Gerbstoffe stabilisieren die Kollagenmatrix der Haut, in dem sie auf unterschiedlichste Art und Weise chemische Quervernetzungen herstellen. Es bleibt jedoch bis heute weitgehend unbeantwortet, auf welcher hierarchischen Ebene der Kollagenstruktur diese Wechselwirkung stattfindet und wie stringent eine solche Bindung mindestens sein muss, um einer Substanz den Charakter eines Gerbstoffes zu verleihen. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde ein Modellsystem entwickelt, das es gestattet, Aussagen darüber zu treffen, auf welcher Strukturebene des Kollagens diese Wechselwirkung stattfindet. Dazu wurde auf ein „bottom-up“ Verfahren zurückgegriffen, bei dem der Gerbstoff nicht auf Haut aufgebracht, sondern die Fibrillen in Anwesenheit von verschiedenen Wirkstoffen neu gebildet werden. Für die Untersuchungen wurden Vertreter aus der Substanzklasse der Polymere ausgewählt. Es kam Polyacrylsäure zum Einsatz, die als Fettungsmittel genutzt wird, und Polymethacrylsäure, welche in der Produktion als Nachgerbstoff verwendet wird. Vertreter ungeladener Polymere waren Ethylen-, Diethylen- und Polyethylenglycol, wobei hier die unterschiedlichen Molekülgrößen im Vergleich von Bedeutung waren. Des Weiteren wurde Glutaraldehyd als Vertreter eines gerbenden kovalenten Vernetzers untersucht. Kollagen Typ I Fibrillen wurden in vitro ausgehend von der Monomerform assembliert, und mit UV/Vis-Spektroskopie wurde verfolgt, ob und gegebenenfalls wie die Polymere die Kinetik der in vitro Fibrillogenese verändern. Dabei wurde beobachtet, dass bis auf Polyethylenglycol alle eingesetzten Substanzen auf unterschiedlichste Art schon auf der kleinsten Kollageneinheit - der Tripelhelix wirken. Diese Daten wurden mittels eines mathematischen Modells ausgewertet, das es ermöglicht, die Fibrillogenese in Teilreaktionen zu gliedern und die geschwindigkeitsbestimmenden Schritte zu evaluieren. So konnte ermittelt werden, dass trotz ähnlich erscheinender Fibrillenbildungskinetiken große Unterschiede zwischen Polyacrylsäure und Polymethacrylsäure bezüglich ihres Hauptwirkortes in den hierarchischen Strukturebenen des Kollagens auftreten. Während der Nachgerbstoff Polymethacrylsäure schon in geringen Konzentrationen in großem Maße in alle Teilprozesse der Fibrillogenese eingreift, zeigt Polyacrylsäure die größten Effekte auf mikrofibrillärer Ebene - einer Fibrillensubstruktur. Dieser Einfluss spiegelt sich in Morphologieänderungen in Form von so genannten gesplitteten Fibrillen wider, welche mittels atomkraftmikroskopischen Untersuchungen beobachtet werden konnten. Zusätzlich scheint Polymethacrylsäure ab einer kritischen Konzentration die Fibrillenbildung über einen alternativen Weg ablaufen zu lassen, was sich in der morphologischen Betrachtung in Form von langen, dünnen Fibrillen äußert, welche nicht mehr in der Lage sind zu höheren Strukturen zu verdrillen. Um zusätzlich die Art der Bindung näher zu charakterisieren, wurde ein weiteres Verfahren entwickelt, welches die Umkehrreaktion der in vitro Fibrillogenese beschreibt. Diese Methode der so genannten Deassemblierung ermöglicht eine Unterscheidung zwischen elektrostatischen Wechselwirkungen und kovalenten Bindungen zwischen Kollagen und Polymer, indem die Fibrille wieder in ihre nativen Monomeruntereinheiten zerlegt und gleichzeitig studiert wird, ob sich die Polymere vom Kollagen durch Ladungseintrag lösen lassen. Polyethylenglycol und seine niedermolekularen Äquivalente lassen sich in saurem Milieu problemlos von Kollagen abwaschen, was für sehr schwache Wechselwirkungen spricht. Kovalente Bindungen, wie etwa zwischen Kollagen und Glutaraldehyd lassen sich mit dieser Methode nicht lösen. Polyacrylsäure und Polymethacrylsäure lassen sich nur zu einem geringen Anteil von Kollagen lösen, was auf unterschiedlich affine Bindungsplätze der Polymere an Kollagen deutet. Beeindruckender Weise ist es für ausschließlich mit Polymethacrylsäure vernetztes Kollagen nicht möglich, dieses wieder in seine Untereinheiten zu zerlegen. Polymethacrylsäure ist demnach in der Lage die Kollagenmatrix auch ohne die Ausbildung kovalenter Bindungen ausreichend zu stabilisieren. Damit können die eingesetzten und entwickelten Verfahren als Screeningmethoden gesehen werden, welche schon vor dem eigentlichen Gerbversuch weit reichende Auskünfte über ein mögliches Gerbverhalten der zu Untersuchung eingesetzten Substanz liefern. Die vorliegenden Ergebnisse erlauben Aussagen über den molekularen Charakter der Kollagen - Polymer Wechselwirkung und stellen somit einen Beitrag zum Verständnis der Gerbung dar.

Das Strukturprotein Kollagen ist der Hautbestandteil von Haut und somit geeignet, die Gerbung auf molekularer Ebene zu studieren. Das schon sehr alte Handwerk des Gerbens hat das Ziel die Kollagenmatrix so zu stabilisieren, dass diese stabil und flexibel bleibt, auch wenn die Feuchtigkeit entweicht und das Leder hohen Temperaturen ausgesetzt ist. Als Größe zur Charakterisierung der Gerbung dient die Schrumpfungstemperatur. Erkenntnisgewinn auf molekularer Ebene ist Ziel der Untersuchungen, da die Mechanismen der Gerbung bis heute nicht vollständig verstanden sind und grundlegend für die Synthese neuer Gerbstoffe sind. Die Kinetik der Assemblierung von Kollagenmonomeren zu Fibrillen wird spektroskopisch studiert. Der Einfluss von Additiven kann somit auf molekularer Ebene evaluiert werden. Ergänzend wird die Morphologie der Assemblate betrachtet. Studien der anschließenden Deassemblierung liefern Informationen über die Festigkeit der Kollagenmatrix. Für die Korrelation der Modellreaktion mit dem Realsystem der Gerbung werden Schrumpfungstemperaturen gemessen und Strukturuntersuchungen durchgeführt. Für diese Untersuchungen wird Hautpulver eingesetzt, um homogene Ergebnisse zu garantieren. Drei praxisrelevante Stoffgruppen, nämlich Chrom, Aldehyde und Polyphenole, wurden untersucht. Der Hauptgerbstoff Chrom zeigt bei den Assemblierungsuntersuchungen nur geringe Auswirkungen auf das Modellsystem. Die Deassemblierung hingegen lässt die gute Gerbeigenschaft klar erkennen. Zur Erklärung des Streifenmusters, das bei chromgegerbten und somit positiv gestainten Fibrillen im TEM zu erkennen ist, wurde ein theoretischer Ansatz unternommen. Glutaraldehyd und Formaldehyd werden zur Gerbung benutzt. Aldehyde vernetzen die Kollagenmatrix kovalent. Die Untersuchung der homologen Reihe der Dialdehyde wurde hinsichtlich einer Tendenz oder einem Optimum in der Moleküllänge untersucht. Die Aldehyde vernetzen die Monomere, sodass in den Assemblierungskinetiken nur verminderte Plateauhöhen erreicht werden. Die Minimierung der Plateauhöhe kann nicht quantitativ mit der Gerbwirkung gleichgesetzt werden. Mit Aldehydzusatz assemblierte Fibrillen haben ein unverändertes Erscheinungsbild. Die Schlussfolgerung ist, dass die Fibrillenstruktur nicht verändert, aber dezimiert ist. Da nur Formaldehyd, Glyoxal und Glutaraldehyd als reine wässrige Lösung vorlagen mussten die andern drei Dialdehyde hergestellt werden. Dabei sind zusätzliche Substanzen in den Lösungen enthalten, die die Ergebnisse stören. Einen Trend, der mit der Moleküllänge einhergeht, konnte nicht beobachtet werden. Dies ist mit der flexiblen Ordnung der Moleküle in Lösung - im Gegensatz zur Kollagenmatrix in der Haut - zu begründen. Eine kombinierte Wirkung von Chrom und Aldehyd konnte bei der Assemblierung nachvollzogen werden und belegt die Annahmen zur Gerbung aus der Literatur, dass die Gerbung über die sauren Seitenketten bzw. über die Aminogruppen geschieht. Die untersuchten Polyphenole haben keine gerbende Wirkung, sind dem Naturgerbstoff Tannin chemisch aber sehr ähnlich, sodass der Unterschied in der räumlichen Struktur liegen muss. Die Kondensate werden bezüglich ihrer Kettenlänge und der Anzahl ihrer funktionellen Gruppen analysiert. Die Störung der Assemblierung ist bei Zusatz von Phenolkondensaten ist stärker als bei den anderen Testsubstanzen, was eine starke Interaktion zeigt. Messungen der Schrumpfungstemperaturen an Hautpulver ergaben, dass die Syntane keinen waschstabilen Effekt haben. Die Anlagerung an das Kollagen ist folglich zu schwach. Parallele TEM-Analysen ergaben, dass der pH-Wert bei der Vernetzung einen Einfluss auf die Intensität der Streifung hat. Mit zunehmendem pH-Wert erscheint die Streifung intensiver, bis hin zu einer erkennbaren Substreifung. Bei verschieden hohen Schrumpfungstemperaturen zeichnen sind zwei Aussagen ab. Zum einen ist mikroskopisch klar zu erkennen, wenn die Probe denaturiert ist, also über ihrer Schrumpfungstemperatur gekommen ist. Zum anderen ist ein leicht verminderter D-Abstand mit zunehmenden Schrumpfungstemperaturen zu verzeichnen. Besitzen Additive eine gerbende Wirkung, so zeigt sich dies nicht analog im Assemblierungsmodell oder in der Morphologie der Fibrillen. Eindeutige Rückschlüsse sind nicht zu ziehen. Bei der Deassemblierung äußert sich die Gerbwirkung aber immer durch eine verminderte Löslichkeit der Matrix. Daher ist dies eine wertvolle Technik für die Grundlagenforschung in der Gerbung.

Gerbstoffe stabilisieren die Kollagenmatrix der Haut, in dem sie auf unterschiedlichste Art und Weise chemische Quervernetzungen herstellen. Es bleibt jedoch bis heute weitgehend unbeantwortet, auf welcher hierarchischen Ebene der Kollagenstruktur diese Wechselwirkung stattfindet und wie stringent eine solche Bindung mindestens sein muss, um einer Substanz den Charakter eines Gerbstoffes zu verleihen. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde ein Modellsystem entwickelt, das es gestattet, Aussagen darüber zu treffen, auf welcher Strukturebene des Kollagens diese Wechselwirkung stattfindet. Dazu wurde auf ein „bottom-up“ Verfahren zurückgegriffen, bei dem der Gerbstoff nicht auf Haut aufgebracht, sondern die Fibrillen in Anwesenheit von verschiedenen Wirkstoffen neu gebildet werden. Für die Untersuchungen wurden Vertreter aus der Substanzklasse der Polymere ausgewählt. Es kam Polyacrylsäure zum Einsatz, die als Fettungsmittel genutzt wird, und Polymethacrylsäure, welche in der Produktion als Nachgerbstoff verwendet wird. Vertreter ungeladener Polymere waren Ethylen-, Diethylen- und Polyethylenglycol, wobei hier die unterschiedlichen Molekülgrößen im Vergleich von Bedeutung waren. Des Weiteren wurde Glutaraldehyd als Vertreter eines gerbenden kovalenten Vernetzers untersucht. Kollagen Typ I Fibrillen wurden in vitro ausgehend von der Monomerform assembliert, und mit UV/Vis-Spektroskopie wurde verfolgt, ob und gegebenenfalls wie die Polymere die Kinetik der in vitro Fibrillogenese verändern. Dabei wurde beobachtet, dass bis auf Polyethylenglycol alle eingesetzten Substanzen auf unterschiedlichste Art schon auf der kleinsten Kollageneinheit - der Tripelhelix wirken. Diese Daten wurden mittels eines mathematischen Modells ausgewertet, das es ermöglicht, die Fibrillogenese in Teilreaktionen zu gliedern und die geschwindigkeitsbestimmenden Schritte zu evaluieren. So konnte ermittelt werden, dass trotz ähnlich erscheinender Fibrillenbildungskinetiken große Unterschiede zwischen Polyacrylsäure und Polymethacrylsäure bezüglich ihres Hauptwirkortes in den hierarchischen Strukturebenen des Kollagens auftreten. Während der Nachgerbstoff Polymethacrylsäure schon in geringen Konzentrationen in großem Maße in alle Teilprozesse der Fibrillogenese eingreift, zeigt Polyacrylsäure die größten Effekte auf mikrofibrillärer Ebene - einer Fibrillensubstruktur. Dieser Einfluss spiegelt sich in Morphologieänderungen in Form von so genannten gesplitteten Fibrillen wider, welche mittels atomkraftmikroskopischen Untersuchungen beobachtet werden konnten. Zusätzlich scheint Polymethacrylsäure ab einer kritischen Konzentration die Fibrillenbildung über einen alternativen Weg ablaufen zu lassen, was sich in der morphologischen Betrachtung in Form von langen, dünnen Fibrillen äußert, welche nicht mehr in der Lage sind zu höheren Strukturen zu verdrillen. Um zusätzlich die Art der Bindung näher zu charakterisieren, wurde ein weiteres Verfahren entwickelt, welches die Umkehrreaktion der in vitro Fibrillogenese beschreibt. Diese Methode der so genannten Deassemblierung ermöglicht eine Unterscheidung zwischen elektrostatischen Wechselwirkungen und kovalenten Bindungen zwischen Kollagen und Polymer, indem die Fibrille wieder in ihre nativen Monomeruntereinheiten zerlegt und gleichzeitig studiert wird, ob sich die Polymere vom Kollagen durch Ladungseintrag lösen lassen. Polyethylenglycol und seine niedermolekularen Äquivalente lassen sich in saurem Milieu problemlos von Kollagen abwaschen, was für sehr schwache Wechselwirkungen spricht. Kovalente Bindungen, wie etwa zwischen Kollagen und Glutaraldehyd lassen sich mit dieser Methode nicht lösen. Polyacrylsäure und Polymethacrylsäure lassen sich nur zu einem geringen Anteil von Kollagen lösen, was auf unterschiedlich affine Bindungsplätze der Polymere an Kollagen deutet. Beeindruckender Weise ist es für ausschließlich mit Polymethacrylsäure vernetztes Kollagen nicht möglich, dieses wieder in seine Untereinheiten zu zerlegen. Polymethacrylsäure ist demnach in der Lage die Kollagenmatrix auch ohne die Ausbildung kovalenter Bindungen ausreichend zu stabilisieren. Damit können die eingesetzten und entwickelten Verfahren als Screeningmethoden gesehen werden, welche schon vor dem eigentlichen Gerbversuch weit reichende Auskünfte über ein mögliches Gerbverhalten der zu Untersuchung eingesetzten Substanz liefern. Die vorliegenden Ergebnisse erlauben Aussagen über den molekularen Charakter der Kollagen - Polymer Wechselwirkung und stellen somit einen Beitrag zum Verständnis der Gerbung dar.

Das Strukturprotein Kollagen ist der Hautbestandteil von Haut und somit geeignet, die Gerbung auf molekularer Ebene zu studieren. Das schon sehr alte Handwerk des Gerbens hat das Ziel die Kollagenmatrix so zu stabilisieren, dass diese stabil und flexibel bleibt, auch wenn die Feuchtigkeit entweicht und das Leder hohen Temperaturen ausgesetzt ist. Als Größe zur Charakterisierung der Gerbung dient die Schrumpfungstemperatur. Erkenntnisgewinn auf molekularer Ebene ist Ziel der Untersuchungen, da die Mechanismen der Gerbung bis heute nicht vollständig verstanden sind und grundlegend für die Synthese neuer Gerbstoffe sind. Die Kinetik der Assemblierung von Kollagenmonomeren zu Fibrillen wird spektroskopisch studiert. Der Einfluss von Additiven kann somit auf molekularer Ebene evaluiert werden. Ergänzend wird die Morphologie der Assemblate betrachtet. Studien der anschließenden Deassemblierung liefern Informationen über die Festigkeit der Kollagenmatrix. Für die Korrelation der Modellreaktion mit dem Realsystem der Gerbung werden Schrumpfungstemperaturen gemessen und Strukturuntersuchungen durchgeführt. Für diese Untersuchungen wird Hautpulver eingesetzt, um homogene Ergebnisse zu garantieren. Drei praxisrelevante Stoffgruppen, nämlich Chrom, Aldehyde und Polyphenole, wurden untersucht. Der Hauptgerbstoff Chrom zeigt bei den Assemblierungsuntersuchungen nur geringe Auswirkungen auf das Modellsystem. Die Deassemblierung hingegen lässt die gute Gerbeigenschaft klar erkennen. Zur Erklärung des Streifenmusters, das bei chromgegerbten und somit positiv gestainten Fibrillen im TEM zu erkennen ist, wurde ein theoretischer Ansatz unternommen. Glutaraldehyd und Formaldehyd werden zur Gerbung benutzt. Aldehyde vernetzen die Kollagenmatrix kovalent. Die Untersuchung der homologen Reihe der Dialdehyde wurde hinsichtlich einer Tendenz oder einem Optimum in der Moleküllänge untersucht. Die Aldehyde vernetzen die Monomere, sodass in den Assemblierungskinetiken nur verminderte Plateauhöhen erreicht werden. Die Minimierung der Plateauhöhe kann nicht quantitativ mit der Gerbwirkung gleichgesetzt werden. Mit Aldehydzusatz assemblierte Fibrillen haben ein unverändertes Erscheinungsbild. Die Schlussfolgerung ist, dass die Fibrillenstruktur nicht verändert, aber dezimiert ist. Da nur Formaldehyd, Glyoxal und Glutaraldehyd als reine wässrige Lösung vorlagen mussten die andern drei Dialdehyde hergestellt werden. Dabei sind zusätzliche Substanzen in den Lösungen enthalten, die die Ergebnisse stören. Einen Trend, der mit der Moleküllänge einhergeht, konnte nicht beobachtet werden. Dies ist mit der flexiblen Ordnung der Moleküle in Lösung - im Gegensatz zur Kollagenmatrix in der Haut - zu begründen. Eine kombinierte Wirkung von Chrom und Aldehyd konnte bei der Assemblierung nachvollzogen werden und belegt die Annahmen zur Gerbung aus der Literatur, dass die Gerbung über die sauren Seitenketten bzw. über die Aminogruppen geschieht. Die untersuchten Polyphenole haben keine gerbende Wirkung, sind dem Naturgerbstoff Tannin chemisch aber sehr ähnlich, sodass der Unterschied in der räumlichen Struktur liegen muss. Die Kondensate werden bezüglich ihrer Kettenlänge und der Anzahl ihrer funktionellen Gruppen analysiert. Die Störung der Assemblierung ist bei Zusatz von Phenolkondensaten ist stärker als bei den anderen Testsubstanzen, was eine starke Interaktion zeigt. Messungen der Schrumpfungstemperaturen an Hautpulver ergaben, dass die Syntane keinen waschstabilen Effekt haben. Die Anlagerung an das Kollagen ist folglich zu schwach. Parallele TEM-Analysen ergaben, dass der pH-Wert bei der Vernetzung einen Einfluss auf die Intensität der Streifung hat. Mit zunehmendem pH-Wert erscheint die Streifung intensiver, bis hin zu einer erkennbaren Substreifung. Bei verschieden hohen Schrumpfungstemperaturen zeichnen sind zwei Aussagen ab. Zum einen ist mikroskopisch klar zu erkennen, wenn die Probe denaturiert ist, also über ihrer Schrumpfungstemperatur gekommen ist. Zum anderen ist ein leicht verminderter D-Abstand mit zunehmenden Schrumpfungstemperaturen zu verzeichnen. Besitzen Additive eine gerbende Wirkung, so zeigt sich dies nicht analog im Assemblierungsmodell oder in der Morphologie der Fibrillen. Eindeutige Rückschlüsse sind nicht zu ziehen. Bei der Deassemblierung äußert sich die Gerbwirkung aber immer durch eine verminderte Löslichkeit der Matrix. Daher ist dies eine wertvolle Technik für die Grundlagenforschung in der Gerbung.

Das Flagellum von Salmonella enterica ist eine komplexe molekulare Nanomaschine, die zur Fortbewegung verwendet wird. Die Synthese erfordert die Sekretion extrazellulärer Bausteine durch die Zellhülle. Der Substratexport erfolgt durch ein hochkonserviertes Typ-III-Sekretionssystem. Der Kern des fT3SS ist eine komplexe Proteinsekretionsmaschine, bestehend aus den Proteinen FliPQR und FlhBA. Ziel dieser Arbeit war die molekularen Mechanismen, die eine korrekte Funktion gewährleisten, tiefergehend zu erforschen. Im ersten Kapitel wurden die molekulare Mechanismen der Qualitätskontrolle während der Synthese des fT3SS untersucht. Es wurde kürzlich gezeigt, dass die korrekte Synthese durch das fT3SS-spezifischen Chaperon FliO gewährleistet wird. Ziel war es, den molekularen Mechanismus, wie FliO an diesem Prozess beteiligt ist, aufzuklären. Die Ergebnisse zeigten, dass mehrere Aminosäuren von FliO während der Assemblierung mit FliP interagieren. Des Weiteren wurde die Relevanz des spaltbaren Signalpeptids am N-Terminus von FliP untersucht. Diese Studie zeigt, dass die Anwesenheit des Signalpeptids und seine korrekte Spaltung entscheidend, aber nicht unerlässlich für die Funktion der Flagellen sind. Das fT3SS ist in der Lage Proteine mit einer bemerkenswerten Geschwindigkeit von mehreren tausend Aminosäuren pro Sekunde zu sekretieren. Das zweite Kapitel konzentrierte sich darauf, wie das fT3SS Proteine mit hoher Geschwindigkeit sekretiert, während das Austreten kleiner Moleküle verhindert wird. Unsere Mutationsanalysen zeigten, dass eine Methioninschleife in FliP, eine sperrige Plug-Domäne in FliR und intermolekulare Salzbrücken zwischen FliQ-Untereinheiten zusammenarbeiten, um die Integrität der Membran aufrechtzuerhalten. Diese Arbeit liefert neue Einblicke in die Synthese des fT3SS Kerns und die Regulation der Substratsekretion. Beide Prozesse werden an mehreren Stellen streng kontrolliert, um eine korrekte Funktion des Flagellums sicherzustellen. / The flagellum of Salmonella enterica is a sophisticated molecular nanomachine, which is used for locomotion. Flagella synthesis requires the translocation of extracellular subunits across the cell envelop, which is mediated by a highly conserved type-III secretion system (fT3SS). The core fT3SS is a complex protein secretion machine consisting of the proteins FliPQR and FlhBA. Productive assembly is crucial for flagella function. The molecular mechanisms which ensure correct function of the fT3SS remain poorly understood. In this thesis, we aimed to gain a profound insight into the molecular mechanisms of fT3SS core assembly and function. The first chapter investigated the molecular mechanisms underlying the quality control during the assembly of the fT3SS. It was recently shown that productive assembly of the core fT3SS relies on the flagella-specific chaperone FliO. We aimed to elucidate the molecular mechanism of how FliO facilitates this process. Our results demonstrated, that several residues of FliO are interacting with FliP during the assembly process. Furthermore, we aimed to identify the relevance of the cleavable signal peptide at the N-terminus of FliP. This study showed, that the presence of the signal peptide and its correct cleavage are crucial but not essential for flagella function. The fT3SS is able to secrete proteins with a remarkable speed of several thousand amino acids per second. The second chapter focused on how the fT3SS secretes proteins at high speed while preventing the leakage of small molecules. Our mutational analyses demonstrated that a methionine loop in FliP, a bulky plug domain in FliR and intermolecular salt bridges between FliQ subunits are acting cooperatively to maintain the membrane barrier. Overall, this work provides new insights into the assembly process of the fT3SS core and the regulation of substrate secretion. Both processes are tightly controlled at multiple stages to ensure the proper functioning of the flagellum.

Das 20S Proteasom bildet den Protein degradierenden Teil des Ubiquitin-Proteasom-Systems (UPS) und ist damit an wichtigen zellulären Prozessen wie Genexpressionskontrolle, Zellzykluskontrolle, Apoptose, Peptidgenerierung zur MHC Klasse I Präsentation und Degradation fehlgefalteter Proteine beteiligt. Die einzelnen Schritte der Biogenese des 20S Proteasoms in Eukaryoten sind bisher nur in Ansätzen verstanden. In dieser Arbeit wird die Untereinheitenzusammensetzung von Biogeneseintermediaten und ihre subzelluläre Lokalisation und Organisation in humanen Zelllinien untersucht. Durch die Etablierung eines in vitro Systems konnten distinkte Assemblierungsintermediate humaner Proteasomen generiert werden und ein (-Ring als früheres Intermediat im in vitro System nachgewiesen werden. Aufschluss über den weiteren Vorgang der Assemblierung wurden durch in vivo Experimente mit radioaktiv markierten HeLa Zellextrakten gewonnen. So konnten vor allem neu synthetisierte und zuletzt eingebaute Untereinheiten identifiziert werden. Hierzu gehören die Untereinheiten ?1 und (7, die aufgrund ihrer in trans agierenden C-terminalen Verlängerungen einen Dimerisierungsprozess zweier Halbproteasom-Vorläuferkomplexe forcieren. Darüber hinaus kann die Untereinheit (1 aufgrund der gewonnen Erkenntnisse als die wahrscheinlich den (-Ring schließende Untereinheit im Vorläuferkomplex postuliert werden. Proteasomale Assemblierungsintermediate konnten außerdem durch immuncytochemische und biochemische Methoden am ER von humanen Zelllinien lokalisiert werden. Dabei scheint dem Assemblierungsfaktor POMP eine Schlüsselrolle zuzukommen, da dieser eine Assoziation der Vorläuferkomplexe mit dem ER erst ermöglicht. In dieser Arbeit sind weitere Schritte des komplexen Biogenese-Vorgangs konstitutiver 20S Proteasomen in humanen Zelllinien aufgeklärt worden und es konnte erstmals die subzelluläre Lokalisation für Assemblierungsintermediate in humanen Zellen beschrieben werden. / The 20S Proteasom represents the protein degrading part of the Ubiquitin- Proteasom- System and is therefore a participant in important cellular processes like gene expression, cell cycle control, apoptosis, peptide generation for MHC class I presentation and degradation of misfolded proteins. Only the beginnings of the individual steps of the 20S proteasome biogenesis in eucaryotes are so far understood. Tis work examines the subunit composition of assembly intermediates and their subcellular localisation and organisation in eucaryotic cells. Distinct assembly intermediates of human proteasomes have been generated by establishing an in vitro system. As an earlier intermediate in the in vitro system an (-ring could be identified. In vivo experiments using radioactive marked total lysates of HeLa cells shed light on the following sequence of assembly. Thus new synthesised and finally incorporated subunits could be indentified. Two of this subunits are (1 and (7 which could force the dimerisation process of two half-proteasome-precursor by their trans acting c-terminal extensions. Furthermore the (1 subunit has been identified as the (-ring completing subunit in the precursor complex. In addition it was possible to detect proteasomal assembly intermediates through immuncytochemical and biochemical methods on the ER of human cell lines. Thereby the assembly factor POMP plays a key role as it allows in the first place the precursor association with the ER. This work clarifies further steps of complex procedure of biogenesis of constitutive 20S proteasomes in human cell lines and allows the characterisation of the subcellular localisation of assembly intermediates in human cells for the first time.

Proteasomen sind Protease-Komplexe, die im Nucleo- und Cytoplasma eukaryontischer Zellen vorkommen. 26S-Proteasomen bestehen aus einem proteolytisch aktiven 20S-Kernkomplex und zwei regulatorischen 19S-Komplexen. Die Regulatorkomplexe erkennen Proteinsubstrate und kontrollieren den Zugang der Substrate in den katalytisch aktiven 20S-Komplex. Die Assemblierung des 20S-Komplexes erfolgt über Halbproteasomen, in denen Ringe aus a-Untereinheiten mit pro-b-Untereinheiten assoziiert sind . Modellvorstellungen zufolge erfolgt die Dimerisierung zweier Halbproteasomen in ein kurzlebiges Intermediat, das naszierende 20S-Proteasom, bevor die aktiven b-Untereinheiten autokatalytisch prozessiert werden. Der konservierte Maturierungsfaktor Ump1 ist mit proteasomalen Vorläuferkomplexen assoziiert und wird nach der Dimerisierung der Halbproteasomen und der Prozessierung der katalytischen Untereinheiten im Inneren des naszierenden 20S-Proteasoms degradiert. Auch Ump1-assoziierte proteasomale Vorläuferkomplexe sind vorwiegend nukleär. Grundlage dieser Arbeit war die Identifizierung des Proteins Blm3 als Proteasomen-assoziiertes Protein in Kernextrakten aus S. cerevisiae. Fluoreszenzmikroskopisch konnte die nukleäre Lokalisation von Blm3 in vivo gezeigt werden. Durch Glycerin-Dichtegradientenzentrifugation und die Charakterisierung von durch native Gel­elektrophorese aufgetrennten Komplexen konnte gezeigt werden, dass Blm3 an Ump1-assoziierte proteasomale Vorläuferkomplexe gebunden vorliegt. Durch native Gelelektrophorese und GFP-Markierungstechniken wurden Ump1-assoziierte Vorläuferkomplexe in Halbproteasomen und naszierende Proteasomen fraktioniert. Es konnte gezeigt werden, dass Blm3 nicht mit Halbproteasomen, sondern mit naszierenden 20S-Proteasomen interagiert. Im Dblm3-Deletionsstamm wurde durch Pulse Chase-Analysen eine beschleunigte Kinetik der Prozessierung des naszierenden Proteasoms und eine beschleunigte Degradation des Maturierungsfaktors Ump1 beobachtet. Das Protein Blm3 verzögert die Reifung des naszierenden Proteasoms in das maturierte 20S-Proteasom. Blm3 übt vermutlich einen koordinierenden oder regulatorischen Effekt auf die Maturierung und letztlich auf die Aktivierung des 20S-Proteasoms aus. / Proteasomes are multisubunit protease complexes that occur in the nucleo- and cytoplasm of eucaryotic cells. They participate in a variety of biological processes. 26S proteasomes consist of a proteolytically active 20S core complex and two regulatory 19S complexes. The regulatory complexes recognize substrate proteins and control the substrate access into the catalytically active 20S complex. The hollow cylindrical 20S complex consists of four heptameric staggered rings. The two inner rings contain seven different b-subunits each, three of which are catalytically active. The two outer rings possess seven different catalytically inactive a-subunits each. The assembly of the 20S complex occurs via half proteasomes in which rings of a-subunits are associated with pre-b-subunits. According to models, the dimerization of two half proteasomes into a short-lived intermediate, the nascent 20S proteasome, takes place before the active b-subunits are processed autocatalytically. The conserved maturation factor Ump1 is associated to half proteasomes and is, after their dimerization and the processing of the catalytical subunits, degraded inside the nascent 20S proteasome. In yeast, proteasomes are essentially localized at the nuclear periphery. Ump1-associated half proteasomes are also predominantly nuclear. The protein Blm3 was found associated with the Ump1-associated half proteasome in nuclear extracts of S. cerevisiae. By fluorescence microscopy, the nuclear localization of Blm3 could be shown in vivo. Ump1-associated precursor complexes were fractionated into half proteasomes and nascent proteasomes by native gel electrophoresis and GFP labelling techniques. It could be shown that Blm3 interacts with nascent proteasomes but not with half proteasomes. In a Dblm3 deletion strain, an accelerated kinetics of processing of proteasomal precursor complexes as well as an accelerated degradation of the maturation factor Ump1 could be observed by pulse chase analysis. Accordingly, the protein Blm3 delays the maturation of the nascent proteasome into the mature 20S proteasome. As a coordinating protein, Blm3 presumably exerts a regulating effect onto the maturation and, finally, onto the activation of the 20S proteasome.

Das Zytoskelett einer eukaryotischen Zelle besteht aus drei Hauptbestandteilen: Aktin, Intermediärfilamenten und Mikrotubuli. Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit dem Protein Aktin, welches unter physiologischen Bedingungen dynamische Filamente durch Polymerisation ausbildet. Diese Filamente können sowohl in Netzwerken als auch Bündeln angeordnet werden. Diese Anordnungen bilden die Grundlage für eine Vielfalt von Strukturen zur Realisierung diverser zellulärer Funktionen. Konventionell wurde die Ausprägung solcher Strukturen durch zusätzliche Proteine erklärt, welche Aktin beispielsweise vernetzen oder sogar aktive, dissipative Prozesse durch ATP Hydrolyse ermöglichen. Durch diese Erklärungen prägte sich ein sehr komplexes Bild zellulärer Funktionen heraus. Die dissipative Natur der meisten Prozesse führte dazu, dass meist auf grundlegende physikalische Beschreibungen, welche auf nicht-dissipativen Gleichgewichtszuständen beruhen, verzichtet wurde. Diese Arbeit widmet sich solchen nicht-dissipativen Prozessen und beschreibt deren inhärente Bedeutung auch in aktiven, dissipativen Systemen. Ein erstes Beispiel beschreibt die Generierung von kontraktilen Kräften in Aktinbündeln durch eine hohe makromolekulare Dichte der Umgebung. Diese hohe Dichte führt zu einem entropischen Effekt, welcher durch Volumenausschluss hochkonzentrierter inerter Polymere Aktinfilamente in Bündel ordnet. Werden diese Strukturen aus ihrem energetischen Minimum ausgelenkt, so entsteht eine rücktreibende Kraft, welche nach Ausschaltung der auslenkenden Kraft zu einer Kontraktion des gesamten Bündels führt. Dieses Bespiel zeigt klar, dass selbst in sehr einfachen Systemen äußerst komplexe Prozesse ablaufen können, welche konventionell mittels dissipativer Umwandlung von chemischer Energie in mechanische Arbeit beschrieben wurden. Die Komplexität der Eigenschaften von Aktinbündeln nimmt zudem drastisch zu sobald zusätzliche Proteine mit eigenen mechanischen Eigenschaften das System beeinflussen. Zur Untersuchung eines solchen Mehrkomponentensystems wurden Aktinfilamente mittels transienter Vernetzungsproteine gebündelt. Versuche auf unterschiedlichen Zeitskalen zeigten klar differenzierbare mechanische Antworten auf induzierte, aktive Biegedeformationen. Im Falle kurzer Deformationen verhielt sich das System völlig elastisch, während für lange Deformationszeiten deutliche plastische Effekte auftraten. Als Ursprung dieser Plastizität wurde die dynamische Umordnung der Vernetzungsproteine identifiziert. Jedoch führen nicht nur zusätzliche Proteine zu einer erhöhten Komplexität. Bereits die Anordnung von reinen Aktinbündeln in Netzwerke mittels entropischer Kräfte führt zu einer überraschenden Variabilität von entstehenden Mustern. Im besonderen Fokus dieser Untersuchung stehen Aster ähnliche Muster, welche regelmäßige Netzwerkstrukturen ausbilden und nur in Verbindung mit Aktin assoziierten Proteinen bekannt waren. Störungen der isotropen Ausgangssituation führen zu veränderter Musterbildung, welche die initiale Störung direkt widerspiegeln. Mit den präsentierten Resultaten leistet die Arbeit einen wichtigen Beitrag zum Verständnis der Dynamik von Aktinbündeln sowie deren Interaktionen.

Die essentielle Histon H3 Variante Cse4 ersetzt am Centromer das Standard Histon H3 und bildet zusammen mit Histon H4 funktionelle Cse4-H4 Tetramere aus. In dieser Studie konnte gezeigt werden, das Cse4 über seinen einzigartigen N-Terminus mit zwei Komponenten des Histon-Acetyltransferase-Komplexes SAS-I interagiert: der enzymatischen Untereinheit Sas2 und Sas4. Mutationen innerhalb des atypischen C2HC Zink-Fingers oder der HAT-Aktivierungsdomäne von Sas2 verhindern eine Bindung an Cse4, obwohl mit Hilfe von Co-Immunopräzipitationsexperimenten eine indirekte Interaktion nachgewiesen werden konnte. Weiterhin wurde gezeigt, dass Cse4 mit Cac1, der größten Untereinheit des Chromatin-Assemblierungsfaktors CAF-I und Asf1 interagiert - zwei Histon Chaperonen, die Histon H3 und H4 in Chromatin assemblieren. Unsere Ergebnisse lassen weiterhin auf eine separate Rolle von Cac1, unabhängig von den beiden anderen Untereinheiten schließen. Die Interaktion von Cse4 und Ctf19 wird durch eine Deletion von Sas2 verhindert. Ebenfalls kann die Temperatur-Sensitivität eines cse4-103 mutierten Hefestamms durch eine Sas2-Deletion partiell supprimiert. Somit kann man darauf schließen, dass Sas2 eine Funktion bei der Stabilisierung des Centromers aufweist. Die bisherigen Ergebnisse lassen die Frage aufkommen, ob Cse4 in der Zelle acetyliert ist und ob es möglicherweise als Histon H3 Variante ebenfalls ein Substrat von SAS-I darstellt. Wir konnten zeigen, dass Cse4 tatsächlich in einem acetylierten Status vorliegt, ob SAS-I jedoch für die Acetylierung verantwortlich ist bleibt nachzuweisen. / The essential histone H3 variant Cse4 plays a crucial role at the centromere in S. cerevisiae, where it replaces histone H3 in that it assembles centromere specific (Cse4-H4)2 tetrameres. We found in our study that the histone H3 variant was able to interact over its unique N-Terminus with two subunits of the histone acetyltransferase complex SAS-I: Sas2 and Sas4. Mutations within the acetyl-CoA binding site (HAT domain) or the zink-finger of Sas2 disrupted the binding to Cse4, although an indirect interaction was found with co-immunoprecipitation experiments. Additionally, the N-terminus of Cse4 interacted with Cac1, the largest subunit of the chromatin assembly factor CAF-I and Asf1 - two histone chaperones that assemble histones H3 and H4 into nucleosomes. Our findings further suggest a role of Cac1 independent of Cac2 and Cac3 as no binding to Cse4 could be detected. A role for Sas2 at the centromere was further confirmed in that a sas2 deletion (sas2 delta) disrupted the binding of Cse4 to Ctf19. Additionally, sas2 delta partially rescued the temperature sensitivity of a cse4-103 mutated strain at elevated temperatures, suggesting a role for Sas2 in improving centromere stability. An important question resulted from our studies: is Sas2 able to acetylate the histone H3 variant Cse4 ? We have circumstantial evidence that Cse4 was indeed acetylated in the cell, but whether Sas2 accounts for the acetylation remains to be determined.

Lipidmembranen ermöglichen die räumliche Anordnung von Biomolekülen. Einerseits repräsentieren Lipidvesikel Kompartimente zur Aufrechterhaltung chemischer Milieus und dienen der Verkapselung verschiedenster Substanzen. Anderseits stellen inhomogene Membranen Matrizen für eine laterale Organisation von Membrankomponenten dar. In der vorliegenden Arbeit wurden lipophile Nukleinsäuren zum Aufbau kompartimentalisierter Strukturen auf der Basis von Lipidmembranen benutzt, erstens, für die geordnete, dreidimensionale Assemblierung von Vesikeln, zweitens, für eine spezifische Funktionalisierung inhomogener Lipidmembranen. Definierte Schichten stabiler Lipidvesikel wurden auf „layer-by-layer“ beschichteten Silikapartikeln angeordnet. Mit Hilfe einer optischen Pinzette wurde der gerichtete Transport der mit Vesikeln beschichteten Partikel demonstriert. Moleküle konnten in den Vesikeln verkapselt und bei Bedarf vor Ort freigesetzt werden. Zudem wurde die kontrollierte Fusion der immobilisierten Veskel gezeigt, die eine Durchmischung von verschiedenen Membrankomponenten zur Folge hatte. Lipophile Nukleinsäuren wurden in die Membranen von lipiddomänenbildenden Vesikeln inkorporiert. Cholesterolbasierte DNS verteilte sich hierbei homogen über die gesamte Membran. Palmitoylierte Peptid-Nukleinsäure konzentrierte sich hingegen in der flüssig-geordneten Phase von flüssig-flüssig phasenseparierten Membranen, welche sogenannten Lipid Rafts in Zellmembranen ähnelt. Mittels der palmitoylierten Peptid-Nukleinsäure und tocopherolmodifizierter DNS wurden lateral inhomogene Membranen domänenspezifisch funktionalisiert. Beide Konstrukte konnten temperaturabhängig vermischt und separiert werden. / Lipid membranes are versatile tools for the spatial organization of biomolecules. On one hand, lipid vesicles represent enclosed compartments to maintain chemical environments and allow the efficient entrapment of substances. On the other hand, lateral inhomogeneous membranes provide the two dimensional sorting of membrane-bound compounds. In this work, lipophilic nucleic acids were used to build multicompartment systems based on lipid membranes by the controlled assembly of vesicles and the domain specific functionalization of inhomogeneous membranes. Three dimensional architectures of vesicles were formed by the sequential assembly of vesicles on layer-by-layer coated particles. Upon binding of the vesicles to the particles the vesicles remained stable – they did not fuse neither became leaky. Molecules could be entrapped inside the vesicles and released on demand. It was shown that the vesicles assembled on a particle can be transported to a defined destiny using an optical tweezer. Thus, the targeted delivery and the release of encapsulated molecules on site was achieved. It was also shown that vesicles immobilized on the particles can be fused by remote control, resulting in a mixing of membrane associated compounds. Different lipophilic nucleic acids were arranged in two dimensional patterns by incorporation into domain-forming vesicles. Cholesterol-modified DNA revealed an equal distribution to both domains in liquid-liquid phase-separated membranes, whereas palmitoylated peptide nucleic acid partitioned into the liquid-ordered domain, which resembles lipid rafts of cellular membranes. Using the palmitoylated peptide nucleic acid and tocopherol-modified DNA both domains of liquid-liquid phase-separated vesicles were functionalized with different DNA recognitions sites. Both constructs could be mixed and separated by temperature control.