La famille des kinases Src, dont Lyn fait partie, joue un rôle clé dans le contrôle de nombreux processus biologiques. Lyn a une fonction bien établie dans les cellules hématopoïétiques et est notamment impliqué dans le maintien de différentes leucémies et son expression protéique est altérée dans les tumeurs solides. Plusieurs études ont mis en évidence qu’elle avait un rôle anti-apoptotique. Lyn peut être clivée par les caspases en donnant une protéine tronquée cytosolique. Nous avons ainsi montré que Lyn cytosolique (cLyn) régulait Bim, un membre pro-apoptotique de la famille Bcl-2, en le phosphorylant sur les tyrosines 92 et 161 en inhibant la fonction pro-apoptotique de Bim, en augmentant son interaction avec Bcl-XL, limitant ainsi la perméabilisation de la membrane externe mitochondriale et l’apoptose. Lyn possède également un rôle pro-inflammatoire. Nous avions préalablement montré que la surexpression de cLyn, chez la souris, conduit à un syndrome inflammatoire de la peau, ressemblant au psoriasis. Sur la base de ce résultat, nous avons voulu savoir si Lyn jouait un rôle dans cette maladie chronique de la peau. L’analyse de l’expression de Lyn chez des patients souffrant de psoriasis a montré que Lyn était surexprimée dans la peau lésionnelle par rapport à la peau non lésionnelle ou saine, résultats confirmés dans deux modèles de psoriasis chez la souris. De façon intéressante, nous avons montré que l’augmentation de l’expression de Lyn se situe à la fois dans le derme et dans l’épiderme chez l’homme et chez la souris, indiquant que le recrutement de cellules immunitaires dans la peau lésionnelle mais aussi la modulation de Lyn dans les kératinocytes sont impliqués. Par ailleurs, une augmentation de l’expression de Lyn a été observée dans les kératinocytes humains stimulés par le TNF-α et l'IL-17A. Afin de déterminer le rôle de Lyn dans cette maladie cutanée nous l’avons induit chez des souris déficientes pour Lyn. Une réduction significative du phénotype cutanée a été observée dans les souris LynKO, identifiant Lyn comme un nouvel acteur dans la pathogénie du psoriasis. De plus, nos résultats ont établi que l’expression de Lyn dans les kératinocytes semblait suffisante pour le maintien du phénotype psoriasique, indiquant un nouveau rôle de Lyn dans les kératinocytes. Au cours de ce travail, nous avions observé que les caspases inflammatoires étaient activées dans la peau lésionnelle de patients atteints du psoriasis. Les caspases inflammatoires, suite à leur activation, vont cliver l’IL-1β et l’IL-18, ce qui conduit à leur maturation. Nous avons alors voulu savoir si les caspases participaient au développement du psoriasis. Nous avons pu montrer que lorsque nous induisions du psoriasis chez des souris, l’invalidation des caspases inflammatoires ou son inhibition pharmacologique réduisait de façon significative le développement de la maladie. Bien que les cellules immunitaires et les kératinocytes soient capables de secréter de l’IL-1β via l’activation de l’inflammasome, nos données ont établi que seule l’activation des caspases inflammatoires dans le système immunitaire semblait nécessaire pour une réponse inflammatoire complète. En résumé, l’ensemble de mon travail de thèse a permis de montrer un mécanisme moléculaire par lequel la kinase Lyn régule négativement la voie apoptotique mitochondriale, ce qui peut contribuer à la transformation et/ou la résistance des cellules cancéreuses. D’autre part, nos résultats montrent que Lyn pourrait être un régulateur important du psoriasis, et notre étude indique que les caspases inflammatoires activées dans les cellules immunitaires sont impliquées dans la pathogenèse du psoriasis. A ce jour, bien que plusieurs traitements aient été développés pour le psoriasis, la maladie reste non résolue, donc le développement de cibles thérapeutiques contre Lyn et les caspases inflammatoires pourraient être intéressant pour le traitement de la maladie. / The Src family kinase, of which Lyn is one member, plays a key role in controlling many biological processes. Lyn has a well-established function in hematopoietic cells, presenting an important role in the regulation of hematopoietic abnormalities. In fact, Lyn plays a key role in maintaining several kind of leukemia, and furthermore it expression is altered in solid tumors. Different studies have shown that Lyn has an anti-apoptotic role. Lyn can be cleaved by caspases, cysteine proteases involved in apoptosis and inflammation, giving a new protein with a cytosolic location, different from the WT and membrane-anchored form. We have shown that the cytosolic form of Lyn (cLyn) regulated Bim, a pro-apoptotic member of the Bcl-2 family, involved in the control of mitochondrial apoptosis. We have identified that Bim is phosphorylated on tyrosine 92 and 161 by Lyn, resulting in an inhibition of its pro-apoptotic function, increasing its interaction with anti-apoptotic members such as Bcl-XL, thus limiting the permeabilization of mitochondrial outer membrane and impairing cell apoptosis. Lyn also has a pro-inflammatory role. We have previously shown that overexpression of the caspase-cleaved form of Lyn, in mice, leads to an inflammatory skin syndrome, resembling human psoriasis. Based on this result, we wanted to know if Lyn played a role in this chronic skin disease. Analysis of Lyn's expression in psoriasis patients showed that Lyn was overexpressed in lesional skin compared to non-lesional or healthy skin, which was subsequently confirmed in two mouse models of psoriasis disease. Interestingly, we have shown that the increase in Lyn expression is in both the dermis and the epidermis in humans and in mice, indicating that recruitment of immune cells into lesional skin but also the modulation of Lyn in keratinocytes are involved. To determine the role of Lyn in this skin disease we induced a psoriasis-like phenotype in Lyn deficient mice. A significant reduction in cutaneous phenotype was observed in LynKO mice compared to WT mice, identifying Lyn as a new player in the pathogenesis of psoriasis. In addition, our results established that Lyn expression in keratinocytes seemed crucial and sufficient for the maintenance of the psoriasis phenotype, indicating a new role of Lyn in the regulation of keratinocytes. During this work, we observed that inflammatory caspases were activated in lesional skin from psoriasis patients. Inflammatory caspases, following their activation within the inflammasome, will cleave IL-1β and IL-18, leading to their maturation. We then wanted to know if inflammatory caspases participated in the development of psoriasis. We were able to show that when we induced a psoriasis-like disease in mice, the invalidation of inflammatory caspases or its pharmacological inhibition significantly reduced the development of the disease compared to WT mice. Although immune cells and keratinocytes were able to secrete IL-1β via activation of the inflammasome, our data established that only activation of inflammatory caspases in the immune system seemed necessary for a complete inflammatory response. In summary, my thesis shows a molecular mechanism by which Lyn tyrosine kinase negatively regulates the mitochondrial apoptotic pathway, which may contribute to the transformation and/or chemotherapeutic resistance of cancer cells. On the other hand, our results show that Lyn could be an important regulator of psoriasis and our study indicates that inflammatory caspases activated in immune cells are involved in the pathogenesis of psoriasis. To date, although several treatments have been developed for psoriasis, the disease remains unresolved, so the development of therapeutic targets against Lyn and inflammatory caspases could be of interest for the treatment of the disease.

Les cancers de l’ovaire demeurant particulièrement meurtriers du fait de leur capacité à développer une résistance aux chimiothérapies conventionnelles, il est donc indispensable de mettre en place de nouvelles stratégies thérapeutiques susceptibles de surmonter la chimiorésistance pour améliorer leur prise en charge. Les travaux antérieurs de l’Unité ont démontré que les protéines anti-apoptotiques Bcl-xL et Mcl-1 coopèrent pour protéger les cellules cancéreuses ovariennes contre l’apoptose et que leur inhibition concomitante conduit à la mort des cellules chimiorésistantes. A ce jour, seuls les inhibiteurs de Bcl-xL/Bcl-2 ont démontré une efficacité en clinique, en particulier l’ABT-263 (Navitoclax). En revanche, l’inhibition de Mcl-1 reste problématique dans un contexte clinique. La recherche d’outils pharmacologiques conduisant à l’inhibition ou à l’inactivation de Mcl-1, utilisables en clinique, reste donc un enjeu majeur, d’autant que cette protéine est désormais désignée comme une cible thérapeutique prioritaire dans de nombreuses localisations tumorales. C’est dans ce contexte que mon projet de thèse s’est inscrit, l’objectif étant d’identifier et d’évaluer de nouveaux inhibiteurs pharmacologiques de Mcl-1 synthétisés par des équipes de chimistes. Dans cette optique, mon projet de thèse s’est scindé en deux parties : Dans une première étude, je me suis attachée à cribler in vitro des molécules appartenant à différentes familles chimiques (Oligopyridines dérivées du Pyridoclax, « Lead » de la première génération des oligopyridines précédemment identifié par notre équipe, ou analogues de MIM1) dans le but d’identifier de nouveaux inhibiteurs de Mcl-1 plus actifs que les molécules dont ils dérivent. Ce travail a permis d’identifier la MR31367, une molécule issue du Pyridoclax qui présente une activité pro-apoptotique plus forte que ce dernier sur plusieurs lignées tumorales ovariennes chimioresistantes. Nous avons également pu mettre en évidence sur ces mêmes modèles que plusieurs molécules issues de MIM1 exhibaient une activité pro-apoptotique amplifiée. Cette étude nous a également permi de mettre en évidence une relation structure activité permettant de classer ces molécules en inhibiteurs spécifiques de Mcl-1 et « dual-inhibiteur » de Mcl-1 et Bcl-xL. Dans une seconde étude, mon travail a consisté en l’évaluation préclinique du sel de Pyridoclax. Nous avons étudié l’effet de différentes doses de Pyridoclax administré par différentes voies d’administration, en agent seul ou en combinaison avec l’ABT-263 sur différents modèles tumoraux établis à partir des lignées chimiorésistantes de cancers ovariens. Nous avons ainsi pu mettre en évidence un effet anti-tumoral du Pyridoclax (20 mg/kg/j) administré par voie IV en agent seul sur des 2 modèles des 3 modèles de xénogreffes, et cela sans toxicité avérée. Ces résultats prometteurs ouvrent des perspectives intéressantes quant à l’utilisation d’inhibiteurs pharmacologiques de Mcl-1 pour le traitement des cancers de l’ovaire / Ovarian cancer is the most leading cause of death from gynecologic malignancies because of its late diagnosis and its ability to develop chemoresistance to conventional therapies. It is now essential to develop new therapeutic strategies to overcome this chemoresistance and improve patient care. Our laboratory has demonstrated the overexpression of the Bcl-2 anti-apoptotic proteins Bcl-xL and Mcl-1 and their cooperation to protect ovarian cancer cells from apoptosis. Currently, the clinically relevant pharmacologic inhibition of Bcl-xL is available using ABT-263 (Navitoclax). However, selective direct Mcl-1 inhibition remained a challenge. This protein is one of the most important anti-apoptotic member which is expressed in multiple cancer types and is at the origin of the acquired resistance to chemotherapy and Bcl-2 family inhibitors (Navitoclax, Venetoclax). Thus, Mcl-1 inhibition represents a major challenge for the clinical success of the Bcl-2 family inhibitors. In this context, I was interested in identifying and evaluating new Mcl-1 inhibitors designed and synthetized by different chemistry research teams. My project was focused on two aspects. In the first part, we have evaluated the cytotoxic effect of different molecules derived from 2 Mcl-1 inhibitors, the Pyridoclax from the oligopyridine family and MIM1. The screening of 8 Noxa-mimetic molecules derived from Pyridoclax allowed us to identify MR31367, one of the most potent oligopyridine molecules that shows a stronger anti-apoptotic activity than Pyridoclax (15μM) and sensitizes different chemoresistant ovarian cancer cell lines (IGROV1-R10, SKOV-3 and A2780) to anti-Bcl-xL strategies (ABT-737, siRNA). Furthermore, we have evaluated the pro-apoptotic activity of 14 MIM1 derivative molecules using the same cellular model. This study has demonstrated that most of these derivatives have greater pro-apoptotic activity than MIM1. We have also established the structure-activity relationship leading to classify these molecules as “Mcl-1 inhibitors” or as “dual inhibitors” of Mcl-1 and Bcl-xL.The second part of my project was focused on the preclinical evaluation of Pyridoclax hydrochlorid. We have analyzed the antitumor activity of Pyridoclax hydrochlorid in several subcutaneous xenografts derived from human ovarian cancer cell lines (IGROV1-R10, SKOV-3 and A2780). Different routes of Pyridoclax hydrochlorid administration were tested (oral, IV and IT) and its antitumor effect was analyzed at different doses as single agent or in combination with ABT-263 (100mg/kg). This study highlighted an effective antitumor activity of 20mg/kg of Pyridoclax hydrochlorid administered intravenously as single agent in two of three xenograft models without any side effects. This results open up interesting perspectives for the clinical use of Mcl-1 inhibitors to improve the clinical management of ovarian cancer

L'apoptose, ou « mort cellulaire programmée », joue un rôle clé dans de nombreux processus biologiques. Les protéines de la famille Bcl-2, dont l'expression est souvent altérée dans les cellules tumorales, sont les principaux régulateurs de l'apoptose. Parmi cette famille, la fonction exacte du répresseur apoptotique Nrh, aussi appelé BCL2L10 ou Bcl-B, reste à ce jour mal comprise. Bien que son expression ne soit pas détectable dans la plupart des tissus sains, on retrouve des niveaux élevés de Nrh corrélés à un mauvais pronostique dans les cancers du sein et de la prostate. Nous avons mis au jour un nouveau mécanisme selon lequel Nrz, l'orthologue de Nrh chez le poisson zèbre, interagit avec le domaine de liaison du ligand IP3 du canal calcique IP3R1. Il s'est avéré que la régulation négative des flux calciques par Nrz est critique lors du développement embryonnaire du poisson zèbre. Grâce à ces nouvelles données, nous avons cherché à comprendre la fonction de Nrh chez l'Homme, dans un contexte pathologique. Nous avons montré que Nrh interagit via son domaine BH4 avec le domaine de liaison du ligand du récepteur IP3R1 humain pour réguler l'homéostasie calcique et la mort cellulaire. Cette interaction définit Nrh comme la seule protéine de la famille Bcl-2 à réguler négativement la mort cellulaire exclusivement au niveau du réticulum endoplasmique. Pour aller plus loin, nous avons montré que la dissociation du complexe Nrh/IP3Rs sensibilise des cellules tumorales mammaires à l'action d'agents chimiothérapeutiques. Pour finir, nos résultats apportent une explication moléculaire sur la contribution de Nrh dans la résistance aux thérapies anti-tumorales / Apoptosis, also called “Programmed Cell Death”, plays a key role in many biological processes and pathologies. The B-cell lymphoma 2 (Bcl-2) proteins, whose expression is often altered in tumor cells, are the main regulators of apoptosis.Among this family, the actual physiological function of the human apoptosis inhibitor Nrh, also referred to as BCL2L10 or Bcl-B, remains elusive. Although in most healthy tissues the Nrh protein is nearly undetectable, clinical studies have shown that Nrh expression is correlated with poor prognosis in breast and prostate carcinomas. We have shed light on a novel mechanism by which Nrz, the zebrafish ortholog of Nrh, was found to interact with the Ligand Binding Domain (LBD) of the Inositol-1,4,5-triphosphate receptor (IP3R) type-I Ca2+ channel. Indeed, the regulation of IP3Rs-mediated Ca2+ signaling by Nrz was shown to be critical during zebrafish embryogenesis. We used the knowledge gained with the zebrafish model to investigate Nrh function in cancer. We showed that Nrh interacts with the LBD of IP3Rs via its BH4 (Bcl-2 Homology 4) domain, which is critical to regulate intracellular Ca2+ trafficking and cell death. Actually, this interaction seems to be unique among the Bcl-2 family, and sets Nrh as the only Bcl-2 homolog to negatively regulate apoptosis by acting exclusively at the Endoplasmic Reticulum. Furthermore, we showed that disruption of the Nrh/IP3Rs complex primes Nrh-dependent cells to apoptotic cell death and enhances chemotherapy efficiency in breast cancer cell lines.Lastly our results bring a new insight to the role of Nrh regarding chemotherapy resistance

Le glycolipide Gb3/CD77 qui est fortement exprimé en surface des cellules de lymphome de Burkitt (LB) est le récepteur d’une toxine bactérienne la Vérotoxine-1 (VT-1). Notre équipe a montré précédemment que, dans les cellules de LB, la VT-1 induit une cascade apoptotique mettant en jeu les caspases et la mitochondrie. Mon travail a consisté à poursuivre l’analyse des bases moléculaires de ce processus, notamment en m’intéressant au rôle de la protéine pro-apoptotique Bid. Bid est un membre de la famille Bcl-2 qui est clivé par la caspase-8 au cours de l’apoptose et dont la forme tronquée (t-Bid) se relocalise à la mitochondrie. Grâce à l’utilisation de clones cellulaires de LB où Bid a été inhibée puis réexprimée sous forme non clivable et d’un inhibiteur de la caspase-8, nous avons montré que lors de l’apoptose induite par la VT1 : 1) la protéine entière Bid (full-length Bid ou FL-Bid) contrôle l’activation de protéines pro-apoptotiques Bax et de Bak ; 2) t-Bid et FL-Bid sont, toutes les deux, impliquées dans la libération des protéines pro-apoptotiques (cytochrome c et Smac/DIABLO) de l’espace intermembranaire de la mitochondrie vers le cytosol ; 3) FL-Bid contrôle l’homodimérisation de Bax et de Bak qui contribuerait à la libération initiale du cytochrome c et de Smac/DIABLO alors que t-Bid est nécessaire à l’hétérodimérisation de Bax et Bak qui permettrait l’amplification de cette libération. L’ensemble de ces résultats montre donc une coopération fonctionnelle entre Bax et Bak au cours de l’apoptose induite par la VT-1 et surtout met en évidence que l’activation de la voie caspase-8/t-Bid n’est absolument pas requise pour initier la mort cellulaire.Gb3/CD77 est aussi exprimé à la surface de certains lymphocytes B normaux, où il constitue un marqueur de différenciation mais sa fonction endogène reste encore indéterminée. Une deuxième partie de mon travail a consisté à essayer d’identifier le ligand physiologique de Gb3/CD77 pour comprendre son rôle biologique. Grâce à une analyse en spectrométrie de masse, nous avons identifié deux protéines potentiellement partenaires de Gb3/CD77 : la galectine-7 et la protéine S100A11. / The Gb3/CD77 glycolipid, which is strongly expressed in Burkitt's lymphoma (BL) cells, is a receptor for the bacterial toxin Verotoxin-1 (VT-1). Previously, our group has shown that VT-1 induces an apoptotic pathway in BL cells which is dependent on caspases and mitochondria. Here, we provide new insights into this pathway. A pro-apoptotic member in the Bcl-2 family, Bid is cleaved by caspase-8 and its truncated form t-Bid is translocated to mitochondria. Using LB cell clones where Bid was inhibited prior to being reexpressed as a non-cleavable mutated form (BID D59A) and a caspase-8 inhibitor to explore VT-1-induced apoptosis, we showed that 1) the full length Bid (FL-Bid) controls the activation of pro-apoptotic proteins Bax and Bak; 2) Both t-Bid and FL-Bid are involved in the release of pro-apoptotic proteins (cytochrome c and Smac/DIABLO) from the mitochondrial intermembrane space to the cytosol; 3) FL-Bid controls the homo-oligomerization of both Bax and Bak, likely contributing to the initial release of cytochrome c and Smac/DIABLO while t-Bid is needed for their hetero-oligomerization followed by amplification of the release. Together, these results reveal a functional cooperation between Bax and Bak during VT-1-induced apoptosis and, most importantly, that activation of caspase-8 and t-Bid is not required to induce the onset of cell death. Gb3/CD77 is also expressed in a proportion of normal B-lymphocytes where it constitutes a differentiation marker but whose function remains uncharacterized. In an effort to look for physiological ligands, we have used a biochemical approach followed by mass spectrometry analysis. Two proteins have been identified as potentially Gb3/CD77 partners, namely galectin-7 and protein S100A11.

No description available.

Of the thousands of dividing progenitor cells (PCs) generated daily in the adult brain only a very small proportion survive to become mature neurons through the process of neurogenesis. Identification of the mechanisms that regulate cell death associated with neurogenesis would aid in harnessing the potential therapeutic value of PCs. Apoptosis, or programmed cell death, is suggested to regulate death of PCs in the adult brain as overexpression of B-cell lymphoma 2 (Bcl-2), an anti-apoptotic protein, enhances the survival of new neurons. To directly assess if Bcl-2 is a regulator of apoptosis in PCs, this study examined the outcome of removal of Bcl-2 from the developing PCs in the adult mouse brain. Retroviral mediated gene transfer of Cre into adult floxed Bcl-2 mice eliminated Bcl-2 from developing PCs and resulted in the complete absence of new neurons at 30 days post viral injection. Similarly, Bcl-2 removal through the use of nestin-induced conditional knockout mice resulted in reduced number of mature neurons. The function of Bcl-2 in the PCs was also dependent on Bcl-2-associated X (BAX) protein, as demonstrated by an increase in new neurons formed following viral-mediated removal of Bcl-2 in BAX knockout mice. Together these findings demonstrate that Bcl-2 is an essential regulator of neurogenesis in the adult hippocampus.

Lors de la transcription de gènes, il y a production d'un pré-ARN messager qui subira plusieurs étapes de maturation pour former l'ARN messager (ARNm) pouvant coder pour une protéine. Une de ces étapes est l'épissage qui consiste à exciser des portions (appelés les introns) pour juxtaposer les autres séquences (les exons), formant ainsi l'ARNm.Lors de l'épissage alternatif, un exon peut parfois être excisé menant à la formation d'un autre isoforme d'ARNm, donc possiblement d'une autre protéine, à partir d'un seul gène. Il est maintenant estimé que plus de 97% des pré-ARNm humains multi-exoniques subissent l'épissage alternatif, permettant ainsi une augmentation considérable de la quantité de protéines codées par les 30 000 gènes humains. Certaines des protéines produites par épissage alternatif peuvent avoir des activités très différentes, voire antagonistes. Ceci est souvent le cas dans l'apoptose, soit la mort cellulaire programmée. Le gène bcl-x, par exemple, peut mener à la formation de deux isoformes majoritaires. Lorsque le site d'épissage 5' proximal est utilisé, il y a formation de Bcl-x[indice inférieur L], codant pour une protéine ayant une activité anti-apoptotique, donc favorisant la survie de la cellule. Par contre, lorsque le site d'épissage 5' distal est utilisé, il y a formation d'un ARNm ayant perdu un exon de 189 nucléotides (nt) qui code pour Bcl-x[indice inférieur s], qui favorisera l'apoptose. L'épissage alternatif de ce pré-ARNm, comme les autres, est évidement bien contrôlé par des séquences présentes sur l'ARN, des facteurs protéiques liant ces séquences et des signaux cellulaires régulant l'activité de ceux-ci. Ma thèse consistait à analyser ces trois aspects et mon travail a mené à la découverte de deux protéines liant le pré-ARNm de bcl-x afin de réguler son épissage, ainsi que d'une région nécessaire à la signalisation cellulaire par la protéine kinase C (PKC). Au début, j'ai aidé à l'identification des hnRNP F et H qui lient une région riche en guanidine, nommée B2G, présente dans l'exon alternatif. Ces protéines lient cet élément et ainsi augmenterait la formation de l'isoforme Bcl-x[indice inférieur s]. Ces résultats sont présentés en annexe. Par la suite, j'ai identifié une région contenant deux éléments antagonistes, soit B1AC et B1u, située 10 nt en amont du site Bcl-x[indice inférieur s]. B1AC augmente l'utilisation de ce site, tandis que B1u fait le contraire, par la liaison de hnRNP K. Cette protéine est souvent fortement exprimée dans certains types de cancer, en accord avec son activité d'inhibition de l'isoforme pro-apoptotique. Ceci est présenté dans la première partie de ma thèse. La deuxième section de ma thèse consiste à l'identification d'une grande région nommée SB1 (361 nt) située au début de l'exon 2. De façon basale, cet élément inhibe le site Bcl-x[indice inférieur s]. Cependant, lors du blocage de l'activité de la PKC par la staurosporine, l'inhibition est perdue entrainant ainsi une forte augmentation de cet isoforme. L'inhibition de la PKC dans les lignées cellulaires cancéreuses n'entraîne pas cet effet sur l'épissage de Bcl-x, suggérant que la voie de signalisation de PKC est déréglée ou non-couplée à la régulation du gène apoptotique Bcl-x dans les cancers. L'avancement de la compréhension de l'épissage alternatif de gènes clés impliqués dans certaines maladies, tel que bcl-x dans le cancer, est primordial pour une meilleure compréhension de celles-ci. Cette thèse présente ma participation dans l'étude de la régulation de l'épissage alternatif de bcl-x .

Les protéines du complexe exon-jonction (WC) régulent l'épissage alternatif du transcrit Bc1-x, ainsi que d'autres transcrits reliés au contrôle de l'apoptose et du cycle cellulaire. L'épissage alternatif du transcrit 8c1-x constitue un événement déterminant pour les choix de vie ou de mort cellulaire en réponse aux stimuli internes ou externes. Les décisions d'épissage s'opérant sur BcI-x aboutissent à la production de deux transcrits majeurs, par utilisation de sites d'épissage 5' en compétition définissant l'exon 2. L'isoforme la plus longue, Bc1-x,, possède une activité anti-apopotique, alors que BcI-xs, amputé des 189 derniers nucléotides de cet exon, présente un potentiel pro-apoptotique. La fonction capitale de ces isoformes antagonistes justifie l'étroite régulation conditionnant leur expression. L'objectif premier de ces travaux de thèse a consisté à identifier des régulateurs protéiques de l'épissage alternatif de BcI-x, afin d'étoffer notre compréhension de cette régulation. L'utilisation d'un criblage à l'ARN interférence a mené à l'implication de plusieurs protéines du complexe exon-jonction (EJC) dans la régulation de cet événement d'épissage. Leur déplétion favorise l'épissage vers une production accrue de l'isoforme pro-apoptotique, corrélée à l'enclenchement de la mort cellulaire programmée. A la différence de leur fonction première au sein de l'EJC, les protéines formant le coeur de l'EJC, soit eIF4A3, 1114 et Magoh, ainsi que les composants s'y associant (RNP51, SAP18 et Acinus), influencent les décisions d'épissage prises sur le pré-ARNm BcI-x, indépendamment des fonctions d'export ou d'initiation du nonsense-mediated decay (NMD) communément associées à l'EJC. Une interaction sur le transcrit est d'ailleurs retrouvée pour la majorité de ces protéines, dans des extraits cellulaires totaux ainsi qu'in vitro. L'investigation des mécanismes moléculaires à l'origine de cette régulation révèlent que les éléments cis impliqués sont distincts, la fonction et la liaison des protéines e1F4A3, Y14 et Magoh étant assurée par un élément 82E, situé en aval du site d'épissage xs, alors que la protéine RNPS1 agirait en liant la portion centrale de l'élément SB1, en amont du site d'épissage xs. Par ailleurs, l'analyse en RT-PCR conduite à moyen débit sur des cellules ayant subi une déplétion de ces facteurs de l'EJC met en évidence des altérations de profils d'épissage concernant une dizaine de transcrits dont la fonction est associée au processus apoptotique. Le premier chapitre de cette thèse relate l'ensemble de ces observations et propose que certains facteurs de l'EJC assureraient une fonction régulatrice sur l'épissage de transcrits participant à l'échafaudage de l'apoptose. La deuxième partie de ces travaux relate les perturbations du cycle cellulaire engendrées par la déplétion de l'ARN hélicase eIF4A3, se traduisant notamment par une accumulation de dommage à l'ADN, ainsi que des défauts de formation de fuseau mitotique. L'analyse en RT-PCR du profil d'épissage de 192 transcrits dont l'ontologie est reliée à la progression du cycle cellulaire met en évidence des variations de l'expression des isoformes produites à partir de plusieurs de ces transcrits, incluant en particulier CDC25B, encodant une phosphatase dont l'activité est cruciale durant la transition G2/M. Les altérations de profil d'épissage retrouvées pour I-IDAC3, une histone déacétylase, et FOXM1, un facteur de transcription régulant de nombreux gènes du cycle cellulaire, pourraient expliquer en partie comment des dommages à l'ADN induisent potentiellement un blocage subséquent en mitose, menant à un processus connu sous le terme de catastrophe mitotique. Mes travaux de thèse suggèrent que plusieurs composants de l'EJC incluant particulièrement la protéine eIF4A3 auraient diversifié leur fonction vers la régulation d'événements d'épissage assurant la coordination entre la progression du cycle cellulaire et la survie. De ce fait, une diminution du niveau intracellulaire de ces facteurs enclenche des perturbations aboutissant ultimement à un arrêt de croissance et la mort cellulaire. [symboles non conformes]

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Breast cancer is the second leading cause of death amongst women ages 20 to 59. Despite advancements in cancer therapies, more research is necessary to improve the diagnoses and treatment of several types of breast cancer. Paclitaxel (Taxol) is a commonly utilized anti-cancer drug for various types of solid tumors. However, the molecular mechanism utilized by paclitaxel to induce cell death is still elusive. Previous studies in our laboratory have shown that the pro-apoptotic BCL-2 family protein, BAK (BCL-2 homologous antagonist/killer) plays an important role in paclitaxel-induced cell death. In untreated breast cancer cells, BAK is associated with the anti-apoptotic BCL-2 family protein MCL-1 (myeloid leukemia cell differentiation protein). BAK is activated with paclitaxel treatment in concert with loss of MCL-1 expression. In addition, it has been shown that the pro-apoptotic BH3-only BCL-2 family protein Noxa, specifically interacts with MCL-1 to inactivate MCL-1 function. Based on these observations, we hypothesized that modulation of Noxa/MCL-1 axis could mimic paclitaxel-induced cell death. Here, we found that down-regulation of MCL-1 induced cell death in all breast cancer cell lines that we tested, but not in a non-transformed breast epithelial cell line. In contrast, Noxa overexpression induced MCL-1 degradation and cell death in some cell lines (Noxa-sensitive), while in others Noxa overexpression neither changed MCL-1 levels nor induced cell death (Noxa-resistant). Noxa strongly interacted with MCL-1 in the Noxa-sensitive cell line, but not in the Noxa-resistant cell line. Based on these findings, the overexpression of Noxa might have two different mechanistic effects on MCL-1 levels in the breast cancer cell lines (induction of MCL-1 degradation or no effect on MCL-1). In Noxa-sensitive cells, the finding could be used as a potential therapeutic strategy for the treatment of breast cancer.