La bilirubine, metabolite de Thème, est un antioxydant puissant exerçant des fonctions athéro-protectrices à des concentrations modérées; cependant elle est neurotoxique à des concentrations élevées. Synthétisée lors du métabolisme de l'hème par l'action successive des enzymes, hème-oxygénase (HO-1) et biliverdine-réductase (BVR), la bilirubine est métabolisée par l'UDP-glucuronosyltransférase (UGT1A1) dans le foie, afin d'être éliminée sous forme glucurono-conjuguée par le transporteur, Multidrug resistance Related Protein (MRP)2. Dans le cadre de la présente étude, nous avons validé une explication pharmacologique supplémentaire du mode d'action des fibrates, médication actuellement sur le marché dans le traitement de la dyslipidémie (prévenant l'athérosclérose in vivo). Les données obtenues démontrent que les fibrates modulent positivement les enzymes de la synthèse et du métabolisme de la bilirubine, favorisant ainsi ses propriétés antioxydantes et athéro-protectrice dans la paroi vasculaire et protègent l'organisme contre ses accumulations toxiques au niveau hépatique. Donc, un mode d'action additionnel des fibrates, pourrait être pris en considération, résultant en une élévation modérée de la concentration locale de la bilirubine et profitant de ses capacités antioxydantes et par la suite athéro-protectrices.

La bilirubine est le produit de dégradation de l’hème. Une accumulation modérée des niveaux circulants de bilirubine est associée à une protection vis-à-vis des maladies cardiovasculaires (MCV). La littérature a mis en évidence le potentiel antioxydant de la bilirubine, notamment en tant que molécule séquestrant les dérivés réactifs de l’oxygène (DRO). L’accumulation des DRO est un phénomène central dans la formation de la plaque athérosclérotique qui est à l’origine de nombreuses MCV. Ainsi la modulation locale du métabolisme de la bilirubine dans les tissus vasculaires représente une cible au potentiel thérapeutique important. Nos travaux visaient à identifier de nouvelles molécules et de nouvelles voies de signalisation permettant d’augmenter la formation de bilirubine dans les tissus vasculaires. Parallèlement, la toxicité induite par l’accumulation excessive de la bilirubine justifiait d’évaluer le potentiel de ces voies de signalisation à contrôler les voies d’élimination hépatique de cette molécule afin de maintenir son homéostasie dans l’organisme et de s’affranchir des effets indésirables d’une telle accumulation. Dans un premier temps nous avons évalué in vitro dans des macrophages (Thp-1 différenciés), dans des cellules endothéliales (HUVEC) et dans des cellules musculaires lisses (CASMC), le potentiel du récepteur nucléaire Liver X Receptor (LXR) à moduler dans la paroi vasculaire l’expression du gène Hème oxygénase (HO)-1 codant pour l’enzyme limitante de la synthèse de la bilirubine. Nous avons également étudié le rôle du Peroxisome Proliferator Activated Receptor (PPAR)α dans la modulation du métabolisme de la bilirubine. Ici nous avons mis en évidence la capacité des ligands pharmacologiques de PPARα à moduler l’expression de HO-1 et la production de bilirubine dans les cellules vasculaires (HUVEC et CASMC). De plus, nous avons observé l’effet régulateur de ces ligands sur l’expression des gènes responsables de l’élimination de la bilirubine : UDP-glucuronosyltransférase (UGT)1A1, et Multidrug resistance-associated protein (MRP)2 dans les cellules hépatiques (Hépatocyte Humains et HepG2). Le troisième volet de nos travaux rapporte l’effet inducteur des acides gras polyinsaturés AGPI n-3 (AGPI n-3), EPA (acide eicosapentaénoïque et DHA (acide docosahexaénoïque) sur l’expression des gènes impliqués dans le métabolisme de la bilirubine : l’exposition des HUVEC et des CASMC à l’EPA et au DHA augmente l’expression de HO-1 et la production de la bilirubine. Parallèlement, dans les cellules hépatiques (HepG2), ces acides gras régulent positivement l’expression de l’UGT1A1 et de MRP2. En conclusion, nos observations décrivent i) l’implication nouvelle de LXR dans le contrôle de l’expression de HO-1 et ii) l’existence d’un mécanisme de régulation concerté du métabolisme de la bilirubine par le contrôle simultané de sa synthèse et de son élimination. De plus ce mécanisme peut être activé par les agonistes pharmacologiques de PPARα mais aussi par les AGPI n-3, EPA et DHA. Globalement, ces données supportent le potentiel de nouvelles approches pharmacologiques et nutritionnelles ciblant le métabolisme de la bilirubine pour la prévention et le traitement des MCV. / Bilirubin is the catabolic product of heme degradation. Moderate elevation of bilirubin levels is associated with a lower risk of cardiovascular diseases (CVD). In vitro analysis showed that the reactive oxygen species (ROS) scavenging properties of bilirubin can provide antioxidant protection. Accumulation of ROS triggers oxidative stress in the vasculature and promotes the development of atherosclerosis, the underlying cause of CVD. Hence the local modulation of bilirubin synthesis represents a potential therapeutic avenue. Our work aimed at identifying new molecules or signaling pathways which modulate the levels of bilirubin in the vasculature. Simultaneously, the consequences of an excessive accumulation of bilirubin in the organism lead us to investigate the effect of these pathways on the hepatic elimination of bilirubin to overcome the deleterious effect of excessive bilirubin accumulation. We firstly investigated in vitro, using macrophages (PMA-differentiated Thp-1), endothelial cells (HUVEC) and smooth muscle cells (CASM), the potential of the nuclear receptor Liver X Receptor (LXR) to modulate the vascular expression of the Heme Oxygenase (HO)-1 gene, which allows the expression of the limiting enzyme responsible for the production of bilirubin. In the same manner, the role of the Peroxisome Proliferator Activated Receptor (PPAR)α in the control of bilirubin metabolism was investigated. We highlighted the capacity of PPARα ligands to enhance HO-1 expression as well as the formation of bilirubin in vascular cells (HUVEC and CASMC). At the same time the ligands act as regulators of the expression of genes involved in bilirubin metabolism, namely UDP-glucuronosyltransferase (UGT)1A1, and Multidrug resistance-associated protein (MRP)2 in hepatic cells (Human Hepatocytes and HepG2). The third part of our work describes the induction of the expression of genes responsible for bilirubin metabolism in response to omega-3 polyunsaturated fatty acids EPA (eicosapentaenoic acid, and DHA (docosahexaenoic acid). In HUVEC and CASMC, exposition to EPA and/or DHA increase HO-1 expression and bilirubin production. In hepatic cells, those omega-3 polyunsaturated fatty acids positively regulate the expression of UGT1A1 and MRP2. In conclusion, our work provides evidences regarding i) the newly identified role of LXR in the regulation of HO-1 expression ii) the existence of a concerted mechanism within bilirubin metabolism, via the simultaneous stimulation of its synthesis and its elimination. This mechanism can be activated by pharmacological agonists of PPARα but also by omega-3 fatty acids EPA and DHA. Overall, our observations highlight the potential of new pharmacological or nutritional approaches that target bilirubin metabolism for treatment and prevention of CVD.

Thèse de doctorat : Sciences de la vie et de la santé. Physiologie et physiopathologie de l'appareil respiratoire : Paris 12 : 2007. / Titre provenant de l'écran-titre. 81 p. Bibliogr. : 316 réf.

Thèse de doctorat : Sciences de la vie et de la santé. Physiopathologie de l'appareil respiratoire : Paris 12 : 2003. / Titre provenant de l'écran-titre. Bibliogr. : 294 réf.

L’hyperbilirubinémie (HB) se développe chez 90% des nouveau-nés prématurés. L’HB modérée peut induire des désordres neurologiques aigus. L'HB sévère a été liée à une augmentation des apnées-bradycardies du prématuré. L'objectif de cette étude est de tester notre hypothèse selon laquelle une HB modérée perturbe le contrôle cardiorespiratoire chez les nouveau-nés prématurés, via une accumulation et/ou une neurotoxicité de la bilirubine au niveau des centres de contrôle cardiorespiratoire. Méthodes : Deux groupes d'agneaux prématurés (14 jours avant terme), contrôle (n=6) et HB (HB, n=5) ont été étudiés. À 5 jours de vie (J0), une HB modérée (150-250 ?mol/L) a été induite par injection iv de bilirubine durant 17h chez les agneaux HB. Les effets de l’HB modérée sur la commande respiratoire de base, la variabilité du rythme cardiaque (VRC) et respiratoire ont été évalués durant des polysomnographies, à J0 et 72h après (J3), après normalisation de la bilirubinémie. L'effet de l’HB sur la réactivité cardiorespiratoire a été analysé à J0 et J3 durant i/ des chémoréflexes laryngés (CRL) induits par injection supra-glottique de HCI, ii/ des chémoréflexes pulmonaires (CRP) provoqués par injection iv de capsaïcine et iii/ une exposition à l’hypoxie. Les cerveaux ont été analysés en imagerie magnétique par résonance (IRM) et histopathologie afin de mettre en évidence les dépôts centraux de bilirubine et d'éventuelles anomalies neuroanatomiques. Résultats : À J0, l’HB modérée augmente le temps passé en apnée spontanée. Elle est responsable d'une co-activation sympatho-vagale avec augmentation de la VRC et d'une perturbation de la rythmogenèse respiratoire. Elle altère la réactivité du système de contrôle cardiorespiratoire, comme l’attestent la diminution de l’inhibition cardiorespiratoire liée aux CRL et aux CRP, ainsi que l’augmentation de la réponse cardiaque à l’hypoxie. Ces effets sont pour la plupart réversibles à J3. Les analyses IRM et histopathologiques n'ont révélé aucune différence majeure entre les 2 groupes. Conclusions : L’HB modérée perturbe le contrôle cardiorespiratoire chez les agneaux prématurés. Bien que cela n'ait pu être démontré dans cette thèse, ces anomalies fonctionnelles pourraient être liées à la neurotoxicité de la bilirubine au niveau des centres de contrôle cardiorespiratoire. L’HB, même modérée, apparait donc comme un facteur important à prendre en compte dans la pathogénie et le traitement des apnées du prématuré.

Plusieurs études ont clairement démontré l'effet athéroprotecteur de la bilirubine. Par contre, un niveau trop élevé de bilirubine peut causer des effets neurotoxiques. Au niveau de la paroi artérielle, le stress oxydatif entraîne la production des oxystérols qui sont les activateurs endogènes du « Liver X Récepteur » (LXR). Nous avons étudié les effets de l'activation du LXRa sur l'expression de l'enzyme responsable de la glucuronidation de la bilirubine, l'UDP-glucuronosyltransférase (UGT) 1A1 dans le foie. Nous avons identifié de nouveaux éléments de réponse (LXRE) dans le promoteur de l'UGTlAl. Dans des cellules hépatiques, l'activation du LXRa entraîne une augmentation de l'expression et de l'activité de l'UGTlAl. Cet élément de réponse fonctionnel n'est pas conservé chez des rongeurs, ce qui entraîne que cette régulation est limitée aux mammifères supérieurs. En conclusion, nous avons identifié une nouvelle fonction du récepteur nucléaire LXRa qui consistent dans le contrôle de l'expression l'UGTlAl. L'activation du récepteur nucléaire LXRa par les oxystérols permet d'intégrer l'augmentation de la production de la bilirubine au niveau de la paroi d'artère avec une augmentation de l'excrétion hépatique. De plus, l'activation du LXRa par des composantes pharmacologiques, peut être intéressante dans le contexte de l'athérosclérose et de Fhyperbilirubinémie, maladies dans lesquelles la bilirubine joue des rôles importants.

Résumé : L’ictère néonatal, lié à l’hyperbilirubinémie, touche 90% des nouveau-nés prématurés. L’hyperbilirubinémie provoque des troubles neurologiques aigus (somnolence, dystonie, difficultés alimentaires, atteinte de l’audition) et a été reliée à des anomalies du contrôle respiratoire. Ces résultats suggèrent une neurotoxicité de la bilirubine sur le tronc cérébral, qui pourrait aussi affecter les centres déglutiteurs. Le but de cette étude est de tester notre hypothèse selon laquelle l’hyperbilirubinémie altère la déglutition nutritive et la coordination déglutition-respiration chez l’agneau prématuré. 11 agneaux prématurés (nés 14 jours avant terme) ont été randomisés dans un groupe contrôle (n = 6) et un groupe bilirubine (n = 5). À 5 jours de vie, une hyperbilirubinémie modérée (150-250 μmol/L) était induite pendant 17h chez les agneaux du groupe bilirubine. La déglutition était étudiée par l’enregistrement de la pression pharyngée, et la respiration était évaluée par pléthysmographie d’inductance respiratoire et oxymétrie de pouls. L’effet de l’hyperbilirubinémie sur la déglutition nutritive (DN) était évalué pendant une alimentation au biberon standardisée, avec du lait de brebis. Un second enregistrement était réalisé 48h plus tard, après normalisation de la bilirubine. L’alimentation était moins performante (mL/min) dans le groupe bilirubine (p = 0,002) avec des DN moins fréquentes (p = 0,003) et de plus petit volume (p = 0,01). Ces différences n’étaient pas retrouvées à distance de l’hyperbilirubinémie. La coordination déglutition-respiration était également altérée chez les agneaux du groupe bilirubine, indiquée par une tendance à la diminution de la durée de l’inhibition respiratoire pendant les bouffées de DN (p < 0,1), ceci pendant et après l’hyperbilirubinémie. Simultanément, pendant l’alimentation, les agneaux du groupe bilirubine passaient plus de temps en désaturations sévère (< 80%) que ceux du groupe contrôle. Enfin, une diminution de la fréquence respiratoire associée à une augmentation des apnées étaient observées dans les minutes suivant l’alimentation dans le groupe bilirubine (p < 0,05). La déglutition et la coordination déglutition-respiration sont altérées par l’hyperbilirubinémie modérée, chez l’agneau prématuré. La diminution globale d’efficacité de l’alimentation au biberon est associée à une poursuite de la respiration durant les bouffées de DN, ce qui pourrait favoriser les aspirations pulmonaires de lait. / Abstract : Rationale: Jaundice, secondary to hyperbilirubinemia (HB), develops in 90% of preterm newborns. HB induces acute neurological disorders (somnolence, abnormal tone, feeding difficulties, auditory dysfunction) and has been linked to alterations in respiratory control. These findings suggest neurotoxicity in the brainstem that could also affect swallowing centers. This study aims to test our hypothesis that HB impairs nutritive swallowing and swallowing‐breathing coordination in the preterm lamb. Methods: Two groups of preterm lambs (born 14 days prior to term), control (C, n = 6) and hyperbilirubinemia (HB, n = 5) were studied. At day 5 of life, moderate HB (150‐250 μmol/L) was induced during 17 h in HB lambs. Swallowing was assessed via recording of pharyngeal pressure, and respiration was studied by respiratory inductance plethysmography and pulsed oximetry. HB effect on nutritive swallowing was assessed during standardized bottle‐feeding with ewe milk. A second recording was performed 48 hours later, after recovery from hyperbilirubinemia. Results: Swallows were less frequent (p = 0.003) and of smaller volume (p = 0.01) in HB lambs, with a consequent decrease in minute swallowing in HB lambs (p = 0,004). These differences were not found after bilirubinemia was returned to normal. Swallowing‐breathing coordination was also impaired in HB lambs, as indicated by a tendency towards a decrease in % time with respiratory inhibition during bursts of swallows, during and after hyperbilirubinemia. Simultaneously, severe desaturations (< 80%) were longer in HB lambs than in C lambs. Finally, a decreased respiratory rate was observed immediately after feeding (p < 0,05), along with increased apneas duration. Conclusions: Both swallowing and swallowing‐breathing coordination are altered by acute, moderate HB in preterm lambs. The overall decreased efficiency at bottle‐feeding is accompanied by continuation of breathing during bursts of swallows, which may promote lung aspiration.

Nous avons montré les performances et les limitations en électrochimie des deuxnouvelles BODs de Bacillus pumilus et de Magnaporthe oryzae. La BOD de M.oryzae commence à réduire l’O2 à un potentiel de + 0,50 V vs. Ag/AgCl et B. pumilusà + 0,44 V vs. Ag/AgCl. La BOD de M. oryzae est peu sensible à la concentration dephosphate de sodium dans l’hydrogel rédox mais est sensible au chlore, à l’urate etaux fortes température. La BOD de B. pumilus a une activité élevée en présence dechlore et à 50 °C mais est sensible à la concentration de phosphate dans l’hydrogel.Cette sensibilité est compensée par une meilleure stabilité en présence d’urate, ainsielle ne perd que 9 % d’activité après 3 heures dans le sérum de veau. La BOD de M.oryzae immobilisée sans médiateur est plus performante que B. pumilus. Sonutilisation dans des nouveaux carbones poreux contenant des nanoparticules d’or amis en évidence l’effet des conditions de séchage des enzymes et de la méthode desynthèse des nanoparticules. Les meilleures performances sont obtenues pour unséchage à 25 °C sous vide et une synthèse séquentielle des nanoparticules. Nousavons combiné ces deux BODs dans une nouvelle cathode bi-enzymatique. Au ratiooptimal de 50 %v de chaque BOD, elle opère à + 0,50 V vs. Ag/AgCl avec un courantde -0,86 ± 0,01 mA.cm-2 dans les conditions physiologiques. Elle a une forte activité àhaute température et en présence de chlore et une stabilité intermédiaire enprésence d’urate. Dans les mêmes conditions nous avons réalisé une cathode bienzymatiqueavec B. pumilus et la laccase de Podospora anserina. Elle estégalement plus performante que les cathodes mono-enzymatiques correspondantes. / Here we showed the performances and the limits in electrochemistry of the two newBODs from Bacillus pumilus and Magnaporthe oryzae. The onset potential for theoxygen reduction with the BOD from M. oryzae is + 0.50 V vs. Ag/AgCl and with B.pumilus is + 0.44 V vs. Ag/AgCl. The BOD from M. oryzae is not sensitive to theconcentration of sodium phosphate in redox hydrogel but is sensitive to chloride,urate and high temperatures. The BOD from B. pumilus has a high activity in thepresence of chloride and at 50 °C, but is sensitive to the concentration of phosphatein the hydrogel. This sensitivity is offset by an improved stability in the presence ofurate, so it loses only 9 % of activity after 3 hours in calf serum. The BOD from M.oryzae immobilized without mediator outperforms B. pumilus. Its use in new porouscarbon materials containing gold nanoparticles showed the effect of enzymes dryingconditions of the synthesis method of the nanoparticles. The best performance isobtained for a drying at 25 °C under vacuum and a sequential synthesis ofnanoparticles. We combined these two BODs in a new bi-enzymatic cathode. At theoptimal ratio of 50 %v of each BOD, it operates at + 0.50 V vs. Ag/AgCl with a currentdensity of -0.86 ± 0.01 mA.cm-2 under physiological conditions. It has a high activityat high temperatures and in the presence of chloride and an intermediate stability inthe presence of urate. Under the same conditions we conceived a bi-enzymaticcathode with B. pumilus and laccase Podospora anserina. It is also more efficientthan the single-enzymatic corresponding cathodes.

La puissance de la biopile enzymatique à glucose/oxygène est limitée par sa partiecathodique. Afin de contourner cette limitation, nous avons étudié les enzymescathodiques : les Bilirubine oxydases (BODs). Dans le but de mieux appréhender ces BODs, lemécanisme réactionnel, la nature de l’étape limitante et l’effet des sels ont alors été étudiés.Deux mécanismes différents sont retrouvés en fonction du mode de transfert des protons etdes électrons (4 fois 1H+/1e- ou 2 fois 2H+/2e-). De plus, nous avons démontré que l’étapelimitante est l’oxydation du substrat pour les trois substrats testés et que les sels agissent auniveau du cuivre T1. Les principales limitations des BODs sont leur stabilité à 37 °C ainsi queleur inhibition par le NaCl. Deux techniques ont alors été utilisées pour identifier des BODsplus résistantes. La première méthode est l’extraction de nouvelles enzymes à partird’organismes extremophiles. Elle a permis d’isoler la BOD d’Anaerophaga thermohalophilaqui possède une bonne résistance au NaCl mais une densité de courant faible. Dans unsecond temps, afin de reconstruire des séquences ancestrales, la phylogénie de la familledes Bacillus Bacterium a été effectuée. Cette technique a permis l’identification de troisBODs possédant des caractéristiques très intéressantes : la BOD de Bacillus nakamurai etdeux BODs ancestrales (Noeud 10 et Noeud 13). Par exemple, après une heure à 37°C et 140mM de NaCl, le Noeud 10 possède une meilleure densité de courant que la BOD de Bacilluspumilus, qui est l’enzyme utilisée comme base de la phylogénie. La seconde technique estdonc une méthode de choix permettant la découverte de nouvelles enzymes à la fois plusstables et plus résistantes que les enzymes actuelles. Elle ouvre de grandes perspectivespour l’utilisation des BODs comme enzymes cathodiques ou pour d’autres applicationsbiotechnologiques. Enfin, nous avons montré que l’immobilisation de la BOD de B. pumilusdans le matériau Si-(HIPE) permet la décoloration cyclique de colorants chimiques surplusieurs mois. / Power of glucose/oxygen enzymatic biofuel cell is limited by the cathodic part. In order to prevent this limitation, we studied cathodic enzymes: Bilirubin oxidases (BODs). For this purpose, the kinetic mechanism, rate-limiting step and salts effect were determined. Two different mechanisms are observed depending on the electron/proton transfer (4 times1H+/1e- or 2 times 2H+/2e-). We also demonstrated that the rate-limiting step is the substrate oxidation for the three substrates tested and salts act around the T1 copper. Main BODs limitations are their stability at 37°C and their inhibition by NaCl. Two methods were used toidentify the most resistant BODs. The first one was the identification of new enzymes from extremophile organisms. It allows to isolate BOD from Anaerophaga thermohalophila whichhas good NaCl resistance but low current density. In addition, in order to reconstructancestral sequences, phylogeny of Bacillus Bacterium family was performed. This methodidentified three BODs with interesting features: BOD from Bacillus nakamurai and twoancestral BODs (Noeud 10 and Noeud 13). For example, after one hour at 37°C and 140 mMNaCl, Noeud 10 has a better current density than the BOD from Bacillus pumilus, which is theenzyme used as basis for the phylogeny. This second method allowed the discovery of newenzymes that were both more stable and more resistant than actual enzymes. Thistechnique opens up valuable prospects for the use of BODs as cathodic enzymes or for otherbiotechnological applications. In the end, we demonstrated that BOD from B. pumilusimmobilization in Si-(HIPE) materials allows cyclic discoloration of chemical dyes duringseveral months.

Dans la nature, la réduction du dioxygène est catalysée par des enzymes de la famille des oxydoréductases. A l’heure actuelle, ces protéines spécifiques et efficaces sont envisagés comme biocatalyseurs au sein de biopile enzymatique. Dans ce contexte, l’optimisation de l’orientation et de la connexion d’oxydases multi-cuivre (MCOs) pour la réduction d’O2 sur des matrices de nanotubes carbone (CNTs) fonctionnalisées a été étudiée. Dans un premier temps, le transfert électronique direct de la laccase est optimisé par la fonctionnalisation non covalente de CNTs par divers dérivés hydrophobes. La dynamique moléculaire ainsi que la modélisation électrochimique ont permis la rationalisation des performances des différentes biocathodes développées. Dans une seconde approche, la modification spécifique par des groupements pyrène de la surface de laccases modifiées par mutagénèse a également été envisagée. La fonctionnalisation supramoléculaire de CNTs par des feuillets de graphène fonctionnalisés d’une part, et par des nanoparticules d’or d’autre part, a également permis de favoriser la connexion de laccases. La seconde partie présente l’élaboration d’autres types de biocathodes basées sur la connexion directe de bilirubines oxydases. Plusieurs stratégies de fonctionnalisation covalente et non covalente de CNTs ont été envisagées. Les différentes biocathodes élaborées par l’assemblage supramoléculaire de MCOs et de matériaux nanostructurés délivrent des densités de courant de réduction du dioxygène de plusieurs mA cm-2. Ces nouvelles bioélectrodes combinées à une bioanode qui catalyse l’oxydation du glucose ont permis le développement de biopiles enzymatiques glucose/O2 délivrant des densités maximales de puissances allant de 250 µW cm-2 à 750 µW cm-2 selon les conditions expérimentales. Enfin une bioanode à base d’une hydrogénase hyperthermophile a été développée et associée à une biocathode à base de bilirubine oxydase pour former un nouveau design de biopile H2/O2. Au sein de ce dispositif, la biocathode à diffusion de gaz réduit directement l’oxygène provenant de l’air, ce qui permet de s’affranchir de l’utilisation d’une membrane séparatrice tout en protégeant l’hydrogénase de sa désactivation en présence d’oxygène. Cette nouvelle biopile délivre une densité maximale de puissance de 750 µW cm-2. / The reduction of oxygen is realized in nature by oxidoreductase enzymes. Currently, these highly specific and efficient proteins are considered as biocatalysts for the development of biofuel cells. In this context, optimizing the orientation and the connection of multicopper oxidase (MCOs) for the reduction of O2 on functionalized carbon nanotubes was studied. In the first part of this manuscript, direct electron transfer of laccase is assessed and optimized by the non-covalent functionalization of CNTs by various hydrophobic derivatives. Electrochemical modeling and molecular dynamics enabled the rationalization of the developed biocathodes efficiency. In a second approach, the specific modification by pyrene moieties of laccases surface modified by protein engineered has also been considered. Additionally, supramolecular functionalization of CNTs by modified graphene sheets and gold nanoparticles also helped to promote laccase connection. The second part presents the development of other types of biocathodes based on the direct connection of bilirubin oxidase. Several strategies of covalent and non-covalent CNTs functionalization have been considered. The different biocathodes developed by the supramolecular assembly of nanostructured materials and MCOs delivered current density of several mA cm-2 for oxygen reduction. These new bioelectrodes combined with a bioanode which catalyzes the glucose oxidation have enabled the development of glucose/O2 enzymatic biofuel cells; delivering maximum power densities from 250 µW cm-2 to 750 µW cm-2 depending on the experimental conditions. Finally a hyperthermophilic hydrogenase based bioanode was developed and associated with a bilirubin oxidase-based biocathode to form a new design of H2/O2 biofuel cell. Within this device, the gas diffusion biocathode directly reduces oxygen from the air, which eliminates the use of a separation membrane while protecting the hydrogenase from its deactivation in the presence oxygen. This new biofuel cell delivers a maximum power density of 750 µW cm-2.