenciado em ensaio ex vivo de dienos conjugados. Através da análise por RMN de 1H, verificou-se que a fração era majoritariamente constituída por ácidos graxos, os quais foram derivatizados para caracterização por Cromatografia Gasosa (GC/FID). Foram identificados 32 ácidos graxos principalmente poli-insaturados (53%). Ácidos graxos minoritários não usuais para o ambiente marinho também foram caracterizados. A esponja P. janeirensis apresentou os efeitos citotóxicos mais promissores em células de glioma e neuroblastoma humano, com um IC50 < 1,0 μg/ml para o extrato aquoso (pH 6,8), sendo este efeito pH-dependente, uma vez que o extrato (pH 5,8) não alterou a viabilidade celular. Para P. janeirensis, foi também investigado seu potencial de defesa química em modelo de Zebrafish. Foi observado que o extrato aquoso desencadeia um efeito de fuga, alterando significativamente o comportamento espaço-temporal de peixes Danio rerio. Analisando em conjunto, os dados do presente trabalho representam uma nova contribuição para o estudo químico e biológico de espécies de esponjas marinhas da costa sul-brasileira e apontam as potencialidades destas esponjas na busca de moléculas protótipos para fármacos, especialmente relacionados à terapia do câncer. / Drug discovery from marine natural products has increased in the past few years, mainly due to technological advances in spectroscopy, chemical synthesis and biotechnology. Among all marine animals, sponges represent one of the major sources of prototype metabolites for several biological activities, highlighting the antitumor effects. In this context, this study carried out chemical and biological investigation of three sponges collected on the South Brazilian coastline: Haliclona tubifera, Polymastia janeirensis and Scopalina ruetzleri. Considering the correlation between cancer, clotting disorders and imbalance of reactive oxygen species (ROS), experiments were conducted for acquisition of these activities and identification of bioactive compounds. H. tubifera showed an interesting cytotoxic effect in human neuroblastoma and glioma cell lines (IC50 <20 μg/ml), antioxidant and anticoagulant effect for ethyl acetate (EtOAc) fraction. The major compound of EtOAc fraction was isolated as an N-Boc derivative and its configuration was established using a new circular dichroism protocol with the production of semi-synthetic derivatives. This long chain sphingoid base (2R,3R,6R,Z)-2-aminooctadec-7-ene-1,3,6-triol was named as halisphingosine A. A new minor compound, halisphingosine B was obtained using nanomol scale techniques and their absolute configuration was established by comparison with compound A. Likewise, for the sponge S. ruetzleri, the EtOAc fraction showed the most promising results. A potential anticancer effect, inhibition of peroxyl radicals and modulation effect of lipid peroxidation was observed. Fingerprint 1H NMR analysis showed that this fraction is mainly constituted of fatty acids. Through Fatty Acid Methyl Ester (FAMEs) analysis by GC/FID, it was possible to identify 32 fatty acids, of which around 50% were Polyunsaturated Fatty Acids (PUFAs). In addition, some minor unusual fatty acids for the marine biosphere were identified. It was observed for P. janeirensis the most promising cytotoxic effects on human glioma and neuroblastoma cells, with an IC50 <1.0 μg/ml to aqueous extract (pH 6.8), being this effect pH-dependent, since the extract (pH 5.8) did not affect the cell viability. Moreover, P. janeirensis was investigated along their potential chemical defense in Zebrafish model. Aqueous extract trigged an escape effect, significantly altering the spatio-temporal swimming activity of animals. Taken together, the data presented from this study represent a new contribution to chemical and biological research of marine sponge species from South Brazilian coastline, and point the potentialities of sponges to search chemical prototypes for drugs, especially related to cancer therapy.

Les chimiothérapies conventionnelles anticancéreuses ont été développées dans le but de traiter le cancer par élimination directe et/ou par inhibition de croissance les cellules tumorales en division. Les cellules endothéliales en prolifération à l’origine de la vascularisation intra-tumorale sont également connues pour être sensibles aux effets cytotoxiques des agents anticancéreux. Depuis, de nombreuses études ont montré que certaines thérapies conventionnelles peuvent être exploitées pour leurs capacités anti-angiogéniques (Browder et al. Cancer Research 2000). La stratégie mise en place consiste à suivre des protocoles où la thérapie est administrée à des doses faibles non myéloablatives et plus fréquemment que les thérapies conventionnelles, appelés dosages métronomiques (Hanahan et al. JCI 2000, Gasparini et al. Lancet Oncology 2001). Le cyclophosphamide (CTX) est un agent alkylant communément utilisé en chimiothérapie dans des protocoles à dosage métronomique. Dans les années 1980, 2 études ont montré que le CTX utilisé à dose métronomique pouvait avoir aussi un rôle sur l’immunité en réduisant la fonction suppressive d’une population de lymphocytes T CD4+ dans un modèle expérimental de tumeur (Awwad et al. Cancer Research 1989) et chez des patients atteints de cancer (Berd et al. Cancer Research 1987). Depuis, les connaissances ont progressé et à présent le CTX métronomique est reconnu pour pouvoir limiter l’expansion et les fonctions des lymphocytes T régulateurs (Treg) (Ghiringhelli et al. EJI 2004, Lutsiak et al. Blood 2005) conduisant à une polarisation des cellules T auxiliaires vers un profil Th1 (Matar et al. Eur J cancer 2000 et Cancer Immunol Immunother 2002). Utilisé en association, le CTX métronomique s’avère donc être un outil intéressant dans le traitement anticancéreux (Hermans et al. Cancer Research 2003, Taieb et al. JI 2006). Nos résultats montrent l’importance des lymphocytes T CD4+ sécréteurs d’IL-17 et d’IFNg dans les effets du CTX. / Conventional cancer chemotherapies were developed to target cancer cells either by directly eliminating them or by inhibiting the growth of dividing tumor cells. Proliferating endothelial cells at the origin of intratumoral vascularization are known to be sensitive to the cytotoxic effects of antineoplastic agents. Many studies have shown that some conventional therapies can be exploited for their anti-angiogenic capabilities (Browder et al. Cancer Research 2000). The adopted strategy, called metronomic chemotherapy, consists of administering low doses of drug that do not induce myelosuppression, on a more frequent schedule as compared to conventional therapies (Hanahan et al. JCI 2000, Gasparini et al. Lancet Oncology 2001). Cyclophosphamide (CTX) is an alkylating agent commonly used as a metronomic chemotherapy. In the 1980s, two studies demonstrated that when used at a metronomic dosing, CTX could impact the immune response particularly in reducing the suppressive function of a CD4+ T lymphocyte population in an experimental tumour model (Awwad et al. Cancer Research 1989) and in cancer patients (Berd et al. Cancer Research 1987). Since then, knowledge has evolved and now CTX used as a metronomic or low-dose therapy is administered to limit expansion and functions of regulatory T cells (Treg) (Ghiringhelli et al. EJI 2004, Lutsiak et al. Blood 2005), leading to a helper T cell polarization toward a Th1 profile (Matar et al. Eur J cancer 2000 et Cancer Immunol Immunother 2002). When used in combination, CTX turns out to be a potent drug in the antineoplastic treatments armamentarium (Hermans et al. Cancer Research 2003, Taieb et al. JI 2006). Our results demonstrate the importance of CTX effects on IL-17 and IFNg secreting CD4+ T lymphocytes.

Células tumorais desenvolvem diversas estratégias para escapar da identificação e eliminação pelo sistema imune. Dessa forma, a investigação dos mecanismos envolvidos na comunicação celular no microambiente tumoral e na desregulação local do sistema imune é crítica para uma melhor compreensão da progressão da doença e para o desenvolvimento de alternativas terapêuticas mais eficazes. Nós aqui demonstramos que SIGIRR/IL-1R8, um importante regulador negativo de receptores de Interleucina-1 (ILRs) e receptores do tipo Toll (TLRs), apresenta expressão aumentada em uma linhagem celular epitelial mamária transformada pela superexpressão do oncogene HER2 e em tumores primários de mama, e promove o crescimento tumoral e metástase através da modulação da inflamação associada ao câncer e da atenuação da resposta imune antitumoral. Observamos que IL-1R8 tem sua expressão correlacionada com HER2 em tecidos mamários e sua alta expressão é fator de pior prognóstico em câncer de mama de baixo grau. Notavelmente, níveis aumentados de IL-1R8 foram observados especialmente nos subtipos HER2+ e Luminais de tumores de mama, e sua expressão aumentada em células epiteliais de mama transformadas por HER2 diminui a ativação da via de NF-&#954;B e a expressão de diferentes citocinas pro-inflamatórias (IL-6, IL-8, TNF, CSF2, CSF3 e IFN-&#946;1). Meio condicionado de células transformadas por HER2, mas não de variantes celulares com o gene IL-1R8 silenciado, induz a polarização de macrófagos para o fenótipo M2 e inibe a ativação de células NK. Em um modelo murino transgênico de tumorigênese espontânea mediada por HER2, MMTV-neu, verificamos que a deficiência de IL-1R8 (IL-1R8-/-neu) retardou o aparecimento de tumores e reduziu a incidência, a carga tumoral e a disseminação metastática. Contudo, não foram observadas diferenças significativas no crescimento tumoral quando animais IL-1R8-/-neu receberam medula óssea de animais IL-1R8+/+, confirmando um papel importante da expressão de IL-1R8 em células não hematopoiéticas na tumorigênese da mama. Tumores IL-1R8+/+neu apresentaram maiores níveis de citocinas pró-inflamatórias como IL-1&#946; e VEGF, e menores níveis da citocina imunomodulatória IFN-&#947;. Além disso, tumores que expressavam IL-1R8 apresentaram menor infiltrado de células NK maduras, células dendríticas (DCs) e linfócitos T-CD8+ e um maior infiltrado de macrófagos M2 e linfócitos T-CD4+. Coletivamente, esses resultados indicam que a expressão de IL-1R8 em tumores de mama pode representar um novo mecanismo de escape da resposta imune e suportam IL-1R8 como potencial alvo terapêutico. / Tumor cells develop numerous strategies to fine-tune inflammation and avoid detection and eradication by the immune system. Identification of new players that regulate the cellular crosstalk within the tumor microenvironment and promote local immune dysregulation is critical to understand disease progression and to improve therapeutic strategies. Here, we demonstrate that SIGIRR/IL-1R8, a negative regulator of IL-1R and TLRs, is up-regulated in a HER2-transformed epithelial mammary cell line and in primary breast tumors and promotes tumor growth and metastasis by modulating cancer-related inflammation and impairing anti-tumor immunity. IL-1R8 expression is correlated with HER2 in mammary tissue, and higher tumor IL-1R8 expression is a poor prognostic factor in lower grade breast tumors. Notably, higher levels of IL-1R8 expression were observed in HER2+ and Luminal breast tumor subtypes and IL-1R8 up-regulation in HER2-transformed mammary epithelial cells inhibited NF-&#954;B activation and the expression of pro-inflammatory cytokines (IL-6, IL-8, TNF&#945;, CSF2, CSF3, IFN-&#946;1). Conditioned medium from HER2-transformed cells, but not from IL-1R8 knockdown variants, induced M2-macrophage polarization and inhibited natural-killer (NK) cell activation. IL-1R8 deficiency in a transgenic mouse model of breast tumorigenesis (MMTV-neu) significantly delayed tumor onset and reduced tumor incidence, burden and metastasis. No significant differences in tumor growth were observed when IL-1R8-/-neu mice were transplanted with bone marrow from IL-1R8+/+ animals, confirming an important role for IL-1R8 expression in non-hematopoietic cells during breast tumorigenesis. IL-1R8+/+neu mammary tumors presented higher levels of pro-inflammatory cytokines such as IL-1&#946; and VEGF, but lower levels of IFN-&#947;. Besides, a lower infiltrate of mature NK cells, dendritic cells (DCs) and CD8+ T cells but higher infiltrate of M2-macrophages and CD4+ T cells were present in IL-1R8 expressing tumors. Collectively, our results support IL-1R8 expression as a novel tumor immune escape mechanism in breast cancer and putative target for immunotherapy.

Submitted by (lucia.rodrigues@ufrpe.br) on 2017-02-15T15:25:59Z No. of bitstreams: 1 Valentina Nascimento e Melo.pdf: 1846879 bytes, checksum: 0f435fbf6eac1935724bc84cb61e7e68 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-02-15T15:25:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Valentina Nascimento e Melo.pdf: 1846879 bytes, checksum: 0f435fbf6eac1935724bc84cb61e7e68 (MD5) Previous issue date: 2015-03-16 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / Two strategies were considered for the synthesis of 2,3-unsaturated O-glucosyl-1,2,3-triazoles. The reaction between tri-O-acetyl-D-glucal and triazole alcohols gave no stereoselectivity. In fact, β-isomer formation was increased. A second strategy furnished 2,3-unsaturated O-glucosides from tri-O-acetyl-D-glucal and alkynols via Ferrier rearrangement; this methodology employing montmorillonite K-10 doped with FeCl3∙6H2O affords new glycosides in good to excellent yields, short time and high α-stereoselectivity in dichloromethane. Subsequently, the glucosides were coupled with 2-azido-1,4-naphthoquinone to give a new series of 1,2,3-1H-triazolyl O-glucoside derivatives based on click reaction. / Duas estratégias foram consideradas para a síntese de 1,2,3-triazóis O-glicosídeos2,3-insaturados. A reação entre o tri-O-acetil-D-glucal e os alcoóis triazólicos não mostrou seletividade. De fato, a formação do isômero β foi aumentada. Uma segunda estratégia forneceu O-glicosídeos 2,3-insaturados a partir do tri-O-acetil-D-glucal e alquinóis via rearranjo de Ferrier; esta metodologia formou novos glicosídeos, empregando montmorilonite K-10 dopado com FeCl3∙6H2O em diclorometano, em rendimentos de bons à excelentes, baixo tempo reacional e alta α-estereosseletividade. Subsequentemente, os glicosídeos foram acoplados com 2-azido-1,4-naftoquinona formando uma nova série de derivados 1,2,3-1H-triazolil O-glicosídeos através da reação Click.

Submitted by Jaqueline Silva (jtas29@gmail.com) on 2014-10-03T21:14:43Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Flávio Silva de Carvalho - 2011.pdf: 2542668 bytes, checksum: 8b150260143e835293c132099b3cbf68 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Jaqueline Silva (jtas29@gmail.com) on 2014-10-03T21:14:50Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Flávio Silva de Carvalho - 2011.pdf: 2542668 bytes, checksum: 8b150260143e835293c132099b3cbf68 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-10-03T21:14:50Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Flávio Silva de Carvalho - 2011.pdf: 2542668 bytes, checksum: 8b150260143e835293c132099b3cbf68 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Previous issue date: 2011-03-02 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / As part of a line of research aimed at the pharmacological and toxicological evaluation of new candidates for antitumor drug prototypes, this work was conducted to evaluate pharmacological and toxicological compounds LQFM030, and LQFM031 LQFL032, drawn from nutlins prototypes. Additionally, we also evaluated whether the compounds LQFM004, LQFM005, and LQFM028 LQFM029 initially envisioned as candidates for prototypes of antipsychotic drugs, drawn from LASSBio579. Initially there was a cytotoxic screening all candidates, using the cytotoxicity test of exclusion of Trypan Blue in K-562 cells. Given this, it was observed that the best IC50 values were obtained with the candidates and LQFM030 LQFM029 (0.55 and 0.56 mM, respectively) and from then on had as starting point for these two molecules to a more detailed and thorough cytotoxicity, where it was observed that the molecule had the best LQFM030 cytotoxic profile in the test of exclusion of Trypan blue and the MTT reduction test, at intervals of 24, 48 and 72, compared with LQFM029 the molecule, using the cell line K-562. Given this, the candidate LQFM030 was the target of other studies conducted to study the survival, safety tests (Capture the Neutral Red dye, Acute Toxicity Oral), cell cycle, cell death mechanism of apoptosis and antioxidant activity. The data showed that the molecule LQFM030 increased life expectancy of the animals, and an IC50 value commensurate with the value of Nutlins found in literature, on the evaluation of acute toxicity, according to OECD 423, the molecule was rated 5 or non- classified according to the classification GSH, the cell cycle was observed an increase in G2 / M phase (73%) and sub-G1 phase (73.6%), and a decrease in S phase (40.9%) ; to assess the mechanism of cell death was characterized increased expression of Bax (8 times compared to untreated group), and a decrease of Bcl-2 (84%) as well as an increase in membrane potential and a decrease of ROS (reactive oxygen species), where there was not a change in protein expression of TNF and NFκβ; antioxidant activity did not show a significant effect, and before the candidate cyclic voltammetry showed only the presence of peak oxidation, not being characterized as a good redox system. When tested for safety in basal cell 3T3, the candidate presented a cytotoxicity with IC50 value of approximately 0.14 mM Thus, the candidate prototype antitumor drug LQFM030 presented as a good candidate for antitumor prototype with important data for such purpose, and the need for further detailed studies to better conceptualization. / No âmbito de uma linha de pesquisa que visa a avaliação farmacológica e toxicológica de novos candidatos a protótipos de fármacos antitumorais, foi realizado neste trabalho a avaliação farmacológica e toxicológica dos compostos LQFM030, LQFM031 e LQFL032, desenhados a partir dos protótipos nutlins. Adicionalmente, também avaliou-se os compostos LQFM004, LQFM005, LQFM028 e LQFM029, inicialmente idealizados como candidatos a protótipos de fármacos antipsicóticos, desenhados a partir do LASSBio579. Inicialmente realizou-se uma triagem citotóxica com todos os candidatos, utilizando o teste de citotoxicidade de Exclusão do Azul de Tripano, em células K-562. Diante disto, observou-se que os melhores valores de IC50 foram obtidos com os candidatos LQFM030 e LQFM029 (0,55 e 0,56 mM, respectivamente) e a partir de então teve-se como ponto de partida essas duas moléculas para um estudo mais detalhado e aprofundado da citotoxicidade, onde observou-se que a molécula LQFM030 apresentou o melhor perfil citotóxico no teste de Exclusão do Azul de Tripano e para o teste de Redução do MTT, no intervalos de tempo de 24, 48 e 72h, quando comparado com a molécula LQFM029, utilizando a linhagem celular K-562. Frente a isso, o candidato LQFM030 foi alvo dos demais estudos realizados visando estudo de sobrevida, ensaios de segurança (Captura do Corante Vermelho Neutro, Toxicidade Aguda Oral), ciclo celular, mecanismo de morte celular por apoptose e atividade antioxidante. Os dados mostraram que a molécula LQFM030 aumentou a expectativa de vida dos animais, e um valor de IC50 compatível com o valor dos Nutlins encontrado na literatura; diante da avaliação da toxicidade aguda, segundo a OECD 423, a molécula teve classificação 5 ou não-classificada de acordo com a classificação GSH; no ciclo celular observou-se um aumento da fase G2/M (73%) e da fase sub-G1 (73,6%), e uma diminuição da fase S (40,9%); para a avaliação do mecanismo de morte celular foi caracterizado um aumento da expressão da proteína Bax (8 vezes em relação ao grupo não-tratado), e uma diminuição de Bcl-2 (84%), assim como um aumento do potencial de membrana e uma diminuição de ROS (espécie reativa de oxigênio), onde não observou-se uma variação na expressão das proteínas TNF e NFκβ; porém um aumento da modulação da proteína citocromo-c de 85%; a atividade antioxidante não apresentou um efeito significativo, e perante a voltametria ciclica o candidato mostrou apenas a presença do pico de oxidação, não sendo caracterizado como um bom sistema de oxirredução. Para o ensaio de segurança, em célula basal 3T3, o candidato apresentou uma citotoxicidade com o valor de IC50 de 0,14 mM aproximadamente. Assim, o candidato a protótipo a fármaco antitumoral LQFM030 apresentou como um bom candidato a protótipo antitumoral com dados importantes para tal finalidade, e a necessidade de estudos ainda mais aprofundados para uma melhor conceituação.