Orientador: Flávio Ruas de Moraes / Coorientador: Julieta Rodini Engrácia de Moraes / Coorientador: Hélio Jose Montassier / Coorientador: João Martins Pizauro Junior / Banca: Fernanda Nogueira Valentin / Banca: Tereza Cristina Ribeiro Dias Koberstein / Banca: Solange de Paula Ramos / Banca: Marcello Pardi de Castro / Resumo: Photobacterium damselae subsp. piscicida (Phdp) é importante agente causal de septicemia e pseudotuberculose, respectivamente nas fases aguda e crônica em peixes marinhos. O método de imunização e tratamento das infecções bacterianas em peixes é limitado à imunização ativa, com demanda bioenergética celular para gerar a resposta imune humoral. O uso de antibióticos na água, como forma terapêutica, resulta em resíduos na carne do peixe e no consumidor final humano, favorecendo o desenvolvimento da resistência microbiana. Este estudo teve como objetivos a produção e purificação de anticorpos IgY policlonais, extraídos da gema do ovo de galinha e específicos para as proteínas citoplasmáticas e de membrana bacteriana de Phdp e seus efeitos no controle da sepse aguda em Rachycentron canadum infectados experimentalmente. Os resultados demonstram redução do acúmulo de células na inflamação aguda induzida, pela inoculação da bactéria homóloga na cavidade celomática e na atividade respiratória de leucócitos sanguíneos nos grupos que receberam anticorpos IgY 48 horas e 15 dias antes do desafio. Verificou-se ainda redução da disseminação bacteriana em fígado, rim, baço e coração que foi correlacionada com a diminuição das lesões renais e hepáticas e demonstrada no perfil bioquímico e histopatológico. Os resultados são promissores no que tange ao uso da imunoglobulina Y como método profilático e na imunoterapia de infecções bacterianas em organismos aquáticos / Abstract: The Photobacterium damselae ssp. piscicida is an important causative agent of septicemia and pseudotuberculosis in the acute and chronic phases in marine fish, respectively. The method for immunization and treatment of bacterial infections in fish is limited to the active immunization, which demands cellular bioenergy to generate humoral immune response. The use of antibiotics in the water as a form of therapy results in residues in the meat that will be consumed by humans, favoring the development of microbial resistance. Thus, the aim of the study was to produce and purify polyclonal IgY, specific for membrane proteins of P. damselae ssp. piscicida (PMBphdp), extracted from the yolk of laying hens, and to observe its effects on the control of acute sepsis in experimentally infected Rachycentron canadus. The results showed reduction of cell accumulation in acute inflammation induced by inoculation of the homologous bacteria in the coelomic cavity and decrease in the respiratory activity of blood leukocytes in groups receiving IgY antibodies at 48 hours and 15 days before the challenge. It was also observed the reduction of bacterial dissemination to the liver, kidney and heart which was correlated with the decrease in liver and kidney damage, which was demonstrated by the biochemical and histopathological profile. The results are promising regarding the use of immunoglobulin Y as prophylactic method and for immunotherapy of microbial infections in aquatic organisms / Doutor

Orientador: Eduardo Bresciani / Co-orientador: Frederico Canato Martinho / Banca: João Maurício Ferraz da Silva / Banca: César Rogério Pucci / Resumo: A cárie é uma doença infectocontagiosa multifatorial. Em cavidades profundas, as lesões cariosas geralmente estão associadas a quadros de sintomatologia pulpar dolorosa. O objetivo deste estudo foi determinar a diversidade bacteriana e a quantidade de endotoxinas e casos de cáries sintomáticas e assintomáticas. Para este estudo foram selecionados 20 pacientes com lesões cariosas profundas com sensibilidade dolorosa compatível com pulpite reversível (n=10) e sem sintomatologia dolorosa (n=10). As amostras de dentina cariada foram obtidas com o auxílio de colheres de dentina estéreis e apirogénicas e foram coletadas em dois momentos: antes e após a remoção convencional do tecido cariado. Estas amostras foram divididas em duas alíquotas, que foram em seguida submetidas ao teste Checkerboard (alíquotas contendo 150 ul de TE e 100 uL de NaOH a 0,5 M) e teste cinético cromogénico LAL (Alíquotas com 1 ml de soro apirogênico) para determinação do perfil microbiano e quantificação de endotoxina, respectivamente. O teste estatístico Mann Whitney não mostrou diferença entre a camada de dentina superficial e profunda para as bactérias estudadas. Em relação ao fator sensibilidade as bactérias Capnocytophaga sputigena, Leptotrichia buccalis e Lactobacillus species foram as que apresentaram diferenças estatisticas significantes, sendo mais presente em pacientes com sintomatologia. Para as endotoxinas, os dentes sintomáticos resultaram em maiores quantidades de endotoxinas (p = 0,047). Dentes sintomáticos apresentaram 4,13 log 10 EU / mg dentina, enquanto o nível de endotoxinas para os dentes dentes assintomáticos foi de 3,45 log 10 EU / mg dentina. Dentinas coletadas em diferentes áreas apresentaram quantidades similares de endotoxinas (p = 0,139). A quantidade de bactérias não parece estar relacionada com a sintomatologia de lesões cariosas profunda, enquanto a quantidade de... / Abstract: Caries is a multifactorial infectious disease. In deep cavities, carious lesions are usually associated with scenarios of pulp painful symptoms. The objective is to determine bacterial diversity and endotoxin levels in cases of sintomatic and assintomatic caries. Twenty patients with deep carious lesions with soreness compatible with reversible pulpitis (n = 10) and without pain symptoms (n = 10). Carious dentine samples were obtained with the aid of sterile dentine and apyrogenic spoons and harvested in two steps: before and after conventional caries removal. These samples were divided into two aliquots, which were then subjected to the checkerboard(aliquots contained in 150µl of TE and 100µl of 0.5 M NaOH) and kinetic chromogenic LAL test(aliquots with 1 ml of apirogenic serum) for determination of microbial profile and quantitation of endotoxin, respectively. By Mann Whitney test showed no difference between the superficial and deep dentin layer for the studied bacteria. In relation to factor sensitivity bacteria Capnocytophaga sputigena, Leptotrichia buccalis e Lactobacillus species were the ones that showed statistically significant differences, being more present in patients with symptoms. For the endotoxins, symptomatic teeth resulted in greater quantity of endotoxins (p=0.047). Symptomatic teeth presented 4.13 log10 EU/mg dentin, while endotoxin level for no symptomatic teeth was 3.45 log10 EU/mg dentin. Dentin collected in different areas presented similar amount of endotoxins (p=0.139). The amount of bacteria does not seem to be related to symptomatology of deep carious lesions, while endotoxins quantity is greater in symptomatic scenarios / Mestre

Orientador: Lucia Maria Carareto Alves / Banca: Lucia Helena Sipauba-Tavares / Banca: Rodrigo Matheus Pereira / Resumo: A aquicultura é uma atividade que está em contínuo crescimento, desta forma os ecossistemas aquáticos utilizados para tal atividade acabam sofrendo alterações nas condições da água e na comunidade microbiana do local. No presente trabalho, compararam-se as comunidades bacterianas presentes em águas de dois viveiros de piscicultura, um utilizado como reservatório de água (V1) e o outro com condições de elevada carga de nutrientes (V4), os quais estão inseridos em um sistema sequencial com fluxo contínuo de água (seis viveiros). A escolha dos viveiros V1 e V4, foi baseada em estudos anteriores no qual foi evidenciado um alto grau de eutrofização neste local. As coletas de água foram realizadas em dois períodos distintos um na seca (Julho e Agosto/2012) e outro na chuva (Janeiro e Fevereiro/2012). A comunidade bacteriana foi avaliada através do sequenciamento do gene 16S rRNA. A população bacteriana variou significativamente entre os dois viveiros e segundo a estação anual, seca ou chuva. No viveiro 1 observou-se uma grande proporção de Proteobacterias, em ambos os períodos, entretanto houve mudanças nas classes deste grupo, a maioria β-Proteobacterias (chuvas) e uma proporção equivalente de β e α-Proteobacterias (seca). No viveiro 4, foi observada uma alta frequência de Cyanobacterias principalmente na estação de seca, aproximadamente 80% da população bacteriana do local, enquanto no período de chuvas este grupo foi menor. A comparação da população bacteriana dos dois viveiros estudados em épocas distintas mostrou que as bactérias nestes locais variam de acordo com o período hidrológico e estão intimamente ligadas com a concentração de nutrientes do local. Estas diferenças são importantes na participação dos ciclos biogeoquímicos, principalmente envolvendo os ciclos do nitrogênio e fósforo e a sanidade do sistema aquático. / Abstract: The aquaculture is an activity that is continuous growing, in this way aquatic ecosystems used for such activity end up suffer changes in water conditions and microbial community local. In this study, we compared the bacterial communities present in waters of two fish farm ponds, a used as water reservoir (V1) and the other with conditions of high nutrient load (V4), which are inserted in a sequential system with continous water flow (six ponds). The choice of nurseries V1 and V4 was based on previous studies in which evidenced a high degree of eutrophication in this location. The water sampling were conducted in two distinct periods one in dry season (July and August/2012) and another in the rain (January and February/2012). The bacterial community was assessed by sequencing the 16S rRNA. The bacterial population varied significantly between the two ponds and according to season annual, dry or rain. In the pond 1 there was a large proportion of proteobacteria, in both periods, however there were changes in the classes of this group, most β-Proteobacteria (rain) and an equivalent proportion of β and α-proteobacteria (dry). In pond 4, we observed a high frequency of cyanobacteria mainly during the dry season, approximately 80% of the bacterial population of the place, while in the rainy season this group was lower. A comparison of the bacterial population of the two ponds studied at different times showed that the bacteria at these sites varies according to the period hydrological and are closely linked with nutrient concentration local. These differences are important in the participation in biogeochemical cycles, especially involving the cycles of nitrogen and phosphorus and health of the aquatic system. / Mestre

Orientador: Heloiza Ferreira Alves do Prado / Coorientador: Gessí Ceccon / Banca: Ana Maria Rodrigues Cassiolato / Banca: Rodrigo Arroyo Garcia / Resumo: Bactérias e fungos são os organismos mais ativos na decomposição de compostos orgânicos no solo, afetando diretamente a disponibilidade de nutrientes para as plantas e as propriedades químicas e físicas dos solos. O solo ecossistema complexo e dinâmico, com transformações microbianas e reações químicas que podem ser alteradas sempre que nesse ecossistema ocorrer alguma interferência. Dessa forma, o manejo do solo e das culturas pode alterar o substrato, favorecer ou inibir diferentes grupos microbianos. Assim, o trabalho foi realizado com o objetivo de avaliar a microbiota local, fungos e bactérias do solo em sistemas de produção de grãos em Dourados-MS em Latossolo Vermelho Distroférrico textura argilosa Os tratamentos foram constituídos pelos seguintes cultivos de outono-inverno 1) milho solteiro (Zea mays), 2) milho consorciado com Brachiaria ruziziensis, 3) Brachiaria ruziziensis solteira e 4) feijão caupi (Vigna unguiculata) e soja no verão nos anos agrícolas de 2011 e 2012. As coletas do solo foram realizadas durante a fase de enchimento de grãos das espécies na entrelinha das culturas. Utilizados procedimentos clássicos para a quantificação microbiana e determinação das atividades amilásicas e celulásicas do solo. A comunidade bacteriana do solo tende a se desenvolver melhor quando as condições climáticas, principalmente umidade, são favoráveis, com destaque para maior numero de unidades formadoras de colônias no feijão caupi em 2011 e no verão para a soja em sucessão ao consórcio e os fungos em condições de seca A diferença observada entre as comunidades microbianas esta relacionada a sucessão das culturas e a influência do efeito rizosferico das culturas. A comunidade bacteriana se relaciona a atividade amilolítica com a degradação do amido e a fungica para a celulose. Devido às poucas... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Bacteria and fungi are the most active organisms in the decomposition of organic compounds in the soil, directly affecting the availability of nutrients for plants and chemicals and physical soils properties. The soil complex and dynamic ecosystem with chemical reactions and microbial transformations that can be changed whenever some interference occurs in this ecosystem. Thus, the management of soil and crops can change the substrate, favor or inhibit different microbial groups. This study was to evaluate the microbiota, fungi and soil bacteria in grain production systems in Dourados-MS in a Distroferric Red Latosol The treatments consisted of the following crops of autumn-winter 1) corn (Zea mays), 2) maize intercropped with Brachiaria ruziziensis, 3) Brachiaria ruziziensis and 4) cowpea (Vigna unguiculata) and soybean in summer in the years 2011 and 2012. The soil samples were taken during the grain filling of species between rows of crops. Classical procedures used for the determination and quantification of microbial activities and amylase cellulase soil. The soil bacterial community tends to develop better climate conditions, especially moisture, favorable, especially for larger number of colony forming units in cowpea in 2011 and in the summer for the soybean crop to the intercroop and fungi in drought conditions The difference between microbial communities is related to the succession of cultures and the influence of crop rhizosphere effect. The bacterial community relates to amylase activity with starch degradation and fungal for cellulose. Due to limited information on the microbiota in this region... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Adelino Vieira de Godoy Netto / Co-orientador: Regina Celia Galvao Frem / Banca: Vania Martins Nogueira / Banca: Antonio Eduardo Mauro / Banca: Alexandre Cuin / Banca: Adriano Bof de Oliveira / Resumo: Apesar de não ser um elemento biológico essencial, a prata metálica e seus derivados (ex. AgNO3 e complexos) têm apresentado várias aplicações medicinais como na purificação da água, tratamento de ferimentos, recobrimentos anti-infecção de instrumentos médicos, no tratamento de queimaduras pois possuem propriedades anti-microbianas potentes com baixa toxicidade em seres humanos. Sua utilização como agente antimicrobiano nos remete ao inicio da história humana, sendo muito utilizada na preservação de água potável durante anos, recurso primordial em conflitos militares. Neste trabalho foram sintetizados e caracterizados novos complexos de prata(I) do tipo Ag(NN)(tu)X, onde NN = 2,2'-bipiridina (bpy), 1,10-fenantrolina (phen), dipirido[3,2-a:2',3'-c]fenazina (dppz) e 1,10-fenantrolina-5,6-diona (phd); tu = tiouréia e X = NO3 -, CF3SO3 -, BF4 - e SO4 2-. Os complexos foram caracterizados pelas técnicas de espectroscopia na região do IV, ressonância magnética nuclear (1H), análise elementar e espectrometria de massas. As estruturas moleculares dos complexos [{Ag(bpy)(μ-tu)}2](NO3)2 (A1) e [{Ag(phd)(μ-tu)(tu)}2](CF3SO3)2 (D2) foram determinadas por difração de raios-X de monocristal, indicando um sistema binuclear com os centros de prata(I) conectados em ponte pelo atomo de enxofre da molécula de tiouréia. A atividade biológica in vitro dos compostos [Ag2(bpy)2(tu)2](NO3)2 (A1), [Ag2(phen)2(tu)2](NO3)2 (B1) e [Ag2(phen)2(tu)2](CF3SO3)2 (B2) foram estudadas frente a fungos (C. albicans, C. tropicalis e C. krusei), bactérias (S. aureus, E. coli e P. aureginosa), M. tuberculosis e formas amastigota e promastigota da L. amazonensis. Mesmo sendo um estudo bastante reduzido, tendo em vista a quantidade de microorganismos e de compostos estudados, foi possível averiguar algumas varições no comportamente biológico com a alteração tanto do ligante quelante NN quanto do contra-íon. Com resultados promissores, os estudos de... / Abstract: Even Ag0, and its derivates, being not an essential element, they have presented medicinal applications such as water purification, injuries treatment, antiinfection recovery of medical instruments, burn treatment as they have powerful antimicrobial properties and low human toxicity. Silver compounds have been used as antimicrobial agent since the beginning of human history when it was added to potable water for preservation as a primary resource in military conflicts. In the present work novel silver complexes (I) of Ag(NN)(tu)X type in which X = 2,2-bipiridine (bpy), 1,10-phenantroline (phen), dipirido[3,2-a:2',3'-c]phenazine (dppz) and 1,10- phenantroline-5,6-dione (phd); tu= thiourea and X=NO3 -, CF3SO3 -, BF4 - and SO4 2- have been synthesized and characterized. The complexes had been characterised by infrared spectroscopy, 1H nuclear magnetic resonance, elementary analysis and mass spectroscopy techniques. The crystal structures of [{Ag(bpy)(μ- tu)}2](NO3)2 (A1) and [{Ag(phd)(μ-tu)(tu)}2](CF3SO3)2 (D2) were determined by single crystal X-ray diffraction indicating a binuclear system with silver(I) centers bridgebonded by sulphur atoms of thiourea molecule. The in vitro biological activity of [Ag2(bpy)2(tu)2](NO3)2 (A1), [Ag2(phen)2(tu)2](NO3)2 (B1) e [Ag2(phen)2(tu)2](CF3SO3)2 (B2) compounds had been studied for fungi (C. albicans, C. tropicalis e C. krusei), bacteria (S. aureus, E. coli e P. aureginosa), M. tuberculosis and amastigote and promastigote forms of L. amazonensis. Although a reduced study has been performed in view of the microorganisms and compounds quantities it was possible to evaluate some changes on biological behavior by both chelant ligand NN and counterion modification. Promising results were obtained on the antileishmanial activity for B2 compound which have showed a selectivity index (SI) of 13,8-15,5 values much higher than the observed for AmpB, the standard drug (5,5-5,83). / Doutor

Orientadora: Eliana Gertrudes Macedo Lemos / Banca: Ely Nahas / Banca: Maria José Valarini / Resumo: Os métodos tradicionais de isolamento e cultivo para análise da diversidade microbiana do meio ambiente são limitados, pois poucos microrganismos são cultiváveis. Grandes avanços na ecologia microbiana molecular ocorreram através da construção de bibliotecas metagenômicas, fornecendo análises dos microrganismos não-cultiváveis. O solo, que é o mais importante habitat para os microrganismos, principalmente procariotos, sofre contínuas alterações. Devido à prática agrícola intensiva, parte da diversidade de microrganismos do solo pode ser alterada, antes de se tornar conhecida. Este trabalho teve por objetivo estimar a diversidade das comunidades bacterianas pela extração direta de DNA do solo em duas áreas (área de agricultura intensiva e área de floresta nativa) no município de Guaíra-SP, ilustrando o impacto da agricultura na microbiota. Utilizando oligonucleotídeos iniciadores específicos e seqüenciamento parcial do gene 16S rDNA, fragmentos dos produtos de PCR (~1.5kb) foram clonados em vetor pGEMR-T e transformados em Escherichia coli, linhagem DH5a. Para cada biblioteca foram coletados e seqüenciados 240 clones. As seqüências obtidas foram submetidas à análise de similaridade com seqüências depositadas no banco de dados GenBank. As análises revelaram extensiva diversidade em ambos os solos, assim como características distintas das comunidades bacterianas, sendo que a área sob floresta apresentou maior diversidade em relação à área sob agricultura intensiva. Os resultados obtidos demonstram que as práticas agrícolas promoveram aumento quantitativo das comunidades bacterianas pertencentes aos filos Proteobacteria e Firmicutes, ao passo que causaram uma diminuição nas comunidades pertencentes aos filos Acidobacteria e Verrucomicrobia, corroborando estudos anteriores. / Abstract: Traditional methods of isolation and cultivation to analyze the microbial diversity of environment are very limited, because few microorganisms are cultivable. Advances in molecular microbial ecology has occurred through the construction of metagenomic libraries, providing analysis of uncultured microorganisms. The soil, which is the most important habitat to microorganisms, principally prokaryotes, suffers continuous alteration. Due to intensive agricultural practices, part of the diversity of the soil microbial diversity could be reduced, even before being known. The aim of this work was to assess the diversity of bacterial community, through direct extraction of DNA of microorganisms from two conditions soil, (intensive agriculture and native forest) Guaíra- SP, to show the impact of agriculture in bacterial community. Using specific primers and partial sequencing of 16S rDNA gene, fragments from PCR (~1.5kb) were cloned in a vector pGEMR-T and transformed into Escherichia coli, strain DH5a. To each library 240 clones were collected and sequenced. The sequences obtained were compared against the GenBank database. The analysis showed extensive diversity in both soils, as well as distinct characteristics of bacterial community. Also, the forest field showed greater diversity than the intensive agriculture. The results obtained showed that agricultural practices promote quantitative grow of bacterial community that inhere the phyla Proteobacteria and Firmicutes, as well as generate one diminution in communities inhere the phyla Acidobacteria and Verrucomicrobia, as previously reported. / Mestre

Orientador: Márcia Carneiro Valera / Co-orientador: Frederico Canato Martinho / Banca: Carlos Henrique Ribeiro Camargo / Banca: Claudio Antonio Talge Carvalho / Banca: Maria Cristina Chavantes / Banca: Suely Itzuco Ciosak / Resumo: Pacientes críticos internados em Unidade de Terapia Intensiva (UTI), em sua maioria, requerem auxílio da Ventilacão Mecânica Invasiva (VMI). A análise da diversidade microbiana é fundamental para identificação de espécies, ainda desconhecidas, responsáveis pela Pneumonia Associada a Ventilação Mecânica (PAVM). Os objetivos deste estudo foram: a) Estudar a diversidade microbiana presente na cavidade oral e no BAL (mini-BAL) de pacientes internados em UTI sob VMI, através da técnica Checkerboard DNA-DNA Hybridization; b) Avaliar se o perfil microbiano presente na cavidade oral está presente no Lavado Bronco Alveolar (mini-BAL), em diferentes períodos de tempo da VMI (12 h, 48 h, 96 h) e na extubação; c) Detectar a presença de espécies bacterianas circulantes na corrente sanguínea de pacientes internados em UTI sob VMI através dos resultados de hemocultura. Participaram do estudo 10 pacientes críticos internados em UTI sob VMI. As amostras foram coletadas no dorso da língua, espaço subgengival, no BAL, no aspirado endotraqueal e cânula de intubação orotraqueal. Foi possível identificar a presença de espécies bacterianas no BAL/aspirado endotraqueal, inclusive com aumento da carga bacteriana com o tempo prolongado de Intubação orotraqueal (IOT), 48 h e 96 h; e em relação à mucosa oral e espaço subgengival também foi possível observar já nas primeiras 12 h a presença de espécies bacterianas no BAL, estes achados apresentaram associação com PAVM e com resultados de hemocultura positiva. As bactérias isoladas na hemocultura foram S auerus, S epidermides, P aeruginosa. Houve associação de febre com PAVM e hemocultura positiva. Concluiu-se que durante a IOT, espécies bacterianas migram rapidamente para as vias aéreas inferiores, podendo contribuir para a fisiopatogenia da PAVM, houve associação de PAVM com Enterococcus faecalis, Fusobacterium periodo / Abstract: Critical patients admitted to intensive care unit (ICU), in their majority, require Invasive Mechanical Ventilation assistance (MV). The analysis of microbial diversity is fundamental to identifying species, as yet unknown, responsible for Pneumonia associated with mechanical ventilation (VAP). The objectives of this study were: to Study microbial diversity) present in the oral cavity and in the BAL (mini-BAL) of patients hospitalized in ICU under VM by Checkerboard DNA-DNA Hybridization technique; b) assess whether the microbial profile present in the oral cavity is present in Broncho Alveolar (mini-BAL), in different time periods of the MV (12 h, 48 'h, 96 h) and on extubation; c) detect the presence of bacterial species circulating in the bloodstream of patients hospitalized in ICU under VM through the results of blood cultures. Participated in this study 10 critical patients admitted to ICU under MV. The samples were collected on the dorsum of the tongue, subgingival space, in BAL, endotracheal aspirate and orotracheal intubation cannula. It was possible to identify the presence of bacterial species in the BAL/endotracheal aspirate, including with increased bacterial load with the extended time of orotraqueall Intubation (OTI), 48 h and 96 h; and in relation to the oral mucosa and subgingival space has also been possible to observe in the first 12 h the presence of bacterial species in the BAL, these findings showed association with VAP and with positive blood culture results. The isolated bacteria in blood culture were S auerus, S epidermides, P aeruginosa. There was association with fever and blood culture positive PAVM. It was concluded that during the OTI, bacterial species migrate quickly to the lower airways and may contribute to the pathophysiology of VAP. There were associations between VAP and Enterococcus faecalis, Fusobacterium periodonticum, Gemella morbillorum, Neisseria... / Doutor

Resíduos ricos em queratina são amplamente disponíveis como subprodutos de agroindústrias, e por sua recalcitrância tornam-se um problema ambiental e econômico por seu acúmulo e difícil manejo. Bactérias que hidrolisam a queratina, através da produção de queratinases, têm mostrado grande potencial biotecnológico. Este trabalho tem como objetivo selecionar, identificar e caracterizar um novo isolado bacteriano, proveniente de solos brasileiros, que seja produtor de queratinases úteis como biodegradadoras de penas, bem como caracterizar sua ação enzimática. Bactérias com atividade proteolítica e produtoras de proteína solúvel a partir de substratos queratinosos foram selecionadas e identificadas através do sequenciamento do 16S do DNAr. O extrato bruto de três linhagens Gram negativas foi caracterizado ao longo de 120 horas de cultivo. Dos 32 isolados, os maiores degradadores de penas foram as bactérias do gênero Bacillus, porém as características do extrato bruto das Gram negativas Aeromonas hydrophila K12, Chryseobacterium indologenes A22 e Serratia marcescens P3 também apresentam promissoras utilizações industriais. Ensaios enzimáticos e zimograma revelaram a produção de uma única protease queratinolítica por isolado, com características de metaloprotease. Utilizando técnicas de planejamento fatorial foi possível gerar um modelo validado estatisticamente para a otimização da produção enzimática. A utilização de sistema aquoso bifásico foi eficiente para a purificação da enzima produzida pela linhagem P3, gerando banda única em SDS-PAGE com massa molecular de aproximadamente 53 kDa. O sequenciamento da protease queratinolítica da linhagem P3, através de espectrômetro de massas, revelou homologia com metaloproteases dependentes de zinco semelhantes às serralisinas. Apesar das serralisinas serem comumente associadas a fatores de virulência, a importância das patogenias causadas por Serratia parece ser menor do que a causada por outras bactérias. Portanto, a enzima de P3, que é facilmente desnaturada por tratamento térmico, pode também ser utilizada biotecnologicamente em processos controlados. / Keratin-rich wastes are widely available as an agroindustrial byproduct. Since these residues are difficult to degrade, they cause economical and environmental problems due to its accumulation and difficult management. Bacteria with keratin-degrading abilities, through keratinase production, have shown several biotechnological applications. This work aimed to select, identify and characterize a novel bacterial isolate from Brazilian soils, which is keratinase producer, useful for feather degradation and characterize its enzymatic activity. Bacteria with proteolytic activity and soluble protein production when cultivated with keratinous wastes were selected and identified based on 16S rDNA gene sequencing. Crude supernatant of three Gram negative strains were characterized over 120 hours of cultivation. Among 32 isolates, the bacteria from Bacillus genus showed higher feather hydrolyses. Although, the characterization of the crude extract produced by the Gram negative Aeromonas hydrophila K12, Chryseobacterium indologenes A22 and Serratia marcescens P3 also revealed their promising use in industrial processes. Enzymatic assays and zimogram analyses indicated the production of a unique proteolytic enzyme by each strain, which have presented metalloprotease characteristics. By using factorial design, a statistically validated model was generated for the optimization of enzymatic production. An aqueous two-phase system was effective for the purification of P3 enzyme, resulting in a single band of approximately 53 kDa on SDS-PAGE. The sequencing of strain P3 keratinolytic protease through mass spectrometry revealed homology with zinc-dependent metaloproteases of the serralysin family. In spite of serralysins being commonly related to virulence factors, the pathogenies caused by Serratia seems to be less concerning than the ones caused by other bacteria. Thus, the enzyme of P3, which is easily denatured by heat treatment, may also be biotechnologically useful in controlled processes.

As interações que ocorrem entre as bactérias e amebas podem dar-se através de relações mútuas, onde ambos os organismos se beneficiam da associação ou parasitárias, em que um organismo se beneficia em detrimento do outro. Quando esses organismos compartilham o mesmo ambiente, pode resultar em algumas alterações, seja no crescimento dos organismos, nos padrões de adaptação, na morfologia, no seu desenvolvimento ou até mesmo na sua capacidade para sintetizar proteínas e outras substâncias. No presente estudo, avaliou-se a interação entre Acanthamoeba polyphaga e Staphylococcus aureus (MRSA) através de um modelo de cocultivo em diferentes tempos de incubação. A partir deste, 89% das células amebianas permaneceram viáveis após contato com a bactéria. O isolado bacteriano foi visualizado no interior da ameba através de microscopia confocal e de fluorescência em até 216 horas de cocultivo, sendo considerado um microrganismo resistente à ameba. O contato de A. polyphaga com S. aureus (MRSA) não demonstrou alteração fenotípica da ameba através dos testes fisiológicos de osmo e termotolerância. O lisado da cultura amebiana aumentou o crescimento de S. aureus (MRSA) nos diferentes tempos de incubação, porém houve diferença significativa apenas entre o controle e 96 horas de cocultivo. O crescimento de S. aureus (MRSA) foi inibido ao longo dos tempos de incubação pelo efeito do sobrenadante da cultura amebiana apresentando diferença significativa entre o controle e 96 horas de cocultivo, sugerindo-se que A polyphaga tenha secretado algum tipo de metabólito, que inibiu o crescimento da bactéria. A interação dos microrganismos não apresentou alterações significativas no perfil de susceptibilidade aos antibióticos testados. S. aureus (MRSA) permaneceu viável em cistos de A. polyphaga, reforçando a hipótese de que Acanthamoeba pode desempenhar um papel crucial na propagação de S. aureus (MRSA) na comunidade e ambiente hospitalar. O maior percentual de amebas encistadas deu-se em 96 horas de incubação quando cocultivadas com o isolado de S. aureus (MRSA), apresentando um aumento progressivo deste percentual a cada período de incubação. A partir disso, estudos devem intensificar-se para melhor compreender os mecanismos de virulência envolvidos na interação entre ambos os microrganismos. / The interactions that occur between bacteria and amoebae can give through mutual relations, where both organisms benefit from the association or parasitic in which one organism benefits at the expense of the other. When these organisms share the same environment, can result in some changes in the growth of organisms, in adaptation patterns, in morphology, development or even in their ability to synthesize proteins and other substances. In the present study, we evaluated the interaction between Acanthamoeba polyphaga and Staphylococcus aureus (MRSA) using a coculture model at different incubation times. From this, 89% of amoebic cells remain viable after contact with the bacteria. The bacterial isolate was visualized inside the amoeba through confocal microscopy and fluorescence for up to 216 hours of cocultivation, being considered a resistant microorganism to the amoeba. The contact of A. polyphaga with S. aureus (MRSA) showed no phenotypic changes of amoeba through physiologic osmo or thermotolerance tests. The lysate of amoebic culture increased the growth of S. aureus (MRSA) in the different incubation times, but there was a significant difference only between the control and 96 hours of cocultivation. The growth of S. aureus (MRSA) has been inhibited over the incubation times for the effect of amoebic culture supernatant showing a significant difference between the control and 96 hours of coculture, suggesting tha A. polyphaga has some kind of secreted metabolites inhibiting the growth of bacteria. The interaction of microorganisms showed no significant changes in the susceptibility profile of the tested antibiotics. S. aureus (MRSA) remained viable cysts of A. polyphaga, reinforcing the hypothesis that Acanthamoeba can play a crucial role in the spread of S. aureus (MRSA) in the community and hospital. The highest percentage of encysted amoebae occurred in 96 hours of incubation when cocultured with the isolate of S. aureus (MRSA), with a progressive increase in this percentage to each incubation period. From this, studies should be intensified to better understand the virulence mechanisms involved in the interaction between these two organisms.

A utilização de biofertilizantes se tornou um assunto bastante estudado como alternativa à degradação ambiental e às perdas econômicas geradas pelo uso excessivo de fertilizantes nitrogenados e fosfatados na agricultura. Os organismos utilizados nessas formulações são capazes de promover o crescimento vegetal, não apenas através da fixação biológica de nitrogênio, mas também através de outras características que podem ser benéficas às plantas. Este estudo teve como objetivo isolar bactérias putativamente fixadoras de nitrogênio (diazotróficas) e avaliar a diversidade desses isolados e de algumas características de promoção de crescimento vegetal nos locais amostrados. Os isolados foram obtidos de amostras de raízes de trigo e de solo rizosférico a elas associado de seis localidades produtoras de trigo no Estado Rio Grande do Sul. O isolamento foi realizado pela utilização de meios semissólidos sem nitrogênio e os isolados foram testados quanto a suas habilidades de solubilizar fosfato e produzir sideróforos e compostos indólicos. A identificação dos isolados foi feita através do sequenciamento parcial do gene que codifica a subunidade ribossomal 16S. Os gêneros bacterianos mais abundantes encontrados entre os 346 isolados obtidos foram Pseudomonas, Burkholderia, Rhizobium e Enterobacter. A diversidade das comunidades bacterianas estudadas (H’) se mostrou mais influenciada pelo pH e pelo teor de matéria orgânica do solo, segundo a Análise de Componentes Principais. Apenas 55 isolados foram capazes de solubilizar fosfatos, a maioria pertencente ao gênero Burkholderia e representantes da família Enterobaceriaceae. A capacidade de produzir sideróforos foi encontrada em 209 isolados, enquanto a produção de compostos indólicos foi observada na totalidade dos isolados. Os isolados do gênero Burkholderia foram encontrados comumente relacionados à solubilização de fosfato e produção de sideróforos, sugerindo a importância desse gênero na incorporação de nutrientes pelas plantas. Dez isolados foram selecionados para experimentação in vivo em câmara de crescimento. Os isolados mais eficientes em promover o crescimento da variedade de trigo utilizada foram B. phymatum GM55 e B. phytofirmans BV47. Experimentos em campo estão em andamento para avaliar o potencial dessas linhagens como biofertilizantes. / Biofertilizers usage has become a very well studied subject as an alternative for environmental damage and economic losses caused for the excessive use of nitrogen and phosphate fertilizers in agricultural crops. The organisms used in these formulations are able to promote plant growth not only through biological nitrogen fixation, but also through others beneficial abilities. This study aimed to isolate putative nitrogen fixing bacteria (diazotrophs) and evaluate some of their plant growth promoting traits according to the sampling sites. The isolates were obtained from roots of wheat plants and from the rhizospheric soil associated to them from six wheat producers’ localities in Rio Grande do Sul state. The isolation procedure was conducted with free-nitrogen semi-solid media and the isolates were assayed for their abilities to solubilize phosphates and to produce siderophores and indolic compounds. Isolates’ identification was performed through partial sequencing of ribosomal 16S subunit coding gene. The most abundant genera found among the 346 isolates were Pseudomonas, Burkholderia, Rhizobium, and Enterobacter. Bacterial community diversity (H’) showed to be mostly influenced for pH and organic matter soil content, according to Principal Component Analysis. Only 55 isolates were able to solubilize phosphates, mostly belonging to Burkholderia genus and members of the Enterobaceriaceae family. The ability to produce siderophores was present in 209 isolates, while indolic compounds production ability was present in all isolates. Isolates belonging to Burkholderia genus were found to be usualy related to phosphate solubilization and siderophore production, suggesting the importance of strains belonging to this genus to plant nutrient uptake. Ten isolates were selected to perform an in vivo experiment in cultivation chamber condition. The most effective isolates to promote plant growth in the evaluated parameters were B. phymatum GM55 and B. phytofirmans BV47. Field experiments are under way to evaluate their potential as biofertilizers.