Submitted by Liliane Ferreira (ljuvencia30@gmail.com) on 2018-09-03T12:02:08Z No. of bitstreams: 2 Tese - Cyro Lucas Silva Chagas - 2018.pdf: 4698038 bytes, checksum: 54bd125cfa8cf11d8672d79de558c77c (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2018-09-04T11:35:55Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Tese - Cyro Lucas Silva Chagas - 2018.pdf: 4698038 bytes, checksum: 54bd125cfa8cf11d8672d79de558c77c (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2018-09-04T11:35:55Z (GMT). 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The methodologies covered in this thesis include: the manufacture of low cost pencil-drawn graphite electrodes on office paper, used in the quantification of inorganic cations (K+ and Na+) in human tears; the manufacture of electrophoresis chips with thermolaminated paper channels with attached graphite electrodes for the monitoring of the electrophoretic separation of biomolecules (albumin and creatinine); and finally, it presents the use of a 3D microfluidic device for the generation of droplets into the microchannel and the manufacturing process of a thermolaminated polyester dispositive for flow injection analysis, both for the analysis of drugs (ascorbic acid and midazolam maleate) in medicines. All analyzes used the same method of capacitively coupled contactless conductivity detection. The proposed graphite electrodes presented excellent analytical performance with good reproducibility. The detection limits found for K+, Na+ and Li+ were 4.9, 6.8 and 9.0 μM, respectively. In addition, the concentration found for K+ and Na+ in the tear samples were, respectively, 20.8 and 101.2 mM for sample A and 20.4 and 111.4 mM for sample B. Experiments using the proposed paper-based microchip have successfully demonstrated the separation of bovine serum albumin and creatinine within 150 s with baseline resolution. The detection limits for albumin and creatinine were 20 and 35 mM, respectively. The quantification of ascorbic acid in a vitamin supplement, through the generation of droplets in the 3D device, was successfully demonstrated with a linear range of 3 to 24 mg/mL and a detection limit of 1.1 mg/mL. The quantification of midazolam maleate in tablets, using a flow injection in the polyester device showed a linear behavior between 0.5 and 4.0 mg/mL and a detection limit of 17 µg/mL. The devices proposed in this thesis allowed the realization of low cost assays with reduced analysis time. In addition, the manufacturing processes demonstrated simplicity and quickness, without the need for sophisticated instrumentation, allowing the use of these devices for applications in clinical analysis and quality control. / O desenvolvimento de dispositivos miniaturizados promoveu uma verdadeira revolução na química analítica moderna. Além disso, o melhoramento das tecnologias de microfabricação possibilitou a criação de dispositivos cada vez menores e mais robustos. Contudo, grande parte destes dispositivos ainda demandam em seu processo de fabricação uma instrumentação sofisticada e de alto custo, necessitando muitas vezes de ambientes controlados ou salas limpas. Tendo em vista a necessidade de se produzir esses dispositivos miniaturizados de uma maneira mais acessível, a presente tese apresenta a fabricação de plataformas e dispositivos microfluídicos alternativos, descartáveis e de baixo custo para aplicações bioanalíticas. As metodologias abordadas nessa tese incluem: a fabricação de eletrodos de grafite de baixo custo desenhados à lápis em papel sulfite, utilizados na quantificação de cátions inorgânicos (K+ e Na+) em lágrima humana; a fabricação de chips de eletroforese com canais de papel termolaminados com eletrodos de grafite de lápis acoplados para o monitoramento da separação eletroforética de biomoléculas (albumina e creatinina); e por fim, apresenta a utilização de um dispositivo microfluídico 3D para a geração de gotas no microcanal e o processo de fabricação de um dispositivo de poliéster termolaminado para análise por injeção em fluxo, ambos para análise de fármacos (ácido ascórbico e maleato de midazolam) em medicamentos. Todas as análises utilizaram o mesmo método de detecção condutométrica sem contato acoplada capacitivamente. Os eletrodos de grafite propostos apresentaram excelente performance analítica com boa reprodutibilidade. Os limites de detecção encontrados para o K+, Na+ e Li+ foram de 4,9, 6,8 e 9,0 µM, respectivamente. Além disso, a concentração encontrada para o K+ e Na+ nas amostras de lágrima foram, respectivamente, de 20,8 e 101,2 mM para a amostra A e 20,4 e 111,4 mM para a amostra B. Os experimentos utilizando o microchip de papel proposto demonstraram com sucesso a separação de albumina de soro bovino e creatinina dentro de 150 s com resolução de linha de base. Os limites de detecção para albumina e creatinina foram 20 e 35 mM, respectivamente. A quantificação de ácido ascórbico em suplemento vitamínico, através da geração de gotas no dispositivo 3D, foi demonstrada com êxito apresentando uma faixa linear entre 3 e 24 mg/mL e limite de detecção igual a 1,1 mg/mL. A quantificação de maleato de midazolam em comprimidos, utilizando injeção em fluxo no dispositivo de poliéster apresentou comportando linear entre 0,5 e 4,0 mg/mL e limite de detecção de 17 µg/mL. Os dispositivos propostos nesta tese possibilitaram a realização de ensaios de baixo custo com tempo de análise reduzido. Além disso, os processos de fabricação demonstraram simplicidade e rapidez, sem a necessidade de instrumentação sofisticada, permitindo a exploração destes dispositivos para aplicações em análises clínicas e de controle de qualidade.

A mistura triterpênica ¤ e ß- amirinas é comumente encontrada em quantidades significativas em espécies do gênero Protium (Burseraceae) e possuem reconhecidas atividades anti-inflamatória, hepatoprotetora, gastroprotetora e analgésica, dentre outras. Entretanto, pouco se sabe sobre sua farmacocinética e metabolismo. Neste sentido, esta tese teve o objetivo de desenvolver metodologias bioanalíticas para determinar a farmacocinética e a eliminação de ? e ?-amirinas isoladas de P. spruceanum bem como avaliar o metabolismo in vitro destes triterpenos. A mistura de ¤ e ß-amirinas foi isolada em grau de pureza cromatográfica acima de 99%. Foi desenvolvida e caracterizada uma nanoemulsão do tipo O/A contendo ¤ e ß-amirinas a fim de viabilizar a administração por vias oral e endovenosa e realizar os estudos de disposição cinética dessas substâncias em camundongos. O tamanho médio das partículas da nanoemulsão foi de 103,5 ± 0,44 nm, com porcentagem de encapsulação de acima de 99%. Os estudos de liberação in vitro mostraram baixa taxa de liberação após 24 horas. A avaliação da disposição cinética de ? e ?-amirinas em camundongos mostrou que após administração oral a suspensão de CMC não foi absorvida, entretanto a nanoemulsão contendo as substancias foi absorvida e a biodisponibilidade oral de ¤ e ß-amirinas foi de 1,03 ± 0,08 e 1,56 ± 0,24%, respectivamente. O Vd foi elevado e a T1/2 foi de 2,61±0,15 e 2,57±0,07 horas, respectivamente. O ClB mostrou-se elevado, comparado ao ClR. Após administração oral da nanoemulsão, praticamente toda a mistura foi eliminada inalterada nas fezes devido a baixa absorção. Entretanto, após administração endovenosa cerca de 50% da mistura foi eliminada inalterada pela via biliar. Estudos de eliminação renal de ¤ e ß-amirinas mostraram que apenas cerca de 0,2% das substâncias foram eliminadas por via renal após administração endovenosa. O fenômeno Flip-Flop ocorreu para a via extravascular utilizada. Os resultados da eliminação parcial e de baixa liberação in vitro sugerem que após administração endovenosa da nanoemulsão pode ocorrer acúmulo extravascular dos compostos, corroborando com altos Vd. As reações biomiméticas de oxidação de ¤ e ß-amirinas mostraram baixa taxa degradação. Apenas um metabólito putativo foi encontrado, entretanto, não foi possível observá-lo nas matrizes biológicas analisadas. / The triterpene mixture of ¤ and ß-amyrins is generally found in significative amounts in Protium species (Burseraceae). They have known biological activities as anti-inflammatory, hepatoprotective, gastroprotective and antinociceptive effects among others. However, their pharmacokinetics and metabolism are practically unknown. The purpose of this thesis was to develop bioanalytical methodologies to perform pharmacokinetic and elimination studies of ¤ and ß-amyrins from P. spruceanum as well as to evaluate in vitro metabolism of these triterpenes. The mixture ¤ and ß-amyrins was isolated with chromatography purity above 99%. One ¤ and ß-amyrins loaded O/W nanoemulsion was developed and characterized to enable the intravenous and oral administration and to performed pharmacokinetic studies of these compounds in mice. The average particle size was 103.5 ± 0.44 nm and the encapsulation efficiency was higher than 99%. In vitro release study demonstrated low release rater after 24 hours. The pharmacokinetics studies of ? and ?-amyrins indicated CMC suspension was not absorbed, however ¤ and ß-amyrins loaded O/W nanoemulsion was poorly absorved and bioavailability was 1.03 ± 0.08 and 1.56 ± 0.24% respectively. The Vd was high and T1/2 was 2.61 ± 0.15 e 2.57± 0.07 hours respectively. The ClB was high compared to ClR. After oral administration almost all ¤ and ß-amyrins were eliminated unchanged in faeces due to low absorption. However, after intravenous administration about 50% was excluded unchanged by biliar excretion pathway. Studies of ¤ and ß-amyrins renal elimination directed only 0.2 % were removed unchanged by renal pathway after intravenous administration. The Flip-Flop phenomenon was happen when ¤ and ß- amyrins was dispensed by extravascular via. The partial biliar excretion in vivo and low release rate in vitro suggests ¤ and ß-amyrins could be stored after nanoemulsion intravenous administration confirming high Vd. The biomimetic reactions of oxidation of ¤ and ß-amyrins showed low degradation rate and only one metabolite was found however it was not detected in biological samples.

O gênero Piper pertencente à família Piperaceae, encontra-se distribuído nas regiões tropicais e subtropicais do globo. Estudos químicos têm demonstrado diversidade de metabólitos secundários com atividade biológica. Os alcalóides são metabólitos característicos. A piplartina, (E)-1-(3-(3,4,5-trimetoxifenil)acriloil)-5,6- diidropiridin-2(1H)-ona, é um alcalóide encontrado em muitas espécies. Tem atividade citotóxica contra células de linhagem tumoral, ansiolítica, antidepressiva, antifúngica e antiagregação plaquetária, sendo dessa forma, uma molécula candidata a um novo fármaco. O conhecimento do metabolismo de um candidato a fármaco é um fator importante na avaliação da sua segurança e eficácia. Ensaios in vitro estão crescentemente sendo utilizados como screening e os microssomas hepáticos representam o sistema in vitro mais utilizado. Dessa forma, o presente trabalho tem como objetivo determinar os parâmetros cinéticos enzimáticos in vitro da piplartina utilizando microssomas de fígado de ratos, bem como a determinação dos possíveis metabólitos formados. Para tanto, foi desenvolvido um método de quantificação da piplartina utilizando cromatografia líquida de alta eficiência. Como condição de análise, empregou-se uma coluna C18, fase móvel acetonitrila:água (40:60, v/v) e vazão de 1 mL min-1. Para extração da piplartina dos microssomas hepático de ratos foi empregado a extração líquido-líquido utilizando 4,0 mL de hexano como solvente extrator. Após otimização da extração, o método foi validado, mostrando-se linear na faixa de 2,4-157,7 ?M, obtendo-se uma equação da reta y= 0,0934x + 0,0027, (r= 0,99) e limite de quantificação de 2,4 ?M. A recuperação média foi de 85%. A precisão e exatidão apresentaram resultados dentro do recomendável pela ANVISA. A piplartina manteve-se estável até 50 minutos em condições de incubação, e até 6h sob a bancada. Após validação da metodologia, estabeleceram-se as condições lineares para a quantidade de proteínas microssomais: 0,28 mg mL-1 e para o tempo de incubação: 16 minutos no consumo da piplartina no meio microssomal, e então efetuou-se a determinação dos parâmetros cinéticos enzimáticos da piplartina empregando as condições de V0. Nesse estudo foi observado um Vmax= 4,74 ± 0,26 ?M/?g mL-1/min, h= 2,53 ± 0,37, S50= 44,69 ± 0,32 ?M e CLmax= 0,054 ?L/min/mg proteina, um perfil cinético indicativo de cooperatividade. Um estudo qualitativo para determinação dos possíveis metabólitos foi feito utilizando-se a espectrometria de massas, por meio da qual foi possível identificar a formação de dois produtos hidroxilados. Deste modo, os microssomas mostraram-se uma ferramenta útil, rápida e simples para determinação da cinética enzimática, e na condução dos estudos preliminares de metabolismo in vitro. / The genus Piper belongs to the Piperaceae family and includes species that are widely distributed throughout the tropical and subtropical regions of the world. Chemical studies have shown diversity of secondary metabolites with biological activity. The alkaloids are characteristic metabolites. The piplartine, (E)-1-(3-(3,4,5- trimethoxyphenyl)acryloyl)-5,6-diidropiridin-2(1H)-one is an alkaloid found in many species. It shows cytotoxic activity against tumor cell lines, anxiolytic, antidepressant, antifungal, and antiplatelet therapy, thus being a drug candidate. The knowledge regarding the oxidative metabolism is an important tool in assessing the safety and efficacy of a drug candidate. In vitro assays are increasingly being used as a screening tool and liver microsomes represent the most widely in vitro system used for that. This study aims to determine the in vitro enzymatic kinetic parameters for piplartine by cytochrome P450 enzymes (CYP) present in the rat liver microsomes, and the determination of possible metabolites. To accomplish, it was developed a method to quantify the piplartine using high performance liquid chromatography. The analysis was carried out employing a C18 column, mobile phase: acetonitrile: water (40:60, v/v) at a flow rate of 1 ml min-1. To extract piplartine from rat liver microsomes it was employed the liquid-liquid extraction (4.0 mL of hexane). The method was validated and proved to be linear in the range of 2.4 to 157.7 ?M, the equation for calibration curve was: y= 0.0934x + 0.0027 (r = 0.99), and a limit of quantification of 2.4 ?M. The mean recovery was 85%. The precision and accuracy were in agreement with ANVISA guidelines. The piplartine remained stable until 50 minutes of incubation conditions, and until 6 hours under the bench. Once validated, it was set the conditions for the linear amount of microsomal protein: 0.28 mg mL-1 and to the incubation time: 16 minutes, then it was performed the determination of enzymatic kinetic parameters, that revealed a sigmoidal profile with Vmax = 4.74 ± 0.26 ?M/mg mL-1/min, h = 2.53 ± 0.37, S50 = 44.69 ± 0.32 ?M, and CLmax = 0.054 ?L/min/mg protein, indicating a cooperativity behavior. A qualitative study to determine possible metabolites carried out using mass spectrometry, through which it was possible to identify the formation of two hydroxylated products. To conclude, the microsomes showed to be a useful, fast and simple tool to determination of enzymatic kinetics and in vitro metabolism studies.

Food contact materials are materials that are intended to come into contact with food, and we are exposed to different types of chemicals that exist in the packages on a daily basis. In this study, a battery of effect‑based in vitro cellular bioassays was used to evaluate the presence of bioactive compounds in commonly used food contact materials made of paper and cardboard, retrieved from the Swedish market. Sample extracts were tested at concentrations 0.3, 1, 3 and 10 mg food contact material/mL cell culture medium. The use of effect-based bioassays allowed for screening of multiple health-relevant endpoints in a non-targeted approach. Hence, taking unknown substances and mixtures into consideration when addressing potential toxicity of the materials. In essence, detection of bioactivity could be considered as moderate to high in assays of positive effects. Antiandrogenic and antiestrogenic effects were found in 72% of the samples, followed by 47% bioactivity in the Nrf2 assay. No androgenic effect was detected. Usage of effect-based bioassays allows for high sensitivity and low detection limits, and these can be used as a first approach to evaluate package materials to ensure the safety of consumers. / Livsmedelsförpackningar är material som är avsedda att komma i kontakt med livsmedel. Vi exponeras för olika typer av kemikalier som existerar i dessa förpackningar varje dag. I denna studie användes ett batteri av effektbaserade in vitro bioanalytiska metoder för att undersöka förekomst av bioaktiva ämnen i vanligen använda livsmedelsförpackningar tillverkade av papper och kartong, insamlade från den svenska marknaden. Provextrakten testades i koncentrationerna 0.3, 1, 3 och 10 mg livsmedelsförpackning/mL cellmedium. Att använda effektbaserade bioanalyser möjliggör undersökning av flertalet hälsorelevanta effekter genom en icke-riktad strategi. På så sätt tas okända substanser och komplexa blandningar i beaktande. Andelen bioaktiva prover kan anses måttlig till hög för positiva analyser. Antiandrogena och antiöstrogena effekter detekterades i 72% av proverna, följt av 47% bioaktivitet i Nrf2 analysen. Ingen agonistisk androgen effekt observerades. Att använda effektbaserade bioanalyser möjliggör hög sensitivitet och detektion vid låga koncentrationer, därför kan dessa användas som ett första steg för att evaluera förpackningsmaterial för att säkra konsumenternas hälsa.

Tesis por compendio / [ES] La medicina actual se dirige hacia un enfoque más personalizado basándose en el diagnóstico molecular del paciente a través del estudio de biomarcadores específicos. Aplicando este principio molecular, el diagnóstico, pronóstico y selección de la terapia se apoyan en la identificación de variaciones específicas del genoma humano, como variaciones de un único nucleótido (SNV). Para detectar estos biomarcadores se dispone de una amplia oferta de tecnologías. Sin embargo, muchos de los métodos en uso presentan limitaciones como un elevado coste, complejidad, tiempos de análisis largos o requieren de personal y equipamiento especializado, lo que imposibilita su incorporación masiva en la mayoría de los sistemas sanitarios. Por tanto, existe la necesidad de investigar y desarrollar soluciones analíticas que aporten información sobre las variantes genéticas y que se puedan implementar en diferentes escenarios del ámbito de la salud con prestaciones competitivas y económicamente viables. El objetivo principal de esta tesis ha sido desarrollar estrategias innovadoras para resolver el reto de la detección múltiple de variantes genéticas que se encuentran en forma minoritaria en muestras biológicas de pacientes, cubriendo las demandas asociadas al entorno clínico. Las tareas de investigación se centraron en la combinación de reacciones de discriminación alélica con amplificación selectiva de DNA y el desarrollo de sistemas ópticos de detección versátiles. Con el fin de atender el amplio abanico de necesidades, en el primer capítulo, se presentan resultados que mejoran las prestaciones analíticas de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) mediante la incorporación de una etapa al termociclado y de un agente bloqueante amplificando selectivamente las variantes minoritarias que fueron monitorizadas mediante fluorescencia a tiempo real. En el segundo capítulo, se logró la discriminación alélica combinando la ligación de oligonucleótidos con la amplificación de la recombinasa polimerasa (RPA), que al operar a temperatura constante permitió una detección tipo point-of-care (POC). La identificación de SNV se llevó a cabo mediante hibridación en formato micromatriz, utilizando la tecnología Blu-Ray como plataforma de ensayo y detección. En el tercer capítulo, se integró la RPA con la reacción de hibridación alelo especifica en cadena (AS-HCR), en formato array para genotipar SNV a partir de DNA genómico en un chip. La lectura de los resultados se realizó mediante un smartphone. En el último capítulo, se presenta la síntesis de un nuevo reactivo bioluminiscente que se aplicó a la monitorización de biomarcadores de DNA a tiempo real y final de la RPA basada en la transferencia de energía de resonancia de bioluminiscencia (BRET), eliminando la necesidad de una fuente de excitación. Todas las estrategias permitieron un reconocimiento especifico de la variante de interés, incluso en muestras que contenían tan solo 20 copias de DNA genómico diana. Se consiguieron resultados sensibles (límite de detección 0.5% variante/total), reproducibles (desviación estándar relativa < 19%), de manera sencilla (3 etapas o menos), rápida (tiempos cortos de 30-200 min) y permitiendo el análisis simultaneo de varios genes. Como prueba de concepto, estas estrategias se aplicaron a la detección e identificación en muestras clínicas de biomarcadores asociados a cáncer colorrectal y enfermedades cardiológicas. Los resultados se validaron por comparación con los métodos de referencia NGS y PCR, comprobándose que se mejoraban los requerimientos técnicos y la relación coste-eficacia. En conclusión, las investigaciones llevadas a cabo posibilitaron desarrollar herramientas de genotipado con propiedades analíticas competitivas y versátiles, aplicables a diferentes escenarios sanitarios, desde hospitales a entornos con pocos recursos. Estos resultados son prometedores al dar respuesta a la demanda de tecnologías alternativas para el diagnóstico molecular personalizado. / [CA] La medicina actual es dirigeix cap a un enfocament més personalitzat basant-se en el diagnòstic molecular del pacient a través de l'estudi de biomarcadors específics. Aplicant aquest principi molecular, el diagnòstic, pronòstic i selecció de la teràpia es recolzen en la identificació de variacions específiques del genoma humà, com variacions d'un únic nucleòtid (SNV). Per a detectar aquests biomarcadors, es disposa d'una àmplia oferta de tecnologies. No obstant això, molts dels mètodes en ús presenten limitacions com un elevat cost, complexitat, temps d'anàlisis llargues o requereixen de personal i equipament especialitzat, la qual cosa impossibilita la seua incorporació massiva en la majoria dels sistemes sanitaris. Per tant, existeix la necessitat d'investigar i desenvolupar solucions analítiques que aporten informació sobre les variants genètiques i que es puguen implementar en diferents escenaris de l'àmbit de la salut amb prestacions competitives i econòmicament viables. L'objectiu principal d'aquesta tesi ha sigut desenvolupar estratègies innovadores per a resoldre el repte de la detecció múltiple de variants genètiques que es troben en forma minoritària en mostres biològiques de pacients, cobrint les demandes associades a l'entorn clínic. Les tasques d'investigació es van centrar en la combinació de reaccions de discriminació al·lèlica amb amplificació selectiva de DNA i al desenvolupament de sistemes òptics de detecció versàtils. Amb la finalitat d'atendre l'ampli ventall de necessitats, en el primer capítol, es presenten resultats que milloren les prestacions analítiques de la reacció en cadena de la polimerasa (PCR) mitjançant la incorporació d'una etapa al termociclat i d'un agent bloquejant amplificant selectivament les variants minoritàries que van ser monitoritzades mitjançant fluorescència a temps real. En el segon capítol, es va aconseguir la discriminació al·lèlica combinant el lligament d'oligonucleòtids amb l'amplificació de la recombinasa polimerasa (RPA), que en operar a temperatura constant va permetre una detecció tipus point-of-care (POC). La identificació de SNV es va dur a terme mitjançant hibridació en format micromatriu, utilitzant la tecnologia Blu-Ray com a plataforma d'assaig i detecció. En el tercer capítol, es va integrar la RPA amb la reacció d'hibridació al·lel específica en cadena (AS-HCR), en format matriu per a genotipar SNV a partir de DNA genòmic en un xip. La lectura dels resultats es va realitzar mitjançant un telèfon intel·ligent. En l'últim capítol, es presenta la síntesi d'un nou reactiu bioluminescent que es va aplicar al monitoratge de biomarcadors de DNA a temps real i final de la RPA basada en la transferència d'energia de ressonància de bioluminescència (BRET), eliminant la necessitat d'una font d'excitació. Totes les estratègies van permetre un reconeixement específic de la variant d'interès, fins i tot en mostres que només contenien 20 còpies de DNA genòmic diana. Es van aconseguir resultats sensibles (límit de detecció 0.5% variant/total), reproduïbles (desviació estàndard relativa < 19%), de manera senzilla (3 etapes o menys), ràpida (temps curts de 30-200 min) i permetent l'anàlisi simultània de diversos gens. Com a prova de concepte, aquestes estratègies es van aplicar a la detecció i identificació en mostres clíniques de biomarcadors associats a càncer colorectal i a malalties cardiològiques. Els resultats es van validar per comparació amb els mètodes de referència NGS i PCR, comprovant-se que es milloraven els requeriments tècnics i la relació cost-eficàcia. En conclusió, les investigacions dutes a terme van possibilitar desenvolupar eines de genotipat amb propietats analítiques competitives i versàtils, aplicables a diferents escenaris sanitaris, des d'hospitals a entorns amb pocs recursos. Aquests resultats són prometedors en donar resposta a la demanda de tecnologies alternatives per al diagnòstic molecular personalitzat. / [EN] Current medicine is moving towards a more personalized approach based on the patients' molecular diagnosis through the study of specific biomarkers. Diagnosis, prognosis and therapy selection, applying this molecular principle, rely on identifying specific variations in the human genome, such as single nucleotide variations (SNV). A wide range of technologies is available to detect these biomarkers. However, many of the employed methods have limitations such as high cost, complexity, long analysis times, or requiring specialized personnel and equipment, making their massive incorporation in most healthcare systems impossible. Therefore, there is a need to research and develop analytical solutions that provide information on genetic variants that can be implemented in different health scenarios with competitive and economically feasible performances. The main objective of this thesis has been to develop innovative strategies to solve the challenge of multiple detection of genetic variants that are found in a minority amount in patient samples, covering the demands associated with the clinical setting. Research tasks focused on the combination of allelic discrimination reactions with selective DNA amplification and the development of versatile optical detection systems. In order to meet the wide range of needs, in the first chapter, the analytical performances of the polymerase chain reaction (PCR) were improved by incorporating a thermocycling step and a blocking agent to amplify selectively minority variants that were monitored by real-time fluorescence. In the second chapter, allelic discrimination was achieved by combining oligonucleotide ligation with recombinase polymerase amplification (RPA), which operates at a constant temperature, allowing point-of-care (POC) detection. SNV identification was carried out by hybridization in microarray format, using Blu-Ray technology as the assay platform and detector. RPA was integrated with allele-specific hybridization chain reaction (AS-HCR), in an array format to genotype SNV from genomic DNA on a chip in the third chapter. The reading of the results was performed using a smartphone. In the last chapter, a new bioluminescent reagent was synthesized. It was applied to real-time and endpoint DNA biomarker monitoring based on bioluminescence resonance energy transfer (BRET), eliminating the need for an excitation source. All the strategies allowed specific recognition of the target variant, even in samples containing as few as 20 copies of target genomic DNA. Sensitive (limit of detection 0.5% variant/total), reproducible (relative standard deviation < 19%), simple (3 steps or less), fast (short times of 30-200 min) results were achieved, allowing simultaneous analysis of several genes. As proof of concept, these strategies were applied to detect and identify biomarkers associated with colorectal cancer and cardiological diseases in clinical samples. The results were validated by comparison with reference methods such as NGS and PCR, proving that the technical requirements and cost-effectiveness were improved. In conclusion, the developed research made it possible to develop genotyping tools with competitive analytical properties and versatile, applicable to different healthcare scenarios, from hospitals to limited-resource environments. These results are promising since they respond to the demand for alternative technologies for personalized molecular diagnostics. / The authors acknowledge the financial support received from the Generalitat Valenciana PROMETEO/2020/094, GRISOLIA/2014/024 PhD Grant and GVA-FPI-2017 PhD grant, the Spanish Ministry of Economy and Competitiveness MINECO projects CTQ2016-75749-R and PID2019-110713RB-I00 and European Regional Development Fund (ERDF). / Lázaro Zaragozá, A. (2022). Study of Strategies for Genetic Variant Discrimination and Detection by Optosensing [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/185216 / TESIS / Compendio

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Microbial natural products have been a source for new drugs for many decades and are unrivaled in their capacity to generate not only future therapeutic agents, but also providing key agents for agricultural and industrial use. LC-MS/MS based metabolomic tools and technologies have been developed that can rapidly dereplicate nonribosomal peptides and statistically identify related congeners in an automated nontargeted process from complex natural product extracts with nanogram sensitivity. This data-base search approach is designed to handle linear, cyclic and cyclic-branched nonribosomal peptides from proteinogenic and nonproteinogenic amino acids without genomic data or traditional bioactivity directed fractionation. Chemometric work-flows combined with a comprehensive metabolomic guided discovery strategy were used to profile the chemical space of a diverse collection of understudied fungal endophytes from fruiting plants. This approach allowed for the prioritization of unique isolates and for the focused discovery, isolation and characterization of distinct outlier metabolites by LC-SPE, 1D and 2D NMR, HRMS and single crystal X-ray analysis. These metabolomic tools and strategies have led to the discovery and characterization of 35 new and over 40 known natural products, many of which are biologically active. This thesis with enabling metabolomic tools and novel discoveries has demonstrated the utility of these analytical methodologies as an effective strategy for the untargeted discovery of new natural products from bacteria and endophytic fungi. / Thesis / Doctor of Philosophy (PhD)

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