Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Os enterococos estão amplamente distribuídos no ambiente. Nos seres humanos, compõem a microbiota do trato gastrintestinal, da cavidade oral e do trato geniturinário. Nas últimas décadas, esses microrganismos se tornaram importantes agentes etiológicos de infecções hospitalares. Uma característica marcante desses microrganismos é a resistência intrínseca a vários antimicrobianos utilizados habitualmente no tratamento de infecções, além de alguns fatores que tem sido relacionado à virulência de enterococos. Este estudo investigou a presença de enterococos em amostras de infecção e colonização de pacientes hospitalizados, profissionais de saúde, dietas hospitalares e manipuladores de alimentos. Foram analisadas 276 amostras de colonização, de quadros de infecção, dietas orais e manipuladores de alimento. Não foram recuperadas amostras dos profissionais de saúde. Todas as amostras foram submetidas a testes convencionais de caracterização do gênero e espécies. Testes de susceptibilidade aos antimicrobianos foram empregados pelo método de disco difusão, além da CIM para vancomicina e teicoplanina. A produção de biofilme e a expressão da gelatinase também foram avaliadas. Os genes de resistência a gentamicina, estreptomicina e vancomicina e os genes de virulência cylA, esp e fsr foram pesquisados pela técnica de PCR. O polimorfismo genético foi determinado por PFGE. A espécie E. faecalis foi a prevalente nas amostras isoladas de colonização e infecção (42,2% e 81,9%, respectivamente). E. casseliflavus (58,9%) foi a mais freqüente dentre as amostras das dietas hospitalares e E. faecium (46,7%) de manipuladores. Dentre as amostras de colonização as maiores taxas de resistência foram observadas para eritromicina (76,3%) e ciprofloxacina (53,9%). Dentre as amostras de infecção, >70% foram resistentes a eritromicina, ciprofloxacina e tetraciclina. Resistência a níveis elevados de gentamcina (HLR-GE) e estreptomicina (HLR-ST) foi detectada em 24,6% e 20,4% das amostras, respectivamente, e todas foram portadoras dos respectivos genes. A maioria das amostras de colonização (52,6%) e infecção (55,7%) foram multirresistentes. A taxa para resistência a níveis elevados de vancomicina foi de 5,2% e todas eram portadoras do gene vanA. Em relação a formação de biofilme, 70,2% foram produtoras, com uma maior freqüência dentre as de infecção. A expressão de gelatinase foi detectada em 28,9% e 44,3% das amostras de colonização e infecção, respectivamente. Nenhuma das amostras isoladas das dietas hospitalares e de manipuladores expressou gelatinase. Nas amostras pertencentes as espécies E. faecalis e E. faecium (n=109) 16,5%, 51,4% e 48,6% apresentaram produtos de amplificação referentes aos genes cylA, esp e fsr, respectivamente. A análise do polimorfismo genético revelou uma extensa diversidade dentre as amostras pertencentes as espécies E. faecalis e E. faecium, não acarretando um perfil eletroforético prevalente. Entretanto, foi observado um perfil único dentre as amostras de E. gallinarum resistentes a vancomicina (vanA). Este estudo mostrou que amostras de enterococos isoladas de diferentes fontes, não só de quadros infecciosos, podem representar um risco para a população, apontando para uma maior reflexão quanto ao papel desses microrganismos nas infecções humanas, particularmente no ambiente hospitalar. / Enterococci are widespread in the nature. In humans, as in the other animals, gastrointestinal tract, the oral cavity and the genitourinary tract. In recent decades, these microorganisms have emerged as one important of the most pathogen associated with nosocomial infections. They shows intrinsic resistance to several antimicrobial commonly used for treatment of the infections. Several potential virulence factors have been identified in enterococci, but none has been established as having a major contribution to virulence in humans, as well as some factors that has been linked to the virulence of enterococci. We analyzed 276 isolates obtained from colonization, infection, hospital diets and food handlers. The isolates were identified by conventional physiological tests for characterization at genus and species level. Antimicrobial susceptibilities were determined by the disk diffusion test method. CIM to vancomycin and teicoplanin were avayable by E-test. The biofilm production and the expression of gelatinase were also evaluated. The genes for resistance to gentamicin, vancomycin, streptomycin resistance genes as code as determinants virulence cylA, esp and fsr were investigated by PCR. The genetic polymorphism was determined by PFGE. E. faecalis was prevalent species recovered from colonization and infection (42.2% and 81.9%, respectively). E. casseliflavus (58.9%) was frequent species among the hospital diets samples. On the other hand, E. faecium (46.7%) was prevalent in food handlers. Among the colonization isolates the highest rates of resistance were observed to erythromycin (76.3%) and ciprofloxacin (53.9%). Although, >70% of infection isolates were resistant to erythromycin, tetracycline and ciprofloxacin. High level resistance to gentamicin (HLR-GE) and streptomycin (HLR-ST) were detected in 24.6% and 20.4% of the samples, respectively, and these isolates harboured the genes aac(6)-Ie-aph(2)-Ia and aph(2)-Ic. Most strains of colonization (52.6%) and infection (55.7%) were multidrug resistant. High level resistance to vancomycin were detected in 5.2% of isolates harbouring vanA gene. 70.2% of the isolates were biofilm producers, were greater frequency among of infection. The expression of gelatinase was detected in 28.9% and 44.3% of colonization and infection isolates, respectively. None of the isolates recovered from the hospital diets and food handlers expressed gelatinase. In E. faecalis and E. faecium strains (n = 109) 16.5%, 51.4% and 48.6% showed amplification products related cylA, esp and fsr genes, respectively. The analysis of genetic polymorphism showed a wide diversity among the isolates belonging to the E. faecalis and E. faecium species. None prevalent profile was observed. The E. gallinarum vanc1/vanA isolates showed identical PFGE profiles. This study showed that enterococci strains isolated from diferents sources, also represents a potential risk for population, particularly those in hospital environment.

Submitted by LUCAS EDUARDO PILON null (lucaseduardopilon@yahoo.com.br) on 2016-03-07T12:00:11Z No. of bitstreams: 1 Tese Lucas Eduardo Pilon.pdf: 1670960 bytes, checksum: 4da72578d702faee29a2735a07314cd0 (MD5) / Approved for entry into archive by Sandra Manzano de Almeida (smanzano@marilia.unesp.br) on 2016-03-07T13:38:08Z (GMT) No. of bitstreams: 1 pilon_le_dr_jabo.pdf: 1670960 bytes, checksum: 4da72578d702faee29a2735a07314cd0 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-03-07T13:38:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 pilon_le_dr_jabo.pdf: 1670960 bytes, checksum: 4da72578d702faee29a2735a07314cd0 (MD5) Previous issue date: 2016-02-05 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / A mastite em ovelhas de dupla aptidão é reconhecida por afetar a qualidade do leite. Staphylococcus coagulase-negativos (SCN) são os principais micro-organismos responsáveis pela doença, e o tratamento ao final da lactação, pode contribuir para a cura e prevenção de casos subclínicos na lactação consecutiva. Entretanto, fatores de virulência e mecanismos de resistência apresentados por SCN podem reduzir as taxas de cura. Os objetivos deste trabalho foram identificar no leite de ovelhas tratadas e não tratadas à secagem com antimicrobianos, as espécies de SCN antes e após o tratamento e identificar nesses micro-organismos a presença dos genes mecA, icaA, icaC, icaD, bap, bhp, sea, seb, sec, sed e tsst-1, determinar o perfil clonal das principais espécies identificadas e relacionar os casos de cura após o tratamento com a presença/ausência dos respectivos genes. Sessenta ovelhas foram divididas em três grupos experimentais: G1, controle, metades mamárias que não receberam antimicrobiano; G2, metades mamárias em que foram administrados 10 mL de cloxacilina-benzatina 100 mg via intramamária / estrutura convencional; G3, metades mamárias em que foram administrados 86 mL de cloxacilina-benzatina 50 mg via intramamária / estrutura nanoencapsulada. As amostras de leite foram coletadas à secagem e aos 15 e 30 dias pós-parto da lactação seguinte. As análises para identificação das espécies de SCN foram realizadas por meio de testes bioquímicos e Internal Transcribe Spacer (ITS-PCR), e a pesquisa dos genes responsáveis pelos fatores de virulência e pela resistência à oxacilina foram realizados por meio da técnica de reação em cadeia de polimerase (PCR). Dentre as espécies identificadas S. warneri prevaleceram nos três grupos experimentais. Nenhuma amostra foi positiva para o gene mecA. O único gene relacionado com a produção de enterotoxinas encontrado foi o sec. Dentre os genes relacionados com a produção de biofilme, icaD foi o único identificado nos três grupos experimentais. Staphylococcus warneri, S. simulans e S. epidermidis apresentaram clones na mesma metade mamária no pré e pós-parto das ovelhas. A cloxacilina benzatina nanoparticulada 50mg / 86 mL foi eficiente para reduzir a mastite subclínica no pós-parto de ovelhas (P= 0,0192). Staphylococcus warneri, S. simulans, S. epidermidis e S. xylosus foram as espécies de maior ocorrência. Os genes icaA, icaC, icaD e bap foram encontrados no momento da desmama e no pós-parto, os genes sec e icaD estão associados à ausência de cura da mastite subclínica no pós-parto. Ovelhas em que foram isolados SCN portadores de genes responsáveis pela formação de biofilme não apresentaram resultados satisfatórios quando submetidas a esquemas de controle e ao tratamento da mastite subclínica. Os genes sec e icaD, estão associadas à ausência de cura microbiológica da mastite subclínica no pós-parto. Staphylococcus epidermidis e S. xylosus portador do gene bap estão associados à reinfecção. / Mastitis in dual-purpose sheep is recognized to affect their milk quality. Coagulase-negative Staphylococcus (CNS) is the main microorganism responsible for this disease and treatment at the end of lactation may contribute towards curing it and preventing subclinical cases during the consecutive lactation. However, virulence factors and resistance mechanisms presented by CNS may reduce the cure rates. The aims of this study were to identify CNS species in sheep’s milk with and without treatment with antimicrobials at the time of drying off and, in these microorganisms, to identify presence of the genes mecA, icaA, icaC, icaD, bap, bhp, sea, seb, sec, sed and tsst-1, determine clonal profile of the main species identified and correlate the cases of cure after treatment with the presence or absence of the respective genes. Sixty sheep were divided into three experimental groups: G1 (control), mammary glands that did not receive antimicrobials; G2, mammary glands to which 10 mL of cloxacillin-benzathine (100 mg) was administered via the intramammary route in a conventional structure; and G3, mammary glands to which 86 mL of cloxacillin-benzathine (50 mg) was administered via the intramammary route in a nanoencapsulated structure. Milk samples were collected at the time of drying off and 15 and 30 days after lambing in the next lactation. The analyses to identify the CNS species were performed by means of biochemical tests and internal transcribe spacer polymerase chain reaction (ITS-PCR), and the genes responsible for the virulence factors and resistance to oxacillin were investigated by means of the PCR technique. Among the species identified, Staphylococcus warneri was most prevalent in the three experimental groups. None of the samples were positive for the gene mecA. The only gene relating to production of enterotoxins that was found was sec. Among the genes relating to biofilm production, icaD was the only one identified in the three experimental groups. Staphylococcus warneri, S. simulans and S. epidermidis presented clones in the same mammary gland before and after lambing. The dose of 86 mL of nanoparticulate cloxacillin-benzathine (50 mg) was efficient for reducing subclinical mastitis after lambing (P = 0.0192). Staphylococcus warneri, S. simulans, S. epidermidis and S. xylosus were the species that occurred most frequently. The genes icaA, icaC, icaD and bap were found at the time of weaning and in the postpartum period. The genes sec and icaD were correlated with absence of cure for subclinical mastitis after lambing. Sheep in which CNS carrying genes responsible for biofilm formation was isolated did not present satisfactory results when they were subjected to regimens for controlling and treating subclinical mastitis. The genes sec and icaD were correlated with absence of microbiological control over subclinical mastitis after lambing. Staphylococcus epidermidis and S. xylosus carrying the gene bap were correlated with reinfection. / FAPESP: 2012/23044-0

Submitted by THAÍSA ZANETONI MARTINS null (thaisa_martins00@hotmail.com) on 2016-05-02T21:00:40Z No. of bitstreams: 1 Dissertação completa e corrigida em pdf.pdf: 3120972 bytes, checksum: 2a88d2765e9af6b31401eaf64047de8a (MD5) / Approved for entry into archive by Felipe Augusto Arakaki (arakaki@reitoria.unesp.br) on 2016-05-04T19:30:40Z (GMT) No. of bitstreams: 1 martins_tz_me_jabo.pdf: 3120972 bytes, checksum: 2a88d2765e9af6b31401eaf64047de8a (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-04T19:30:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 martins_tz_me_jabo.pdf: 3120972 bytes, checksum: 2a88d2765e9af6b31401eaf64047de8a (MD5) Previous issue date: 2016-04-04 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / O cancro cítrico tem como agente causal a bactéria Xanthomonas citri subsp. citri (Xac), que afeta diferentes espécies de citros economicamente importantes. É uma doença ainda sem método curativo, e pela sua relevância e dano econômico, faz-se necessário o entendimento em termos moleculares da interação Xac-citros para o desenvolvimento de estratégias que controlem a doença. O objetivo do presente trabalho foi investigar os efeitos da deleção da ORF XAC0024 presente no genoma da Xac isolado 306, que codifica uma proteína hipotética conservada e que apresenta vários domínios putativos, entre eles o domínio peptidase M23. A hipótese é que esta proteína pode estar envolvida com a patogenicidade e/ou virulência da bactéria. Para obter o mutante ΔXAC0024 foi utilizada a técnica de mutagênese sítio-dirigida, seguida de recombinação homóloga com o vetor suicida pOK1. O mutante ΔXAC0024 foi analisado em relação às características de patogenicidade, crescimento in vivo e in vitro, capacidade de autoagregação, produção de biofilme e produção de goma xantana. O teste de patogenicidade e a curva de crescimento in vivo foram realizados em limão cravo utilizando o método de infiltração por seringa para a inoculação da bactéria. Os sintomas do desenvolvimento da doença foram registrados por fotografia digital até o 25º dia após a inoculação (dai) e a curva de crescimento in vivo também foi determinada até o 25º dai. A curva de crescimento in vitro e a agregação célula-a-célula foram analisadas em meio de cultura líquido NB. O ensaio de produção de biofilme foi feito em meio de cultura líquido XVM2 em superfície abiótica empregando cristal violeta para sua visualização e espectrofotometria para sua quantificação. A extração da goma xantana foi realizada por meio da precipitação com isopropanol após dissolução de KCl em meio goma com as bactérias multiplicadas em 96 horas. Verificou-se que o mutante ΔXAC0024 foi menos virulento em relação à Xac selvagem e que o seu desenvolvimento in planta é limitado; porém, em meio nutritivo NB apresenta crescimento similar à Xac selvagem. O mutante ΔXAC0024 apresentou ainda maior formação de goma xantana, diminuição na capacidade de se autoagregar e inalterabilidade na formação de biofilme em relação à Xac selvagem. Essa é a primeira evidência de que a ORF XAC0024 interfere na virulência da bactéria, afeta a produção de goma xantana e a agregação celular de Xac 306. A hipótese é de que a proteína codificada pela ORF XAC0024 participe do sistema de degradação do peptideoglicano na divisão celular em Xac, sendo que experimentos adicionais são necessários para confirmar esta hipótese. / The bacteria Xanthomonas citri subsp. citri (Xac) is the causal agent of citrus canker, a disease that affects different species of economically important citrus. There is no a curative method for this disease, and do to its relevance and economic damage, it is necessary to understand at molecular level the Xac-citrus interaction in order to develop strategies to control the disease. The objective of this study was to investigate the effects of the deletion of the ORF XAC0024 present in the genome of Xac strain 306, which encodes a conserved hypothetical protein and has several putative domains, including peptidase M23 domain. It is hypothesized that this protein may be involved in the pathogenicity and / or virulence of the bacterium. For the ΔXAC0024 mutant was used for site-directed mutagenesis technique, followed by homologous recombination with the suicide vector pOK1. The ΔXAC0024 mutant was analyzed in relation to pathogenicity characteristics, growth in vivo and in vitro, self-aggregation capacity, biofilm production and production of xanthan gum. The pathogenicity test and in vivo growth curves were performed on Rangpur lime using syringe-infiltration method for the inoculation of bacteria. Symptoms of the disease development were recorded by digital photography to the 25° day after inoculation (dai) and in vivo growth curve was also determined to give the 25°. The growth curve in vitro and cell-to-cell aggregation were analyzed in liquid culture medium NB. Biofilm production test was done in a liquid culture medium XVM2 on abiotic surface using crystal violet for your viewing and spectrophotometry for its quantification. The extraction of xanthan gum was performed by isopropanol precipitation after dissolving KCl among gum with bacteria grown in 96 hours. It was found that the ΔXAC0024 mutant was less virulent compared to the wild Xac and its development in planta is limited; however, in nutrient medium NB presents similar growth to the wild Xac. The ΔXAC0024 mutant also showed increased formation of xanthan gum, decreased ability to self-aggregation and inviolability in biofilm formation compared to wild Xac. This is the first evidence that ORF XAC0024 interfere with bacterial virulence affects the production of xanthan gum and cell aggregation Xac 306. The hypothesis is that the protein encoded by ORF XAC0024 participate in the peptidoglycan degradation in division system cell in Xac, and further experiments are needed to confirm this hypothesis.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Gingivitis is the most prevalent form among periodontal diseases. Evidence has shown the importance of gingivitis as a precursor of periodontal attachment loss and tooth loss. Despite its importance, often the diagnosis of gingival inflammation is overlooked. For maintaining gingival health, biofilm mechanical removal procedures should be perfomed effectively and periodically. Studies have shown oral hygiene frequencies of 12 and 24h are related to the gingival health maintenance. As important as frequency, it is the quality in which the procedure is performed. Studies assessing the association between toothbrushing frequency, effective biofilm removal and gingival clinical changes have an important role in the prevention and treatment of gingivitis. The aim of this study was to evaluate correlation between plaque and gingival inflammation in individuals underwent effective biofilm control at different frequencies. Data from this study were collected from a randomized clinical trial conducted in 2012 in Santa Maria, RS, Brazil. The sample consisted of 52 UFSM students, of courses not related to health, initially randomized into 4 oral hygiene frequencies and grouped into 2: Group G12/24 (12 and 24h) and group G48/72 (48 and 72h). In G12/24, even with an increase in plaque levels during 30 days, gingival inflammation levels were not statistically different from baseline. In G48/72, increase in plaque levels were accompanied by increasing levels of gingival inflammation. Positive correlation was observed in both groups, however, correlation is reduced in G12/24, demonstrating that increase in plaque levels were not sufficient to develop inflammatory response. In subjects who perform effective biofilm control, the correlation between plaque and gingival inflammation is affected by oral hygiene frequency. / A gengivite é considerada a forma mais prevalente dentre as doenças periodontais. Evidências têm mostrado a importância da gengivite como precursora da perda de inserção periodontal e perda dental. A despeito de sua importância, muitas vezes o diagnóstico da inflamação gengival é negligenciado. Para a manutenção de saúde gengival, procedimentos de desorganização mecânica do biofilme devem ser realizados de forma efetiva e periódica. Estudos observaram que frequências de higiene bucal (HB) de 12 e 24 horas estão relacionadas a manutenção de saúde gengival. Tão importante quanto a frequência, é a qualidade em que esse procedimento é realizado. Estudos que avaliam a associação entre frequência de escovação, desorganização efetiva do biofilme e alterações clínicas gengivais têm um papel importante na prevenção e tratamento das gengivites. Portanto, o objetivo deste estudo foi avaliar a existência de correlação entre biofilme e inflamação gengival em indivíduos que realizaram efetivo controle do biofilme em diferentes frequências. Os dados deste estudo foram coletados de um ensaio clínico randomizado realizado no ano de 2012 na cidade de Santa Maria, RS, Brasil. A amostra foi composta por 52 estudantes de cursos não relacionados a área da saúde da UFSM inicialmente randomizados em 4 frequências de higiene bucal e agrupados em 2: grupo G12/24 (12 e 24h) e grupo G48/72 (48 e 72h). No G12/24, mesmo havendo aumento nos níveis de Índice de Placa (IPl) durante os 30 dias, os níveis de inflamação gengival não diferiram estatisticamente do baseline. Já no G48/72, aumento nos níveis de IPl foi acompanhado por aumento nos níveis de inflamação gengival. Houve correlação positiva em ambos os grupos, no entanto, a correlação diminuiu no G12/24, demonstrando que o aumento nos níveis de biofilme não foi suficiente para desenvolver resposta inflamatória gengival. Em indivíduos que realizam controle efetivo do biofilme, a correlação entre biofilme e inflamação gengival é afetada pela frequência de higiene bucal.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:56:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DissLTS.pdf: 9020125 bytes, checksum: e5e1b73c065d46b9f7bb52f9113ba1dd (MD5) Previous issue date: 2005-03-24 / Universidade Federal de Minas Gerais / This work had as objective studies of the biofilms formation in polymerics particles used as material supports in anaerobic fluidized-bed reactors. Three polymerics supports were tested: polystyrene, PET and PVC, which suffered appropriate acid treatment, in way to provide them superficial characteristics as rugosity, porosity and favorable electric charge, with the purpose of favoring the microbial adhesion. The reactors were inoculated with sludge originating from reactor UASB that treated swine slaughterhouse residue, adapted to the degradation of the phenol by 150 days. The volume of the reactors was of 770cm3, and they operated with ascendant speed of 1,3 times of the flow rate of the minimum fluidization. The phenol concentration varied from 100 to 400mg/L in the feeding of each system, presenting results of removal of phenol of 97%, 98% and 97,5% and removal of DQO of 84%, 88,5% and 87%, respectively for the reactors with polystyrene, PET and PVC, which operated with time of detention hydraulic relative the height of the bed, corresponding to the reactional volume of the reactors (TDHr) of 22 h, 10,6 h and 20,4 h, respectively. The quantification of extracellular polymeric showed better results for the particles of PVC that it presented 0,2 mgCarbohydrate/gParticle and 0,06 mgProteyn/gParticle. However, deformations in those particles harming the acting of the reactor, defining as better support the particles of PET, and in this reactor the percentage of phenol removal was larger for a smaller TDHr. / Este trabalho teve como objetivo estudar da formação de biofilmes em partículas poliméricas usadas como meio suporte em reatores anaeróbios de leito fluidizado. Foram testados 3 suportes poliméricos: poliestireno, PET e PVC, os quais sofreram tratamento ácido adequado, de modo a proporcionar-lhes características superficiais como rugosidade, porosidade e carga elétrica favorável, com a finalidade de favorecer a adesão microbiana. Os reatores foram inoculados com lodo proveniente de reator UASB que tratava resíduo de suinocultura, adaptado à degradação do fenol por 150 dias. O volume dos reatores era de 770cm3, e operaram com velocidade ascensional igual a 1,3 vezes da vazão de mínima fluidização. A concentração de fenol variou de 100 a 400mg/L na alimentação de cada sistema, apresentando resultados de remoção de fenol de 97%, 98% e 97,5% e remoção de DQO de 84%, 88,5% e 87%, respectivamente para os reatores com poliestireno, PET e PVC, os quais operaram com tempo de detenção hidráulico relativo a altura do leito, correspondente ao volume reacional dos reatores (TDHr) de 22 h, 10,6 h e 20,4h, respectivamente. A quantificação de polímeros extracelulares mostrou melhores resultados para as partículas de PVC que apresentou 0,2 mgCarboidrato/gPartícula e 0,06 mgProteina/gPartícula. No entanto, deformações nessas partículas prejudicaram o desempenho do reator, definindo como melhor suporte as partículas de PET, sendo que neste reator a porcentagem de remoção de fenol foi maior para um menor TDHr.

Na aquacultura de recirculação são utilizados filtros biológicos para o tratamento do efluente antes que este retorne aos tanques. Estas unidades de tratamento têm como finalidade a transformação de nitrogênio amoniacal em nitrato, pois a amônia e o nitrito são tóxicos para os peixes. O nitrogênio amoniacal tende a se acumular na água de cultivo, pois é um importante produto de excreção dos organismos aquáticos e degradação da ração não consumida. Nestes filtros biológicos, os microorganismos responsáveis pelo tratamento da água residuária se encontram aderidos no meio de preenchimento, formando um biofilme. O presente trabalho teve como objetivo caracterizar as comunidades microbianas presentes no biofilme associado ao filtro biológico de uma unidade experimental de tratamento de efluente de aquacultura. Durante o experimento, realizado em dois sistemas paralelos representando unidades de aquacultura com e sem recirculação de água, também foram monitorados parâmetros de qualidade da água. Os tanques experimentais foram povoados com juvenis de tilápias-do-Nilo (Oreochromis niloticus), que foram submetidos a pesagens a cada quinze dias para avaliar seu ganho de biomassa. As bactérias foram identificadas através da técnica de análise microbiológica da hibridização fluorescente in situ (FISH). A estrutura do biofilme foi avaliada através de microscopia eletrônica de varredura. Os resultados indicam que a nitrificação teve um papel mais importante no controle da qualidade da água no sistema com recirculação em relação ao tanque sem recirculação. A análise microbiológica do meio de preenchimento do filtro revelou uma presença marcante (com proporções de Cy3/DAPI variando entre 0,5% e 7,6%) de células ativas de organismos nitrificantes (oxidadores de amônia e de nitrito), pertencendo a gêneros distintos como Nitrobacter, Nitrococcus e Nitrosomonas, além de outros grupos de presença expressiva, como bactérias filamentosas (com proporções de 11,2% a 17,3% da contagem de células marcadas com DAPI). As imagens de Microscopia Eletrônica de Varredura revelaram a natureza do arranjo destas bactérias no meio filtrante, caracterizando um biofilme bem desenvolvido, composto por diversos morfotipos microbianos. O conhecimento das bactérias que compõe este biofilme pode tornar possível a geração de melhorias que podem ser implementadas para aumentar a eficiência do sistema. / In recirculating aquaculture, biological filters are used for treating the effluent before it returns to tanks. These treatment units are intended for transforming ammoniacal nitrogen into nitrate, since ammonia and nitrite are toxic to fish. Ammoniacal nitrogen tends to accumulate in culture water, because it is an important excretion product from aquatic organisms and also due to degradation of non consumed feed. In these biological filters, microorganisms responsible for the treatment of waste water adhere to the filler, forming a biofilm. The present work intended to characterize the microbial community present in the biofilm associated to the biological filter at an experimental aquaculture effluent treatment unit. During the experiment, conducted in two parallel systems representing aquaculture units with and without water recirculation, water quality parameters were also monitored. Experimental tanks were populated with juvenile Nile Tilapias (Oreochromis niloticus), which were subjected to weighing every 15 days in order to assess their biomass gain. Bacteria were identified through the microbiological analysis technique of Fluorescent In Situ Hybridization (FISH). The biofilm structure was assessed using scanning electron microscopy. The results indicate that nitrification had a more important role in the control of water quality in the system with recirculation compared with the tank without recirculation. The microbiological analysis of the filter media revealed a significant presence (with Cy3/DAPI range between 0.5% e 7.6%) of active cells from nitrifying organisms (ammonia and nitrite oxidizers), which belonged to different genera such as Nitrobacter, Nitrococcus and Nitrosomonas, in addition to groups that had an expressive presence, such as filamentous bacteria (representing 11.2% to 17.3% of the total DAPI stained cells). Scanning Electron Microscopy images revealed the nature of the arrangement of these bacteria in the filtering media, characterizing a well developed biofilm made up of diverse microbial morphotypes. The knowledge about the bacteria making up the biofilm may enable improvements that can be implemented to increase system effectiveness.

Foram avaliados 528 isolados clínicos de Pseudomonas aeruginosa de 131 pacientes fibrocísticos atendidos em um centro de referência em fibrose cística (FC) durante o período de 2005 a 2008. 135 isolados clínicos (25,6%) apresentaram subpopulação hipermutante (isolados com altas taxas de mutações) utilizando teste modificado de suscetibilidade aos antimicrobianos. Destes, 9 isolados (6,7%) de 7 pacientes foram classificados como hipermutantes (HPM) segundo estimativa da freqüência de mutação. Após seqüenciamento do gene mutS e análise de mutações relacionadas à inativação do sistema de reparo de erros no pareamento do DNA (Mismatch Repair System - MRS), foi possível observar este tipo de mutação em 5 isolados HPM de 4 pacientes. Avaliamos a formação de biofilme em 45 isolados NHPM, 9 HPM e suas respectivas subpopulações por duas metodologias. Segundo o primeiro método, 24 (53,3%) e 3 (21,4%) isolados NHPM e HPM, respectivamente, foram classificados como não-formadores de biofilme. Pelo segundo método, apenas 4 (8,9%) isolados NHPM e nenhum isolado HPM foram classificados nessa categoria. Os percentuais de resistência aos antibióticos ceftazidima, ciprofloxacino e tobramicina em condições de biofilme foram mais elevados que aqueles obtidos em crescimento plantônico e, em ambas as condições, foi possível evidenciar forte associação entre hipermutabilidade e aumento de resistência antibiótica. A associação dos macrolídeos azitromicina e claritromicina, em concentrações sub-inibidoras, com os antibióticos anti-pseudomonas, demonstrou ação inibitória sobre isolados clínicos de P. aeruginosa em condições de biofilme, o que sugere sua indicação no tratamento de infecções por P. aeruginosa pela sua ação anti-biofilme. / We evaluated 528 clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa in 131 CF patients attended at a referral center for cystic fibrosis (CF) during the period of 2005 to 2008. 135 clinical isolates (25.6%) presented hypermutable subpopulation (isolates with high mutation rates) using a modified antimicrobial susceptibility method. Of these, 9 isolates (6.7%) of 7 patients were classified as hypermutable (HPM) according to the estimate of mutation frequency. After gene sequencing and analysis of mutS mutations related to inactivation of the repair system errors in DNA pairing (Mismatch Repair System - MRS), we observed this type of mutation in 5 HPM isolates of 4 patients. We evaluated the biofilm formation in 45 isolates NHPM, 9 HPM and their subpopulations by two methods. According the first method, 24 (53.3%) and 3 (21.4%) isolates NHPM and HPM, respectively, were classified as non-biofilm formers. According the second method, only 4 (8.9%) isolates NHPM and none HPM were classified in this category. The percentages of resistance to antibiotics ceftazidime, ciprofloxacin and tobramycin in conditions of biofilm were higher than those obtained in planktonic growth, and in both conditions, it was observed a strong association between hypermutability and increased antibiotic resistance. The association of macrolides azithromycin and clarithromycin, in sub-inhibitory concentrations, with anti-pseudomonas antibiotics, has shown inhibitory activity on clinical isolates of P. aeruginosa in biofilm conditions, which should be recommended for treatment of CF P. aeruginosa infections due to its anti-biofilm action.

abstract: ABSTRACT Sustainable global energy production is one of the grand challenges of the 21st century. Next-generation renewable energy sources include using photosynthetic microbes such as cyanobacteria for efficient production of sustainable fuels from sunlight. The cyanobacterium Synechocystis PCC 6803 (Synechocystis) is a genetically tractable model organism for plant-like photosynthesis that is used to develop microbial biofuel technologies. However, outside of photosynthetic processes, relatively little is known about the biology of microbial phototrophs such as Synechocystis, which impairs their development into market-ready technologies. My research objective was to characterize strategic aspects of Synechocystis biology related to its use in biofuel production; specifically, how the cell surface modulates the interactions between Synechocystis cells and the environment. First, I documented extensive biofouling, or unwanted biofilm formation, in a 4,000-liter roof-top photobioreactor (PBR) used to cultivate Synechocystis, and correlated this cell-binding phenotype with changes in nutrient status by developing a bench-scale assay for axenic phototrophic biofilm formation. Second, I created a library of mutants that lack cell surface structures, and used this biofilm assay to show that mutants lacking the structures pili or S-layer have a non-biofouling phenotype. Third, I analyzed the transcriptomes of cultures showing aggregation, another cell-binding phenotype, and demonstrated that the cells were undergoing stringent response, a type of conserved stress response. Finally, I used contaminant Consortia and statistical modeling to test whether Synechocystis mutants lacking cell surface structures could reduce contaminant growth in mixed cultures. In summary, I have identified genetic and environmental means of manipulating Synechocystis strains for customized adhesion phenotypes, for more economical biomass harvesting and non-biofouling methods. Additionally, I developed a modified biofilm assay and demonstrated its utility in closing a key gap in the field of microbiology related to axenic phototrophic biofilm formation assays. Also, I demonstrated that statistical modeling of contaminant Consortia predicts contaminant growth across diverse species. Collectively, these findings serve as the basis for immediately lowering the cost barrier of Synechocystis biofuels via a more economical biomass-dewatering step, and provide new research tools for improving Synechocystis strains and culture ecology management for improved biofuel production. / Dissertation/Thesis / Doctoral Dissertation Biological Design 2016

Proteins can often adsorb irreversibly at fluid/fluid interfaces; the understanding of the adsorption mechanism has relevance across a variety of industrial (e.g. the creation of stable emulsions) and biological (e.g. biofilm formation) processes. I performed molecular dynamics simulations of two surfactant proteins as they interact with air/water and oil/water interfaces, describing the origin of the surface activity, the adsorption dynamics and the conformational changes that these proteins undergo at the interface. BslA is an amphiphilic protein that forms a highly hydrophobic coat around B. subtilis biofilms, shielding the bacterial community from an external aqueous solution. By investigating the behaviour of BslA variants at oil/water interfaces via coarse-grained molecular dynamics, I show that BslA represents a biological example of an ellipsoidal Janus nanoparticle, whose surface interactions are controlled by a local conformational change. All-atom molecular dynamics simulations then reveal the details of the conformational change of the protein upon adsorption, and the self-assembly into a two-dimensional interfacial crystal. Ranaspumin-2 is one of the main components of the tungara frog foam nest. Contrary to most surfactant proteins, its structure lacks any sign of amphiphilicity. All-atom simulations show that the adsorption proceeds via a two-step mechanism where firstly the protein binds to the interface through its flexible N-terminal tail and then it undergoes a large conformational change in which the hydrophobic core becomes exposed to the oil phase. I then developed a simple structure-based coarse-grained model that highlights the same adsorption mechanism observed in all-atom simulations, and I used it to compare the dynamics of adsorption and the underlying free energy landscape of several mutants. These results agree with and are used to rationalise the observations from Langmuir trough and pendant drop experiments. Colloids can often be considered simpler versions of proteins that lack conformational changes. I performed coarse-grained simulations of the compression of interfacial monolayers formed by rod-like particles. These simulations show a rich behaviour characterised by the flipping of adsorbed rods, nematic ordering and bilayer formation. I report the series of transitions that take place as the rod aspect ratio is increased from 3 to 15.

Dans un contexte de stress hydrique, la micro-irrigation avec des eaux usées traitées constitue une solution visant à réduire les dépenses en eau. Cependant, le colmatage des goutteurs constitue une contrainte à l’utilisation de ces eaux bien chargées à cause des précipitations chimiques et du développement de biofilm. Les objectifs de cette étude sont de: a) Caractériser la précipitation des sels dissous en fonction des conditions opératoires, b) étudier le développement des biofilms sous différentes conditions hydrodynamiques, c) analyser l’interaction entre le carbonate de calcium et le développement du biofilm. En premier lieu une étude fut conduite sur l’impact de la température le pH et la pression partielle du CO2 sur la précipitation chimique. Cette étude a permis de quantifier l’augmentation de la masse du carbonate de calcium en fonction du pH et de la température. Les résultats expérimentaux ont permis de valider et de calibrer un modèle numérique (PHREEQC) qui permet de prédire la précipitation chimique pour une qualité d’eau donnée dans des conditions opératoire variées. Des expérimentations ont ensuite été réalisées à l’aide d’un banc d’essai d’irrigation pour étudier l’influence du carbonate de calcium sur la croissance des biofilms au niveau des conduites et des goutteurs. En parallèle un réacteur de Taylor-Couette fut utilisé pour étudier l’influence de la contrainte de cisaillement sur le développement des biofilms. Le biofilm a tendance à se développer selon la plus forte contrainte de cisaillement (4.4 Pa comparée à des contraintes de 2.2 et 0.7 Pa). Une précipitation du carbonate de calcium a été observée en interaction avec la croissance du biofilm. / In a context of water stress, micro-irrigation with treated wastewater is a solution to reduce water expenditure. However, the clogging of micro-irrigation systems constitutes a constraint on the use of these well-laden waters due to chemical precipitation and the development of biofilm. The objectives of this study are to: a) characterize precipitation of dissolved salts as a function of operating conditions, b) study the development of biofilms under different hydrodynamic conditions and c) analyze the interaction between calcium carbonate and the development of biofilm. First, a study was conducted on the impact of pH, temperature and partial pressure of CO2 on chemical precipitation. This study permits the quantification of the increase in the mass of the precipitate produced in the form of calcite (calcium carbonate) as a function of the increase in pH and temperature. The experimental results allowed validation and calibration of the modeling of the precipitation under PHREEQC’s software. This numerical model allows prediction and quantification of chemical precipitation for a given water quality under various operating conditions. Experiments were then carried out using an irrigation set-up to study the influence of calcium carbonate on the growth of biofilms inside pipes and drippers. In parallel, a Taylor-Couette reactor was used to study the influence of shear stress on the development of biofilms. Biofilm tends to develop under the highest shear stress (4.4 Pa compared to 2.2 and 0.7 Pa). Precipitation of the calcium carbonate in the form of calcite was observed in interaction with the growth of the biofilm.