Os procedimentos de higienização nos matadouros de aves consistem fundamentalmente no uso de água quente, detergentes e sanificantes. Embora a água quente e os detergentes diminuam a carga bacteriana das superfícies, o objetivo principal do seu uso é a remoção de resíduos orgânicos e minerais. A sanitização, que é a última etapa do procedimento de higienização, visa reduzir os microrganismos até níveis seguros, de modo a obter um produto de boa qualidade higiênico-sanitária. Dentre os contaminantes da carne de aves, microrganismos patogênicos apresentam grande relevância como causadores de doenças veiculadas por alimentos e por terem reflexo econômico. Do ponto de vista da segurança e da degradação de alimentos, os biofilmes são importantes devido à sua formação em alimentos, utensílios e superfícies e à sua dificuldade de remoção. Com base na relevância destes temas, nesta tese constam seis trabalhos científicos. No primeiro trabalho foi avaliada a contaminação bacteriana das superfícies em contato com carne de frango através das contagens de microrganismos mesófilos aeróbios, coliformes totais, Escherichia coli, Staphylococcus sp, S. aureus e pesquisa de Salmonella sp. Verificou-se que a E. coli foi detectada na bancada de aço inoxidável e na esteira sobreposta de “nylon”, Staphylococcus sp foi detectado em todas as amostras, S. aureus não foi detectado apenas na bancada de aço inoxidável e em uma das esteiras lisas de poliuretano e Salmonella sp esteve ausente em todas as superfícies analisadas. No trabalho 2 avaliou-se a formação de biofilme em placas de poliestireno por Salmonella Heidelberg isoladas de abatedouros avícolas, cultivadas em caldo TSB com diferentes concentrações de glicose e a hidrofobicidade destas cepas na fase logarítmica (4 h) e na fase estacionária (24 h) do crescimento bacteriano. As S. Heidelberg foram capazes de formar biofilmes no poliestireno, com diferentes fontes de nutrientes, sendo fortemente formadoras de biofilme no caldo TSB sem suplementação de glicose, e foram determinadas como altamente hidrofóbicas e com média hidrofobicidade. O terceiro trabalho foi realizado para comparar o uso de swab e esponja para avaliação de superfícies em contato com alimentos em matadouro de aves. Concluiu-se que não houve diferença estatística entre as duas metodologias para a verificação da higienização em superfícies como as bancadas de aço inoxidável, esteiras de poliuretano, esteira sobreposta de “nylon” e placas de polietileno. No trabalho 4 foi realizada a pesquisa de Salmonella sp e Listeria sp em diferentes superfícies de contato com alimentos e a verificação da eficácia do processo de sanitização. Salmonella sp. não foi isolada em nenhuma das superfícies testadas. Antes da lavagem, isolou-se Listeria welshimeri da esteira de poliuretano e L. monocytogenes da mesa de aço inoxidável, ambas de superfícies contendo resíduos de alimentos. Após a lavagem com água quente isolou-se L. monocytogenes da esteira de poliuretano, sendo que este agente não foi novamente isolado após o tratamento com amônia quaternária a 2%. No trabalho 5 foram avaliadas as condições higiênico-sanitárias das superfícies de uma sala de cortes de abatedouro avícola, utilizando microbiologia convencional (placas Rodac e esponja) e ATP-bioluminescência, para analisar a efetividade da água quente e da ação de três princípios ativos (ácido peracético, amônia quaternária e biguanida) no processo de higienização, quantificando microrganismos mesófilos aeróbios, Staphylococcus aureus, Escherichia coli e ATP. O método ATP-bioluminescência demonstrou a presença de matéria orgânica em todos os pontos coletados e, assim como a microbiologia convencional, também evidenciou a eficácia da higienização, demonstrando ser um método rápido para a verificação e controle do processo. A utilização das placas Rodac possibilitou uma melhor recuperação de microrganismos que a esponja na quantificação de mesófilos aeróbios, E. coli e S. aureus. Houve redução da contaminação após o uso da água quente. Quanto aos sanitizantes, após o uso da amônia quaternária e do ácido peracético, em todas as superfícies avaliadas, não houve mais recuperação de E. coli e S. aureus. No trabalho 6 foi realizada a quantificação da formação de biofilme em poliestireno por Listeria, Escherichia coli e Staphylococcus aureus isolados de superfícies de abatedouro avícola. As amostras de S. aureus formaram biofilme no poliestireno em pelo menos uma das concentrações testadas, sendo fortemente formadoras em caldo TSB com 2 %, 3 %, 3,5 % e 4 % de glicose. As amostras de Listeria demonstraram-se moderadamente formadoras de biofilme em todas as concentrações de glicose testadas, exceto as cultivadas em TSB com 1,5 % glicose, no qual foram não formadoras e fracamente formadoras. Uma amostra, cultivada no caldo TSB com 3,5 % de glicose, foi a única L. monocytogenes considerada fortemente formadora de biofilme. As amostras de E. coli formaram biofilme em pelo menos uma das concentrações testadas, e foram fortemente formadoras quando cultivadas em caldo TSB com 0 %, 3,5 % e 4 %. / Cleaning procedures at poultry slaughterhouses basically include the use of hot water, detergents and sanitizing agents. Although hot water and detergents reduce the bacterial load on surfaces, their main goal is to remove organic and mineral residues. Sanitization, which is the last cleaning step is targeted at reducing the number of microorganisms to safety levels so as to obtain a product of good hygienic and sanitary quality. Among contaminants of poultry meat, pathogenic microorganisms play a key role as causing agents of foodborne diseases and also have a remarkable economic impact. With respect to food safety and degradation, biofilms are important because of their formation on foods, utensils and surfaces and because they cannot be easily removed. Given the relevance of these issues, the present study includes six scientific articles. The first one assessed bacterial contamination of surfaces in contact with poultry meat based on the counting of aerobic mesophiles, total coliforms, Escherichia coli, Staphylococcus sp, S. aureus and investigation of Salmonella sp. E. coli was detected on stainless steel tables and on the overhead nylon conveyor; Staphylococcus sp was detected in all samples; S. aureus was not detected only on stainless steel tables and on one smooth polyurethane conveyor, and Salmonella sp was not detected in any of the surfaces analyzed. The second article assessed biofilm formation on polystyrene cutting boards by Salmonella Heidelberg isolated from poultry slaughterhouses, grown in TSB at different glucose concentrations, in addition to the hydrophobicity of these strains in the logarithmic phase (4 h) and in the stationary phase (24 h) of bacterial growth. S. Heidelberg strains were capable of forming biofilm on polystyrene, at different nutrient concentrations, and turned out to be strong biofilm producers in TSB without glucose supplement, being regarded as highly and moderately hydrophic. The third article compared the use of swab and sponge in the assessment of surfaces in contact with foods at a poultry slaughterhouse. It concluded that there was no statistical difference between the two methods used to check the cleaning of surfaces such as stainless steel tables, polyurethane conveyors, overhead nylon conveyors and polyethylene cutting boards. Article 4 investigated Salmonella sp and Listeria sp on different surfaces in contact with foods and the efficacy of the sanitization process. Salmonella sp. was not isolated on any of the surfaces analyzed. Before washing, Listeria welshimeri was isolated from the polyurethane conveyor and L. monocytogenes from the stainless steel table, both from surfaces that contained food residues. After hot water washing, L. monocytogenes was isolated from the polyurethane conveyor, but this pathogen was not detected again after cleaning with 2% quaternary ammonium. Article 5 assessed the cleaning and hygiene of surfaces in the cutting room of a poultry slaughterhouse using conventional microbiological methods (Rodac plates and sponge) and ATP-bioluminescence to assess the effectiveness of hot water and the action of three active ingredients (peracetic acid, quaternary ammonium and biguanide) in the sanitization process, quantifying aerobic mesophilic microorganisms, Staphylococcus aureus, Escherichia coli and ATP. The ATP-bioluminescence assay revealed presence of organic matter at all sites analyzed and, as with conventional microbiology, it also demonstrated that sanitization was efficacious, proving that it is a quick method for inspecting and controlling the process. The use of Rodac plates allowed for better recovery of microorganisms than the sponge in the quantification of aerobic mesophiles, E. coli and S. aureus. Contamination was reduced after hot water use. With regard to sanitizing agents, E. coli and S. aureus were no longer detected on any of the surfaces analyzed after the use of quaternary ammonium and peracetic acid. The last article quantified biofilm formation on polystyrene by Listeria, Escherichia coli and Staphylococcus aureus isolated from surfaces at a poultry slaughterhouse. S. aureus strains formed biofilm on polystyrene at least at one of the concentrations tested, being strong biofilm producers in TSB with 2, 3, 3.5 and 4% of glucose. Listeria strains were moderate biofilm producers at all glucose concentrations, except for those grown in TSB containing 1.5% of glucose, in which they did not form biofilm or were weak producers. One L. monocytogenes strain, grown in TSB with 3.5% of glucose, was the only one regarded as strong biofilm producer. E. coli strains analyzed formed biofilm at least at one of the concentrations and were strong biofilm producers when grown in TSB with 0, 3.5 and 4% of glucose.

O Streptococcus pneumoniae, também conhecido como pneumococo, é um importante agente etiológico causador de pneumonia, bacteremia, meningite e otite aguda do ouvido médio, acometendo especialmente crianças e idosos. A cápsula polissacarídica (PS) é o fator de virulência mais importante e localiza-se na superfície do microrganismo e tem ação anti-fagocítica in vivo. O pneumococo expressa pelo menos 91 cápsulas diferentes, que são química e sorologicamente distintas. Usualmente, a cápsula é o antígeno das vacinas anti-pneumocócicas, tanto como polissacarídeo livre ou conjugado a proteínas. O sorotipo 6B acomete principalmente crianças e é o segundo mais prevalente no Brasil, e a otimização das condições de cultivo buscando maior produtividade em PS é o alvo desta tese. Simultaneamente, também foi investigada a influência do inóculo e da glicose residual no instante do pulso ou do início da alimentação em cultivos descontínuos alimentados. Nos cultivos descontínuos alimentados foi observado que quanto menor a densidade óptica da cultura do inóculo, maior a concentração de PS obtida. A concentração da glicose residual no momento do pulso provavelmente influenciou a produção de PS: a produção foi maior quando o pulso foi dado ainda em altas concentrações de substrato. Por isso, obteve-se uma produção de PS ~390 mg/L em cultivo descontínuo alimentado com pulso, quando DO 600 nm da cultura do inóculo ~1,6 e o pulso de glicose e acetato de amônio ~15 g/L. Observou-se também que, mesmo com DO do inóculo ~1,65, a produção de PS foi somente 248 mg/L, devido à aplicação do pulso quando a concentração de glicose residual era ~4,5 g/L. A menor produção de PS foi obtida quando a DO da cultura do inóculo foi ~2,6 e a concentração de glicose residual ~3,4 g/L, gerando somente 194 mg/L de PS. Assim, cultivos descontínuos alimentados com pulso renderam melhores resultados que os cultivos descontínuos alimentados. A alimentação constante rendeu maior quantidade de PS quando comparada à alimentação exponencial. E tanto os ensaios descontínuos com ou sem pulso e os descontínuos alimentados foram melhores do que os cultivos contínuos, principalmente se considerarmos a facilidade de operação. O efeito da concentração residual da glicose no instante da alimentação na produção de PS é provavelmente influenciado pela presença de outros componentes do meio, devido aos requerimentos nutricionais do pneumococo. O estado fisiológico do inóculo determinou uma importante correlação entre a produção de PS nos cultivos descontínuos alimentados do sorotipo 6B: cultura do inóculo no meio da fase exponencial rendeu maior produção de PS. Esta correlação poderia ser conseqüência do perfil de crescimento do microrganismo in vitro e da ação de enzimas líticas após a fase exponencial. Foi observado, portanto, um efeito sinérgico entre a DO da cultura do inóculo, a concentração de glicose residual no momento de alimentação e produção de PS nos cultivos descontínuos alimentados. / Streptococcus pneumoniae is a major pathogen commonly responsible for pneumonia, bacteraemia, meningitis and otitis media, especially among young children and older adults. The most prominent pneumococcal virulence factor is the capsular polysaccharide (PS), which coats the surface of the bacterium and acts as an antiphagocytic factor in vivo. S. pneumoniae express at least 91 distinct capsules which are chemically and serologically distinct. The capsule is currently used as antigen in pneumococcal vaccines, either as free polysaccharide or conjugated to proteins. Pneumococcal serotype 6B is the second most prevalent in Brazil and the optimization of cultivation conditions is part of this study. Simultaneously we investigated the influence of the growth phase of the inoculum and the residual glucose concentration at the instant of the pulse or the start of feeding on PS production in batch and fed-batch cultivation. Streptococcus pneumoniae serotype 6B strain ST 433/03 was used. Bench scale experiments were carried out using a variant of the Hoeprich medium, containing glucose, acid-hydrolyzed casein, dialyzed yeast extract, L-glutamine and asparagine as nitrogen sources, choline as a growth factor and salts. The experiments were conducted in bioreactors monitored by the LabView 7.1program. It was observed in fed-batch cultivation, that the lower was the OD of the starter culture, the higher was the PS concentration obtained. The residual glucose concentration at the moment of the pulse also influenced the PS production: the PS production was higher when the pulse was given at higher residual glucose concentration. Hence, in fed-batch culture the highest PS production (387 mg/L) was obtained using an OD=1.6 of the starter culture and giving the pulse when the residual glucose was ~15 g/L. Using a similar inoculum (OD=1.65), the PS concentration reached 248 mg/L after giving the pulse when the residual glucose was 4.5 g/L. The lowest PS production was obtained when a culture with an OD=2.6 was inoculated into the reactor and the pulse was given when the residual glucose was 3.4 g/L (PS=194 mg/L). The effect of the residual glucose concentration at the instant of the start of feeding on PS production was probably influenced by the presence of other components in the concentrated feeding medium, which could better fit the nutritional requirements of the microorganism. The physiological state of the inoculum showed an important correlation to the PS production in batch and fed-batch cultivation of S. pneumoniae serotype 6B: mid-log phase inocula yielded high PS production. This correlation is consequence of the in vitro growth profile, the action of lytic enzymes after the log phase. In fed-batch cultivation, it was also observed a synergic effect of the inoculum OD and the residual glucose concentration in the moment of the pulse on PS production.

A variação sazonal na produção de compostos secundários em Tithonia diversifolia (Hemsl) Gray foi investigada desde a primavera de 2002 até o inverno de 2003. Coletas bimensais foram realizadas com posterior extração e fracionamento do material vegetal (folhas e flores). As amostras foram monitoradas por CCD e analisadas quanto a atividade antimicrobiana contra Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Salmonella choterasuis e Pseudomonas aeruginosa, pelo método de microplaca. Os perfis cromatográficos foral distintos para as diferentes épocas do ano, sendo evidenciada a presença de um grupo de substâncias em maior quantidade no mês de Abril de 2003 (outono), período de pré-florada desta espécie. Os extratos foram ativos para apenas dois microrganismos dentre os quatro testados. Algumas frações apresentaram CIM (concentração inibitória mínima) significativa (<1mg/mL). / The seasonal variation upon production of active compounds in Tithonia diversifolia (Hemsl) Gray was investigated from spring of 2002 until winter of 2003. Leaf samples were collected every three months for posterior extraction and analysis . The samples were monitored by Thin Layer Chromatography (TLC) and analyzed for anti-microbial activities on Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Salmonella choterasuis and Pseudomonas aeruginosa, using micro-plate method. The TLC results showed a clear accumulation of active compounds during April . The extracts were active for only two microorganisms of a total of four studied.

Made available in DSpace on 2014-06-12T18:30:27Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo3563_1.pdf: 2862069 bytes, checksum: 8ef6f7035e92bf837ff1580945cd1157 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2009 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Atualmente, a Pseudomonas aeruginosa é o bacilo Gram-negativo mais reportado em casos de infecções hospitalares. Sua elevada resistência a antimicrobianos e desinfetantes químicos pode ser explicada, em parte, pela forma de crescimento em biofilmes. A variante mucóide da P. aeruginosa, comumente isolada de pacientes com fibrose cística, é capaz de produzir grandes quantidades de alginato, resultando em biofilmes extremamente complexos. O presente estudo objetivou realizar um levantamento da prevalência da P. aeruginosa, bem como seu perfil de susceptibilidade aos antimicrobianos no Hospital das Clínicas da Universidade Federal de Pernambuco (HC), assim como avaliar a ação do óxido nítrico sobre biofilmes de amostras mucóides da mesma bactéria oriundas de pacientes com fibrose cística do Instituto de Medicina Integral Professor Fernando Figueira (IMIP), Recife-PE. Para a análise da prevalência, foi realizado um estudo retrospectivo baseado no livro de registros de secreções diversas do laboratório de bacteriologia do HC. Biofilmes de amostras mucóides e não-mucóides de pacientes com fibrose cística do IMIP foram analisados sobre microscopia eletrônica de varredura. As bactérias mais freqüentes, isoladas das secreções diversas, foram P. aeruginosa (26%) e S. aureus (25%). Quanto à origem, a P. aeruginosa parece ser um patógeno essencialmente respiratório, uma vez que 33% das amostras positivas para esta bactéria foram de secreções traqueais e 21% nasais. Os antimicrobianos mais eficazes contra a P. aeruginosa foram Amicacina, Imipenem, Meropenem e Aztreonam. Biofilmes de amostras mucóides da P. aeruginosa são muito mais complexos se comparados aos das amostras não-mucóides. No primeiro caso, as bactérias se agregam em estruturas que lembram teias de aranha que se fixam ao substrato formando grandes estruturas complexas no interior das microcolônias. Portanto, apesar da elevada prevalência no HC, a P. aeruginosa mostrou boa sensibilidade aos antimicrobianos testados naquele hospital. Ainda concluindo, biofilmes desta bactéria apresentam grande complexidade e necessitam de estudos mais aprofundados. Apesar de mais complexos, biofilmes mucóides da P. aeruginosa podem ser inibidos na presença de concentrações nanomolares do nitroprussiato de sódio

Esporos de Bacillus subtilis podem ser utilizados como veículos vacinais capazes de expressar ou adsorver proteínas heterólogas em sua superfície. Estudos recentes indicaram que esporos de B. subtilis também conferem um forte efeito adjuvante para vacinas baseadas em proteínas purificadas administradas por via parenteral. Nesse cenário, o objetivo do presente projeto foi avaliar o papel adjuvante dos esporos de B. subtilis e viabilizar sua utilização como carregadores de vacinas de DNA pelo método da biobalística (gene gun). Nesta metodologia, os esporos foram utilizados como substitutos das micropartículas de ouro usualmente empregadas, mantendo a capacidade de transfecção de células eucarióticas in vitro, e produção de anticorpos específicos em camundongos C57BL/6 imunizados com o plasmídeo vacinal pgDE7h (que codifica para uma forma atóxica da oncoproteína E7 do HPV-16). Além disso, esporos de B. subtilis foram capazes de ativar células dendríticas in vitro e, quando coadministrados a pgDE7h pela via intramuscular, conferiram um aumento de 50% na proteção anti-tumoral de animais previamente transplantados com a linhagem tumoral TC-1 (que expressa a proteína E7 do HPV-16), em uma relação dose-dependente. / Bacillus subtilis spores can be used as vaccine vehicles capable of to display or adsorb heterologous proteins in its surface. Recent studies have indicated that spores of B. subtilis confer a strong adjuvant effect for vaccines based on purified proteins administered by the parenteral route. In this scenario, the objective of this project is to evaluate the adjuvant role of B. subtilis spores e viabilize its use as DNA vaccine carriers of biolistic method (gene gun). In this methodology, the spores are used as gold microparticles substitutes usually employed, maintaining the ability to transfect eukaryotic cells in vitro and production of specific antibodies in C57BL / 6 mice immunized with the vaccine plasmid pgDE7h (encoding a non-toxic form of the E7oncoprotein of HPV-16). Additionally, spores of B. subtilis were able to activate dendritic cells in vitro when co-administered intramuscularly to pgDE7h, conferring an increase of 50% of anti-tumor protection in animals previously transplanted with the TC-1 tumor cell line (expressing the E7 protein of HPV-16) in a dose-dependent manner.

Streptococcus pneumoniae é uma bactéria encapsulada que coloniza a nasofaringe, sendo uma das principais causas de morte por pneumonia e meningite em crianças e idosos. As vacinas contra S. pneumoniae são compostas por polissacarídeos capsulares (PS) livres ou conjugados à uma proteína. A vantagem do polissacarídeo conjugado em relação ao livre é a resposta timo-dependente. Pelo fato de existirem pelo menos 92 diferentes sorotipos capsulares, a utilização de uma proteína pneumocócica em uma vacina conjugada com apenas alguns sorotipos poderia aumentar a sua cobertura vacinal. Para tal, a utilização da proteína de superfície pneumocócica A (PspA) foi utilizada como carreador protéico covalentemente ligado ao polissacarídeo capsular sorotipo 14. Este trabalho também apresenta uma nova metodologia para a síntese de vacinas conjugadas, que vem demonstrando melhores resultados em nosso laboratório em comparação aos métodos clássicos de conjugação. O conjugado PS14-PspA foi administrado em camundongos BALB/c e o título de IgG anti-PS14 e anti-PspA, o índice de avidez, a deposição de complemento e a distribuição das subclasses de IgG foram avaliados. O título de IgG anti-PS14 conjugado foi significativamente maior do que título de IgG anti-PS14 livre. A avidez e a deposição de complemento do soro anti-PS14 conjugado também foram maiores. A principal subclasse de IgG induzida pelo PS14 livre foi IgG3 enquanto o PS14 conjugado induziu preferencialmente IgG1. No entanto, o índice de avidez, o perfil de distribuição das subclasses de IgG e a medida funcional da atividade opsonofagocítica dos soros anti-PspA livre e conjugada foram os mesmos. / Streptococcus pneumoniae is an encapsulated bacterium that colonizes the nasopharynx, being one of the leading causes of death from pneumonia and meningitis in infants and elderly. Vaccines against S. pneumoniae are constituted by plain capsular polysaccharide (PS) or conjugated to a protein. The advantage of conjugated PS on plain PS vaccine is the thymus dependent immune response. Since there are at least 92 different capsular serotypes, the use of a pneumococcal protein in a conjugate vaccine using only few serotypes might broader its coverage. For this purpose the pneumococcal surface protein A (PspA) was used as protein carrier to bind covalently to the capsular polysaccharide serotype 14. This work also presents a new methodology for the synthesis of conjugate vaccines, which showed better results in our laboratory in comparison to the classic ones. The conjugate PS14-PspA was injected in BALB/c mice and sera were measured for IgG titer against PS14 and PspA. IgG avidity index, complement deposition, and anti-PS14 and anti-PspA IgG subclasses were also evaluated. IgG titer against conjugated PS14 was significantly higher than IgG titer against control PS14. The avidity and the complement deposition of conjugated anti-PS14 serum were also higher. The main IgG subclass induced by free PS14 was IgG3 while conjugated PS14 induced preferably IgG1. Nevertheless, the avidity index, the IgG subclasses distribution profile, and the functional opsonophagocytic measure from free and conjugated anti-PspA sera were the same.

No leite tipo \"B\" comercializado em São Paulo foram pesquisados a presença de aflatoxina M1 e de inibidores bacterianos (penicilina, água oxigenada, formol e cloro}. As amostras de leite utilizadas foram provenientes das quatro marcas de maior consumo pela população de São Paulo. O trabalho constituiu-se em um estudo longitudinal, com amostragem probabilística, dividido em dois períodos iguais de 140 dias com 224 amostras analisadas. No primeiro período, de 14 de junho a 31 de outubro de 1982, foram pesquisados todos os contaminantes propostos. No segundo período, de 01 de novembro de 1982 a 30 de março de 1983, a aflatoxina não foi pesquisada, pois, como sofre influência sazonal, há maior possibilidade de ser encontrada nos meses de temperaturas mais baixas. A aflatoxina, embora em baixos níveis e em pequena proporção (1 ,8 por cento ), fez-se presente nas quatro marcas. Foi constatada alta prevalência de inibidores bacterianos. No primeiro e no segundo período a proporção foi de 4,95 por cento e 4,50 por cento respectivamente. No primeiro período a incidência de resíduos de penicilina e de inibidores não identificados foi de 0,9 por cento , e de 3,6 por cento respectivamente. No segundo foi de 0,45 por cento e de 3,15 por cento . Houve uma baixa proporção de amostras com água oxigenada e formal, e ausência de cloro. De acordo com os resultados, concluiu-se que há necessidade do estabelecimento de limites de tolerância para a aflatoxina no leite, ausentes na nossa legislação; e pela necessidade da atuação da Saúde Pública através de inspeção, e através de amplos programas educativos junto aos produtores e indústrias. / B-type milk sold in the city of São Paulo, Brazil, was examined for Aflatoxin M1 and bacterial inhibitors, such as penicilin, hydrogen peroxide, formaldehyde and chlorine. Samples were taken from the faur most consumed brands. The study was longitudinal, with probabilistic sampling, divided in two equals periods of 140 days each; the total number studied was 224 in each period. During the first period, June 14 th through October, 31st, 1982, all mentioned contaminants were studied where as aflatoxin was not studied in the second period, November 1st, 1982 through March, 30th, 1983, as its occurrence is seasonal and the probability of it being encountered is practically null. Aflatoxin, although is small proportion (1.8%) and at low levels, was present in the four brands studied. The prevalence of bacterial inhibitors was high is both periods (4.95% in the first period and 4.50% in the second). During the first period the incidence of penicillin residues and non-identified inhibitors was 0.9% and 3.6% respectively, in the first period, and 0.45% and 3.15% respectively in the second. The proportion of samples containing hidrogen peroxide, formaldehyde was low and chlorine was absent in all. Our results show the need for establishing legal tolerance limits for aflatoxin in milk (which has not been done as yet) and the need for Public Health measures regarding inspection and education of productors and industrial plants.

O S. mutans é o agente etiológico da cárie dental humana, uma doença com ampla distribuição mundial. A adesão à superfície dental depende da interação entre a proteína de superfície P1 e a aglutinina salivar (SAG) adsorvida ao dente. A região N-terminal da P1 é um alvo vacinal importante que está diretamente associada às funções de adesão e agregação. Este trabalho teve o objetivo de avaliar estratégias vacinais contra o S. mutans baseadas na proteína P1 usando linhagens recombinantes de B. subtilis. O B. subtilis é uma bactéria gram positiva, formadora de esporos, não patogênica, empregada como sistema de expressão de proteínas heterólogas e como veículo vacinal administrado por vias de mucosas. Empregamos o B. subtilis para expressar e purificar a proteína P139-512 derivada da proteína P1 de S. mutans UA159. O antígeno P139-512 apresentou epítopos lineares e conformacionais semelhantes aos presentes na proteína P1 nativa. O sítio de ligação à SAG está preservado nessa proteína assim como suas propriedades imunogênicas. A coadministração parenteral do antígeno com adjuvantes vacinais promoveu resposta sistêmica específica com anticorpos eficazes no bloqueio da adesão de S. mutans. Por fim, usamos esporos de B. subtilis como veículo de entrega de mucosa para o antígeno alvo de S. mutans. Esporos de B. subtilis foram modificados para expressar na superfície adesinas bacterianas (SlpA, InvA ou Inv600) com capacidade de ligação ao epitélio intestinal e, quando no estágio de célula vegetativa, expressar intracelularmente o antígeno P139-512. A imunização oral com os esporos adesivos induziu altas concentrações de anticorpos sistêmicos e de mucosa. A imunização nasal ou sublingual com os esporos recombinantes induziu níveis de anticorpos sistêmicos maiores do que aqueles obtidos após a imunização oral. Além disso, esses anticorpos foram mais eficientes em bloquear a adesão de S. mutans à SAG imobilizada, sem interferir com a agregação. Em conclusão, os resultados obtidos abrem perspectivas interessantes para o desenvolvimento de vacinas anti-cárie baseadas em linhagens de B. subtilis. / S. mutans is the major etiologic agent of human dental caries, a disease with worldwide distribution. The adhesion to the tooth surface is dependent on the interaction of the P1 surface protein and salivary agglutinin (SAG) adsorbed to the tooth. The N-terminal region of P1 is an important vaccine target that is directly associated with adhesion and aggregation functions. This study aimed to evaluate vaccination strategies against S. mutans based on the P1 protein using recombinant B. subtilis strains. B. subtilis is a gram positive, spore-forming, non-pathogenic bacterium used as expression system for heterologous proteins and as a vaccine vehicle administered by mucosal routes. Inicially, we employed a recombinant B. subtilis strain to express and purify the P139-512 protein derived from the S. mutans UA159 P1 protein. The P139-512 antigen showed important conformational and linear epitopes similar to those present in the native P1 protein. The SAG-binding site is preserved in P139-512 as well as immunological properties. The parenteral co-administration of antigen with vaccine adjuvants stimulated systemic antibodies effective in blocking adhesion of S. mutans to SAG. Lastly, we used B. subtilis spores as a mucosal delivery vehicle for antigen targeting. B. subtilis endospores were modified to display bacterial adhesins (SlpA, InvA or Inv600), capable to bind to the intestinal epithelium, on the spore surface and to express intracellularly the P139-512 antigen during the vegetative cell stage. Oral immunization with adhesives spores induced high systemic and mucosal specific antibodies levels. The nasal or sublingual immunization with B. subtilis recombinant spores induced higher amounts of systemic antibodies than the oral immunization. Furthermore, the specific antibodies were highly effective in blocking the adherence of S. mutans to immobilized SAG, without interfering with aggregation. In conclusion, the results open interesting perspectives for the development of anti-caries vaccines based on B. subtilis strains.

Os microrganismos podem apresentar-se tanto em forma de vida livre como aderidos a uma superfície ou interface ar-líquido, formando comunidades complexas e dinâmicas conhecidas como biofilmes. Nos últimos anos, com o avanço das pesquisas em nível molecular, foi identificado que a maioria das bactérias utilizam guanosina monofosfato (3´-5´)-cíclica dimérica (c-di-GMP) como um segundo mensageiro. De forma geral, essa molécula controla a sinalização celular, virulência, comunicação entre células e a expressão de proteínas relacionadas com o fenótipo de biofilmes, em resposta à sua concentração intracelular. Sua síntese e degradação são controladas respectivamente por diguanilto ciclases (DGCs) contendo domínio GGDEF e fosfodiesterases (PDEs) que possuem os domínios EAL ou HD-GYP. Em Pseudomonas aeruginosa (PA14) foi identificada uma nova classe de receptor específico para c-di-GMP, a proteína transmembranar PelD, cuja porção citoplasmática contém os domínios GAF e GGDEF degenerado. Sua modulação através desse dinucleotídeo controla a produção de exopolissacarídeos pelos componentes do conservado operon pel e influencia diretamente na capacidade de formação de biofilmes. Devido à escassez de dados a respeito dos eventos moleculares do mecanismo de sinalização mediado por c-di-GMP, este trabalho teve como objetivo principal a caracterização biofísica/estrutural da proteína PelD, bem como o reconhecimento de interação entre este ligante e a porção citoplasmática da proteína. Diversas construções solúveis de PelD foram clonadas e expressas, sendo que a construção compreendendo os resíduos 176-455 (PelD176-455) foi cristalizada com sucesso e teve sua estrutura determinada por iodo-SAD. O modelo final apresentou os dois domínios com enovelamentos característicos das famílias GAF e GGDEF, sendo a interface inter-domínios composta majoritariamente por resíduos hidrofóbicos. Visando uma compreensão das bases moleculares de reconhecimento e ativação de PelD por c-di-GMP, uma estrutura em complexo com o ligante foi resolvida. Como esperado, o dinucleotídeo foi encontrado no sítio inibitório do domínio GGDEF, onde o motivo R367xxD370 e o resíduo R402 são responsáveis pela maior parte das interações com c-di-GMP. No entanto, nenhuma grande mudança estrutural foi observada entre as formas apo e holo de PelD, ao contrário de outros sistemas efetores tal como LapD e domínios PilZ. Curiosamente, apenas uma molécula de c-di-GMP foi encontrada no sítio, contrastando com a forma dimérica intercalada normalmente ligada aos sítios inibitórios de domínios GGDEF, tais como em PleD e WspR. Estudos de ITC confirmaram a estequiometria 1:1 em solução. Isso mostra a versatilidade dos diversos receptores já identificados até o momento, frente à ligação desse dinucleotídeo. Estudos de bioinformática identificaram uma potencial região de coiled-coil na hélice juxtamembrana de PelD, resíduos 115-160, provavelmente responsável pela homodimerização. Visando uma comprovação experimental dessa hipótese, uma construção contendo toda a porção citoplasmática, PelD111-455, foi expressa e purificada. Estudos comparativos de dicroísmo circular e ultracentrifugação analítica entre as construções PelD176-455 e PelD111-455 realmente demonstraram que os resíduos extras presentes em PelD111-455 formam uma hélice-&alpha; e são responsáveis pela dimerização da porção citoplasmática da proteína. De modo geral, os resultados aqui apresentados não só contribuirão para o entendimento dos mecanismos de regulação das vias de sinalização mediadas por c-di-GMP como, em longo prazo, poderão levar ao desenvolvimento de agentes contra infecções bacterianas. / Microorganisms may be presented either in planktonic free-swimming life-style or adhered to surfaces, forming a complex and dynamic community known as biofilm. In recent years, with the progress of research at the molecular level, it was identified that the majority of bacteria use guanosine monophosphate (3\'-5 \')-cyclic dimeric (c-di-GMP) as a second messenger. Generally, this molecule controls the cell signaling, virulence, communication between cells and expression of proteins related to the phenotype of biofilms in response to its intracellular concentration. Its synthesis and degradation are controlled respectively by diguanylate cyclases (DGC) containing the GGDEF domain and phosphodiesterases (PDE) with the domains EAL or HD-GYP. In Pseudomonas aeruginosa (PA14) a novel class of receptor specific for c-di-GMP has been identified, the transmembrane protein PelD, which contains a GAF and degenerate GGDEF domains in the cytoplasmic portion. Its modulation through this dinucleotide controls the production of exopolysaccharides by the components of the conserved operon pel and directly influences the ability of biofilm formation. Due to the paucity of data about the molecular events of the signaling mechanism mediated by c-di-GMP, this study aimed to characterize biophysically and structurally the protein PelD. Various soluble constructions of PelD were cloned and expressed, and the construction comprising the residues 176-455 (PelD176-455) was successfully crystallized and its structure was determined by iodine-SAD. The final model showed the two characteristic domains of families GAF and GGDEF, and the inter-domain interface composed primarily of hydrophobic residues. Seeking an understanding of the molecular basis of recognition and activation of PelD by c-di-GMP, a structure in complex with the ligand was solved. As expected, the dinucleotide was found at the inhibitory site of the GGDEF domain, where the motif R367xxD370 and the residue R402 are responsible for most of the interactions with c-di-GMP. However, no major structural change was observed between the apo and holo forms of PelD, unlike other effector systems such as LapD and domains PilZ. Interestingly, only one molecule of c-di-GMP was present on the site, in contrast to the dimeric intercalated form normally found at I-sites GGDEF domains, such as PleD and in WspR. ITC studies confirmed the 1:1 stoichiometry in solution. This shows the versatility of the various receptors identified so far, compared to the binding of dinucleotide. Bioinformatics studies have identified a potential coiled-coil region in the juxtamembrane helix of PelD, residues 115-160, probably responsible for homodimerization. Aiming at an experimental confirmation of this hypothesis, a construct containing the full cytoplasmic portion, PelD111-455 was expressed and purified. Comparative studies of circular dichroism and analytical ultracentrifugation between constructs PelD176-455 and PelD111-455 indeed demonstrated that the extra residues present in PelD111-455 form an &alpha;-helix and are responsible for dimerization of the cytoplasmic portion of the protein. Overall, the results presented here not only contribute to the understanding of the mechanisms of regulation of signaling pathways mediated by c-di-GMP as in the long run, may lead to the development of agents against bacterial infections.

Biofilmes são comunidades bacterianas tridimensionais complexas, que vivem organizadas e aderidas a uma superfície, biótica ou abiótica, embebidas em uma matriz exopolimérica. Cerca de 80% das bactérias vivem organizadas na forma de biofilmes, pois dentro destas estruturas são menos sensíveis aos antibióticos e à resposta imune do hospedeiro. Dentre as principais bactérias formadoras de biofilmes têm-se Staphylococcus spp., Pseudomonas aeruginosa e enterobacteriaceas. Estas bactérias formadoras de biofilmes são importantes colonizadoras da superfície de dispositivos médicos e implantes, aumentando a morbidade e mortalidade dos pacientes que apresentam este tipo de infecção. A investigação de novas estratégias para prevenção e tratamento de infecções por biofilmes é urgentemente necessária. Dentre estas estratégias estão a pesquisa de diferentes mecanismos ou substâncias capazes de provocar a inibição da formação ou a erradicação do biofilme formado. Neste contexto, os venenos animais representam uma fonte ainda inexplorada de uma vasta quantidade de moléculas bioativas, candidatas ao desenvolvimento de novas terapias, inclusive antibiofilme. O principal objetivo deste estudo é avaliar diferentes venenos de serpentes e análogos sintéticos como fonte de moléculas contra biofilmes bacterianos patogênicos. O capítulo 1 revisa estudos que relatam a atividade antimicrobiana (contra bactérias, vírus, protozoários e fungos) de 170 peptídeos isolados de venenos de oito diferentes animais. Peptídeos antimicrobianos vêm ganhando destaque em pesquisas para o tratamento de infecções e peptídeos com atividade antibiofilme são uma nova e promissora abordagem, para o tratamento de infecções relacionadas. O capítulo 2 mostra as atividades antimicrobiana, antibiofilme e de erradicação de biofilmes pré-estabelicidos de 18 análogos de peptídeos de oriundos de venenos de serpentes. Inicialmente foram analisadas e alinhadas 170 sequências peptídeos oriundos de venenos animais. O pepptídeos 16 apresentou considerável atividade antimicrobiana contra cepas bacterianas Gram-positivas, sensíveis e resistentes. Para S. epidermidis os peptídeos 1, 2, 3, 4, 12, 13 e 16 apresentaram menos de 50% de formação de biofilme e os peptídeos 2, 3 e 16 reduziram o biofilme pré-formad. A citotoxicidade e a actividade hemolítica foram testadas e os peptídeos ativos 2 e 16 apresentaram citotoxicidade e hemólise significativas em comparação com os controles. A posição dos aminoácidos pode contribuir para as atividades, sendo que mais testes são necessários para entender a relação das posições de aminoácidos na ação. O capítulo 3 mostra as atividades antiformação e erradicação de biofilmes pré-estabelecidos de dezessete diferentes venenos de serpentes, duas de escorpiões e três de anêmonas marinhas, bem como as secreções de pele de três espécies de sapos. Consideráveis atividades antiformação e de erradicação foram verificadas contra as cepas de S. aureus, S. epidermidis e E. cloaceae por todos os venenos de serpentes testados, em diferentes concentrações. Além disso, um fracionamento inicial foi realizado e as melhores condições foram selecionadas para um novo fracionamento, onde foram testadas 27 frações de veneno de B. diporus. As frações 8, 14 e 23 apresentaram atividades com menos de 50% de formação de biofilme e menos de 80% do biofilme remanescente. Os resultados indicam a capacidade dos venenos, especialmente da serpente de B. diporus, de serem potenciais fontes de moléculas como estratégia para combater os biofilmes patogênicos bacterianos. O presente estudo aborda o potencial de venenos animais, principalmente venenos de serpentes, como fonte de moléculas, que podem apresentar inúmeras atividades farmacológicas inéditas, incluindo àquelas relacionadas com a prevenção da formação e de erradicação de biofilmes bacterianos patogênicos. Atualmente, existem seis medicamentos aprovados pelo Food and Drug Administration (FDA), oriundos de venenos, como o Captopril (Capoten®). Este estudo mostra a capacidade de venenos como fonte de novas moléculas ativas contra biofilmes patogênicos. / Biofilms are complex three-dimensional bacterial communities living organized and attached on a surface, embedded in exopolimeric matrix. About 80% of live bacteria are organized in the form of biofilms because in these structures are less sensitive to antibiotics and host immune response. Staphylococcus spp., Pseudomonas aeruginosa and enterobacteriaceas are the main biofilm forming bacteria. These forming biofilms bacteria are important colonizing surface of medical devices and implants, increasing the morbidity and mortality of patients with this kind of infection. The investigation of new strategies for prevention and treatment of infections caused by biofilms is urgently needed. Among these strategies, there are the research of different mechanisms or substances capable of inhibit the formation or to eradicate the formed biofilm. In this context, animal venoms represent an untapped source of vast amounts of bioactive molecules, candidates for the development of new therapies, including antibiofilm. The main objective of this study is to evaluate different venoms of snakes and synthetic analogs as source of molecules against pathogenic bacterial biofilms. The chapter 1 reviewed numerous studies reporting the antimicrobial activity (against bacteria, viruses, protozoa and fungi) of 170 peptides isolated from venoms of eight different animals. Antimicrobial peptides have been gaining attention in research for the treatment of infections and peptides with antibiofilm activity are a new and promising approach for the treatment of infections related. The chapter 2 shows the antimicrobial, antibiofilm and eradication of established biofilms activities of 18 analogs of peptides derived from snake venoms. Initially, 170 peptide sequences from animal venoms were analyzed and aligned. The peptide 16 showed considerable antimicrobial activity against Gram-positive bacterial strains, sensitive and resistant. For S. epidermidis, the peptides 1, 2, 3, 4, 12, 13 and 16 showed less than 50% of biofilm formation and peptides 2, 3 and 16 reduced preformed biofilm. Cytotoxicity and hemolytic activity were tested and active peptides 2 and 16 showed significant cytotoxicity and hemolysis compared with the controls. The position of the amino acids can contribute to the activities and more tests are needed to understand the relationship of the amino acid positions in the action. The chapter 3 shows the antiformation and eradication of established biofilms activities of seventeen different venoms of snakes, two of scorpions and three of marine anemones, as well as the skin secretions of three species of frogs. Significant activities were observed against strains of S. aureus, S. epidermidis and E. cloaceae for all venom of snakes tested at different concentrations. In addition, an initial fractionation was performed and the best conditions were selected for a new fractionation, where 27 fractions of B. diporus enom were tested. Fractions 8, 14 and 23 presented activities with less than 50% of biofilm formation and less than 80% of the remaining biofilm. The results indicate the ability of venoms, especially the snake B. diporus, to be potential sources of molecules as a strategy to combat bacterial pathogenic biofilms. This study addresses the potential of animal venoms, especially snake venoms, as source of molecules, which can present numerous unpublished pharmacological activities, including those related to the prevention of the formation and eradication of pathogenic bacterial biofilms. Currently, there are six drugs approved by Food and Drug Administration (FDA), derived from venoms, such as Captopril®. This study shows the ability of venoms as source of new bioactive molecules against pathogenic biofilms.