Esta tese trata do desenvolvimento de métodos bioanalíticos, baseados na técnica de eletroforese capilar, para duas aplicações distintas: a análise de complexos formados pela ligação entre proteínas e DNA e detecção e monitoramento de hidrólise de GTP catalisada por enzimas. No primeiro capítulo descreve-se uma investigação sobre a viabilidade de ensaios tipo EMSA (?electrophoretic mobility shift assay?) em chips com microcanais para eletroforese. Os fatores de transcrição purificados c-Jun(AP1) e p-50(NFkB) foram usados nos estudos de ligação a sondas de DNA fita dupla contendo as seqüências consenso de ligação dos fatores AP1, NFkB e AP2. As sondas de DNA sintéticas continham como modificação a marcação com o corante fluorescente Cy5 ligado à extremidade 5?, sendo que as mesmas seqüências não marcadas foram usadas para experimentos de competição. Ensaios tipo EMSA em chip puderam ser realizados em cerca de 2 h com baixo consumo de amostra e sem a necessidade de usar marcação com material radioativo. A sondas de DNA e os complexos formados nas reações de ligação foram analisados no Bioanalyzer usando tanto o procedimento padrão para a análise de DNA quanto um protocolo modificado. Nesta modificação não foi usado corante de intercalação mas 4,9 nM de Cy5-dCTP que foi adicionado ao gel, permitindo apenas a detecção de DNA previamente marcado. Apesar da necessidade de ajustes no método para cada proteína testada, foi mostrado o potencial de se substituir o método de EMSA em gel por métodos baseados em eletroforese em chip. Um experimento de competição foi realizado com sucesso mostrando a ligação do fator de transcrição p-50 à sonda contendo a seqüência consenso NFkB. Este experimento foi considerado como prova de princípio para a hipótese estudada. No segundo capítulo relata-se o desenvolvimento de um método para a detecção e monitoramento in vitro de atividade nucleotídeo-trifosfatase. O método que se mostrou robusto e reprodutível foi aplicado para investigar a atividade GTPase de uma proteína recombinante contendo o domínio catalítico de uma septina humana SEPT4 / Bradeiona (GST-rDGTPase). O exemplo de aplicação demonstra que a técnica de eletroforese capilar pode substituir o método tradicionalmente usado com marcação radioativa para detecção de atividade GTPase inclusive em estudos de cinética enzimática. Os parâmetros cinéticos determinados para a GST-rDGTPase foram: vmax = 1.7 μ M min-1 ± 0.1 and Km = 1.0 mM ± 0.3; kcat = 9 x 10-3 SM-1. O efeito de co-fatores como Mg2+ and Mn2+ também foi estudado. O método analítico descrito também se mostrou útil para a análise de di- e trifosfatos de outros nucleotídeos. / This Thesis concerns on the development of capillary electrophoresis-based bioanalytical methods for two distinct applications: DNA-protein binding analysis and monitoring of enzyme-catalyzed GTP hydrolysis. In the first chapter, the feasibility of on-chip electrophoretic mobility-shift assays (EMSA) is investigated. Purified transcription factors c-Jun(AP1) and p-50(NFkB) were used for binding studies to dsDNA probes containing the consensus sequences from AP1, NFkB and AP2 regulatory sequences. DNA probes were modified at the 5?-end with the Cy5 and unlabeled oligos were used for competition experiments. On-chip-EMSA could be carried out within ca. 2 h with low sample consumption and no need to handle radioactive material. Both, the dsDNA probes and the shifted oligos from binding reactions were analyzed on the ?2100 Bioanalyzer? using either, the standard procedure for DNA analysis or a modified protocol, in which no intercalating dye was used. Instead, 4.9 nM Cy5-dCTP was added to the gel matrix allowing the detection of only Cy5-labeled DNA. Despite the need of specific adjustments for each protein, we have shown the potential for replacing slab gel-based EMSA for on-chip methods. A competition experiment to show sequence specific binding of the transcription factor p-50 to the consensus sequence NFkB is presented as a proof of principle. In chapter II, a capillary electrophoresis-based method for in vitro detection and monitoring of nucleotide-triphosphatase activity is described. This robust and reproducible method was used to investigate GTPase activity of a recombinant protein construct containing the catalytic domain of Human SEPT4 /Bradeion ? (GST-rDGTPase). The application example demonstrates that the capillary electrophoresis technique can replace classical radioactive methods for GTPase activity assays and may be used as a routine analytical tool. Enzyme kinetics of GST-rDGTPase was studied and yielded the following kinetic parameters: vmax = 1.7 μM min-1 ± 0.1 and Km = 1.0 mM ± 0.3; kcat = 9 x 10-3 s-1. In addition the effect of co-factors such as Mg2+ and Mn2+ in the catalytic activity was investigated. The described analytical method was also shown to be useful to analyze di- and triphosphated forms of other nucleotides.

Made available in DSpace on 2015-04-14T13:47:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 448009.pdf: 5718766 bytes, checksum: fcdc0ed165f9b223c0eded95c8f2eb8d (MD5) Previous issue date: 2013-03-26 / In "An international problem of serious proportions": The cooperation between the Rockefeller Foundation and the Government of the State of Rio Grande do Sul to fight ancylostomiasis and its consequences (1919-1929)", our proposal is to analyze the cooperation between the International Health Board of the Rockefeller Foundation and the government of the state of Rio Grande do Sul to fight a rural endemic disease, ancylostomiasis, in the 1920s, and the developments and consequences of this cooperation on public health in the state, both as regards the fight against ancylostomiasis and the organization of health in the state, taking aspects of the international, national and local context into account. Based on the discussion in the literature concerning the topic and the analysis of the documents produced, especially by the Rockefeller Foundation (reports, letters and publications), and by the government of the state of Rio Grande do Sul (Reports of the Department of the State for Internal and Foreign Affairs), we shall focus on activities to fight the disease performed in Rio Grande do Sul municipalities as a result of the cooperation between the Foundation and the state government, guided by the North American institution and performed through the state Directorate of Hygiene between 1920 and 1923. / Em An international problem of serious proportions : A coopera??o entre a Funda??o Rockefeller e o governo do estado do Rio Grande do Sul no combate ? ancilostom?ase e seus desdobramentos (1919-1929), nossa proposta ? analisar, levando em considera??o aspectos do contexto internacional, nacional e local, a coopera??o entre a divis?o internacional de sa?de International Health Board da Funda??o Rockefeller e o governo estadual do Rio Grande do Sul no combate a uma endemia rural, a ancilostom?ase, na d?cada de 1920, e os desdobramentos, as consequ?ncias desta coopera??o na sa?de p?blica estadual, tanto no que se refere ao combate ? ancilostom?ase em si quanto ? organiza??o da sa?de no estado. A partir da discuss?o de bibliografia pertinente ao tema e da an?lise de documenta??o produzida, principalmente, pela Funda??o Rockefeller (relat?rios, correspond?ncia e publica??es) e pelo governo do estado do Rio Grande do Sul (Relat?rios da Secretaria de Estado dos Neg?cios do Interior e Exterior), enfocaremos as atividades de combate ? doen?a realizadas em munic?pios ga?chos a partir da coopera??o entre a Funda??o e o governo estadual, orientadas pela institui??o norte-americana e realizadas atrav?s da Diretoria de Higiene estadual entre 1920 e 1923. Al?m disso, discutiremos tamb?m o trabalho de combate ? ancilostom?ase mantido pelo governo estadual ap?s o t?rmino da coopera??o com a Funda??o, com a organiza??o do Servi?o de Postos de Profilaxia Rural estadual em funcionamento entre 1924 e 1929. Por fim, abordaremos a atua??o da Funda??o na forma??o de profissionais de sa?de p?blica, pois, durante a coopera??o entre a institui??o e o governo estadual, um m?dico da Diretoria de Higiene, Fernando de Freitas e Castro, recebeu uma bolsa para realizar estudos em sa?de p?blica nos Estados Unidos entre 1922 e 1923. Em 1929, Freitas e Castro, ent?o ? frente da pasta da sa?de no Rio Grande do Sul, p?s fim ?s atividades do Servi?o de Postos de Profilaxia Rural a partir da proposta de uma Reforma Sanit?ria que introduzia, no estado, os health centers ou centros de sa?de, um modelo de organiza??o em sa?de p?blica difundido pela Funda??o.

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<p>The challenge for the future was defined by the Brundtland Commission (1987) and by the Rio Declaration (1992), in which the fundamental principles for achieving a sustainable development were provided. Sustainable chemistry can be defined as the contribution of chemistry to the implementation of the Rio Declaration. This thesis shows how Pressurized Fluid Extraction (PFE) can be utilized in chemical analysis, and how this correlates to Green Chemistry.</p><p>The reliability and efficiency of the PFE technique was investigated for a variety of analytes and matrices. Applications discussed include: the extraction of the antioxidant Irganox 1076 from linear low density polyethylene, mobile forms of phosphorus in lake sediment, chlorinated paraffins from source-separated household waste, general analytical method for pesticide residues in rape seed, total lipid content in cod muscle, and squalene in olive biomass. Improved or comparable extraction yields were achieved with reduced time and solvent consumption. The decrease in use of organic solvents was 50-90%, resulting in minimal volatile organic compounds emissions and less health-work problem. Due to higher extraction temperatures and more efficient extractions, the selection of solvent is not as important as at lower temperatures, which makes it possible to choose less costly, more environmentally and health beneficial solvents. In general, extraction times are reduced to minutes compared to several hours. As a result of the very short extraction times, the amount of co-extracted material is relatively low, resulting in fewer clean-up step and much shorter analysis time. Selective extractions could be obtained by varying the solvent or solvent mixture and/or using adsorbents. </p><p>In this thesis, the PFE technique was compared to the twelve principles of Green Chemistry, and it was shown that it follows several of the principles, thus giving a major contribution to sustainable chemistry. </p>

The challenge for the future was defined by the Brundtland Commission (1987) and by the Rio Declaration (1992), in which the fundamental principles for achieving a sustainable development were provided. Sustainable chemistry can be defined as the contribution of chemistry to the implementation of the Rio Declaration. This thesis shows how Pressurized Fluid Extraction (PFE) can be utilized in chemical analysis, and how this correlates to Green Chemistry. The reliability and efficiency of the PFE technique was investigated for a variety of analytes and matrices. Applications discussed include: the extraction of the antioxidant Irganox 1076 from linear low density polyethylene, mobile forms of phosphorus in lake sediment, chlorinated paraffins from source-separated household waste, general analytical method for pesticide residues in rape seed, total lipid content in cod muscle, and squalene in olive biomass. Improved or comparable extraction yields were achieved with reduced time and solvent consumption. The decrease in use of organic solvents was 50-90%, resulting in minimal volatile organic compounds emissions and less health-work problem. Due to higher extraction temperatures and more efficient extractions, the selection of solvent is not as important as at lower temperatures, which makes it possible to choose less costly, more environmentally and health beneficial solvents. In general, extraction times are reduced to minutes compared to several hours. As a result of the very short extraction times, the amount of co-extracted material is relatively low, resulting in fewer clean-up step and much shorter analysis time. Selective extractions could be obtained by varying the solvent or solvent mixture and/or using adsorbents. In this thesis, the PFE technique was compared to the twelve principles of Green Chemistry, and it was shown that it follows several of the principles, thus giving a major contribution to sustainable chemistry.

Made available in DSpace on 2014-12-17T14:46:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 IzabellaBL_DISSERT.pdf: 2225362 bytes, checksum: 5266709fbea2ce750a1dad0fdbd90e66 (MD5) Previous issue date: 2012-02-17 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Cient?fico e Tecnol?gico / Leprosy is a chronic infectious-contagious disease, caused by Mycobacterium leprae, manifested by dermatological and neurological signs and symptoms and has great disabling power. It was marked by a strong stigma throughout its history, since its bearers represented a threat, target of fear and social contempt. Currently, leprosy has treatment and cure, and the need to separate the diseased from family and social environment is no more necessary. However, patients still suffer prejudice and discrimination. This study aimed to understand the social representations of leprosy that interfere modifying mental health of the patient with leprosy in relation to stigma and prejudice. This is a descriptive and exploratory study, with qualitative approach, which involved 22 users of the Special Care Clinic in Infectious Diseases at the Hospital Giselda Trigueiro, located in Natal / RN. They were in use of multidrug therapy in the period of data collection, were of both sexes, aged between 16 and 80 years of age and classified as paucibacillary or multibacillary. The study was approved by the UFRN Ethics in Research Committee. Data collection was performed by filling the questionnaire identification and then for conducting the semi-structured interview, which was recorded. After the end of data collection, there was the construction of tables and graphs, using the Microsoft Excel Start 2010 for proper characterization of the research subjects; and for the treatment of the data obtained from the interviews, was used the Content Analysis and based on the Theory of Social Representations. The subjects studied were mostly male (64%), married or in a stable relationship (68%), concentrated in the age group 50-60 years (36%) and 28-38 years (23%), had at most elementary education (65%) and were low-income (59%). Of the total respondents, 64% were classified as multibacillary, with predominantly dimorfous form, and 50% had disability grade I or II, with different periods of diagnosis. The reports originate two categories: 1. The negative meanings of illness and leprosy; and 2. The positive meanings of illness in leprosy, which were subsequently subdivided into subcategories. Thus, it was found that in the group studied, the social representation of leprosy experiences a moment of transition, as regards the understanding of the disease and its way of experiencing the disease process. Such representation is anchored in the quality of information on the disease of its bearers and aimed at an attempt to face the illness of leprosy as a "normal process". It was found in this study that the transition is due to the work of combating stigma and consequences of leprosy, which is able to gradually transform reality, both regarding the team work of reference, and in relation to a broader character, of actions of health education, which favors overcoming of psychosocial disabilities / A hansen?ase ? uma doen?a infecto-contagiosa, cr?nica, causada pelo Mycobacterium leprae, que se manifesta por sinais e sintomas dermatoneurol?gicos e tem grande poder incapacitante. Foi marcada por um forte estigma durante toda a sua hist?ria, pois seus portadores representavam uma amea?a, alvo do medo e do desprezo social. Atualmente, a hansen?ase tem tratamento e cura, e n?o h? mais a necessidade de separar os seus portadores do meio familiar e social, no entanto, eles ainda sofrem preconceito e discrimina??o. Este estudo teve como objetivo apreender as representa??es sociais da hansen?ase que interferem modificando a sa?de mental do portador da hansen?ase no que diz respeito ao estigma e preconceito. Trata-se de um trabalho descritivo e explorat?rio com abordagem qualitativa, do qual participaram 22 usu?rios do Ambulat?rio de atendimento especializado em doen?as infectocontagiosas do Hospital Giselda Trigueiro, localizado em Natal/RN. Os mesmos estavam em uso da poliquimioterapia no per?odo da coleta de dados, eram de ambos os sexos, com faixa et?ria entre 16 e 80 anos de idade e classificados como paucibacilar ou multibacilar. A pesquisa foi aprovada pelo Comit? de ?tica e Pesquisa da UFRN. A coleta de dados foi realizada com o preenchimento do question?rio de identifica??o e pela realiza??o da entrevista semi-estruturada, a qual foi gravada. Ap?s o fim da coleta de dados, realizou-se a constru??o de tabelas e gr?ficos, com a utiliza??o do Microsoft Excel Start 2010, para a devida caracteriza??o dos sujeitos da pesquisa; e o tratamento dos dados obtidos a partir das entrevistas gravadas realizou-se atrav?s da An?lise de Conte?do, com base na Teoria das Representa??es Sociais. Os sujeitos estudados eram, em sua maioria, do sexo masculino (64%), casados ou em uni?o est?vel (68%), se concentravam na faixa et?ria de 50 a 60 anos (36%) e 28 a 38 anos (23%), tinham no m?ximo ensino fundamental completo (65%) e eram de baixa renda (59%). Do total de entrevistados, 64% eram classificados como multibacilares, com predom?nio da forma dimorfa; e 50% possu?am grau de incapacidade I ou II; com diferentes per?odos de diagn?stico. Os relatos originaram duas categorias: 1. Os significados negativos do adoecer em hansen?ase e 2. Os significados positivos do adoecer em hansen?ase; as quais foram, posteriormente, subdivididas em subcategorias. Dessa maneira, foi constatado que, no grupo estudado, a representa??o social da hansen?ase vivencia um momento de transi??o, no que tange o entendimento sobre a doen?a e a sua maneira de experienciar o seu processo de adoecimento. Tal representa??o encontra-se ancorada na qualidade da informa??o sobre a doen?a que seus portadores e objetivada na tentativa de encarar o adoecer em hansen?ase como um processo normal . Constatou-se no estudo que esse processo de transi??o se deve ao trabalho desenvolvido de combate ao estigma e das sequelas da hansen?ase, que tem conseguindo, aos poucos, transformar a realidade, tanto no que se refere ao trabalho da equipe de refer?ncia, quanto no que se refere a um car?ter mais amplo, de a??es de educa??o em sa?de, o que favorece a supera??o das incapacita??es psicossociais

Made available in DSpace on 2014-12-17T14:03:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 SergioRFA_TESE.pdf: 7822699 bytes, checksum: 8e76eaff31bfe4bd8789eb8d81e15701 (MD5) Previous issue date: 2013-12-20 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior / O tropismo do M. leprae pela pele e nervos perif?ricos, confere ? hansen?ase caracter?sticas peculiares, tais como perda de sensibilidade e deformidades teciduais. Hipotetizamos que a susceptibilidade do hospedeiro ? gerida por um complexo conjunto de fatores diferentes, como aumento da express?o dos genes ERBB2, PARK2 e PACRG e/ou o ganho de atividade dos seus produtos g?nicos, em virtude de polimorfismos nesses genes. Outro fator que hipotetizamos estar contribuindo com a susceptibilidade ? hansen?ase, juntamente com os fatores gen?ticos, ? a exist?ncia de elementos de risco entre pessoas suscept?veis, tais como, co-morbidades e exposi??o prolongada ao pat?geno. Tamb?m hipotetizamos que a distribui??o desigual da doen?a em algumas ?reas populacionais, com forma??o de aglomerados, seja devido, a elevada densidade populacional de pessoas suscept?veis em ?reas de risco por tempo prolongado. Portanto, para comprovar essas hip?teses tem-se os seguintes objetivos: 1) Testar o envolvimento de polimorfismos nos genes ERBB2, PARK2 e PACRG com a hansen?ase em duas ?reas end?micas, mas com popula??es distintas; 2) Testar a rela??o de fatores de risco exposicionais e co-morbidades, dentre outros, com o aumento de susceptibilidade ? hansen?ase na popula??o do Rio Grande do Norte e 3) Avaliar se fatores como densidade demogr?fica e padr?o socioecon?mico e sanit?rio est?o contribuindo com a desigual distribui??o da doen?a em ?rea end?mica para a hansen?ase no estado do Rio Grande do Norte. Este estudo foi desenvolvido em 3 etapas: Foram genotipados marcadores no gene ERBB2 na popula??o de Bel?m/PA, usando uma abordagem familiar. Num segundo momento foram genotipados marcadores nos genes ERBB2, PARK2 e PACRG na popula??o do Rio Grande do Norte, usando uma abordagem caso-controle. Num terceiro momento, foi avaliada a distribui??o espacial da hansen?ase em Nova Cruz/RN. Foram feitas an?lises in silico, que apontaram para uma muta??o delet?ria no gene ERBB2 (rs1058808) e outra no gene PARK2 (rs1801334). Atrav?s de an?lise de modelagem molecular tamb?m foi encontrada uma muta??o potencialmente capaz de alterar a fun??o da prote?na ErbB2 (rs1801200). A genotipagem da popula??o de Bel?m/PA mostrou como fatores de risco dentre as fam?lias analisadas os polimorfismos rs2517956 e rs1058808 no gene ERBB2. Na genotipagem da popula??o do Rio Grande do Norte, encontramos como fatores de risco, os polimorfismos rs6915128 e rs1801334 para a hansen?ase per se e suas formas cl?nicas e rs1333955 para o ENH. Encontramos dois fatores de risco que justificaram a distribui??o desigual dos casos de hansen?ase na cidade de Nova Cruz/RN, a elevada densidade demogr?fica e o maior tempo de moradia de pessoas suscept?veis em ?reas de risco. Os genes PARK2, PACRG e ERBB2 participam da patog?nese da hansen?ase e, portanto s?o s?rios candidatos a alvos para agentes terap?uticos. Nesse estudo foi encontrado um SNP que tamb?m j? havia sido associado ao mal de Parkinson, e portanto, pode haver um compartilhamento funcional da parquina entre a hansen?ase e o Parkinsonismo. Nesse estudo tamb?m foi encontrado pela primeira vez associa??o entre variantes gen?ticas de ERBB2 e a hansen?ase

Made available in DSpace on 2014-12-17T14:13:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 JoseWQ_TESE.pdf: 1778874 bytes, checksum: 7ff2c9f470b5b3873803d39a321ee362 (MD5) Previous issue date: 2009-10-05 / This work demonstrates the importance of using tools used in geographic information systems (GIS) and spatial data analysis (SDA) for the study of infectious diseases. Analysis methods were used to describe more fully the spatial distribution of a particular disease by incorporating the geographical element in the analysis. In Chapter 1, we report the historical evolution of these techniques in the field of human health and use Hansen s disease (leprosy) in Rio Grande do Norte as an example. In Chapter 2, we introduced a few basic theoretical concepts on the methodology and classified the types of spatial data commonly treated. Chapters 3 and 4 defined and demonstrated the use of the two most important techniques for analysis of health data, which are data point processes and data area. We modelled the case distribution of Hansen s disease in the city of Mossor? - RN. In the analysis, we used R scripts and made available routines and analitical procedures developed by the author. This approach can be easily used by researchers in several areas. As practical results, major risk areas in Mossor? leprosy were detected, and its association with the socioeconomic profile of the population at risk was found. Moreover, it is clearly shown that his approach could be of great help to be used continuously in data analysis and processing, allowing the development of new strategies to work might increase the use of such techniques in data analysis in health care / O presente trabalho demonstra a import?ncia do uso de ferramentas relacionadas ? sistemas de informa??o geogr?fica (SIG) e an?lise espacial de dados (AED) em estudos de doen?as infecciosas. M?todos de an?lise foram usados para descrever de forma mais abrangente a distribui??o espacial de doen?as a partir da incorpora??o do elemento geogr?fico na an?lise. No Cap?tulo 1 relata-se a evolu??o hist?rica da aplica??o destas t?cnicas no campo da sa?de humana e elege-se a hansen?ase no estado do Rio Grande do Norte como exemplo de aplica??o. No Cap?tulo 2 introduzem-se alguns conceitos te?ricos b?sicos sobre a metodologia e classificam-se os tipos de dados espaciais comumente tratados. Os Cap?tulos 3 e 4 definem e demonstram a utiliza??o das mais importantes t?cnicas de an?lise para os dois principais tipos de dados encontrados na sa?de, quais sejam dados de processos pontuais e dados de ?rea, focalizando como estudo de caso a hansen?ase na cidade de Mossor? RN. Na an?lise, ? priorizada a utiliza??o do sistema R, disponibilizando-se scripts de rotinas e procedimentos de an?lise desenvolvidos pelo autor que podem ser facilmente utilizados por pesquisadores de diversas ?reas. Como resultados pr?ticos, importantes ?reas de risco da hansen?ase em Mossor? foram detectadas e sua forte associa??o com o perfil socioecon?mico da popula??o sob risco foi constatada. Al?m disso, estima-se que este trabalho possa vir a incrementar a utiliza??o de tais t?cnicas na an?lise de dados na ?rea de sa?de

Made available in DSpace on 2014-12-17T14:13:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 SilviaRS_TESE.pdf: 1377136 bytes, checksum: 8255e0cbf50a79a12b6f6b0f3965241e (MD5) Previous issue date: 2010-10-08 / Lithiasis is considered a public health issue due to its high prevalence and rates of recurrence. Objective: To identify risk factors for lithiasis in kidney stone patients from Fortaleza, Brazil. In the first stage of the study, the medical records of 197 patients with urinary lithiasis covering the period 1996 2006 were analyzed with regard to clinical and metabolic data. In the second stage, 340 kidney stones were submitted to morphological examination under 10x magnification. According to the external morphology and the cut surface, the stones were classified as pure or mixed, and major and minor components were identified. In addition, the stone fragments of 25 patients treated with lithotripsy were submitted to morphological analysis. In the third stage, a subsample of 50 stones was used in a double-blind comparison of morphological and chemical findings. Results were expressed as concordant, partly concordant (discordant for minor components) or discordant (discordant for major components). The average age of first symptoms was 35.8?13.3 years, with no significant difference between the genders. The male/female ratio was 1:1.7. Recurrence was reported in 53.3% of cases. The main metabolic changes observed were hypernatriuria (80.7%), hypercalciuria (48.7%), low urine volume (43.7%), hyperoxaluria (30.5%) and hyperuricosuria (17.3%). Pure stones represented 34.7% of the total sample of 340 stones. The most common route of elimination was spontaneous for pure stones (49.1%) and surgical for mixed stones (50.5%). Pure stones consisted most frequently of calcium oxalate (OxCa) (59.3%) and uric acid (UA) (23.7%), the former prevalent in women, the latter prevalent in men. The most frequently observed component in mixed stones was OxCa (67.1%), followed by carbapatite (11.2%) and struvite (7.9%). The main components were OxCa and UA for men, and carbapatite and struvite for women. Nearly half (48%) the 25 analyzed fragments were pure, consisting of calcium oxalate dihydrate (COD) (56%), calcium oxalate monohydrate (COM) (48%), phosphate (32%) and UA (20%). Four patients (16%) had infectious stones. In the chemical analysis of the subsample of 50 stones, the most 64 frequently observed major components were calcium (70%), oxalate (66%), ammonium (56%), urate (28%) and carbonate (24%). In the morphological analysis, the main components were calcium and magnesium phosphate (32%), COM (24%), UA (20%), COD (18%) and cystine (6%). Morphological and chemical findings were totally concordant for 38% of the stones, partly concordant in 52% and discordant in 10%. Conclusion: The risk factors for lithiasis in kidney stone patients from Fortaleza (Brazil) were hyperoxaluria, hypercalciuria with or without hypernatriuria, hyperuricosuria and low urine volume / A lit?ase urin?ria ? um problema de sa?de p?blica pela elevada preval?ncia e recorr?ncia. Objetivo: O objetivo do presente estudo foi determinar os fatores litog?nicos em pacientes com lit?ase urin?ria de Fortaleza, Cear?. O estudo foi dividido em tr?s fases: na primeira, realizouse estudo documental de prontu?rios de 197 pacientes com lit?ase urin?ria atendidos entre 1996 e 2006, para a an?lise de dados cl?nicos e avalia??o metab?lica. Na segunda fase foi realizada uma avalia??o morfol?gica de 340 c?lculos urin?rios, classificando-os como puro ou misto e os componentes em majorit?rios ou minorit?rios. Foi tamb?m avaliado fragmentos de c?lculos de 25 pacientes tratados com litotripsia. Na terceira fase utilizou-se uma amostra de 50 c?lculos para um estudo duplo-cego comparando a an?lise morfol?gica e a an?lise qu?mica. Os resultados foram considerados como concordantes, parcialmente concordantes (componentes minorit?rios discordantes) ou discordantes (componentes majorit?rios discordantes). A m?dia de idade dos 197 pacientes no primeiro sintoma foi 35,8 ? 13,3 anos, n?o houve diferen?a entre os g?neros. A rela??o homem:mulher foi de 1:1,7, 53,3% eram recorrentes. As principais altera??es metab?licas foram hipernatri?ria (80,7%), hipercalci?ria (48,7%), volume urin?rio baixo (43,7%), hiperoxal?ria (30,5%) e hiperuricos?ria (17,3%). Entre os 340 c?lculos analisados, 34,7% foram puros. A via de elimina??o mais comum dos c?lculos puros foi a espont?nea (49,1%) e a dos mistos foi a cir?rgica (50,5%). Os c?lculos mais freq?entes foram o oxalato de c?lcio (OxCa=59,3%) e ?cido ?rico (AU=23,7%), sendo o primeiro mais comum nas mulheres e o segundo nos homens. Entre os c?lculos mistos, o OxCa foi o principal componente (67,1%), seguido da carbapatita (11,2%) e estruvita (7,9%). Os principais componentes nos homens foram o OxCa e AU, enquanto que nas mulheres foram a carbapatita e estruvita. Entre os 25 fragmentos de c?lculos analisados, 48% foram puros. Os componentes encontrados foram: OxCa dihidratado-COD (56%), OxCa monohidratado-COM (48%), fosfato (32%), AU (20%). Quatro pacientes (16%) apresentaram c?lculo de infec??o. Na an?lise qu?mica dos 50 c?lculos urin?rios os principais componentes majorit?rios foram c?lcio (70%), xvi oxalato (66%), am?nio (56%), urato (28%) e carbonato (24%), enquanto que na morfol?gica foram fosfato de c?lcio e magnesiano (32%), COM (24%), AU (20%), COD (18%) e cistina (6%). Concord?ncia total foi observada em 38%, parcial em 52% e discord?ncia em 10%. Conclus?o: Os fatores de risco litog?nicos na regi?o de Fortaleza foram hiperoxal?ria, hipercalci?ria com ou sem hipernatri?ria, hiperuricos?ria e volume urin?rio reduzido

Esta tese trata do desenvolvimento de métodos bioanalíticos, baseados na técnica de eletroforese capilar, para duas aplicações distintas: a análise de complexos formados pela ligação entre proteínas e DNA e detecção e monitoramento de hidrólise de GTP catalisada por enzimas. No primeiro capítulo descreve-se uma investigação sobre a viabilidade de ensaios tipo EMSA (?electrophoretic mobility shift assay?) em chips com microcanais para eletroforese. Os fatores de transcrição purificados c-Jun(AP1) e p-50(NFkB) foram usados nos estudos de ligação a sondas de DNA fita dupla contendo as seqüências consenso de ligação dos fatores AP1, NFkB e AP2. As sondas de DNA sintéticas continham como modificação a marcação com o corante fluorescente Cy5 ligado à extremidade 5?, sendo que as mesmas seqüências não marcadas foram usadas para experimentos de competição. Ensaios tipo EMSA em chip puderam ser realizados em cerca de 2 h com baixo consumo de amostra e sem a necessidade de usar marcação com material radioativo. A sondas de DNA e os complexos formados nas reações de ligação foram analisados no Bioanalyzer usando tanto o procedimento padrão para a análise de DNA quanto um protocolo modificado. Nesta modificação não foi usado corante de intercalação mas 4,9 nM de Cy5-dCTP que foi adicionado ao gel, permitindo apenas a detecção de DNA previamente marcado. Apesar da necessidade de ajustes no método para cada proteína testada, foi mostrado o potencial de se substituir o método de EMSA em gel por métodos baseados em eletroforese em chip. Um experimento de competição foi realizado com sucesso mostrando a ligação do fator de transcrição p-50 à sonda contendo a seqüência consenso NFkB. Este experimento foi considerado como prova de princípio para a hipótese estudada. No segundo capítulo relata-se o desenvolvimento de um método para a detecção e monitoramento in vitro de atividade nucleotídeo-trifosfatase. O método que se mostrou robusto e reprodutível foi aplicado para investigar a atividade GTPase de uma proteína recombinante contendo o domínio catalítico de uma septina humana SEPT4 / Bradeiona (GST-rDGTPase). O exemplo de aplicação demonstra que a técnica de eletroforese capilar pode substituir o método tradicionalmente usado com marcação radioativa para detecção de atividade GTPase inclusive em estudos de cinética enzimática. Os parâmetros cinéticos determinados para a GST-rDGTPase foram: vmax = 1.7 &#956; M min-1 ± 0.1 and Km = 1.0 mM ± 0.3; kcat = 9 x 10-3 SM-1. O efeito de co-fatores como Mg2+ and Mn2+ também foi estudado. O método analítico descrito também se mostrou útil para a análise de di- e trifosfatos de outros nucleotídeos. / This Thesis concerns on the development of capillary electrophoresis-based bioanalytical methods for two distinct applications: DNA-protein binding analysis and monitoring of enzyme-catalyzed GTP hydrolysis. In the first chapter, the feasibility of on-chip electrophoretic mobility-shift assays (EMSA) is investigated. Purified transcription factors c-Jun(AP1) and p-50(NFkB) were used for binding studies to dsDNA probes containing the consensus sequences from AP1, NFkB and AP2 regulatory sequences. DNA probes were modified at the 5?-end with the Cy5 and unlabeled oligos were used for competition experiments. On-chip-EMSA could be carried out within ca. 2 h with low sample consumption and no need to handle radioactive material. Both, the dsDNA probes and the shifted oligos from binding reactions were analyzed on the ?2100 Bioanalyzer? using either, the standard procedure for DNA analysis or a modified protocol, in which no intercalating dye was used. Instead, 4.9 nM Cy5-dCTP was added to the gel matrix allowing the detection of only Cy5-labeled DNA. Despite the need of specific adjustments for each protein, we have shown the potential for replacing slab gel-based EMSA for on-chip methods. A competition experiment to show sequence specific binding of the transcription factor p-50 to the consensus sequence NFkB is presented as a proof of principle. In chapter II, a capillary electrophoresis-based method for in vitro detection and monitoring of nucleotide-triphosphatase activity is described. This robust and reproducible method was used to investigate GTPase activity of a recombinant protein construct containing the catalytic domain of Human SEPT4 /Bradeion ? (GST-rDGTPase). The application example demonstrates that the capillary electrophoresis technique can replace classical radioactive methods for GTPase activity assays and may be used as a routine analytical tool. Enzyme kinetics of GST-rDGTPase was studied and yielded the following kinetic parameters: vmax = 1.7 &#956;M min-1 ± 0.1 and Km = 1.0 mM ± 0.3; kcat = 9 x 10-3 s-1. In addition the effect of co-factors such as Mg2+ and Mn2+ in the catalytic activity was investigated. The described analytical method was also shown to be useful to analyze di- and triphosphated forms of other nucleotides.