Abstract Osteoarthritis is a common joint disease in the adult population characterized by degeneration and limited repair capability of articular cartilage. Cartilage degeneration is also associated with remodeling and sclerosis of the subchondral bone. The relative contributions of these processes are not fully understood partly because of a lack of proper biomarkers for the diagnosis and follow-up of the disease progress. Current diagnostic methods are too insensitive or subjective for reliable and early diagnosis of osteoarthritis. Novel magnetic resonance imaging (MRI) techniques can be used for indirect assessment of cartilage constituents. In addition, the imaging of the subchondral bone and osteochondral junction has become feasible, which has been very difficult with conventional MRI methods due to the very fast signal (T2) decay in those tissues. Quantitative MRI of cartilage involves measurement of relaxation time parameters (T1, T2, T1ρ, T2ρ, TRAFF, T1sat) and investigation of how the parameters reflect the properties of the cartilage. SWIFT (Sweep imaging with Fourier transform) is an MRI technique capable of imaging short T2 structures, enabling assessment of the osteochondral junction as well as the subchondral bone. The aim of this work was to investigate osteoarthritic changes occurring in articular cartilage and subchondral bone in experimental animal models of osteoarthritis and degenerated human specimens with quantitative MRI measurements and SWIFT imaging at 9.4 T. Moreover, the feasibility of the different quantitative MRI techniques in the assessment of osteoarthritic changes was studied. For reference, biomechanical, quantitative and qualitative histology, biochemical and micro-computed tomography measurements were conducted. Novel adiabatic T1ρ and T2ρ relaxation time parameters were more sensitive than conventional methods (T1, T2) or continuous wave T1ρ to both early degenerative changes in a rabbit model of cartilage degeneration and to spontaneous degeneration of human cartilage. SWIFT enabled assessment of the structural properties of the subchondral bone. Moreover, signal changes related to the degree of osteoarthritis were detected at the cartilage–bone interface with SWIFT. These methods may provide new tools for improving the diagnosis of early osteoarthritis. Further studies are needed to investigate the clinical feasibility of these MRI techniques. / Tiivistelmä Nivelrikko on yleinen nivelsairaus, johon ei tällä hetkellä ole parannuskeinoa. Nivelrikossa nivelrusto rappeutuu asteittain aiheuttaen lopulta kudoksen tuhoutumisen; samanaikaisesti myös rustonalaisessa luussa sekä rusto–luurajapinnassa tapahtuu muutoksia. Nivelrustokudoksen uusiutumiskyky on erittäin heikko, joten vauriot olisi hyvä havaita varhaisessa vaiheessa. Nivelrikon syntymekanismeja ei kuitenkaan vielä täysin ymmärretä, koska nykyiset seurantamenetelmät eivät ole riittävän tarkkoja taudin etenemisen tarkkailemiseksi. Magneettikuvausteknologian kehitys mahdollistaa kuitenkin nivelruston koostumuksen tarkastelun nivelen ulkopuolelta. Kvantitatiivisen magneettikuvauksen avulla (T1, T2, T1ρ, T2ρ, TRAFF, T1sat relaksaatioaikaparametrit) voidaan mitata epäsuorasti nivelruston koostumusta ja rakennetta. SWIFT (Sweep Imaging with Fourier Transform) on uusi lyhyen kaikuajan magneettikuvausmenetelmä, joka mahdollistaa myös erittäin lyhyen T2-relaksaatioajan omaavien kudosten, kuten rusto–luurajapinnan sekä rustonalaisen luun kuvaamisen. Työssä tutkittiin nivelrikossa syntyviä muutoksia nivelrustossa, rusto–luurajapinnassa ja rustonalaisessa luussa erilaisissa eläinmalleissa sekä ihmiskudoksessa. Lisäksi työssä tarkasteltiin eri magneettikuvaustekniikoiden herkkyyttä havaita muutokset näissä kudoksissa. Nivelruston ja rustonalaisen luun ominaisuuksien määrittelemiseen käytettiin verrokkimenetelminä biomekaanisia, histologisia sekä biokemiallisia mittauksia ja tietokonetomografiakuvauksia. Kvantitatiivisista magneettikuvausparametreista adiabaattinen T1ρ sekä adiabaattinen T2ρ osoittautuivat herkimmiksi havaitsemaan muutoksia varhaisen nivelrikon eläinmallissa sekä ihmiskudosnäytteissä. SWIFT-magneettikuvaustekniikka puolestaan mahdollisti sekä rustonalaisen luukudoksen tilan arvioinnin että nivelrikossa tapahtuvien muutosten havainnoinnin rusto–luurajapinnassa. Nämä menetelmät voivat mahdollistaa nivelrikon diagnosoinnin taudin varhaisessa vaiheessa, mutta lisätutkimuksia vaaditaan menetelmien soveltuvuudesta kliiniseen käyttöön.

Articular cartilage injuries occur frequently in the knee joint. Several methods have been implemented clinically, to treat osteochondral defects but none have been able to produce a long term, durable solution. Photopolymerizable cartilage tissue engineering approaches appear promising; however, fundamentally, forming a stable interface between the tissue engineered cartilage and native tissue, mainly subchondral bone and native cartilage, remains a major challenge. The overall objective of this research is to find a solution for the current problem of dislodgment of tissue engineered cartilage at the defect site for the treatment of degraded cartilage that has been caused due to knee injuries or because of mild to moderate level of osteoarthritis. For this, an in-vitro model was created to analyze the integration of tissue engineered cartilage with the bone, healthy and diseased cartilage over time. We investigated the utility of hydroxyapatite (HA) nanoparticles to promote controlled bone-growth across the bone-cartilage interface in an in vitro engineered tissue model system using bone marrow derived stem cells. We also investigated the application of HA nanoparticles to promote enhance integration between tissue engineered cartilage and native cartilage both in healthy and diseased states. Samples incorporated with HA demonstrated significantly higher interfacial shear strength (at the junction between engineered cartilage and engineered bone and also with diseased cartilage) compared to the constructs without HA (p < 0.05), after 28 days of culture. These findings indicate that the incorporation of HA nanoparticles permits more stable anchorage of the injectable hydrogel-based engineered cartilage construct via augmented integration between bone and cartilage.

Indiana University-Purdue University Indianapolis (IUPUI) / Articular cartilage is subjected to dynamic mechanical loading during normal daily activities. This complex mechanical loading, including cell deformation and interstitial fluid flow, affects chondrocyte mechano-chemical signaling and subsequent cartilage homeostasis and remodeling. Focal adhesion kinase (FAK) and Src are known to be main mechanotransduction proteins, but little is known about the effect of mechanical loading on FAK and Src under its varying magnitudes and types. In this study, we addressed two questions using C28/I2 chondrocytes subjected to the different types and magnitudes of mechanical loading: Does a magnitude of the mechanical loading affect activities of FAK and Src? Does a type of the mechanical loading also affect their activities? Using fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based FAK and Src biosensor in live C28/I2 chondrocytes, we monitored the effects of interstitial fluid flow and combined effects of cell deformation/interstitial fluid flow on FAK and Src activities. The results revealed that both FAK and Src activities in C28/I2 chondrocytes were dependent on the different magnitudes of the applied fluid flow. On the other hand, the type of mechanical loading differently affected FAK and Src activities. Although FAK and Src displayed similar activities in response to interstitial fluid flow only, simultaneous application of cell deformation and interstitial fluid flow induced differential FAK and Src activities possibly due to the additive effects of cell deformation and interstitial fluid flow on Src, but not on FAK. Collectively, the data suggest that the intensities and types of mechanical loading are critical in regulating FAK and Src activities in chondrocytes.

Einleitung: Die Osteoarthritis ist für einen Großteil der Lahmheiten beim Pferd verantwortlich. Durch die starken Belastungen der equinen Gelenke schreitet die Osteoarthritis unweigerlich fort und setzt diese Tiere einem hohen Leidensdruck aus. Bisherige Therapien reichen nicht aus, um in osteoarthritischen Gelenken die physiologische Integrität des Knorpels wiederherzustellen. Humane und caprine nasale Knorpelzellen zeigten in präklinischen und klinischen Studien ein hohes Regenerationspotential und eine hohe Integrität nach autologer Implantation in Defekte des Gelenkknorpels. Dies wurde auf ihr „Hox-Gen-negatives“ Expressionsprofil zurückgeführt, das sich nach der Implantation dem des artikulären Knorpels anpasste. Ziel der Studie: Das Hox-Genexpressionsprofil nasaler Chondrozyten sollte mit denen artikulärer Chondrozyten in der Zellkultur verglichen werden, um den nasalen Knorpel auch beim Pferd als mögliche autologe Knorpelquelle zu identifizieren. Tiere, Material und Methoden: Knorpelgewebe wurde von 7 verstorbenen Pferden aus dem Nasenseptum und einem vorderen sowie hinterem Fesselgelenk entnommen, Chondrozyten isoliert und bis zur vierten Passage zweidimensional kultiviert. Während der Kultivierung wurden die Chondrozyten alle 3 bis 4 Tage mittelseines eigens erstellten Beurteilungsbogens evaluiert. Zellen aus der ersten (T1) und der dritten (T2) Subkultivierung wurden lysiert, die RNA extrahiert und in cDNA umgeschrieben. Es folgte eine qPCR, um die Expressionslevel von drei Hox-Genen (A3, D1, D8) und zwei knorpeltypischen Genen (SOX9, Kollagen II) an den drei verschiedenen Lokalisationen während T1 und T2 zu bestimmen. Die Quantifizierung der relativen Genexpression erfolgte anschließend mit der ΔΔCT-Methode unter Verwendung von RPL32 und GAPDH als Housekeeping-Gene. Zur statistischen Auswertung wurden die Multiple Lineare Regression, eine einfaktorielle Varianzanalyse (ANOVA) und ein zweiseitiger t-Test herangezogen. Die Signifikanzniveaus aller statistischen Tests wurden auf α= 0,05 festgesetzt. Ergebnisse: Die Hox-Genexpressionen unterschieden sich in Bezug auf die drei Lokalisation und die Messzeitpunkte nicht signifikant voneinander. Die nasalen Chondrozyten wiesen während der ersten Subkultivierung gegenüber den artikulären Chondrozyten signifikant höhere Kollagen-II-Expressionen auf. Eine „Hox-Gen-negative“ Expression konnte für die Tierart Pferd nicht bestätigt werden. Die vorliegende Arbeit zeigt, dass Pferde wahrscheinlich ein speziesspezifisches Hox- Gen-Expressionsmuster aufweisen und dass die equinen Hox-Genexpressionsprofile statistisch signifikanten individuellen Einflüssen unterliegen. Schlussfolgerung: Das equine Hox-Genexpressionsprofil unterliegt statistisch signifikanten individuellen Einflüssen, die bei einer potenziellen Zelltherapie zu beachten sind. Nasale Chondrozyten eignen sich beim Pferd aufgrund ihrer genetischen Ähnlichkeit, bezogen auf die Expressionen der untersuchten Hox-Gene, zu artikulären Chondrozyten und ihrer hohen Bereitschaft zur Kollagen-II-Bildung wahrscheinlich als potenzielle Quelle für die autologe chondrozytäre Implantation (ACI).:1. Einleitung ...................................................................................................... 1 2. Literaturübersicht .......................................................................................... 2 2.1 Knorpel ..................................................................................................... 2 2.1.1 Allgemeiner Überblick ....................................................................... 2 2.1.2 Chondrogenese und Regeneration .................................................. 3 2.1.3 Intraartikulärer Hyaliner Knorpel ....................................................... 3 2.1.4 Extraartikulärer Hyaliner Knorpel....................................................... 6 2.2 Osteoarthritis bei Mensch und Pferd ........................................................ 8 2.2.1 Bedeutung und Ätiologie ................................................................... 8 2.2.2 Pathogenese ..................................................................................... 9 2.2.3 Diagnostik ........................................................................................ 10 2.2.4 Bisherige Therapieansätze .............................................................. 12 2.3 Knorpelgewebe in der Forschung .............................................................13 2.3.1 Kultivierung von Chondrozyten ......................................................... 13 2.3.2 Tiermodelle in der Osteoarthritisforschung ....................................... 15 2.3.3 Neue Therapieansätze ..................................................................... 17 2.3.3.1 Stammzellbasierte Verfahren ...................................................... 17 2.3.3.2 Artikuläre autologe Chondrozyten .............................................. 19 2.3.3.3 Nasale Chondrozyten ................................................................. 21 2.4 Hox-Gene ................................................................................................ 22 2.4.1 Allgemeiner Überblick ..................................................................... ..22 2.4.2 Regulation der Hox-Gene ................................................................. 23 2.4.3 Erkrankungen im Zusammenhang mit Hox-Genen ........................... 25 3. Ziel der Studie ........................................................................................... 27 4. Publikation ................................................................................................ 28 5. Diskussion................................................................................................. 45 5.1 Primer ....................................................................................................46 5.2 Auswahl der Messzeitpunkte und Proben ............................................. 47 5.3 Hox-Genprofile kultivierter equiner Chondrozyten ................................ 49 5.4 Individuelle Hox-Genprofile ................................................................... 50 5.5 SOX9 und Kollagen II .............................................................................51 5.6 Hox-Genprofile im Vergleich verschiedener Spezies ............................. 53 5.7 Ausblick ................................................................................................ 53 6. Schlussfolgerung ...................................................................................... 55 7. Zusammenfassung ................................................................................... 56 8. Summary .................................................................................................. 58 9. Referenzen .............................................................................................. 60 9.1 Literaturverzeichnis .............................................................................. 60 9.2 Abbildungsverzeichnis.......................................................................... 71 10. Anhang .................................................................................................. 72 10.1 Evaluierungsbogen Chondrozytenkulturen ........................................ 72 10.2 Auszug aus der Korrelationsmatrix ..................................................... 73 10.3 Publikationsverzeichnis Christiane Storch .......................................... 74 11. Danksagung .......................................................................................... 75 / Introduction: Osteoarthritis is responsible for most of the lameness in horses. Due to severe stress on equine joints, osteoarthritis inevitably progresses and results in a high degree of suffering. Current therapeutic options are not sufficient to restore the physiological integrity of the cartilage in osteoarthritic joints. Human and caprine nasal chondrocytes demonstrated high regenerative potential and integrity after autologous implantation into articular cartilage defects in preclinical and clinical studies. This was attributed to their “Hox gene negative” expression profile, matching the profile of articular cartilage after implantation. Aim of the study: The Hox gene expression profile of nasal chondrocytes was compared with those of articular chondrocytes in a cell culture to address nasal cartilage as a possible autologous source also in horses. Animals, Material and Methods: Cartilage was harvested from the nasal septum, one anterior and one posterior fetlock joint of deceased 7 horses, chondrocytes were isolated and cultured two-dimensionally until the fourth passage. During cultivation, chondrocytes were evaluated every 3 to 4 days using a specially designed assessment sheet. Cells were harvested during the first (T1) and third (T2) subcultivation. RNA was extracted and transcribed into cDNA. Subsequently, qPCR was performed to determine the expression levels of three Hox genes (A3, D1, D8) and two tissue-identifying genes (SOX9, collagen II) of the three locations after T1 and T2. Quantification of relative gene expression was performed with the ΔΔCT method using RPL32 and GAPDH as housekeeping genes. Multiple linear regression, one-way analysis of variance (ANOVA), and two-tailed t-test were used for statistical analysis. The significance levels of all statistical tests were set at α= 0.05. Results: Hox gene expressions were not significantly different in terms of localization and measurement time points. Nasal chondrocytes exhibited significantly higher collagen II expression than articular chondrocytes during the first subcultivation. 'Hox gene negative' expression could not be confirmed in horses. This study demonstrates that equine Hox gene expression pattern is likely species-specific and that equine Hox gene expression profiles are subject to statistically significant individual influences. Conclusion: The equine Hox gene expression profile is subject to statistically significant individual influences that should be considered in potential cell therapy. Nasal chondrocytes are probably suitable as a potential source for autologous chondrocyte implantation (ACI) in horses due to their genetic similarity, in terms of the expressions of the examined Hox genes, to articular chondrocytes and their high propensity for collagen II formation.:1. Einleitung ...................................................................................................... 1 2. Literaturübersicht .......................................................................................... 2 2.1 Knorpel ..................................................................................................... 2 2.1.1 Allgemeiner Überblick ....................................................................... 2 2.1.2 Chondrogenese und Regeneration .................................................. 3 2.1.3 Intraartikulärer Hyaliner Knorpel ....................................................... 3 2.1.4 Extraartikulärer Hyaliner Knorpel....................................................... 6 2.2 Osteoarthritis bei Mensch und Pferd ........................................................ 8 2.2.1 Bedeutung und Ätiologie ................................................................... 8 2.2.2 Pathogenese ..................................................................................... 9 2.2.3 Diagnostik ........................................................................................ 10 2.2.4 Bisherige Therapieansätze .............................................................. 12 2.3 Knorpelgewebe in der Forschung .............................................................13 2.3.1 Kultivierung von Chondrozyten ......................................................... 13 2.3.2 Tiermodelle in der Osteoarthritisforschung ....................................... 15 2.3.3 Neue Therapieansätze ..................................................................... 17 2.3.3.1 Stammzellbasierte Verfahren ...................................................... 17 2.3.3.2 Artikuläre autologe Chondrozyten .............................................. 19 2.3.3.3 Nasale Chondrozyten ................................................................. 21 2.4 Hox-Gene ................................................................................................ 22 2.4.1 Allgemeiner Überblick ..................................................................... ..22 2.4.2 Regulation der Hox-Gene ................................................................. 23 2.4.3 Erkrankungen im Zusammenhang mit Hox-Genen ........................... 25 3. Ziel der Studie ........................................................................................... 27 4. Publikation ................................................................................................ 28 5. Diskussion................................................................................................. 45 5.1 Primer ....................................................................................................46 5.2 Auswahl der Messzeitpunkte und Proben ............................................. 47 5.3 Hox-Genprofile kultivierter equiner Chondrozyten ................................ 49 5.4 Individuelle Hox-Genprofile ................................................................... 50 5.5 SOX9 und Kollagen II .............................................................................51 5.6 Hox-Genprofile im Vergleich verschiedener Spezies ............................. 53 5.7 Ausblick ................................................................................................ 53 6. Schlussfolgerung ...................................................................................... 55 7. Zusammenfassung ................................................................................... 56 8. Summary .................................................................................................. 58 9. Referenzen .............................................................................................. 60 9.1 Literaturverzeichnis .............................................................................. 60 9.2 Abbildungsverzeichnis.......................................................................... 71 10. Anhang .................................................................................................. 72 10.1 Evaluierungsbogen Chondrozytenkulturen ........................................ 72 10.2 Auszug aus der Korrelationsmatrix ..................................................... 73 10.3 Publikationsverzeichnis Christiane Storch .......................................... 74 11. Danksagung .......................................................................................... 75

Articular cartilage is an avascular and flexible connective tissue found in joints. It produces a cushioning effect at the joints and provides low friction to protect the ends of the bones from wear and tear/damage. It has poor repair capacity and any injury can result pain and loss of mobility. One of the common forms of articular cartilage disease which has a huge impact on patient¿s life is arthritis. Research on cartilage cell/tissue engineering will help patients to improve their physical activity by replacing or treating the diseased/damaged cartilage tissue. Cartilage cell, called chondrocyte is embedded in the matrix (Lacunae) and has round shape in vivo. The in vitro monolayer culture of primary chondrocyte causes morphological change characterized as dedifferentiation. Transforming growth factor-beta (TGF-¿), a cytokine superfamily, regulates cell function, including differentiation and proliferation. The effect of TGF-¿1, 2, 3, and their manipulated forms in biological regulation of primary chondrocyte was investigated in this work. A novel method was developed to isolate and purify the primary chondrocytes from knee joint of neonate Sprague-Dawley rat, and the effect of some supplementations such as hyaluronic acid and antibiotics were also investigated to provide the most appropriate condition for in vitro culture of chondrocyte cells. Addition of 0.1mg/ml hyaluronic acid in chondrocyte culture media resulted an increase in primary chondrocyte proliferation and helped the cells to maintain chondrocytic morphology. TGF-¿1, 2 and 3 caused chondrocytes to obtain fibroblastic phenotype, alongside an increase in apoptosis. The healing process of the wound closure assay of chondrocyte monolayers were slowed down by all three isoforms of TGF-¿. All three types of TGF-¿ negatively affected the strength of chondrocyte adhesion. TGF-¿1, 2 and 3 up regulated the expression of collagen type-II, but decreased synthesis of collagen type-I, Chondroitin sulfate glycoprotein, and laminin. They did not show any significant change in production of S-100 protein and fibronectin. TGF-¿2, and 3 did not change expression of integrin-¿1 (CD29), but TGF-¿1 decreased the secretion of this adhesion protein. Manipulated TGF-¿ showed huge impact on formation of fibroblast like morphology of chondrocytes with chondrocytic phenotype. These isoforms also decreased the expression of laminin, chondroitin sulfate glycoprotein, and collagen type-I, but they increased production of collagen type-II and did not induce synthesis of fibronectin and S-100 protein. In addition, the strength of cell adhesion on solid surface was reduced by manipulated TGF-¿. Only manipulated form of TGF-¿1 and 2 could increase the proliferation rate. Manipulation of TGF-¿ did not up regulate the expression of integrin-¿1in planar culture system. The implications of this R&D work are that the manipulation of TGF-¿ by combination of TGF-¿1, 2, and 3 can be utilized in production of superficial zone of cartilage and perichondrium. The collagen, fibronectin and hyaluronic acid could be recruited for the fabrication of a biodegradable scaffold that promotes chondrocyte growth for autologous chondrocyte implantation or for formation of cartilage.

7 Abstract (AJ) Introduction Radiology examination using specialized modern imaging methods, including CT and MRI, is essential in the diagnosis of congenital and acquired diseases of the musculoskeletal system. The first part of the dissertation deals with certain congenital defects of the short femur, known in the literature as proximal femoral focal deficiency (PFFD). This part summarizes our experience with the radiological findings in the preoperative and postoperative period, with the main attention to the vascular supply to the affected area. The second part of the presentation deals with some aspects of autologous chondrocyte transplantation fixed at two different carriers implanted into post-traumatic articular cartilage defects of the distal femur. Radiological findings are evaluated in the relation to the histopathological findings. Objectives The first part of the study after the distribution of patients with PFFD by current commonly used radiographic classification sets the objective in the extent of scans of the hip joints to specify diagnosis PFFD in each patient and to evaluate in detail changes in the area of disability, especially a course of blood vessels. The evaluation of the radiation burden of repeated X-ray measurements was done with respect to the age of the patients. Tissue samples...

7 Abstract (AJ) Introduction Radiology examination using specialized modern imaging methods, including CT and MRI, is essential in the diagnosis of congenital and acquired diseases of the musculoskeletal system. The first part of the dissertation deals with certain congenital defects of the short femur, known in the literature as proximal femoral focal deficiency (PFFD). This part summarizes our experience with the radiological findings in the preoperative and postoperative period, with the main attention to the vascular supply to the affected area. The second part of the presentation deals with some aspects of autologous chondrocyte transplantation fixed at two different carriers implanted into post-traumatic articular cartilage defects of the distal femur. Radiological findings are evaluated in the relation to the histopathological findings. Objectives The first part of the study after the distribution of patients with PFFD by current commonly used radiographic classification sets the objective in the extent of scans of the hip joints to specify diagnosis PFFD in each patient and to evaluate in detail changes in the area of disability, especially a course of blood vessels. The evaluation of the radiation burden of repeated X-ray measurements was done with respect to the age of the patients. Tissue samples...

Indiana University-Purdue University Indianapolis (IUPUI) / Insulin-like Growth Factor I (IGF-I) is a growth factor that stimulates both mitogenic and anabolic responses in articular chondrocytes. While it has been shown that exogenous IGF-I can regulate chondrocyte integrins, little is known regarding regulatory effects of IGF-I produced from a transiently expressed plasmid based adeno-associated virus (pAAV) vector. Because chondrocytes are using cellular machinery to overexpress IGF-I, it is of interest to see whether or not pAAV IGF-I will significantly upregulate or downregulate chondrocyte integrins. Additionally, it is of interest to know whether chondrocyte adhesion through integrins will have any regulatory effects on the production of IGF-I from the transgene. Therefore, this study will ascertain if pAAV IGF-I will have similar effects that exogenous IGF-I has on integrin regulation and if integrin silencing mechanisms will affect the production of IGF-I from the transgene. To test these hypotheses, adult articular chondrocytes were doubly transfected with the pAAV vector for IGF-I and short interference ribonucleic acid (siRNA) for integrins beta 1 and alpha V. Gene products were monitored at the transcriptional levels using quantitative real time polymerase chain reactions (qPCR) and IGF-I protein production was monitored at the translational level using enzyme linked immunoabsorbant assays (ELISAs). Adult articular chondrocytes doubly transfected were encapsulated in a three dimensional hydrogel system to simulate an in vivo environment. Samples were collected for analysis at days 2, 4, and 6 post encapsulation. Results show that IGF-I treatment with the pAAV vector does not cause significant changes in the transcriptional regulation of the beta 1 integrin in a three dimensional hydrogel system. The pAAV IGF-I vector did not cause significant regulatory changes on integrin alpha V at any time point during the experiment. Additionally, by knocking down the expression levels of integrins by using siRNA, it was shown that integrin knockdown does not have a significant regulatory effect on transcriptional or translational expression levels of IGF-I from the pAAV vector.

Die rheumatoide Arthritis ist eine chronisch-entzündliche Bindegewebserkrankung mit symmetrischem Befall der Gelenke. Die genaue Ätiologie ist bisher unbekannt. Aktivierte synoviale Fibroblasten sollen durch gesteigerte Adhäsion und Produktion von proinflammatorischen Zytokinen und Matrix-lysierenden Proteasen maßgeblich an der Gelenkdestruktion beteiligt sein. Ziel dieser Arbeit war es, ein neues in-vivo-Knorpeldestruktions-Modell zu etablieren, in welchem unter immunkompetenten Bedingungen, die Invasion und Destruktion von Gelenkknorpel durch die Fibroblasten-Zelllinie LS48 über einen längeren Zeitraum simuliert werden kann. Die am Institut für klinische Immunologie der Medizinischen Fakultät der Universität Leipzig etablierte Zelllinie LS48 wurde in die ipsilateralen Kniegelenke von BALB/c-Mäusen injiziert. Die dadurch induzierte Gewebsdestruktion wurde über zehn Wochen in zweiwöchigem Abstand histopathologisch beurteilt und klassifiziert. Als vergleichende Fibroblasten-Zelllinie wurden nicht-invasive NIH/3T3-Zellen eingesetzt. An Hand der Score-Parameter Zellinvasion, Pannusformation und Knorpeldestruktion wurde eine mäßige bis schwer-wiegende Gewebsdestruktion durch die LS48-Zellen bereits ab der zweiten Untersuchungswoche lichtmikroskopisch nachgewiesen, ohne dass dabei pathologische Effekte in den kontralateralen Kniegelenken aufgetreten sind. Polarisationsmikroskopisch wurden für den Parameter Knorpeldestruktion vergleichbare Ergebnisse erzielt. Damit wurde gezeigt, dass das Modell BALB/c LS48 ein erfolgversprechendes Instrument darstellt, das zur Testung neuer therapeutischer Strategien gegen die Gelenkdestruktion verwendet werden kann. Inwieweit die Auseinandersetzung der LS48-Zellen mit dem spezifischen Immunsystem der BALB/c-Maus Auswirkungen auf den Verlauf der Gewebsdestruktion hat, sollte in weiterführenden Experimenten untersucht werden.

Die rheumatoide Arthritis ist eine chronisch-entzündliche Bindegewebserkrankung mit symmetrischem Befall der Gelenke. Die genaue Ätiologie ist bisher unbekannt. Aktivierte synoviale Fibroblasten sollen durch gesteigerte Adhäsion und Produktion von proinflammatorischen Zytokinen und Matrix-lysierenden Proteasen maßgeblich an der Gelenkdestruktion beteiligt sein. Ziel dieser Arbeit war es, ein neues in-vivo-Knorpeldestruktions-Modell zu etablieren, in welchem unter immunkompetenten Bedingungen, die Invasion und Destruktion von Gelenkknorpel durch die Fibroblasten-Zelllinie LS48 über einen längeren Zeitraum simuliert werden kann. Die am Institut für klinische Immunologie der Medizinischen Fakultät der Universität Leipzig etablierte Zelllinie LS48 wurde in die ipsilateralen Kniegelenke von BALB/c-Mäusen injiziert. Die dadurch induzierte Gewebsdestruktion wurde über zehn Wochen in zweiwöchigem Abstand histopathologisch beurteilt und klassifiziert. Als vergleichende Fibroblasten-Zelllinie wurden nicht-invasive NIH/3T3-Zellen eingesetzt. An Hand der Score-Parameter Zellinvasion, Pannusformation und Knorpeldestruktion wurde eine mäßige bis schwer-wiegende Gewebsdestruktion durch die LS48-Zellen bereits ab der zweiten Untersuchungswoche lichtmikroskopisch nachgewiesen, ohne dass dabei pathologische Effekte in den kontralateralen Kniegelenken aufgetreten sind. Polarisationsmikroskopisch wurden für den Parameter Knorpeldestruktion vergleichbare Ergebnisse erzielt. Damit wurde gezeigt, dass das Modell BALB/c LS48 ein erfolgversprechendes Instrument darstellt, das zur Testung neuer therapeutischer Strategien gegen die Gelenkdestruktion verwendet werden kann. Inwieweit die Auseinandersetzung der LS48-Zellen mit dem spezifischen Immunsystem der BALB/c-Maus Auswirkungen auf den Verlauf der Gewebsdestruktion hat, sollte in weiterführenden Experimenten untersucht werden.:Bibliographische Zusammenfassung II Inhaltsverzeichnis III Abkürzungsverzeichnis IV 1 Einleitung 1 1.1 Rheumatische Erkrankungen 1 1.2 Die rheumatoide Arthritis 2 1.2.1 Immunologische Grundlagen der rheumatoiden Arthritis 2 1.2.1.1 Hypothese der Fibroblasten-Abhängigkeit 3 1.2.1.2 Hypothese der T-Zell-Abhängigkeit 4 1.3 Allgemeine Anatomie und Histologie des Kniegelenks 6 1.4 Die Histopathologie der rheumatoiden Arthritis 9 1.4.1 Verschiedene Synovialmembrantypen bei rheumatoider Arthritis 10 1.5 Tiermodelle zur Untersuchung der rheumatoiden Arthritis 11 1.5.1 Das Tiermodell der Fibroblasten-induzierten Gelenkdestruktion in der BALB/c-Maus 12 1.6 Histopathologische Score-Systeme der rheumatoiden Arthritis in Tiermodellen 13 1.7 Ziel 13 1.7.1 Fragestellungen 14 2 Material und Methoden 16 2.1 Zelllinien und Versuchstiere 16 2.1.1 Die Fibroblasten-Zelllinie NIH/3T3 16 2.1.2 Die Fibroblasten-Zelllinie LS48 16 2.1.3 Die BALB/c-Maus 17 2.2 Tierversuchsplan 18 2.3 Zellkultur 19 2.3.1 Geräte und Verbrauchsmaterialien 19 2.3.2 Reagenzien 20 2.3.3 Durchführung 21 2.4 Isolation der murinen Kniegelenke 22 2.5 Histologische Aufarbeitung 23 2.5.1 Geräte und Verbrauchsmaterialien 23 2.5.2 Reagenzien 24 2.5.3 Entkalkung, Entwässerung, Einbettung und Schneiden der Präparate 26 2.5.4 Azanfärbung nach Heidenhain (Kernechtrubin-Anillinblau-Orange G-Färbung) 27 2.6 Klassifikation mit dem Durchlichtmikroskop für das Modell der Fibroblasten-induzierten Knorpeldestruktion (Balb/c-LS48) 29 2.7 Klassifikation mit dem Polarisationsmikroskop für das Modell der Fibroblasten-induzierten Knorpeldestruktion (Balb/c-LS48) 29 2.8 Statistik 30 3 Ergebnisse 31 3.1 Score-Erhebung mit dem Lichtmikroskop für das Modell der Fibroblasten-induzierten Knorpeldestruktion (BALB/c-LS48) 31 3.1.1 Bewertungsmodus für den Score-Parameter Zellinvasion 32 3.1.2 Bewertungsmodus für den Score-Parameter Pannusformation 35 3.1.3 Bewertungsmodus für den Score-Parameter Knorpeldestruktion 38 3.2 Datenanalyse der lichtmikroskopisch untersuchten Parameter Zellinvasion, Pannusformation und Knorpeldestruktion für das Modell der Fibroblasten-induzierten Knorpeldestruktion (BALB/c-LS48) 41 3.2.1 Zellinvasion 41 3.2.2 Pannusformation 45 3.2.3 Knorpeldestruktion 48 3.2.4 Gesamtscore 51 3.3 Score-Erhebung mit dem Polarisationsmikroskop für das Modell der Fibroblasten-induzierten Knorpeldestruktion (BALB/c-LS48) 56 3.3.1 Bewertungsmodus für den Score-Parameter Knorpeldestruktion 56 3.4 Datenanalyse des polarisationsmikroskopisch untersuchten Parameters Knorpel-destruktion für das Modell der Fibroblasten-induzierten Knorpeldestruktion (BALB/c-LS48) 59 3.5 Statistischer Vergleich der licht- und polarisationsmikroskopischen Analysemethoden für den Parameter Knorpeldestruktion 62 3.6 Statistischer Vergleich der medialen und lateralen histologischen Sagittalschnitte der Kniegelenke 63 4 Diskussion 64 4.1 Die Bedeutung der histopathologischen Score-Parameter für das Modell der Fibroblasten-induzierten Gelenkdestruktion in der BALB/c-Maus 65 4.1.1 Der Score-Parameter Zellinvasion 65 4.1.1.1 Die pathophysiologische Bedeutung des Score-Parameters Zellinvasion 67 4.1.1.2 Interpretation der lichtmikroskopischen Befunde des Score-Parameters Zellinvasion für die Zelllinie LS48 im ipsilateralen Kniegelenk im Verlauf von zehn Wochen 69 4.1.2 Der Score-Parameter Pannusformation 70 4.1.2.1 Die pathophysiologische Bedeutung des Score-Parameters Pannusformation 71 4.1.2.2 Interpretation der lichtmikroskopischen Befunde des Score-Parameters Pannusformation für die Zelllinie LS48 im ipsilateralen Kniegelenk im Verlauf von zehn Wochen 73 4.1.3 Der Score-Parameter Knorpeldestruktion 74 4.1.3.1 Die pathophysiologische Bedeutung des Score-Parameters Knorpeldestruktion 75 4.1.3.2 Interpretation der lichtmikroskopischen Befunde des Score-Parameters Knorpeldestruktion für die Zelllinie LS48 im ipsilateralen Kniegelenk im Verlauf von zehn Wochen 76 4.1.4 Interpretation des lichtmikroskopisch erhobenen Gesamtscores für das Knorpeldestruktionsmodell (BALB/c-LS48) im ipsilateralen Kniegelenk im Verlauf von zehn Wochen 78 4.1.4.1 Verlaufsvergleich zu anderen Tiermodellen 81 4.2 Die histopathologischen Auswirkungen der Zelllinien LS48 und NIH/3T3 im ipsilateralen Kniegelenk der BALB/c-Maus im Vergleich 83 4.3 Vergleich der medialen und lateralen Sagittalebenen der histologischen Präparate der Kniegelenke 85 4.4 Beurteilung histopathologischer Veränderungen in den kontralateralen Kniegelenken im Verlauf von zehn Wochen 86 4.5 Vergleich der licht- und polarisationsmikroskopischen Untersuchungsergebnisse 87 4.6 Schlussfolgerungen und Ausblick 89 Zusammenfassung 94 Literaturverzeichnis 99 Abbildungs- und Tabellenverzeichnis 116 Eigenständigkeitserklärung VIII Danksagung IX