CoordenaÃÃo de AperfeÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Os corantes artificiais, tais como amarelo sÃlido e laranja GGN, vÃm preocupando a populaÃÃo mundial por sua natureza tÃxica. Em substituiÃÃo a esses compostos, fontes alternativas de corantes naturais estÃo sendo buscadas pelos pesquisadores. O bagaÃo do pedÃnculo do caju, subproduto da indÃstria de sucos, apresenta quantidade apreciÃvel de carotenÃides, compostos com poder corante e biologicamente ativos, alÃm de apresentar teor de flavonÃides, sendo uma fonte promissora de corantes naturais. Este trabalho teve como objetivo estudar a obtenÃÃo de carotenÃides e flavonÃides a partir do bagaÃo do pedÃnculo do caju por maceraÃÃo enzimÃtica. Para o estudo da maceraÃÃo foi utilizado o bagaÃo de caju proveniente da indÃstria e um complexo enzimÃtico pectinolÃtico. Na primeira etapa do trabalho, selecionaram-se os melhores parÃmetros de proporÃÃo bagaÃo: Ãgua, concentraÃÃo enzimÃtica, tempo e temperatura de maceraÃÃo, em escala de bancada, cujo procedimento baseou-se na determinaÃÃo do parÃmetro b de cor instrumental. Definidos esses parÃmetros, os experimentos foram conduzidos em escala de planta piloto, nas quais os extratos foram obtidos por cinco ciclos de prensagem/diluiÃÃes sucessivas. O extrato foi centrifugado, obtendo-se um resÃduo e um sobrenadante, que foi concentrado a vÃcuo. Foi realizada caracterizaÃÃo fÃsico-quÃmica dos extratos brutos, concentrados e do resÃduo. Os resultados revelaram que as melhores condiÃÃes de maceraÃÃo do bagaÃo do caju para a obtenÃÃo de carotenÃides foram a temperatura de 30ÂC, proporÃÃo 1:1 (bagaÃo: Ãgua), adiÃÃo de 500 ppm de complexo enzimÃtico pectinolÃtico e tempo de incubaÃÃo de 1 hora. JÃ para o teor de flavonÃides, a adiÃÃo de preparado enzimÃtico pectinolÃtico, combinado com um aumento de 10ÂC na temperatura, aumentaram o teor desses compostos nos extratos. A concentraÃÃo do extrato resultou em perda dos teores de carotenÃides, vitamina C e compostos fenÃlicos, gradativamente, com o aumento dos nÃveis de concentraÃÃo.

Submitted by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2017-01-31T12:38:26Z No. of bitstreams: 2 Tese - Eliane Santana Fernandes Alves - 2016.pdf: 5008665 bytes, checksum: 2bf6c1927704513144d6115676f77dff (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2017-01-31T12:38:51Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Tese - Eliane Santana Fernandes Alves - 2016.pdf: 5008665 bytes, checksum: 2bf6c1927704513144d6115676f77dff (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-01-31T12:38:51Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Tese - Eliane Santana Fernandes Alves - 2016.pdf: 5008665 bytes, checksum: 2bf6c1927704513144d6115676f77dff (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2016-04-18 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / Antimicrobial peptides are gaining high importance in the pharmaceutical sector given its high affinity and selectivity to interact with targets, and its low toxicity profile. The increase in the number of peptides screened in clinical trials is a significant triumph for structural biology, considering the search for peptides that meet the required criteria in terms of cost, stability, long half-life and bioavailability. This research is best performed with a good understanding of the mechanisms of action, dynamics and biomolecules kinetics. Nuclear magnetic resonance spectroscopy (NMR) plays an important role in this context, since it provides informations about the interactions in target binding solution of biologically active molecules. Thus, this study aims to observe the intramolecular interactions of peptides clavanin A, Cm-p1 and [Phe3]Cm-p1. The clavanin peptide is found in tunicate blood cells Styela clava, and presents a broad spectrum of activity against Gram-positive and Gram-negative bacteria, and against several kinds of fungi. The Cm-p1 peptide can be extracted from the crude extract of the marine snail Cenchritis muricatus, and shows activity against yeasts and filamentous fungi. The peptide [Phe3]Cm-p1 corresponds to Cm-p1 peptide modified with a change in residue position 3. Circular dichroism spectroscopy was used in the observation of secondary structure of peptide, and the informations provided by NMR were used in the studies of molecular modeling. The clavanin peptide in the presence of TFE (2,2,2-trifluoroethanol), presented a amphipathic alpha-helices from Phe-2 to Val-22 residues. The Cm-p1 peptide was structured in α-helix, short amphipathic, in the presence of micelles of SDS-d25 between Arg-2 and Ile-6 residues. The peptide [Phe3]Cm-p1 in the presence of micelles SDS-d25 (sodium dodecyl sulfate) is structured between Arg-2 and Gln-9, showing that the addition of a hydrophobic residue in position 3 provided a greater interaction peptide-micelle, as noted by the smaller diffusion of the peptide [Phe3]Cm-p1 relative to Cm-p1 peptide. All the obtained structures showed good quality and geometry, as revealed by the validation study. NMR spectroscopy provided information about the intramolecular interactions of peptides clavanin A, Cm-p1 and [Phe3]Cm-p1. It was possible to assign the residues which were important in the interactions between the peptides and the environment. This knowledge is essential in the development of new drugs. / Os peptídeos antimicrobianos estão ganhando cada vez mais importância na área farmacêutica, pela sua elevada afinidade e seletividade para interagir com alvos em conjunto com seu perfil de baixa toxicidade. O aumento do número de peptídeos que entraram em ensaios clínicos é um triunfo significativo para biologia estrutural, com a busca cada vez maior por peptídeos que cumpram os critérios exigidos em termos de custo, estabilidade, longa meia-vida e biodisponibilidade. Essa busca pode ser facilitada pelo melhor entendimento dos mecanismos de ação, dinâmica e cinética de biomoléculas. Nesse contexto se encontra a espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN), que possui um papel de destaque no estudo das interações em solução ligante-alvo de moléculas biologicamente ativas. Desta forma, o presente estudo teve como objetivo observar as interações moleculares dos peptídeos clavanin A, Cm-p1 e [Phe3]Cm-p1. O peptídeo clavanin A é encontrado nas células do sangue do tunicado Styela clava, ele apresenta um amplo espectro de atividades contra bactérias Gram-positivas e Gram-negativas, além de vários fungos. O peptídeo Cm-p1 pode ser extraído do extrato bruto do caracol marinho Cenchritis muricatus, ele apresenta atividade contra leveduras e fungos filamentosos. O peptídeo [Phe3]Cm-p1 corresponde ao peptídeo Cm-p1 modificado, com uma modificação na posição do resíduo 3. Nos estudos foram empregadas as espectroscopias de dicroísmo circular, na observação da estrutura secundária do peptídeo e RMN, nos estudos de modelagem molecular. O peptídeo clavanin A, na presença de TFE (2,2,2-trifluoroetanol), apresentou uma estrutura em α-hélice anfipática do resíduo de Phe-2 à Val-22. O peptídeo Cm-p1 se estruturou em α-hélice pouco anfipática na presença de micelas de SDS-d25 entre os resíduos Arg-2 e Ile-6. Já o peptídeo [Phe3]Cm-p1 na presença de micelas de SDS-d25 (Dodecil sulfato de sódio) se estruturou entre os resíduos Arg-2 e Gln-9, mostrando que a adição de um resíduo hidrofóbico na posição 3 proporcionou uma maior interação peptídeo-micela, como observado pela menor difusão, do peptídeo [Phe3]Cm-p1 em relação ao peptídeo Cm-p1. Todas as estruturas obtidas apresentaram boa qualidade e geometria, conforme mostraram as validações empregadas. A espectroscopia de RMN forneceu informações a respeito das interações intramoleculares dos peptídeos clavanin A, Cm-p1 e [Phe3]Cm-p1, possibilitando descrever os resíduos importantes nas interações moleculares com meio. As informações levantadas neste estudo são essenciais a futuras pesquisas para o desenvolvimento de fármacos a partir desses peptídeos.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O tipo de vegetação, a estação do ano e o estado físico da própolis podem interferir em sua composição, qualidade e quantidade produzida. Este trabalho teve por objetivo estudar a própolis produzida em Roraima por Apis mellifera em áreas de floresta e savana e em períodos de chuva e seca, com base na composição química e atividade antioxidante. As soluções de extratos etanólicos foram preparadas por meio de maceração e adição de solvente, apresentando variação de coloração. Por métodos espectrofotométricos foram quantificados fenólicos e flavonoides. A determinação do potencial antioxidante foi avaliado utilizando o método de sequestro do radical 2,2-difenil-1-picril-hidrazila e a oxidação do sistema β-caroteno/ácido linoleico. A produção de própolis das amostras coletadas em áreas de floresta foi maior no período chuvoso, e no período seco se destacaram as coletadas em áreas de savana. O teor de fenólicos mais elevado foi observado no período seco em ambas as fitofisionomias. Flavonas e flavonóis nas duas áreas estudadas apresentaram os maiores teores durante o período seco. As quantidades mais elevadas de flavanonas e diidroflavonois foram detectadas nas amostras das áreas de floresta e savana durante a estação seca. Os teores de antocianinas foram muito superiores às demais classes de flavonoides, e os melhores resultados para os locais de floresta foram obtidos durante o período seco, e nos de savana no chuvoso. Esta classe se destacou devido aos elevados teores apresentados e também por resultados para quantificação de antocianinas em própolis não serem apresentados na literatura. A atividade antioxidante determinada pela oxidação do sistema β-caroteno/ácido linoleico foi maior no período chuvoso nas áreas de floresta e no período seco nas áreas de savana. Por outro lado, a análise da capacidade atividade pelo método DPPH foi maior no período seco nas duas fitofisionomias estudadas. Esta atividade por ambos os métodos foi significativa, apresentando valores muito elevados quando comparados a dados da literatura. Quando utilizada a correlação de Pearson entre os compostos fenólicos e flavonoides totais com a capacidade antioxidante observou-se correlações variando de moderada à fortemente positiva (r2= 0,5 a 1,0). / The type of vegetation, the season and the physical state of propolis can interfere in its composition, quality and quantity produced. This study aimed to study the propolis produced in Roraima by Apis mellifera in areas of forest and savannah and rain and dry periods, based on the chemical composition and antioxidant activity. The ethanol extract solutions were prepared by maceration and solvent addition, with varying color. By spectrophotometric methods were quantified phenolics and flavonoids. Determination of antioxidant activity was evaluated using the method of 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl radical sequestration and oxidation of β-carotene/linoleic acid system. The production of propolis samples collected in forest areas was higher in the rainy season and the dry season were the most collected in savanna areas. The higher phenolic content was observed in both the dry period phytophysiognomies. Flavones and flavonols in the two areas studied showed the highest levels during the dry season. The higher amounts of flavanones and diidroflavonois were detected in samples from areas of forest and savannah during the dry season. The anthocyanin content were higher than the other flavonoids classes, and better results for forest were obtained during the dry season, and in the savannah during the rainy. This class stood out due to high levels presented and also results for the quantification of anthocyanins in propolis not be common in the literature. The antioxidant activity determined by the oxidation of β-carotene / linoleic acid system was observed during the rainy season in forest areas, and in the savannah the highlight was the propolis collected during drought. On the other hand, the capacity analysis activity by DPPH was higher in the dry season, the two studied vegetation types. This activity by both methods was significant, with very high values when compared to literature data. Pearson correlation of phenolic compounds and flavonoids with antioxidant capacity was observed ranging from moderate to strongly positive (r2 = 0.5 to 1.0).

Os efeitos deletérios causados pela radiação ultravioleta (UV) e o aumento significativo no diagnóstico de câncer de pele, confirmam a necessidade de um progresso significativo na pesquisa de produtos fotoprotetores eficazes e seguros, para proteção eficaz da pele. As formulações atuais associam filtros UV, orgânicos e inorgânicos, com eficácia limitada e que podem acarretar reações cutâneas adversas. O extrato de Vaccinium myrtillus L. (EVM) apresenta em sua composição compostos fenólicos, como as antocianinas, que possuem atividade antioxidante. O objetivo deste estudo foi avaliar formulações fotoprotetoras contendo extrato de Vaccinium myrtillus L. com amplo espectro de ação e concentrações reduzidas de filtros UV. As emulsões contendo ou não EVM e filtros orgânicos (octocrileno e metileno bis-benzotriazolil tetrametilbutilfenol) e inorgânico (dióxido de titânio) foram avaliadas e consideradas estáveis perante parâmetros pré-definidos. O perfil de segurança foi determinado pelo método in vitro Hen´s Egg Test - Chorioallantoic Membrane (HET-CAM) e o potencial antirradicalar do EVM foi confirmado pelo teste de DPPH• A formulação fotoprotetora acrescida de 5,0% de EVM foi avaliada quanto à eficácia fotoprotetora in vivo e in vitro e não demonstrou aumento significativo no FPS quando comparada à formulação que continha somente os filtros solares e, no ensaio referente à hidratação da pele, não houve alteração nos dados, segundo teste de eficácia clínica. Os resultados obtidos sugeriram que mesmo não apresentando aumento no valor de FPS in vivo, a formulação fotoprotetora contendo o extrato, poderia atuar como agente antioxidante evitando os danos provocados pela radiação UV. / The deleterious effects caused by ultraviolet radiation (UV) and the significant increase in the diagnosis of skin cancer confirm the need for significant progress in researching effective and safe sunscreen products for effective skin protection. Current formulations associate UV, organic and inorganic filters with limited efficacy that can lead to adverse skin reactions. Vaccinium myrtillus extract (EVM) contains in its composition polyphenols compounds, such as anthocyanins, which have been antioxidant activity. The objective of this study was to evaluate sunscreens containing EVM with broad action spectrum and reduced concentrations of UV filters. Emulsions containing or not EVM and organic (octocrylene and methylene bis-benzotriazolyl tetramethylbutylphenol) and inorganic (titanium dioxide) filters were evaluated and considered stable under pre-defined parameters. The safety of the emulsion was assessed was determined by the in vitro Hen´s Egg Test - Chorioallantoic Membrane method (HET-CAM) and the antiradical potential of EVM was confirmed by the DPPH• test. The sunscreen formulation containing EVM 5.0% was photoprotective efficacy evaluated in vivo and in vitro and did not show a significant increase in SPF when compared the formulation only with UV filters and no improves skin hydration, according to clinical efficacy assay. The results of the study suggest that even without increase SPF in vivo, the sunscreen formulation containing the extract may show antioxidant activity avoiding damage caused by UV.

Fungos do gênero Colletotrichum são considerados um dos principais fitopatógenos do mundo, comprometendo diversas culturas e causando danos econômicos e sociais para diversos países, inclusive o Brasil. Apesar de medidas de controle já serem empregadas, estas nem sempre são eficazes, motivo pelo qual se faz necessária a busca por novas opções de controle que possam atuar no manejo integrado. Dentre estas, encontram-se os metabólitos secundários produzidos por fungos endofíticos, os quais estão envolvidos na produção de compostos de interesse biotecnológico, com aplicações em diversas áreas, inclusive a agronômica. Neste contexto, o presente trabalho de doutorado teve por objetivo explorar o potencial biológico e químico de metabólitos secundários produzidos por fungos endofíticos isolados de guaranazeiros da Amazônia, avaliando sua atividade antifúngica \"in vitro\" a Colletotrichum gloeosporioides, isolado da cultura do guaranazeiro, a C. acutatum e C. gloeosporioides, isolados da cultura do pimentão. Para tanto, 16 linhagens de fungos endofíticos foram avaliadas em ensaio biológico por cultivo pareado e pelo método de difusão em disco contra Colletotrichum spp. Observou-se que quatro linhagens se mostraram mais promissoras, as quais foram selecionadas para o estudo de bioprospecção. A partir do extrato bruto do endófito Aspergillus flavus (272) foi isolado o composto ativo asperfuran, que apresentou atividade inibitória aos três fitopatógenos, com CI50 < 100 &mu;g disco-1, semelhante ao fungicida comercial difenoconazol. A partir do extrato bruto de Xylaria sp. (214) foi isolado o composto ativo citocalasina D, que apresentou atividade inibitória a C. gloeosporioides isolado do guaranazeiro, com CI50 > 500 &mu;g disco-1. A partir do extrato bruto de Xylaria sp. (249) foi isolado o composto ativo ácido pilifórmico, que apresentou atividade inibitória a C. gloeosporioides isolado do guaranazeiro, com CI50 de 500 &mu;g disco-1 e à C. acutatum isolado o pimentão, com CI50 de 300 &mu;g disco-1. E, a partir do extrato bruto de Talaromyces aculeatus (507) foram isolados três compostos, da classe dos ésteres ftalicos, sendo um ativo. A fração antecessora destes três compostos apresentou atividade inibitória a C. gloeosporioides isolado do guaranazeiro, com CI50 > 500 &mu;g disco-1. A partir do extrato bruto de T. aculeatus também foi isolado um composto ativo parcialmente identificado e um composto ativo semi-purificado. A fração antecessora destes dois compostos apresentou atividade inibitória aos dois C. gloeosporioides, com CI50 > 300 &mu;g disco-1 e a C. acutatum, com CI50 em torno de 150 &mu;g disco-1. A atividade antifúngica destes compostos a fungos do gênero Colletotrichum está sendo relatada pela primeira vez neste estudo. / Colletotrichum fungi are considered one of the main pathogens in the world, affecting different cultures and causing social and economic damage to several countries, including Brazil. Despite control measures already being employed, these are not always effective, which is why the search for new control options that can act in the integrated management is necessary. Among these, the secondary metabolites produced by endophytes are involved in the production of compounds of biotechnological interest, with applications in several areas, including the agronomic. In this context, this study aimed to explore the biological and chemical potential of secondary metabolites produced by endophytic fungi isolated from the Amazonian guarana, evaluating their antifungal activity \"in vitro\" to Colletotrichum gloeosporioides, isolated from the culture of guarana and C. acutatum and C. gloeosporioides, isolated from the red pepper crop. For this purpose, 16 strains of endophytic fungi were evaluated in biological assay of dual culture and disk diffusion method against Colletotrichum spp. Four strains of these strains presented promising results which were selected for bioprospecting. From the crude extract of the endophyte Aspergillus flavus (272) was isolated the active compound asperfuran, which showed inhibitory activity to three pathogens, with IC50 <100 &mu;g disk-1, similar to the commercial fungicide difenoconazole. From the crude extract of Xylaria sp. (214) was isolated the active compound cytochalasin D, which showed inhibitory activity against C. gloeosporioides isolated from guarana (IC50> 500 &mu;g disk-1). From the crude extract of Xylaria sp. (249) was isolated the active compound piliformic acid, which showed inhibitory activity against C. gloeosporioides isolated from guarana (IC50 of 500 &mu;g disk-1) and C. acutatum isolated from red pepper (IC50 of 300 &mu;g disk-1). And from the crude extract of Talaromyces aculeatus (507) were isolated three compounds, of phthalate esters class, one of them with activity. The predecessor fraction of these three compounds showed inhibitory activity against C. gloeosporioides isolated from guarana (IC50> 500 &mu;g disk-1). From the crude extract of T. aculeatus it was also isolated a partially identified active compound and a semi-purified active compound. The predecessor fraction of these two compounds showed inhibitory activity to both C. gloeosporioides (IC50> 300 &mu;g disk-1) and to C. acutatum (IC50 around 150 &mu;g disk-1). The antifungal activity of the compounds isolated in this study is being reported for the first time against fungus of the genus Colletotrichum.

Introdução: Doenças cardiovasculares constituem importante causa de morte em todo mundo e a hipercolesterolemia está diretamente relacionada a elas. A dieta desempenha papel importante neste processo e alguns alimentos como o feijão caupi (Vigna unguiculata L. Walp), especialmente sua proteína, tem sido apontado com potencial capacidade de redução do colesterol plasmático. Os efeitos hipocolesterolêmicos já observados indicaram o uso da proteína do feijão caupi, ou dos seus peptídeos, como ingrediente funcional de alimentos para a promoção da saúde e a redução do risco de doenças. Entretanto, as consequências da digestão gastrointestinal na absorção destes peptídeos são claramente complexas tornando essenciais estudos in vitro e in vivo para avaliar a sua bioacessibilidade e sua resistência à degradação gastrointestinal, além da disponibilidade e real eficácia destes peptídeos. Objetivo: Analisar a biodisponibilidade de peptídeos e avaliar parâmetros ligados ao metabolismo do colesterol em modelos animais após ingestão de isolado proteico de feijão caupi. Métodos: A farinha de feijão caupi foi desengordurada e sua proteína isolada. O isolado proteico foi submetido a métodos de hidrólise in vitro, para verificação das frações peptídicas formadas e inferência sobre a capacidade de ligação à albumina. Dois experimentos in vivo foram conduzidos. No primeiro, o isolado proteico do feijão caupi foi administrado a ratos e a concentração dos peptídeos monitorada no sangue, por 2 horas. O experimento in vivo 2 consistiu na alimentação de hamsters com dietas normo (N) - e hipercolesterolêmicas por 21 dias, contendo a proteína do feijão caupi como única proteína da ração (I), comparada ao controle de caseína (H). Neste experimento foram analisados no plasma: colesterol total (CT) e frações (LDLc, VLDLc e HDLc), triglicerídeos (TG) e peptídeos; nas fezes: colesterol total (CF) e ácidos biliares (AB); no fígado: colesterol (CH) e lipídeos totais (LH), HMGCR (atividade enzimática e expressão) e expressão de SREBP2, LDLR, ABCA1, ABCG1, ABCG5, ABCG8, LXRa e AMPK. Resultados: Os peptídeos identificados a partir da hidrólise proteica do feijão caupi, ou a partir do plasma dos animais estudados não evidenciaram similaridades entre os experimentos ou corresponderam a sequências previamente identificadas para o feijão caupi a partir de banco de dados. CT, VLDLc, HDLc, TG, CH dos hamsters foram maiores nos grupos H e I quando comparado ao N; LDLc foi maior para I comparado aos demais; LH foi maior em H comparado a N, sendo que I não diferiu dos demais; CF foi maior para I comparado a N, sendo que H não diferiu dos demais. A expressão de ABCA1 foi maior para I em relação aos demais; LXRa foi maior para I em relação a H, mas N não diferiu dos demais; SREBP2 foi menor em H em comparação aos demais; HMGCR foi mais expressa em N em comparação aos demais, ao passo que a atividade desta enzima foi maior em I quando comparado a N, sendo que H não diferiu dos demais. Não houve diferença entre os grupos quanto a AB ou expressão de ABCG8 ou AMPK. Não foram obtidos resultados de expressão para LDLR, ABCG1 e ABCG5. Conclusão: Apesar de pesquisas anteriores a este trabalho terem evidenciado a capacidade do isolado proteico do feijão caupi em inibir a atividade da HMGCR, inibir a solubilização micelar ou melhorar o perfil de lipídeos plasmáticos, no trabalho atual esta matéria prima não mostrou atuação positiva quanto ao metabolismo do colesterol de hamsters nas condições experimentais utilizadas. Os fragmentos indicados como peptídeos obtidos a partir da hidrólise proteica do feijão caupi, ou do plasma dos animais estudados não corresponderam a peptídeos com comprovada, ou até mesmo, com indicação de bioatividade / Introduction: Cardiovascular diseases are important cause of death worldwide and hypercholesterolemia is directly related to them. Diet plays an important role in this process and some foods such as cowpea (Vigna unguiculata L. Walp), especially its protein, have been shown to have a potential for reducing plasma cholesterol. The hypocholesterolemic effects already observed indicated the use of cowpea protein, or its peptides, as a functional food ingredient for health promotion and reduction of disease risk. However, the consequences of gastrointestinal digestion on the absorption of these peptides are clearly complex, making in vitro and in vivo studies essential to assess their bioaccessibility and resistance to gastrointestinal degradation, as well as the availability and actual efficacy of these peptides. Objectives: To analyze the bioavailability of peptides and evaluate parameters related to cholesterol metabolism in animal models after ingestion of protein isolate of cowpea. Methods: Cowpea flour was defatted and its protein isolated. The protein isolate was subjected to in vitro hydrolysis methods to verify the formed peptide fractions and inference about albumin binding ability. Two in vivo experiments were conducted. In the first, the cowpea protein isolate was administered to rats and the concentration of the peptides monitored in the blood for 2 hours. The in vivo experiment 2 consisted of feeding hamsters with normal (N) - and hypercholesterolemic diets for 21 days, containing the cowpea protein as the sole dietary protein (I), compared to casein control (H). In this experiment were analyzed in the plasma: total cholesterol (TC) and fractions (LDLc, VLDLc and HDLc), triglycerides (TG) and peptides; In feces: total cholesterol (CF) and bile acids (AB); In the liver: cholesterol (CH) and total lipids (LH), HMGCR (enzymatic activity and expression) and expression of SREBP2, LDLR, ABCA1, ABCG1, ABCG5, ABCG8, LXRa and AMPK. XX. Results: The peptides identified from the protein hydrolysis of cowpea or from the plasma of the animals studied did not show similarities among the experiments or correspond to sequences previously identified for the cowpea from the database. CT, VLDLc, HDLc, TG, CH of hamsters were higher in groups H and I when compared to N; LDLc was higher for I compared to the others; LH was higher in H compared to N, and I did not differ from the others; CF was higher for I compared to N, and H did not differ from the others. The expression of ABCA1 was higher for I than the others; LXRa was higher for I than H, but N did not differ from the others; SREBP2 was lower in H compared to the others; HMGCR was more expressed in N compared to the others, whereas the activity of this enzyme was higher in I when compared to N, and H did not differ from the others. There was no difference between groups regarding AB or expression of ABCG8 or AMPK. No expression results were obtained for LDLR, ABCG1 and ABCG5. Conclusion: Although previous research to this work evidenced the ability of the cowpea protein isolate to inhibit HMGCR activity, inhibit micellar solubilization or improve the plasma lipid profile, in the current work this raw material did not show a positive cholesterol metabolism of hamsters under the experimental conditions used. The fragments indicated as peptides obtained from the protein hydrolysis of cowpea beans, or from the plasma of the animals studied did not correspond to peptides with proven, or even, with indication of bioactivity

O número crescente de descobertas de substâncias bioativas produzidas pelo metabolismo secundário de cianobactérias tem despertado o interesse de grupos de pesquisa no mundo todo com o objetivo comum de descrever e explorar estas moléculas e entender a sua biossíntese. No Brasil, as pesquisas sobre moléculas bioativas produzidas por linhagens de cianobactérias nativas são escassas. Neste trabalho, utilizando iniciadores específicos da PCR e sequenciamento, a presença de genes envolvidos na biossíntese da neurotoxina saxitoxina (STX) foi confirmada em representantes dos gêneros Dolichospermum, Sphaerospermopsis, Cuspidothrix e Cylindrospermopsis, enquanto que genes da citotoxina cilindrospermopsina (CYN) foram detectados somente em representantes de Cylindrospermopsis. Genes envolvidos com a produção dos inibidores enzimáticos, microviridina (MDN) e a cianobactina microciclamida (MCA) foram sequenciados em isolados do gênero Microcystis. Os genomas das linhagens de Cylindrospermopsis raciborskii CENA302 e CENA303 foram sequenciados usando a plataforma HiScan SQ (Ilumina) com biblioteca pareada 2 x 100 pb. O genoma da Sphaerospermopsis torques-reginae ITEP-024 foi sequenciado utilizando a plataforma Ion Torrent (Life Technologies) com tamanhos de fragmentos de até 200 pb. As tentativas de montagem ab initio dos genomas foram realizadas e o agrupamento gênico da saxitoxina (28 kb) da linhagem C. raciborskii CENA302 foi identificado e caracterizado. As análises filogenéticas das sequências de aminoácidos envolvidos com a biossíntese das moléculas bioativas avaliadas demonstraram que os isolados brasileiros de cianobactérias formam clados com elevado valor de reamostragem com sequências homólogas de cianobactérias conhecidas como produtoras dessas moléculas. Neste estudo é relatada pela primeira vez a presença de genes cyr em linhagens da América do Sul de C. raciborskii e a presença simultânea de genes cyr e sxt em uma única linhagem de C. raciborskii. Além disso, este é o primeiro estudo que relata a presença de genes envolvidos na biossíntese de MDN e MCA nas espécies de cianobactérias M. protocystis, M. panniformis e M. wesenbergii. Análises por espectrometria de massas acoplada a cromatografia líquida (LC-MS) e imunoensaio enzimático (ELISA) foram utilizadas a fim de detectar e identificar variantes estruturais das moléculas bioativas das cianobactérias que tiveram os genes biossintéticos sequenciados. A análise de LC-MS mostrou a produção das variantes GTX2, GTX3, STX e dc-STX pela linhagem C. raciborskii CENA302, enquanto que a linhagem C. raciborskii CENA305 apresentou as variantes NEO, C1 e dcGTX3. As quatro novas variantes de MCY, [D-Val1]MC-RR, [D-Leu/Ile1]MC-RR, [D-Leu/Ile1]MC-YR e [D-Phe1]MC-LR, foram encontradas nas espécies M. panniformis SPC702 e M. protocystis SPC697. Este é o primeiro relato da produção de MCY por essas duas espécies de Microcystis. Dezesseis linhagens que ainda não possuíam as sequências do gene de RNAr 16S foram sequenciadas. O resultado da análise filogenética das sequências do gene de RNAr 16S foi coerente com as descrições morfológicas, sendo que todas as linhagens foram caracterizadas em nível de espécie. As informações geradas neste estudo contribuem para o aumento do conhecimento da diversidade metabólica dos isolados brasileiros de cianobactérias e trazem nova visão sobre a evolução dessas moléculas produzidas pelo metabolismo secundário / The growing numbers of discoveries of bioactive substances produced by cyanobacterial secondary metabolism has attracted the interest of research groups around the world with the common goal of describing and exploring these molecules and understanding their biosynthesis. In Brazil, researches on bioactive molecules produced by native cyanobacterial strains are scarce. In this work, using specific PCR primers and sequencing, the presence of genes involved in the biosynthesis of the neurotoxin saxitoxin (STX) was confirmed in representatives of the genera Dolichospermum, Sphaerospermopsis, Cuspidothrix and Cylindrospermopsis, while genes of the cytotoxin cylindrospermopsin (CYN) were detected only in representatives of Cylindrospermopsis. Genes involved in the production of protease inhibitors, microviridin (MDN) and the cianobactin microciclamide (MCA), were sequenced in isolates of the genus Microcystis. The genomes of Cylindrospermopsis raciborskii strains CENA302 and CENA303 were sequenced using the high-throughput platform HiScan SQ (Illumina) as paired-ends 2 x 100 bp. The Sphaerospermopsis torques-reginae ITEP-024 genome was sequenced using the high-throughput platform Ion Torrent (Life Technologies) with fragment sizes up to 200 bp. Attempts of ab initio genomes assembly were performed and the 28 kb saxitoxin gene cluster of C. raciborskii strains CENA302 was identified and characterized. Phylogenetic analyses of amino acid sequences involved in the biosynthesis of the bioactive molecules evaluated showed that the Brazilian cyanobacterial isolates formed clades with high bootstrap values with homologous sequences of known cyanobacterial producers of these molecules. In this study is reported for the first time the presence of cyr genes in South America strains of C. raciborskii and the simultaneous presence of cyr and sxt genes in a single C. raciborskii strain. Furthermore, this is the first study reporting the presence of genes involved in the biosynthesis of MDN and MCA in the cyanobacterial species M. protocystis, M. panniformis e M. wesenbergii. Analyses by mass spectrometry coupled to liquid chromatography (LC-MS) and enzyme immunoassay (ELISA) were used to detect and identify structural variants of bioactive molecules of the cyanobacteria that had the biosynthetic genes sequenced. Analysis of LC-MS showed the production of the variants GTX2, GTX3, STX and dc-STX by the C. raciborskii strain CENA302, whereas the strain C. raciborskii CENA305 presented the variants NEO, C1 and dcGTX3. The new four MCY variants [D-Val1]MC-RR, [D-Leu/Ile1]MC-RR, [D-Leu/Ile1]MC-YR and [D-Phe1]MC-LR were found in the species M. panniformis SPC702 and M. protocystis SPC697. This is the first report of the MCY production by these two species of Microcystis. Sixteen strains that still lacked the 16S rRNA gene sequences were sequenced. The result of the phylogenetic analysis of 16S rRNA gene sequences was consistent with the morphological descriptions, and all strains were characterized to species level. The informations generated in this study contribute to the increase of knowledge on metabolic diversity of Brazilian cyanobacterial strains and bring new insight into the evolution of these molecules produced by secondary metabolism

O presente trabalho avaliou a formacao de tecido osseo ao redor de implantes osseointegraveis de titanio, apos realizacao de defeitos osseos, utilizando diferentes tipos de substitutos osseos. Foram utilizados 5 caes de raca indeterminada, os pre molares e molares mandibulares foram extraidos, passados 12 semanas, os caes foram submetidos a um novo procedimento cirurgico aonde foram realizadas as perfurações preconizados pelo fabricante dos implantes, o osso vestibular da mandibula foi desgastado ate que parte da perfuracao fosse exposta, os implantes entao foram colocados nas respectivas perfuracoes, ficando com 4 espiras expostas. Esses defeitos foram preenchidos aleatoriamente com Bioglass® 45S5, Biosilicato® , Osso autogeno, e sem nenhum material de preenchimento. 18 semanas depois da colocacao dos implantes os caes foram mortos e suas hemi-mandibulas contendo os implantes removidas e submetidas aos analises histologiaos e histomorfometricas, os dados obtidos foram submetidos ao teste de Kruskal-Wallis. A histologia dos 4 grupos estudados revelaram a presenca de tecido osseo maduro em contato com os implantes, porem sem ralacao direta com os vidros bioativos e osso autogeno. A porcentagem de contato osso implante, matriz ossea mineralizada ao redor da espira, e area de espelho, nao mostraram diferencas estatisticas significantes entre os 4 materiais testados. Os resultados indicam que a presenca de substitutos osseos nao interfere com a formacao ossea ao redor dos implantes nesse modelo experimental. E existe resposta tecidual muito semelhante entre o osso autogeno, Bioglass® 45S5 e Biosilicato. / The aim of the present study was to investigate the amount of bone formation on Ti implants in sites with intra-bony defects filled with different bone substitutes. Mandibular premolars and first molars were extracted from 5 dogs, and after 12 weeks 3 implants were bilaterally placed in sites with intra-bony defects and each implantation site randomly received the following treatment: Biosilicate®, Bioglass® 45S5, aoutologous bone or no treatment. At 18 weeks after implantation, the hemi-mandibles containing the implants were removed and processed for morphological and histomorphometric analysis. Data were submitted to Kruskal-Wallis and Fishers test. The histological sections of the 4 experimental groups exhibited mature bone tissue in contact with implants, but not related with bioactive glasses or autologous bone used. The percentage of bone-implant contact, mineralized bone matrix between implant threads, and mineralized bone matrix within mirror area in the treated or non-treated sites were not statistically different among the 4 experimental groups. These results indicates that the presence of the bone substitutes evaluated here did not interfere with bone formation on Ti implants in sites with intra-bony defects. In addition, tissue response to Biosilicate® was similar to that of Bioglass® 45S5 and autologous bone.

Estudamos a ação das proteases bothropasina e Bothrops protease A, do veneno da serpente Bothrops jararaca, sobre o fibrinogênio (FBG), fibronectina (FN) e cininogênio (HK), como ferramenta para geração de peptídeos bioativos. As sequências primárias dos produtos de digestão foram identificadas por espectrometria de massas, com as buscas direcionadas por peptídeos em comum gerados pelas duas proteases. Foram encontradas oito sequências em comum provenientes do FBG e onze, da FN. Apenas a bothropasina clivou o HK, liberando desArg9BK. Foram sintetizados peptídeos derivados do FBG (FBG1-6) e da FN (FN1-4), além de des-Arg9-BK. Oito peptídeos apresentam potencial atividade antiangiogênica predita in silico. Observamos a inibição da elastase (28-20%) causada por FBG1-2-5-6. A melhor inibição da trombina foi de 17%, por FBG1. Contudo, a maioria dos peptídeos intensificou sua atividade. Por fim, este trabalho sugere que as proteases de veneno de serpentes podem ser usadas como ferramentas para processar componentes do plasma, visando à busca por peptídeos bioativos. / We studied the action of the proteases bothropasin and Bothrops protease A purified from the venom of snake Bothrops jararaca upon fibrinogen (FBG), fibronectin (FN) and kininogen (HK), as a tool to generate bioactive peptides. The primary sequences of the digestion products were identified by mass spectrometry and we focused the search for common peptides released by both proteases simultaneously. Sequences in common released by both proteases were found, being eight peptides from FBG, and 11 from FN. Only bothropasin was able to cleave HK releasing des-Arg9-BK. Peptides from fibrinogen (FBG1-6) and from fibronectin (FN1-4), as well as the des-Arg9-BK were synthetized. Eight peptides have potential antiangiogenic predicted in silico. We observed the inhibition of elastase (28-20%) caused by FBG1-2-5-6. The best inhibition of thrombin was 17% by FBG1. However, most of the peptides intensified its activity. Finally, this work suggests that the snake venom protease can be used as tools to process plasma components in order to search for bioactive peptides.

Orientador: Maria Angela de Almeida Meireles / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-25T04:15:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Debien_IsabelCristinadoNascimento_D.pdf: 14354516 bytes, checksum: 30a73e64c77ed62ec9c96b7c5a8067b0 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: O presente projeto de doutorado foi desenvolvido em duas etapas: (1) Estudo da extração com fluido supercrítico e com líquido pressurizado dos ecdisteróides do Ginseng brasileiro (Pfaffia glomerata) e (2) Estudo do equilíbrio de fases de sistemas complexos. Etapa 1: Espécies do gênero Pfaffia são popularmente conhecidas como substituto do gênero Panax devido a sua morfologia e propriedades bioativas semelhantes. Dentre as espécies do gênero Pfaffia, a Pfaffia glomerata, popularmente conhecida como Ginseng brasileiro, se destaca devido à presença de ecdisteróides. Comercialmente, esse composto é obtido através de métodos convencionais de extração sólido-líquido, onde uma grande quantidade de solvente é utilizada. Atualmente, há um crescente interesse por métodos de extração que agridam menos o meio ambiente, como é o caso da extração com fluido supercrítico (SFE) e com líquido pressurizado (PLE) que possibilitam a extração de compostos bioativos utilizando altas temperaturas e pressões com menor consumo de solvente. Nessa etapa do trabalho os objetivos foram: (a) realizar um estudo preliminar da extração com fluido supercrítico da beta-ecdisona das raízes de Ginseng brasileiro (Pfaffia glomerata). Foram avaliados os efeitos da pressão (20 e 30 MPa) e quantidade de cossolvente utilizada (15, 75 e 90 % de etanol) no comportamento da curva global de extração (OEC) e no teor de beta-ecdisona no extrato. Usando dióxido de carbono (CO2): etanol (EtOH) (85:15, v/v) como solvente a 20 MPa, maiores quantidade de beta-ecdisona foram obtidas em um menor tempo de processo. O aumento da proporção de etanol na mistura (cossolvente) resultou no aumento do rendimento da extração e do teor de beta-ecdisona em relação a quantidade de matéria-prima; (b) realizar um estudo da extração com líquido pressurizado da beta-ecdisona das raízes de Ginseng brasileiro. Foram avaliados os efeitos da temperatura (333 ¿ 393 K), pressão (8 ¿ 30 MPa) e do solvente (EtOH e EtOH : H2O (80:20 v/v)) no rendimento global, atividade antioxidante e teor de beta-ecdisona dos extratos. O aumento da temperatura ocasionou o aumento do rendimento global, chegando a 25 % (base seca). Assim, pode-se concluir que aumentando a temperatura a seletividade do solvente diminui, uma vez que ocorre a coextração de outros compostos além dos ecdisteróides. Extratos com maior atividade antioxidante foram obtidos quando o solvente de extração é a mistura EtOH: H2O (80:20, v/v). Quando o EtOH puro foi usado como solvente uma maior recuperação de beta-ecdisona foi obtida. Cerca de 5 % de beta-ecdisona nos extratos foi obtida usando etanol a 393 K, enquanto a pressão não afetou significativamente. Assim a melhor condição de extração em termos do teor de beta-ecdisona (393 K, 8 MPa e etanol como solvente) foi selecionada para a realização do estudo cinético. Na OEC foi possível observar que na primeira hora de extração aproximadamente 70 % do total do rendimento e 74 % do total de massa de beta-ecdisona foi obtido. O custo de manufatura foi avaliado na condição da cinética, onde foram obtidos maiores teores de beta-ecdisona quanto maior a capacidade do extrator. Os custos de manufatura, tanto em relação a quantidade de extrato quanto em relação a quantidade de beta-ecdisona recuperada no processo de PLE, foram 14 e 8 vezes maiores do que os obtidos no processo de SFE, respectivamente. Etapa 2: Polímeros biodegradáveis tem recebido maior atenção devido ao seu potencial para aplicações na área médica e na indústria de alimentos, dentre eles o poli (L-lactídeo) (PLA) principalmente por causa da sua biocompatibilidade e características sustentáveis. Ao longo dos últimos anos, a síntese de tais biopolímeros pela reação de polimerização utilizando a técnica de abertura do anel aromático catalisada enzimaticamente em fluidos comprimidos tem se mostrado bastante promissora. O objetivo nessa etapa do trabalho foi medir os dados de equilíbrio de fases dos sitemas L-ácido láctico + (propano + etanol) e L-ácido láctico + (CO2 + etanol). Os experimentos foram realizados numa célula de equilíbrio de fases com visualização utilizando o método estático sintético, em temperaturas de 323,15 a 353,15 K e pressões até 25 MPa, mantendo constante a fração mássica de etanol:CO2 (ou propano) de 1:9. Para o sistema L-ácido láctico + (propano + etanol) foram observadas as transições líquido-vapor, líquido-líquido e líquido-líquido-vapor, enquanto que para o sistema L-ácido láctico + (CO2 + etanol) foram observadas somente as transições líquido-líquido. Os resultados mostraram que o sistema L-ácido láctico + (propano + etanol) apresenta transições do tipo UCST (Upper Critical Solution Temperature) e um UCEP (Upper Critical End Point), enquanto o sistema L-ácido láctico + (CO2 + etanol) apresenta um comportamento do tipo LCST (Lower Critical Solution Temperature). Foi realizada a modelagem termodinâmica dos dados experimentais obtidos utilizando a equação de estado de Peng-Robinson com regra de mistura quadrática de van der Waals (PR-vdW2) e com regra de mistura de Wong-Sandler (PR-WS). Os resultados mostraram que os modelos PR-vdW2 e PR-WS foram capazes de representar satisfatoriamente o comportamento de fases do sistema L-ácido láctico + (dióxido de carbono + etanol). Entretanto, para o sistema L-ácido láctico + (propano + etanol), o modelo PR-vdW2 não foi capaz de descrever apropriadamente o seu comportamento / Abstract: The doctoral project is being developed in two steps: (1) Supercritical fluid and pressurized liquid extraction study of Brazilian ginseng (Pfaffia glomerata) ecdysteroids and (2) Phase equilibrium data of complex systems. Step 1: Species of the genus Pfaffia are popularly known as substitute for Panax due their similar morphology and bioactive properties. Among them, Pfaffia glomerata has received special attention due the presence of ecdysteroids. Commercially, this compound is obtained by conventional solid-liquid extraction methods, that is, using large quantities of solvents. Nowadays, more environmentally friend methods are preferred, like supercritical fluid (SFE) and pressurized liquid extraction (PLE) that enables extraction of bioactive compounds under high temperatures and pressures. The aim of this step of work is: (a) preliminary study the supercritical fluid extraction of Brazilian ginseng (Pfaffia glomerata) ecdysteroids. The effects of pressure (20 and 30 MPa) and cosolvent amount (10, 15, 75 and 90 % of Ethanol) on the behavior of overall extraction curve (OEC) and content of beta-ecdysone were studied. The larger amounts of beta-ecdysone were obtained in shorter processing time using CO2: EtOH (85:15, v/v) as extracting solvent at 20 MPa. The higher proportion of EtOH in the mixture leads an increase an extraction yield and an increase a beta-ecdysone content relative a raw material amount. (b) study the pressurized liquid extraction of Brazilian ginseng (Pfaffia glomerata) ecdysteroids. The effects of temperature (333 ¿ 393 K), pressure (8 ¿ 30 MPa) and solvent [ethanol and ethanol:water (80:20 v/v)] on the global yield extraction, antioxidant activity and beta-ecdysone content of the extracts from Brazilian ginseng (Pfaffia glomerata) roots were studied. The extraction global yield increased with the increase in temperature (333 ¿ 393 K) reaching up to 25 % (dry basis). As the temperature increased the selectivity of the extracting solvent decreased promoting the co-extraction of other compounds besides the ecdysteroids. The use of EtOH:H2O (80:20 v/v) as extracting solvent produced extracts with the highest antioxidant activity. The recovery of beta-ecdysone was maximized when EtOH was used, besides fractions containing up to 5 % of beta-ecdysone were obtained using this solvent at 393 K, while pressure did not affect it. Thus the better extraction condition in terms of beta-ecdysone was selected (393 K, 8 MPa and ethanol as extracting solvent) and the kinetic extraction study was realized. From the overall extraction curve obtained it was possible to verify that in the first hour of extraction approximately 70 % of the total yield and 74 % of the total beta-ecdysone mass are obtained. The cost of manufacturing (COM) was evaluated in the kinetic condition in which was obtained the highest beta-ecdysone content; the increase of the extractor capacity significantly decreased the COM. The COMs for the crude extract and beta-ecdysone obtained by this novel process were 14-fold and 8-fold lower than that for the SFE process, respectively. Step 2: Biodegradable polymers has received increased attention due to their potential applications in medicine and food industry, with highlights to poly (L-lactic acid) (PLA) mainly because of its biocompatibility and resorbable features. Over the last years, synthesis of such biopolymer by enzyme-catalyzed ring-opening polymerization of L-lactic acid in compressed fluids has been considered a promising route over. The aim of this step of work is to report phase equilibrium data (cloud points) of L-lactic acid + (propane + ethanol) and L-lactic acid + (carbon dioxide + ethanol). Phase equilibrium experiments were conducted in a variable-volume view cell employing the static synthetic method, from 323.15 K to 353.15 K and pressures up to 25 MPa, keeping constant the mass ratio of ethanol to CO2 or propane at 1:9. For the (propane + ethanol) + L-lactic acid it was observed vapor-liquid, liquid-liquid and vapor-liquid-liquid, while for (carbon dioxide + ethanol) + L-lactic acid only liquid-liquid type transitions were recorded. Results show that the system (propane + ethanol) + L-lactic acid present UCST (Upper Critical Solution Temperature) transition type and an UCEP (Upper Critical End Point), whereas the system (carbon dioxide + ethanol) + L-lactic acid exhibit LCST (Lower Critical Solution Temperature) behavior. The experimental data were modeled using the Peng-Robinson equation of state with the classical van der Waals quadratic mixing rule (PR-vdW2) and with the Wong-Sandler mixing rule (PR-WS). It is shown that the PR-vdW2 and PR-WS models were both able to satisfactorily represent the phase behavior of the system L-lactic acid + (carbon dioxide + ethanol). However, for the system L-lactic acid + (propane + ethanol), the PR-vdW2 model was not able to appropriately describe its phase behavior / Doutorado / Engenharia de Alimentos / Doutora em Engenharia de Alimentos