Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2007. / Submitted by Fabrícia da Silva Costa Feitosa (fabriciascf@gmail.com) on 2010-01-13T22:18:05Z No. of bitstreams: 1 2007_TatianeGuerreiroCMachado.pdf: 2409688 bytes, checksum: 7c7a021f2c710fa7e040d98e17b5cc62 (MD5) / Approved for entry into archive by Lucila Saraiva(lucilasaraiva1@gmail.com) on 2010-01-13T22:36:48Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2007_TatianeGuerreiroCMachado.pdf: 2409688 bytes, checksum: 7c7a021f2c710fa7e040d98e17b5cc62 (MD5) / Made available in DSpace on 2010-01-13T22:36:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2007_TatianeGuerreiroCMachado.pdf: 2409688 bytes, checksum: 7c7a021f2c710fa7e040d98e17b5cc62 (MD5) Previous issue date: 2007-05-15 / A febre amarela é uma doença hemorrágica causada por um vírus pertencente à família Flavivirus que é transmitido aos humanos através de picada por mosquitos. O vírus possui RNA fita simples, sentido positivo, com genoma de 10.862 nucleotídeos e uma única fase aberta de leitura ou ORF (do inglês: "Open Reading Frame") de cerca de 10.233 nucleotídeos. A ORF codifica três proteínas estruturais (capsídeo, pré-M e envelope) e 7 não estruturais (NS1, NS2a, NS2b, NS3, NS4a, NS4b, NS5), sendo que destas, a proteína do envelope é uma das mais estudadas devido ao seu alto potencial antigênico O isolamento de partes virais pode ser importante na utilização de antígenos para o desenvolvimento de novas vacinas e métodos diagnósticos. Na tentativa de isolar partes virais e expressá-las em separado são utilizados diferentes sistemas de expressão e dentre eles pode ser utilizado o sistema de expressão baseado em Baculovírus e células de inseto, que é um dos sistemas de expressão mais popular e eficiente. Baculovírus são vírus de DNA circular, dupla fita, que infectam artrópodes, principalmente os insetos. Existem muitas vantagens em se usar o sistema de expressão baseado em baculovírus e células de inseto, como altos níveis de expressão e modificações pós-traducionais, que permitem às proteínas recombinantes, serem montadas corretamente e biologicamente ativas. O gene do envelope do vírus da Febre Amarela foi isolado por técnica de RT-PCR, apresentando um tamanho de aproximadamente 1.600 pares de base. Em seguida, foi clonado em dois diferentes + plasmídeos de transferência: pSynXIV VI X3 e p2100, os quais foram co-transfectados, em células de inseto, com DNA de baculovírus recombinantes (vSynVI-gal, derivado do Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus (AcMNPV), para o pSynXIV + X3 e vAgGalA2, derivado do Anticarsia gemmatalis multiple nucleopolyhedrovirus (AgMNPV), para o p2100. Sete dias após a transfecção o sobrenadante da cultura celular foi coletado e utilizado para purificar o vírus recombinante pelo método de diluição seriada em placa de 96 poços. Os vírus recombinantes vSynYFE e vAgGalA2 foram, então, utilizados para infectar células de Trichopluisa ni em cultura (BTI- Tn5B1-4) e lagartas de Spodoptera frugiperda (para o vSynYFE) e Anticarsia gemmatalis (para o vAgYFE). Células de inseto infectadas com o vírus vSynYFE mostraram efeitos citopáticos manifestados pela formação de sincício celular (que é típico da infecção por flavivirus) e a análise desse extrato celular por SDS-PAGE detectou a presença de um polipeptídeo de aproximadamente 50 kDa, similar ao tamanho da proteína do envelope do vírus da Febre Amarela. Entretanto, extratos de tecido adiposo de lagartas infectadas (96 h p. i.) analisadas por SDS-PAGE e western blot detectaram um polipeptídeo por volta de 70 kDa, maior do que o esperado para a proteína do envelope da Febre Amarela. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Yellow fever is an haemorrhagic disease caused by a virus that belongs to the genus Flavivirus (Flaviviridae family) and is transmitted by mosquitoes. It is a positive- sense, single-stranded, enveloped RNA virus, and its genome consists of 10,862 nucleotides coding for a single ORF of 10,233 nucleotides. This ORF encodes three structural proteins (capsid, pre-M, and envelope) and seven non-structural proteins (NS1, NS2a, NS2b, NS3, NS4a, NS4b, NS5). Among the viral proteins, the envelope protein is the most studied one, due to its high antigenic potencial. Isolated recombinant viral antigens may be useful in new vaccine and/or diagnosis development. On the purpose of isolating viral parts and expressing them separately, different heterologous expression systems may be used and within these, the Baculovirus Expression System in insect cells is one of the most popular and efficient. Baculoviruses have a circular, double stranded DNA genome and infect arthropodes, mainly insects. There are many advantages of using the baculovirus expression system such as high expression levels and post-translational modifications that allow the expressed proteins to be correctly folded and biologically active. The Yellow fever envelope gene was isolated by RT- PCR (1,600 base pairs). This fragment was cloned into two different transfer vectors: + pSynXIV VI X3 and p2100, that were co-transfected, in insect cells, with DNA from recombinant baculoviruses vSynVI-gal, derived from Autographa californica multiple + nucleopolyhedrovirus (AcMNPV), for the pSynXIVVI X3 and vAgGalA2, derived from Anticarsia gemmatalis multiple nucleopolyhedrovirus (AgMNPV), for the p2100]. Seven days after transfection, the cell culture supernatant was collected and used to purify the recombinant virus by the end-point dilution method in 96-well plates. The recombinant viruses, vSynYFE e vAgGalA2 were used to infect Trichopluisa ni insect cells (BTI-Tn5B1-4) and Spodoptera frugiperda larvae (for vSynYFE) and Anticarsia gemmatalis larvae (for vAgYFE). Insect cells infected with vSynYFE virus showed cytopathic effects manifested by multinucleated syncytial cells (which is typical of Flavivirus infection) and analysis of these cells extracts by SDS-PAGE detected the presence of a polypeptide around 50 kDa, similar to the size of the original Yellow fever envelope protein. However, fat body extracts of infected larvae (96 h p.i.) analysed by SDS-PAGE and Western blot detected a polypeptide around 70 kDa, different from the predicted size of the envelope protein.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2006. / Submitted by wesley oliveira leite (leite.wesley@yahoo.com.br) on 2009-10-27T18:10:25Z No. of bitstreams: 1 2006_AlineWelzel.pdf: 2868723 bytes, checksum: 61f500bb6388c0e8e5c9d9601b198293 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2009-11-03T17:51:40Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2006_AlineWelzel.pdf: 2868723 bytes, checksum: 61f500bb6388c0e8e5c9d9601b198293 (MD5) / Made available in DSpace on 2009-11-03T17:51:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2006_AlineWelzel.pdf: 2868723 bytes, checksum: 61f500bb6388c0e8e5c9d9601b198293 (MD5) Previous issue date: 2006-03-23 / Os baculovírus são vírus de DNA, específicos de artrópodes, possuindo uma ampla utilização, principalmente, como bioinseticida em lepidópteros e como vetores de expressão de genes heterólogos. A habilidade do vírus Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) de infectar um grande número de hospedeiros tem facilitado estudos moleculares desse vírus com o objetivo de melhorar sua propriedade bioinseticida. Este trabalho teve por objetivo a construção de AcMNPV recombinantes com a introdução de um gene de uma protease (catepsina-L) e de uma quitinase no genoma viral, para a observação dos efeitos da infecção viral em larvas de Spodoptera frugiperda, comparativamente aos vírus AcMNPV selvagem e outro AcMNPV recombinante, contendo o gene de uma serino-protease (queratinase) de Aspergillus fumigatus. Outro objetivo do trabalho foi a construção de Anticarsia gemmatalis multiple nucleopolyhedrovirus (AgMNPV) recombinantes com a introdução dos genes das proteases catepsina-L e queratinase no genoma viral. Foram utilizados os vetores de transferência pSynXIVVI+X3 e p2100, respectivamente, para cada vírus. O DNA plasmidial dos vetores de transferência recombinantes foi co-transfectado com o DNA do vírus vSyngalVI- e do vAgGalA2, em células de Trichoplusia ni (BTI-Tn5B1-4) e Anticarsia gemmatalis (UFL-AG-286), respectivamente. Os isolamentos dos vírus recombinantes foram feitos com a técnica de diluição seriada em placa de 96 poços e a detecção dos vírus recombinantes se deu pela observação de poliedros nas células infectadas por meio da microscopia de luz. O vírus AcMNPV recombinante contendo o gene da catepsina-L (vSynCAT) assim como o AcMNPV recombinante contendo o gene da queratinase (vSynQUERAT) foram mais virulentos contra larvas de 3° e 4° instar de S. frugiperda quando comparados aos vírus selvagem e o vírus AcMNPV xx recombinante contendo o gene da quitinase (vSynQUIT). Além disso, os vírus vSynCAT e vSynQUERAT induziram a melanização da cutícula dos insetos nos estágios mais tardios da infecção. Os AgMNPV recombinantes ainda não foram isolados e, desta forma, não foi possível analisar o efeito desses genes no genoma do baculovírus mais utilizado como bioinseticida no mundo. __________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Baculoviruses are DNA viruses specific to artropods. They have been widely used as bioinseticides against lepidopterous insect pests and as heterologous gene expression vectors. The ability of the Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) to infect a great variety of hosts, have facilitated molecular biology studies aiming the improvement of this virus as a biopesticide. The aim of this work is the construction of recombinant AcMNPV viruses with the introduction of a protease gene (cathepsin-L) from Sarcophaga peregrina and a chitinase gene from Metarhizium anisopliae, into the viral genome and observation of the effects of these recombinant viruses during the infection of Spodoptera frugiperda larvae, comparatively with the wild-type AcMNPV and another AcMNPV recombinant, containing a serino-protease (keratinase) gene from Aspergillus fumigatus . Another aim of this work was the construction of Anticarsia gemmatalis multiple nucleopolyhedrovirus (AgMNPV) recombinant viruses containing the cathepsin-L and keratinase genes into the viral genome. The pSynXIVVI+X3 e p2100 transfer vectors were used, respectively for each virus. Recombinant transfer vectors DNAs were co- transfected with DNA from polyhedrin minus vSyngalVI- and vAgGalA2 viruses, in Trichoplusia ni (BTI-Tn5B1-4) and Anticarsia gemmatalis (UFL-AG-286) cells, respectively. Isolation of the recombinant viruses was carried out using the serial dilution method in 96 well-plates and was achieved by the observation of polyhedra inside infected cells under a light microscope. The AcMNPV recombinant containing the cathepsin-L gene (vSynCAT), as well as the AcMNPV recombinant containing the keratinase gene (vSynQUERAT), were more virulent towards 3° and 4° instar S. frugiperda larvae, when compared to the wild-type AcMNPV and a AcMNPV xxii recombinant containing the kitinase gene (vSynQUIT). Furthermore, the vSynCAT and vSynQUERAT viruses induced melanization of insect cuticule late in infection. The AgMNPV recombinants have not been isolated yet, and therefore, it was not possible to analyse the effect of the introduction of these genes on the virulence of the world most used baculovirus biopesticide.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2011. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2011-10-18T14:50:07Z No. of bitstreams: 1 2011_GreiceKellyMenezesMartins.PDF: 8249552 bytes, checksum: 41f1382a22b8a584754a3559c4b87408 (MD5) / Approved for entry into archive by Leila Fernandes (leilabiblio@yahoo.com.br) on 2011-10-18T15:02:53Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2011_GreiceKellyMenezesMartins.PDF: 8249552 bytes, checksum: 41f1382a22b8a584754a3559c4b87408 (MD5) / Made available in DSpace on 2011-10-18T15:02:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011_GreiceKellyMenezesMartins.PDF: 8249552 bytes, checksum: 41f1382a22b8a584754a3559c4b87408 (MD5) / No Brasil, a raiva e a dengue podem ser citadas como duas doenças que causam prejuízos econômicos. A raiva é uma doença causada por um vírus do gênero Lyssavirus, transmitida pela saliva de mamíferos infectados, e uma vez iniciados os sintomas, a mortalidade ocorre em praticamente todos os casos. O vírus da raiva é formado por cinco proteínas: a nucleoproteína, a fosfoproteína, a proteína de matriz, a RNA polimerase e a glicoproteína (GPV), principal proteína viral imunogênica. Neste trabalho, a GPV foi expressa em células de mamíferos utilizando um baculovírus recombinante. Baculovirus são vírus de insetos que têm sido amplamente utilizados como biopesticidas e como ferramenta para a expressão de proteínas heterólogas em células de inseto e de mamíferos. Eles são considerados seguros devido à sua especificidade ao hospedeiro e a incapacidade de se replicar em linhagens de células não-inseto, embora eles possam entrar nas células de mamíferos. Para a construção do vírus recombinante, um fragmento gênico contendo o promotor CMV e o gene GPV foi clonado no vetor pFastBac1. O vírus recombinante AcCMV-GPV foi obtido através do sistema Bac-to-Bac (Invitrogen) e foi usado para infectar células de inseto. O extrato celular foi analisado por SDS-PAGE e a presença da proteína GPV foi confirmada por western blot usando um anticorpo anti-vírus da raiva. Células HeLa, derivadas de hepatoma humano, foram transduzidas com o vírus recombinante e o extrato celular também foi analisado por SDS-PAGE e a proteína GPV marcada com o anticorpo anti-vírus da raiva. Células HuH-7, derivadas de hepatócitos humanos, foram transduzidas com o vírus recombinante e a proteína GPV foi quantificada através de um ELISA. Futuramente, testes in vivo poderão ser feitos a fim de analisar os efeitos imunogênicos do vírus recombinante. Baculovírus recombinante capaz de expressar GPV em células de mamíferos pode ser uma alternativa para o desenvolvimento de uma vacina contra a raiva a custos mais baixos. A dengue é uma doença tropical e tem se tornado um grave problema de saúde pública. A doença é causada pelo vírus da dengue (dengue virus, DENV), um Flavivirus composto de quatro sorotipos (DENV-1 a 4), todos transmitidos ao ser humano através da picada da fêmea de mosquitos do gênero Aedes. O DENV se replica tanto em células de vertebrados como nas células do mosquito. Há muito conhecimento sobre os mecanismos de entrada e replicação de Flavivirus em cultura de células de mamífero e seus efeitos in vivo. No entanto, pouco se sabe a respeito dos processos moleculares do vírus no vetor. Dentro desse contexto, o presente trabalho propos a análise transcricional de células de Ae. albopictus (C6/36) infectadas com DENV-1, isolado do Distrito Federal. Doze horas pósinfecção, as células foram coletadas, o RNA total de células infectadas e não infectadas foi extraído e utilizado para confecção da biblioteca subtrativa de cDNA, através da técnica de Representational Difference Analysis (RDA). Os cDNAs amplificados foram clonados no vetor pGEM-T Easy e seqüenciados. Cerca de 300 clones foram seqüenciados e as seqüências obtidas foram analisadas em um banco de dados. Infelizmente, a maioria das seqüências foi de RNA ribossomal. Tal resultado indica que houve problemas técnicos na construção da referida biblioteca. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / In Brazil, rabies and dengue fever may be cited as two diseases that cause economic impacts. Rabies is a disease caused by a virus of the genus Lyssavirus and it is transmitted through the saliva of infected mammals. Once the symptoms started, the mortality occurs in virtually all cases. The rabies virus is composed of five proteins: nucleoprotein, phosphoprotein, matrix protein, RNA polymerase and glycoprotein (GPV), the main immunogenic viral protein. In this work, the GPV was expressed in mammalian cells using a recombinant baculovirus. Baculovirus are insect viruses that have been widely used as biopesticides and as a tool for expression of heterologous proteins in insect and mammalian cells. They are considered safe due to their host specificity and the inability to replicate in non-insect cell lines, although they can enter in mammalian cells. To construct the recombinant virus, a gene cassete containing the CMV promoter and the GPV gene was cloned into the vector pFastBac1. The recombinant AcCMV-GPV was obtained by Bac-to- Bac system (Invitrogen) and was used to infect insect cells. The cell extract was analyzed by SDS-PAGE and the presence of the GPV protein was confirmed by western blot using an antibody anti-rabies virus. HeLa cells, derived from human hepatoma, were transduced with the recombinant virus, the cell extract was also analyzed by SDS-PAGE and the GPV protein was labeled with the same antibody. Huh-7 cells derived from human hepatocytes were transduced with the recombinant virus and the protein was quantified by ELISA. In future, in vivo tests can be done to examine the immunogenic effects of the recombinant virus. Recombinant baculovirus expressing GPV in mammalian cells may be an alternative for the development of vaccine against rabies at lower costs. Dengue is a tropical disease and has become a serious public health issue. The disease is caused by dengue virus (DENV), a Flavivirus, which has four serotypes (DENV-1 to 4), all transmitted to humans through the bite of female mosquitoes of the genus Aedes. The DENV replicates in both vertebrate and mosquito cells. There are a lot of knowledge about the mechanisms of Flavivirus entry and replication in mammalian cell culture and its effects in vivo. However, little is known about the molecular processes of the virus in the vector. In this context, this paper proposes cell transcriptional analysis of Ae. albopictus cells (C6/36) infected with DENV-1, isolated from Distrito Federal. Twelve hours after infection, cells were collected, total RNA from infected and uninfected cells was extracted and used to construct a subtractive cDNA library, using the technique of Representational Difference Analysis (RDA). The amplified cDNAs were cloned into pGEM-T Easy vector and sequenced. About 300 clones were sequenced and the sequences were analyzed in a database. Unfortunately, most of the sequences were ribosomal RNA. This result indicates that there were technical problems in building the library.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2012. / Submitted by Alaíde Gonçalves dos Santos (alaide@unb.br) on 2012-05-14T13:46:12Z No. of bitstreams: 1 2012_LorenaCarvalhodeSouzaChaves.pdf: 2104640 bytes, checksum: 8d444129ca0c1b47390b577e4c879cea (MD5) / Approved for entry into archive by Marília Freitas(marilia@bce.unb.br) on 2012-05-14T14:38:41Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_LorenaCarvalhodeSouzaChaves.pdf: 2104640 bytes, checksum: 8d444129ca0c1b47390b577e4c879cea (MD5) / Made available in DSpace on 2012-05-14T14:38:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_LorenaCarvalhodeSouzaChaves.pdf: 2104640 bytes, checksum: 8d444129ca0c1b47390b577e4c879cea (MD5) / Febre amarela é uma doença infecciosa, endêmica nas florestas tropicais da África, Américas Central e do Sul. O agente etiológico da febre amarela é o vírus da febre amarela pertencente ao gênero Flavivirus, e espécie-tipo da família Flaviviridae. O genoma contêm 10.233 pares de bases (bp) , que codifica as proteínas estruturais (Capsídeo – C, Membrana – Pré M/M, Envelope – E) e não estruturais (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, NS5). NS1 é um gene essencial requerido para replicação eficiente do RNA viral. O diagnóstico mais utilizado para febre amarela é o teste MAC-ELISA para a detecção de IgM (pesquisa de anticorpos recentes). As reações cruzadas entre o vírus amaralíco e outros flavivirus são fatores que dificultam o diagnóstico sorológico, principalmente em áreas endêmicas de múltiplos flavivirus. Desta forma, nesse trabalho, a proteína NS1 do vírus da febre amarela foi expressa em sistemas procariótico (Escherichia coli) e eucariótico (células de inseto) com o objetivo de utilizá-la no diagnóstico precoce de infecção pelo vírus da febre amarela. Para expressão da proteína NS1 de YFV em sistema procariótico, foi utilizado o sistema de recombinação sítio específica Gateway® (Invitrogen). A proteína recombinante expressa em E. coli foi purificada e inoculada em camundongos para produção do anti-soro policlonal anti-NS1. Para expressão da proteína NS1 em sistema eucariótico, foi utilizada a técnica de transposição sítio específica Bac-to-Bac® (Invitrogen). O gene NS1 foi fusionado ao gene da poliedrina do baculovírus AcMNPV e introduzido no genoma viral. O vírus recombinante foi usado para infectar células de inseto e a proteína recombinante foi detectada por Western blot. Ambos os sistemas de expressão foram utilizados com sucesso e as proteínas recombinantes serão testadas como antígenos para o desenvolvimento de novos métodos de diagnóstico de infecção pelo vírus da febre amarela. Palavras chaves: NS1; Baculovírus; Febre Amarela; Poliedrina; AcMNPV. _______________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Yellow Fever is an infectious disease, endemic in African, Central and South American tropical forests. The etiologic agent of the yellow fever is the Yellow Fever Virus belonging to the genus Flavivirus, and the type-species of the family Flaviviridae. The genome has 10.233 base pairs (bp), which encodes structural (Capsid – C, Membrane – Pre M/M, Envelope – E) and non-structural (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, NS5) proteins. NS1 is an essential gene required for an efficient RNA viral replication. The most used diagnosis test to confirm yellow fever is the MAC-ELISA for the detection of IgM (survey about recent antibodies). The cross-reactivities between the amarilic virus and other flaviviruses are factors that hinder the serological diagnosis, especially in endemic areas with multiple flaviviruses. Hence, in this work, the NS1 protein of the yellow fever virus was expressed in prokaryotic (Escherichia coli) as well as in eucariotic systems (insect cells) with the aim of using this protein in the early diagnosis of yellow fever virus infection. For the expression of the YFV NS1 protein in a prokaryotic system it was used the site-specific recombinant system Gateway® (Invitrogen). The recombinant protein expressed in E. coli was purified and inoculated in mice for the production of polyclonal anti-serum anti-NS1. For the expression of the NS1 in a eukaryotic system, the Bac-to-Bac® (Invitrogen) site-specific transposition was used. The NS1 gene was fused to the polyhedrin gene of the baculovirus AcMNPV and introduced into the viral genome. The recombinant virus was used to infect insect cells and the recombinant protein detected by Western blot. Both expression systems were used with success and the recombinant proteins will be tested as antigens for the development of new diagnostic methods for yellow fever virus infection.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2007. / Submitted by Larissa Ferreira dos Angelos (ferreirangelos@gmail.com) on 2010-01-25T14:46:22Z No. of bitstreams: 1 2007_RobertoFTCorrea.pdf: 4112592 bytes, checksum: 52046698f69dc6f05f1105cdddeed69d (MD5) / Approved for entry into archive by Lucila Saraiva(lucilasaraiva1@gmail.com) on 2010-01-25T21:04:50Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2007_RobertoFTCorrea.pdf: 4112592 bytes, checksum: 52046698f69dc6f05f1105cdddeed69d (MD5) / Made available in DSpace on 2010-01-25T21:04:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2007_RobertoFTCorrea.pdf: 4112592 bytes, checksum: 52046698f69dc6f05f1105cdddeed69d (MD5) Previous issue date: 2007-06-14 / Os genes cry4Aa e cry4Ba, pertencentes a diferentes estirpes brasileiras de Bacillus thuringiensis, S1806 e S1989, respectivamente, foram amplificados por PCR e clonados em um vetor de clonagem. A análise do seqüenciamento do gene cry4Aa mostrou alta identidade com outras seqüências do gene já descritas e este foi clonado tanto no vetor de transferência pSynXIVVI+X3, como no pFastBac®1 para expressão e análise da toxicidade da proteína heteróloga a partir dos baculovírus construídos por recombinação homóloga, vSyncry4Aa, e por transposição sítio-específica, vBacCry4Aa. O gene cry4Ba foi introduzido no vetor pSynXIVVI+X3 dando origem, por recombinação homóloga, ao baculovírus recombinante vSyncry4Ba. Os vírus recombinantes, derivados de recombinação homóloga, foram isolados em placas de 96 poços, enquanto o vírus recombiante obtido por transposição foi isolado de colônias de células de Escherichia coli DH10BacTM crescidas em placas de Petri contendo antibióticos, X-Gal e IPTG. Células de inseto BTI-TN5B1-4 foram infectadas com os vírus recombinantes isoladamente e mRNA derivados dos extratos celulares (72 h.p.i.) analisados por RT-PCR, para confirmação da expressão e presença de transcritos específicos para os genes. Extratos de larvas de Spodoptera frugiperda, infectadas com os vírus recombinantes (120 h.p.i.) foram analisados por eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE), mostrando a presença de bandas de aproximadamente 128 e 130 kDa correspondentes aos tamanhos das proteínas Cry4Aa e Cry4Ba, respectivamente. Possíveis cristais das proteínas recombinantes foram observados por microscopia de luz. Bioensaios com os extratos de insetos infectados mostraram-se tóxicos para larvas de segundo instar de Aedes aegypti. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / The cry4Aa and cry4Ba genes from Brazilian strains of Bacillus thuringiensis, S-1806 and S-1989, respectively, were amplified by PCR, cloned into a plasmid cloning vector and sequenced. Sequence analysis of the cry4Aa gene showed high identity to previous known cry genes and it was cloned into both pSynXIVVI+X3 and pFastBac®1 transfer vectors for expression and toxicity analysis of the heterologous proteins derived from the recombinant baculoviruses constructed by homologous recombination (vSynCry4Aa) and transposition (vBacCry4Aa). The cry4Ba gene was introduced into the transfer vector pSynXIVVI+X3/3 resulting in the construction of the recombinant virus vSynCry4Ba by homologous recombination. The recombinant viruses, derived from homologous recombination, were isolated by serial dilution in 96 well plates while the recombinant virus produced by transposition was isolated from Escherichi coli (DH10BacTM) colonies grown on Petri dishes containing antibiotics, X-Gal and IPTG. Insect cells BTI-TN5B1-4 were separetly infected with the recombinante viruses and mRNA from cell extracts (72 h.p.i.) analysed by RT-PCR, in order to confirm the presence of the genes specific transcripts. Recombinant viruses infected insect extracts (120 h p.i.) were analysed by polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) showing the presence of polypepitide bands of around 128 and 130 kDa, corresponding, respectively to the sizes of the proteins Cry4Aa and Cry4Ba. Putative crystals from the recombinant proteins were observed by light microscopy. Bioassays with virus-infected insect extracts were shown to be toxic to second instar Aedes aegypti larvae.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2008. / Submitted by Suelen Silva dos Santos (suelenunb@yahoo.com.br) on 2009-10-19T16:55:50Z No. of bitstreams: 1 2008_SyomaraHakikoMatusitaSoaresRezende.pdf: 2481803 bytes, checksum: 686b92c7e5facc7b3520a55d4d76d3d6 (MD5) / Approved for entry into archive by Marília Freitas(marilia@bce.unb.br) on 2009-12-03T18:32:54Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2008_SyomaraHakikoMatusitaSoaresRezende.pdf: 2481803 bytes, checksum: 686b92c7e5facc7b3520a55d4d76d3d6 (MD5) / Made available in DSpace on 2009-12-03T18:32:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2008_SyomaraHakikoMatusitaSoaresRezende.pdf: 2481803 bytes, checksum: 686b92c7e5facc7b3520a55d4d76d3d6 (MD5) Previous issue date: 2008 / Baculovírus são vírus de inseto com grande potencial de uso em programas de controle biológico principalmente devido ao seu apelo ecológico, uma vez que são altamente específicos ao inseto alvo e não apresentam toxicidade ao homem e ao meio ambiente. Sua produção tem sido feita basicamente pela sua multiplicação no inseto hospedeiro. Porém, a produção de baculovírus em cultivos celulares oferece vantagens em relação à multiplicação in vivo por ser um sistema controlável, estéril, com alta pureza do produto e por dispor de centenas de linhagens de células de inseto estabelecidas. No entanto, sucessivas passagens do vírus em cultura de células podem resultar em alterações genéticas levando à perda de virulência. A alteração mais comum refere-se à formação de mutantes FP (Few Polyhedra) devido a mutações no gene 25k fp. O baculovírus Anticarsia gemmatalis multiple nucleopolyhedrovirus (AgMNPV) vem sendo utilizado com sucesso como agente de controle da lagarta da soja (A. gemmatalis). Entretanto, sua produção tem sido feita in vivo e pouco se conhece sobre sua produção em cultivos celulares. Nesse trabalho, os efeitos causados pela passagem do vírus AgMNPV em células BTI-Tn-5B1-4 foram estudados. A porcentagem de células contendo muitos poliedros manteve-se alta e constante até a quinta passagem. A partir desse ponto houve uma redução significante na quantidade de células com muitos poliedros com concomitante aumento na quantidade de células com poucos poliedros. Em paralelo, houve um dramático aumento no título viral pela produção de vírus extracelulares (budded virus). Todos esses parâmetros associados à análise ultraestrutural caracterizam a geração de mutantes FP durante a passagem serial do vírus em cultura de células. Adicionalmente, os perfis de restrição do DNA viral obtido em diferentes passagens mostraram similaridade revelando a ausência de grandes modificações genéticas, como deleções e inserções no genoma do vírus. A indicação da presença de alterações menores como mutações pontuais no locus do gene 25k fp foi comprovada pela determinação da sequência nucleotídica deste gene nos mutantes selecionados (sobrenadante da sétima passagem). Mutações pontuais foram detectadas em três clones (FP1, FP3, FP4) na região do gene 25k fp, incluindo sua região promotora, sendo que apenas um clone (FP5) não apresentou qualquer alteração nesse gene. Com base na cinética de síntese de proteínas utilizado marcação radioativa, uma redução na síntese da poliedrina (principal componente protéico dos corpos de oclusão) foi também observada em todos os clones do tipo FP em comparação com o vírus padrão. Além disso, a análise ultraestutrural dos clones FP revelou características típicas de formação de mutantes FP como células com poucos ou nenhum poliedro, produção de poliedros amorfos com baixo número de virions e formação de estroma virogênico com intensa produção de nucleocapsídeos. Finalmente, variantes Many Polyhedra (MP), apresentando um maior número de poliedros por célula e um título de budded virus similar ao vírus parental, foram selecionados como parte de uma estratégia para produção do vírus em escala maior em cultivos celulares (biorreatores). _________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Baculovirus are insect viruses with great application potential for biological control programs due mainly to their ecological appeal, once they are highly specific to the host insect and do not present toxicity to man and to the environment. Their production has been made basically by their multiplication in host insects. Nevertheless, baculovirus production in cell cultures offers advantages over the in vivo multiplication for being a controllable, sterile, high pureness product yield process besides the fact of hundreds of cell lines being already established. However, successive passages of the virus in cell culture result in genetic alterations leading to loss of virulence. The most common alteration is the FP (Few Polyhedra) mutants formation due to mutations in the 25k fp gene. Anticarsia gemmatalis multiple nucleopolyhedrovirus (AgMNPV) baculovirus is being used successfully as control agent of the soybean caterpillar (A. gemmatalis). However, its production has been made in vivo and little is known on its production in cell cultures. In this work, the effects caused by the passage of the AgMNPV in BTI-Tn-5B1-4 cells was studied. The percentage of cells containing many polyhedra remained high and constant until the fifth passage. From this point on there was a significant reduction in the amount of cells with many polyhedra with concomitant increase in the amount of cells with few polyhedra. In parallel, there was a dramatic increase in the viral titer by production of extracellular virus (budded virus). All these parameters associated to the ultra structural analysis characterize the FP mutants generation during serial passage of the virus on cell culture. Additionally, there was similarity in the viral DNA restriction endonuclease digestion profile of different passages reveling no significant genetic modifications, such as deletions and insertions. The indication that small alterations, such as point mutations, present in the 25k fp gene locus was confirmed by this gene nucleic sequence determination in the selected mutants (seventh passage of supernatant). Point mutations in the 25k fp gene region were detected in three clones (FP1, FP3 and FP4), including its promoter region, and only one clone (FP5) did not present any alteration in this gene. Based on the protein synthesis kinetics using radioactive labeling, a reduction in the polhyedrin synthesis (the main component of the occlusion bodies) in all FP clones was also observed in comparison to the standard virus. Moreover, the ultra structural analysis of the FP clones disclosed typical characteristics of FP mutants formation such as cells with few or no polyhedra, amorphous polyhedra production with low virions number and virogenic stroma formation with intense nucleocapsid production. Finally, Many Polyhedra (MP) variants, presenting a larger number of polyhedra per cell and a similar to the parental virus budded virus titer, were selected as part of a strategy for a larger viral scale up production in cell culture (bioreactors).

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2006. / Submitted by Diogo Trindade Fóis (diogo_fois@hotmail.com) on 2009-11-10T10:48:48Z No. of bitstreams: 6 Dulcyane Neiva Mendes_parte6.pdf: 2216961 bytes, checksum: d73b059744afaa9ab6ba4add16a9bea3 (MD5) Dulcyane Neiva Mendes_parte5.pdf: 8933066 bytes, checksum: 8fdc7f1b5afebc6b5b9e8ac64925df9a (MD5) Dulcyane Neiva Mendes_parte4.pdf: 9356524 bytes, checksum: dc2eb26962ce971ba570126ab82baf5b (MD5) Dulcyane Neiva Mendes_parte3.pdf: 3258196 bytes, checksum: 806ee54d9db41724cdede7f8c24a3b32 (MD5) Dulcyane Neiva Mendes_parte2.pdf: 346419 bytes, checksum: 40831fbebfcfe3bb3719d6ed192a1d6e (MD5) Dulcyane Neiva Mendes_parte1.pdf: 1453437 bytes, checksum: 986969a01d929c7b2f1053edf8aa230d (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2009-12-11T15:23:47Z (GMT) No. of bitstreams: 6 Dulcyane Neiva Mendes_parte6.pdf: 2216961 bytes, checksum: d73b059744afaa9ab6ba4add16a9bea3 (MD5) Dulcyane Neiva Mendes_parte5.pdf: 8933066 bytes, checksum: 8fdc7f1b5afebc6b5b9e8ac64925df9a (MD5) Dulcyane Neiva Mendes_parte4.pdf: 9356524 bytes, checksum: dc2eb26962ce971ba570126ab82baf5b (MD5) Dulcyane Neiva Mendes_parte3.pdf: 3258196 bytes, checksum: 806ee54d9db41724cdede7f8c24a3b32 (MD5) Dulcyane Neiva Mendes_parte2.pdf: 346419 bytes, checksum: 40831fbebfcfe3bb3719d6ed192a1d6e (MD5) Dulcyane Neiva Mendes_parte1.pdf: 1453437 bytes, checksum: 986969a01d929c7b2f1053edf8aa230d (MD5) / Made available in DSpace on 2009-12-11T15:23:47Z (GMT). No. of bitstreams: 6 Dulcyane Neiva Mendes_parte6.pdf: 2216961 bytes, checksum: d73b059744afaa9ab6ba4add16a9bea3 (MD5) Dulcyane Neiva Mendes_parte5.pdf: 8933066 bytes, checksum: 8fdc7f1b5afebc6b5b9e8ac64925df9a (MD5) Dulcyane Neiva Mendes_parte4.pdf: 9356524 bytes, checksum: dc2eb26962ce971ba570126ab82baf5b (MD5) Dulcyane Neiva Mendes_parte3.pdf: 3258196 bytes, checksum: 806ee54d9db41724cdede7f8c24a3b32 (MD5) Dulcyane Neiva Mendes_parte2.pdf: 346419 bytes, checksum: 40831fbebfcfe3bb3719d6ed192a1d6e (MD5) Dulcyane Neiva Mendes_parte1.pdf: 1453437 bytes, checksum: 986969a01d929c7b2f1053edf8aa230d (MD5) Previous issue date: 2006-12-21 / Baculovírus são vírus de insetos que têm sido utilizados como bioinseticidas para controle de pragas agrícolas, bem como importante ferramenta em Biotecnologia como vetor de expressão gênica. O sistema de expressão utilizando baculovírus em células de insetos fornece um ambiente apropriado para a síntese de proteínas eucarióticas. A renina humana, uma proteína produzida principalmente pelos rins e responsável pelo controle da pressão sangüínea e do balanço salino, é a chave principal para o desencadeamento do sistema renina-angiotensina-aldosterona que culmina no aumento da pressão sangüínea. Neste trabalho é proposta a produção da renina, com base na construção de baculovírus recombinantes, visando o estudo mais aprofundado tanto de suas propriedades quanto de inibidores que possam ser empregados na indústria farmacêutica. Inicialmente dois baculovírus recombinantes contendo o gene da pré-pró-renina humana foram construídos. No sistema vSyn VI-gal o fragmento da pré-pró-renina (~1,4 Kb) foi inserido no vetor de expressão pSynXIV VI+X3 e por recombinação homóloga com DNA viral levou a formação de vírus recombinante ocluso positivo. No sistema Bac-to-Bac (Invitrogen) o fragmento da pré-pró-renina foi inserido em bacmídeo, por transposição, e levou a formação de vírus recombinante ocluso negativo. A presença do gene da pré-pró-renina nos vírus recombinantes foi confirmada após amplificação do gene por reação em cadeia da polimerase (PCR) com os primers específicos da pró-renina. Para identificação das proteínas virais produzidas durante a infecção foi feita cinética da síntese de proteínas por marcação radioativa (35S-metionina), em células de inseto High five e Sf21, em diferentes tempos pós-infecção (0, 24, 48 e 72 h). Na fase muito tardia da infecção foi observada a síntese de duas proteínas de cerca de 40 kDa e 47 kDa, que correspondem ao peso molecular esperado para a pró-renina e a renina, ou formas glicosiladas da mesma. Como esperado, a análise das proteínas por ensaio imunológico, utilizando anticorpo policlonal contra a renina, mostrou sinal de hibridização nas amostras das células infectadas com os vírus recombinantes contendo o gene da pré-pró-renina (Sf21 e High five). Embora nas células High five não infectadas (mock infected) não tenha havido marcação com o anticorpo, foi, entretanto, detectado sinal de hibridização não esperado em células Sf21 não infectadas (mock infected), o que deve ser devido à hibridização inespecífica. A análise ultraestrutural das células infectadas com vírus recombinante revelou que houve indução de efeitos citopáticos típicos por infecção com baculovírus. Entretanto, no vírus recombinante ocluso positivo parece não ter havido a correta inclusão dos vírions na matriz protéica resultando na formação de poliedros com pouco ou nenhum vírion em seu interior. Finalmente, larvas de Anticarsia gemmatalis e de Spodoptera frugiperda foram infectadas para investigar as alterações morfológicas causadas pelos vírus. Sinais claros de que houve mudanças na fisiologia larval foram observados quando, além dos sintomas da doença, a lagarta infectada apresentou mudança de coloração do tegumento para cor rosa. Essa coloração não é observada na lagarta infectada com o vírus selvagem AcMNPV. As alterações ultraestruturais apresentadas pelas células e as mudanças na coloração da cutícula das larvas infectadas mostram que está havendo diferença na expressão protéica entre o vírus selvagem e os vírus recombinantes. Os resultados obtidos até o momento indicam ter havido a expressão de uma proteína com peso molecular esperado para a renina e que estaria interferindo, de alguma forma, no processo de oclusão da partícula viral bem como na fisiologia do inseto. __________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Baculovirus are insect viruses being used as bioinsecticides for agricultural pest control as well as an important tool in Biotechnology as gene expression vector. The baculovirus expression system in insect cells gives an appropriate environment for eukaryotic proteins synthesis. The human renin is a protein produced mainly in the kidney and responsible for blood pressure and salt balance controls and is the principal key to the role of reninangiotensin- aldosteron system that culminates in the blood pressure rise. In this work the renin production is proposed, based on the construction of recombinant baculoviruses, aiming the studies development of the protein properties as well as the inhibitors that may be used in the pharmaceutical industry. Initially, two recombinant baculoviruses containing the preprorenin gene were constructed. In the vSyn VI-gal system the preprorenin fragment (~1.4 Kb) was inserted in the pSynXIV VI+X3 vector, homologous recombined with the viral DNA, leading to an occluded virus assembly. In the Bac-to-Bac system (Invitrogen) the preprorenin fragment was inserted in the bacmid, by transposition, leading to a negative occluded virus assembly. The presence of the preprorenin gene in the recombinant viruses was confirmed by its amplification by Polymerase Chain Reaction (PCR) technique with specific primers for prorenin. For identification of the viral proteins produced during infection, the kinetics of protein synthesis was done by radioactive labeling (35S-metionin), in High five and Sf21 insect cells, at different times post infection (0, 24, 48 and 72h). In the very late phase of infection the synthesis of two proteins about 40 kDa and 47 kDa was observed. These polypeptides correspond to the molecular weight expected for prorenin and renin, or any of their corresponding glycosilated forms. Protein analysis by immunological assay, using polyclonal antibodies against renin, showed a hybridization signal in infected cells samples with the recombinant viruses containing the preprorenin gene (Sf21 and High five). Although there was no hybridization signal in mock infected High five cells, there was an unexpected signal detected in mock infected Sf21 cells, which could be somehow due to unspecific labeling of the antibody. Ultrastructural analyses of infected cells showed that there was induction of typical cytophatic effects with baculovirus infection. However, with the occluded recombinant virus it seemed that there was no correct virion inclusion in the protein matrix resulting in polyhedra formation with few or none virions inside. Finally, Anticarsia gemmatalis and Spodoptera frugiperda larva were infected to further investigate the morphological alterations caused by the viruses. Clear signs of larval physiology change were observed when in addition to the common symptoms of the disease the infected larvae presented a tegument change to a pinkish color. This color is not observed in larvae infected with the wild type AcMNPV. The ultrastructural alterations in infected cells and the change in the color cuticle of infected larvae show that there is a protein expression difference between the wild type and the preprorenin recombinant viruses. The data obtained until now indicate that there is a protein being expressed with the expected molecular weight for renin and that it is somehow interfering with the occlusion process of the viral particle as well as with the insect physiology.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2010. / Submitted by Jaqueline Ferreira de Souza (jaquefs.braz@gmail.com) on 2011-04-16T23:23:41Z No. of bitstreams: 1 2010_BrunaCarolinaCastroBatista.pdf: 4362150 bytes, checksum: 854cb36bf2a23c796b0a170ab50d7866 (MD5) / Approved for entry into archive by Jaqueline Ferreira de Souza(jaquefs.braz@gmail.com) on 2011-04-16T23:24:39Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2010_BrunaCarolinaCastroBatista.pdf: 4362150 bytes, checksum: 854cb36bf2a23c796b0a170ab50d7866 (MD5) / Made available in DSpace on 2011-04-16T23:24:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2010_BrunaCarolinaCastroBatista.pdf: 4362150 bytes, checksum: 854cb36bf2a23c796b0a170ab50d7866 (MD5) / O vírus causador da febre amarela (YFV) é um membro da família Flaviviridae e importante arbovírus patogênico ao homem. O diagnóstico da febre amarela é importante tanto para medidas de saúde pública como também para o tratamento adequado dos pacientes, já que os sintomas iniciais são típicos de outras doenças virais infecciosas. A glicoproteína do envelope (E) desse vírus é a maior determinante da imunogenicidade viral e da resposta imunológica do hospedeiro. Neste trabalho, a proteína do envelope do vírus da febre amarela foi expressa fusionada com a proteína poliedrina (POLH) dos corpos de oclusão do baculovírus Anticarsia gemmatalis multiple nucleopolyhedrovirus (AgMNPV) em células de inseto pela infecção com um baculovírus Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) recombinante. Primeiramente, foi construído um vetor baculoviral modificado para expressão de proteínas heterólogas fusionadas à POLH, o pFastAgPol. O fragmento de DNA contendo o gene da poliedrina (polh) do AgMNPV foi amplificado e, em seguida, transferido para o plasmídeo comercial pFASTBac1¿ (Invitrogen). Utilizando o sistema Bac-to-Bac (Invitrogen), o AcMNPV recombinante contendo o gene polh de AgMNPV foi construído (vAcPolAg). Células de inseto foram infectadas pelo vAcPolAg, e a expressão da proteína recombinante analisada por microscopia de luz, SDS-PAGE e Western blot. A proteína foi detectada por Western-blot, mas não houve a formação de corpos de oclusão. Um fragmento de DNA contendo o gene do envelope do YFV foi clonado no vetor de transferência pFastAgPol, em fase com o gene polh, para ser expresso como uma proteína de fusão e inserido no genoma do AcMNPV. Células de inseto também foram infectadas com o AcMNPV recombinante (vAcPolAgEnv) e a expressão da proteína recombinante foi analisada por SDS-PAGE e Western blot, que detectou um polipeptídeo de aproximadamente 88 kDa, correspondente à fusão da proteína E do vírus amarílico com a POLH de AgMNPV. Entretanto, também não ocorreu a formação de corpos de oclusão. As células infectadas com os dois recombinantes também foram analisadas por microscopia de luz, de transmissão e pelo microscópio confocal. A não formação de corpos de oclusão pode ter sido causada, no caso do vAcPolAg, pela substituição do sítio de terminação do gene polh por um sítio de clonagem para a fusão do gene E, o que resultou na introdução de 41 amino ácidos no C-terminal da POLH. No caso do vírus contendo a proteína de fusão, POLHENV, a própria fusão pode ter resultado na formação de uma proteína incapaz de formar corpos de oclusão pelas mudanças conformacionais. A construção dos vírus recombinantes, vAcPolAg e vAcPolAgEnv, e a expressão das proteínas fusionadas foram bem sucedidas demostrando o potencial do sistema baculoviral para o desenvolvimento de técnicas alternativas de diagnóstico e produção de vacinas utilizando partes virais. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / The yellow fever virus (YFV), a member of the family Flaviviridae, is an important arbovirus pathogenic to humans. The yellow fever diagnosis its important not only to public health measures but also to patients proper treatment, once the initial symptoms are similar to others viral infectious diseases. The envelope glycoprotein (E) of this virus is the major imunogenicity and host immune response determinant. In this work, the yellow fever virus envelope protein was expresse fused to the protein polyhedrin (POLH) of the baculovirus Anticarsia gemmatalis multiple nucleopolyhedrovirus (AgMNPV) occluded bodies in insect cells by the infection of a baculovirus Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) recombinant. First, was constructed a modified baculoviral vector (pFastAgPol) for heterologous protein expression fused to POLH. The DNA fragment containing the AgMNPV polyhedrin gene (polh) was amplified and then transferred to a commercial plasmid pFASTBac1™ (Invitrogen).Using the Bac-to-Bac system (Invitrogen), the AcMNPV recombinant containg the AgMNPV polh gene was constructed (vAcPolAg). Insect cells were infected with vAcPolAg and the protein expressed was analyzed by light microscopy, SDS-PAGE and Western blot. The protein was detected by Western-blot but was not capable of forming occlued bodies. A DNA fragment containing the envelope gene of YFV was cloned into the transfer vector pFastAgPol, in frame with the polh gene, in order to be expressed as a protein fusion, and inserted into the AcMNPV genome. Insect cells were also infected with the AcMNPV recombinant (vAcPolAgEnv) and recombinant protein expression was analyzed by SDS-PAGE and Western-blot which detected a polypeptide around 88kDa, corresponding to the fusion of the yellow fever virus protein E with the AgMNPV POLH. However, threre were no formation of occlusion bodies either. Infected cells with the two recombinants also were analyzed by light, electron and confocal microscopy. The lack of occlusion body formation, in the case of vAcPolAg, could have been due to the substitution of the stop codon of the polh gene by a restriction site for the fusion with the E gene which resulted in the introduction of 41 amino acids to the C-terminal end of POLH. In the case of virus containing the fusion protein POLHF, the fusion itself could be responsible for the formation of a protein uncapable of forming occlusion bodies due to conformational changes. The construction of recombinant viruses, vAcPolAg vAcPolAgEnv, and expression of fused proteins were successful, demonstrating the potential of the baculoviral system for the development of alternative techniques of diagnosis and production of viral vaccines using parts of it.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2010. / Submitted by Shayane Marques Zica (marquacizh@uol.com.br) on 2011-07-08T19:29:27Z No. of bitstreams: 1 2010_AlineWelzelGramkowParcial.pdf: 2841617 bytes, checksum: 6d3e8691cd26e3d57ff5f9003c7d61c3 (MD5) / Approved for entry into archive by Jaqueline Ferreira de Souza(jaquefs.braz@gmail.com) on 2011-07-13T21:46:16Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2010_AlineWelzelGramkowParcial.pdf: 2841617 bytes, checksum: 6d3e8691cd26e3d57ff5f9003c7d61c3 (MD5) / Made available in DSpace on 2011-07-13T21:46:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2010_AlineWelzelGramkowParcial.pdf: 2841617 bytes, checksum: 6d3e8691cd26e3d57ff5f9003c7d61c3 (MD5) / Os baculovírus compreendem o maior grupo de vírus de insetos estudados no mundo, principalmente pela eficiência em matar pragas da agricultura. Neste trabalho, três baculovírus recombinantes contendo os genes ScathL (Catepsina L) de Sarcophaga peregrina (vSynScathL), Kerat (Queratinase) do fungo Aspergillus fumigatus (vSynKerat) e Quit (Quitinase) do fungo Metarhizium anisopliae (vSynQuit) foram construídos e suas propriedades bioinseticidas analisadas em larvas de Spodoptera frugiperda. Bioensaios em larvas neonatas e de 3º ínstar de S. frugiperda infectadas com os baculovírus vSynScathL, vSynKerat e vSynQuit mostraram uma diminuição no tempo necessário para matar os insetos infectados quando comparado ao vírus selvagem. O vSynScathL apresentou uma TL50 e TD de 47 horas e 2,62 dias, respectivamente, enquanto o AcMNPV, uma TL50 de 136 horas e TD de 5,37 dias, respectivamente para larvas de S. frugiperda de 3º ínstar. Isso representa uma diminuição significativa de 65,5% para TL50 e 50,09% para TD, no tempo necessário para o vírus matar os insetos infectados quando comparado ao vírus selvagem. A TL50 e TD para o vírus vSynKerat foi de 91 horas e 3,70 dias, respectivamente, com uma redução de 32,8% para TL50 e 30,21% para TD, no tempo necessário para o vírus matar os insetos infectados quando comparado ao vírus AcMNPV. Já, o vírus recombinante vSynQuit apresentou uma TL50 de 110,67 horas, o que foi 23,6% menor do que o vírus selvagem (TL50 de 144,97). Já em larvas neonatas de S. frugiperda o vSynScathL mostrou uma TL50 de 77 horas comparado ao AcMNPV de 104 horas quando inoculado com 102 corpos de oclusão/nL, já o TD foi de 3,46 dias para o vírus recombinante e 4,16 dias para o AcMNPV. Isso representa uma redução de 26% na TL50 e 16,82% para TD no tempo necessário para matar os insetos infectados quando comparado ao vírus selvagem AcMNPV. A TL50 do vírus vSynKerat foi de 54 horas, com uma redução de xx 48% comparado ao vírus AcMNPV e o TD de 3,87 dias, reduzindo 6,97% no tempo necessário para matar os insetos; já a TL50 do vírus vSynQuit foi de 86 horas, com uma redução de 45,2% comparado ao vírus selvagem e o TD de 3,75 dias comparado com o vírus selvagem de 4,43 dias, representando uma redução de 15,34% no tempo necessário para matar os insetos. Também mostramos que os vírus vSynScathL e vSynKerat foram capazes de aumentar a atividade de fenoloxidase na hemolinfa de larvas de S. frugiperda em relação ao vírus selvagem e à larva não infectada. A expressão de proteases em larvas infectadas resulta na destruição dos tecidos internos em estágios tardios da infecção, podendo ser uma das razões para o aumento da velocidade para matar as larvas de S. frugiperda, como observado na microscopia eletrônica de varredura para os vírus vSynScathL e vSynKerat em relação ao vírus selvagem e à larva não infectada. O ensaio enzimático com quitina regenerada mostrou também uma diferença quitinolítica significativa em relação aos corpos de oclusão do vírus vSynQuit em comparação ao vírus selvagem. A transcrição de genes celulares em hemócitos derivados de larvas de Anticarsia gemmatalis infectados (12 h p.i.) pelos baculovírus Anticarsia gemmatalis multiple nucleopolyhedrovirus (AgMNPV) e/ou Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) também foram analisados neste trabalho pela técnica análise de diferença representacional (RDA). Os trancritos mais abundantes encontrados foram para proteases celulares, que estão provavelmente envolvidas na resposta do inseto à infecção viral. Outros genes, como por exemplo, hsp70 e hsc70, proteínas ribossomais, aminopeptidase, beta 1,3 glicanase, proteína induzida pelo hormônio juvenil, lipase também foram detectados. Todos esses transcritos podem de alguma maneira ter um papel na defesa celular e/ou estabelecimento da infecção viral. Para confirmação dos dados obtidos pela RDA, a transcrição do gene hsc70 foi analisada por PCR em tempo real e confirmou sua expressão diferencial. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Baculovirus comprise the largest group of insect viruses most studied worldwide, mainly because they efficiently kill agricutural insect pests. In this study, tree recombinant baculoviruses containing the ScathL gene (Cathepsin L) from Sarcophaga peregrina (vSynScathL), the Kerat gene (Keratinase) from the fungus Aspergillus fumigatus (vSynKerat) and Quit gene (Chitinase) from the fungus Metarhizium anisopliae (vSynQuit) were constructed and their insecticidal properties analysed against Spodoptera frugiperda larvae. Bioassays of third-instar and neonate S. frugiperda larvae with vSynScathL,vSynKerat and vSynQuit showed a decrease in the time needed to kill the infected insects when compared to the wild type virus. The vSynScathL showed LT50 and TD of 47 hours and 2.62 days respectively, while AcMNPV, a LT50 of 136 hours and TD of 5.37 days, respectively for third-instar S. frugiperda.larvae. This represents a significant decrease (from 65.5% for LT50 and 50.09% for TD) in the time required to kill the virus infected insects compared to wild virus. The LT50 and TD for vSynKerat was 91 hours and 3.70 days, respectively, showing also a reduction (32.8% for LT50 and 30.21% for TD), in the time required to kill the virus infected insects compared to AcMNPV. Also, the vSynQuit in another bioassay, showed a LT50 of 110.67 hours, which was 23.6% lower than the wild type virus (LT50 of 144.97 hours). Using neonate larvae of S.frugiperda, the vSynScathL showed a LT50 77 hours compared to 104 hours of AcMNPV when inoculated with 102 occlusion bodies/nL, since the TD was 3.46 days for the recombinant virus and 4.16 days for AcMNPV. This represents a 26% reduction in LT50 and 16.82% for TD compared to wild type virus AcMNPV. The LT50 of the virus vSynKerat was 54 hours with a 48% reduction compared to AcMNPV and in the TD of 3.87 days, 6.97%; with vSynQuit the LT50 was 86 hours, with a reduction of 45.2% compared to the wild virus and TD of 3.75 days compared with 4.43 days for wild type virus, a reduction of 15.34%. We have also shown that vSynScathL and vSynKerat were able to increase phenoloxidase activity in the hemolymph of S. frugiperda larvae compared with the wild type virus and with larvae not infected. The expression of proteases in infected larvae resulted in destruction of internal tissues late in infection, which could be the reason for the increased viral speed of kill, as observed in scanning electron microscopy for viruses vSynScathL and vSynKerat compared to the wild type virus and uninfected larvae. The enzyme assay with regenerated chitin also showed a significant chitinolytic difference with occlusion bodies of the vSynQuit compared to wild type virus . The transcription of cellular genes in hemocytes derived from infected larvae of Anticarsia gemmatalis (12 h p.i.) by Anticarsia gemmatalis multiple nucleopolyhedrovirus (AgMNPV) and/or Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) were also analyzed in this work by the representational difference analysis (RDA). Transcrits more abundants were cellular proteases, which are probably involved in insect response to viral infection. Other genes, such as hsc70 and hsp70, ribosomal proteins, aminopeptidase, beta 1.3 glucanase, protein induced by juvenile hormone, lipase were also detected. All of these transcripts can somehow play a role in cellular defense and/or establishment of viral infection. To confirm the data obtained by RDA, the hsc70 gene transcription was analyzed by real time PCR and confirmed their differential expression.

Orientador : Octavio Henrique de Oliveira Pavan / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-18T21:50:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Araujo_EdsonFreitasde_M.pdf: 2895382 bytes, checksum: 92e5f3324d91725a4c06a085b86a1d48 (MD5) Previous issue date: 1993 / Mestrado / Genetica / Mestre em Ciências Biológicas