Made available in DSpace on 2013-09-17T11:20:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000450558-Texto+Completo-0.pdf: 2693787 bytes, checksum: e4ffe9234a98b2ddfc9bc350c708c01c (MD5) Previous issue date: 2013 / Tuberculosis (TB), one of the oldest recorded human afflictions, is still one of the biggest killers among the infectious diseases. The HIV co-infection and the emergence of multidrug resistant TB have provided a very alarming challenge to global health and led us to focus on the research for new and more effective therapeutics against the disease. The modern approach to the development of new chemical compounds against complex diseases, especially the neglected endemic ones, such as TB, is based on the use of defined molecular targets. Enzymes from the pyrimidine biosynthesis pathway have been considered potential targets for identification or development of novel anti-mycobacterial agents since in bacteria, pyrimidine nucleotide interconvertion pathways are important in a number of essential processes, including DNA, RNA, and phospholipid biosynthesis. Cytidine 5'-monophosphate kinase from Mycobacterium tuberculosis (MtCMK) catalyzes the ATP-dependent phosphoryl group transfer preferentially to CMP and dCMP. Here, initial velocity studies and Isothermal Titration Calorimetry (ITC) measurements showed that MtCMK follows a random-order kinetic mechanism of substrate binding, and an ordered mechanism for product release. The thermodynamic signatures of CMP and CDP binding to MtCMK showed favorable enthalpy and unfavorable entropy, and ATP binding was characterized by favorable changes in enthalpy and entropy. The contribution of linked protonation events to the energetics of MtCMK:phosphoryl group acceptor binary complex formation suggested a net gain of protons. Values for the pKa of a likely chemical group involved in proton exchange and for the intrinsic binding enthalpy were calculated. The Asp187 side chain of MtCMK is suggested as the likely candidate for the protonation event. Data on thermodynamics of binary complex formation were collected to evaluate the contribution of 2'-OH group to intermolecular interactions. The data are discussed in light of functional and structural comparisons among CMP/dCMP kinases and UMP/CMP ones. / A tuberculose (TB), uma das doenças mais antigas da humanidade, ainda é uma das principais causas de morte entre as doenças infecciosas. A coinfecção com o HIV e a emergência de TB resistente a múltiplas drogas representam um desafio à saúde pública e tem estimulado a pesquisa por novos e mais efetivos agentes terapêuticos contra a doença. Novas abordagens para o desenvolvimento de compostos contra doenças complexas, especialmente doenças endêmicas negligenciadas, são baseadas no uso de alvos moleculares definidos. Enzimas envolvidas no metabolismo de pirimidinas tornam-se alvos moleculares interessantes para compostos inibidores, uma vez que em bactérias, as rotas de interconversão de nucleotídeos pirimidínicos são importantes em inúmeros processos essenciais, incluindo a biossíntese de DNA, RNA e fosfolipídios. A citidina 5'-monofosfato quinase de Mycobacterium tuberculosis (MtCMK) em estudo, catalisa a transferência reversível de um grupamento fosforil a partir de ATP, preferencialmente para CMP e dCMP. Neste trabalho, os estudos de velocidade inicial e experimentos de Calorimetria de Titulação Isotérmica (ITC) demonstraram que a adição dos substratos (CMP e ATP) à MtCMK segue um mecanismo cinético sequencial aleatório, e que a liberação dos produtos ocorre de forma ordenada, onde o ADP é o primeiro produto a ser liberado. As assinaturas termodinâmicas da ligação do CMP e do CDP à MtCMK mostraram variações favoráveis da entalpia e desfavoráveis da entropia, e, a ligação do ATP foi caracterizada por mudanças favoráveis da entalpia e da entropia. As contribuições energéticas oriundas dos eventos de protonação, associados à formação do complexo binário MtCMK:receptor do grupamento fosforil, sugerem um ganho líquido de prótons. Além disso, foram calculados os valores de pKa de um provável grupo envolvido na troca de prótons, e da entalpia de ligação intrínseca. A cadeia lateral do Asp187 da MtCMK é sugerido como provável candidato para o evento de protonação. As medidas termodinâmicas da formação do complexo binário foram coletados a fim de avaliar a contribuição do grupo 2'-OH da pentose nas interações intermoleculares. Os dados obtidos foram discutidos comparando-se as características estrutural e funcional entre as CMKs já estudadas e a UMP/CMP quinase humana.

Made available in DSpace on 2013-09-17T11:20:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000450257-Texto+Completo-0.pdf: 1851494 bytes, checksum: 45b94fe1b9cb73399670961f3d6d6798 (MD5) Previous issue date: 2013 / Human tuberculosis (TB), an illness that results from Mycobacterium tuberculosis infection, remains a major health problem worldwide, accounting for an estimated 8. 7 million new cases globally in 2011. Problems related to treatment of M. tuberculosis infection are related to its ability to persist latently in host tissues, getting protection against drug treatment and creating a reservoir of disease. Addictionaly, the emergence of multi, extensively and totally drug-resistant strains, TB-HIV co-infection and the complexity of the treatment currently used, underline the need of new antitubercular drugs, with novel mechanisms of action. The enzyme adenylosuccinate lyase (ASL) is involved in both de novo and salvage pathways of purine biosynthesis. Here we describe M. tuberculosis ASL (MtASL) cloning and expression in Escherichia coli. N-terminal amino acid sequencing and electrospray ionization mass spectrometry analyses confirmed the identity of homogeneous MtASL. Size exclusion chromatography showed that the protein is a homotetramer in solution. Steady-state kinetics revealed that MtASL exhibits hyperbolic kinetics and confirmed that the recombinant enzyme indeed catalyses the cleavage of S-AMP in AMP and fumarate. The pH-rate profile showed that MtASL follows an overall acid-basic mechanism of catalysis and these studies, combined with multiple sequence alignment analysis led us to propose what amino acid residues are involved in the MtASL chemical reaction. In addition, product inhibition studies and isothermal titration calorimetry of binding products allowed us to propose the MtASL kinetic mechanism. The results here reported could lead to the identification of nucleoside analogs that potently inhibit M. tuberculosis viability, with minor damages to the human host. / A tuberculose humana (TB) é uma doença infectocontagiosa provocada principalmente pelo Mycobacterium tuberculosis e permanece sendo um importante problema mundial de saúde. Estima-se que 8,7 milhões de novos casos tenham ocorrido em 2011. Problemas relacionados ao tratamento da infecção ocorrem devido à sua habilidade de persistir de forma latente no hospedeiro criando um reservatório da doença. Adicionalmente, a emergência de cepas multi, extensivamente e totalmente resistentes, a coinfecção TB-HIV e a complexidade do tratamento utilizado atualmente, alertam para a necessidade de novos medicamentos, que possuam novos mecanismos de ação. A enzima adenilossuccinato liase (ASL) está envolvida em ambas as vias de biossíntese de purinas. Neste trabalho, nós descrevemos a amplificação, clonagem da ASL de M. tuberculosis (MtASL) e expressão em Escherichia coli. O sequenciamento N-terminal juntamente com análises por espectrometria de massas confirmaram a identidade da MtASL homogênea. Foi demonstrado através de cromatografia de exclusão por tamanho que a proteína é um homotetrâmero em solução. Ensaios de cinética no estado estacionário revelaram que a MtASL exibe um modelo de cinética hiperbólica e que catalisa a clivagem de S-AMP a AMP e fumarato. Estudos de perfil de pH demonstraram que a MtASL realiza um mecanismo catalítico ácido-básico e, tais estudos, combinados ao alinhamento múltiplo de sequências, permitiram propor os resíduos de aminoácidos envolvidos na reação. Adicionalmente, estudos de inibição pelos produtos somados a estudos de calorimetria de titulação isotérmica da ligação dos mesmos, permitiram propor o mecanismo cinético da MtASL. Os resultados deste trabalho podem auxiliar na posterior identificação de análogos de nucleotídeos que sejam capazes de inibir a viabilidade do M. tuberculosis, com poucos danos ao hospedeiro humano.

Made available in DSpace on 2013-10-11T13:35:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000451454-Texto+Completo-0.pdf: 6697842 bytes, checksum: 890c954db41088b36538c3133a7c2606 (MD5) Previous issue date: 2013 / Epilepsy, characterized by the occurrence of spontaneous and recurrent seizures, is one of the main chronic neurological diseases, affecting around 1% of the world's population. Adenosine is an endogenous modulator of neuronal excitability and has anticonvulsant properties. Thus, the modulation of adenosinergic signalling pathway may presents important effects on epilepsy. In this study we characterize different aspects of the adenosinergic signaling in a model of seizures induced by pentylenetetrazole (PTZ) in zebrafish. In this study we also analyzed the effect of different modulators of adenosinergic signaling on controlling the development of seizures. Our results showed that the activation of type A1 adenosine receptors has an important role in controlling seizures in zebrafish. Furthermore, we observed that ecto-5´-nucleotidase and ADA enzymes, in addition to nucleoside transporters, are directly involved in controlling extracellular adenosine levels and, consequently, in controlling the development of seizures in this teleost. In addition, we clarified the occurrence of controversial data related to the mTOR signaling pathway in oxidative stress. Previous studies have suggested the activation of this pathway in oxidative stress based on the misinterpretation of the phosphorylation of RSK and MSK proteins through the antibody anti-phospho-Thr389-S6K, in addition to protein S6 phosphorylation, regulated by the MAPK signaling pathway in this case. Therefore, these findings might contribute for a better understanding about the signaling pathways involved in the mechanisms of seizure control and represents na alternative for the development of antiepileptic drugs, increasing the therapeutic options in epilepsia. Our results may also contribute to future studies on the characterization and modulation of TOR signaling pathway in zebrafish. / A epilepsia, caracterizada pela ocorrência de crises convulsivas espontâneas e recorrentes, é umas das principais doenças neurológicas crônicas, afetando em torno de 1% da população mundial. A adenosina é um modulador endógeno da excitabilidade neuronal e apresenta propriedades anticonvulsivantes. Sendo assim, a modulação da via de sinalização adenosinérgica pode apresentar um efeito importante na epilepsia. Neste estudo, nós caracterizamos diferentes aspectos da sinalização adenosinérgica em modelo de crise convulsiva induzida por pentilenotetrazol (PTZ) em peixe-zebra. Nossos resultados demonstram um aumento nas atividades da adenosina desaminase (ADA), responsável pela desaminação de adenosina em inosina, logo após uma crise convulsiva. Além disso, foi observado que os fármacos antiepilépticos gabapentina, fenitoína e ácido valpróico preveniram o efeito estimulatório promovido pelo PTZ sobre as atividades da adenosina desaminase. Neste estudo, também analisamos o efeito de diferentes moduladores da sinalização adenosinérgica no controle do desenvolvimento de convulsões induzidas por PTZ. Nossos resultados demonstraram que a ativação de receptores de adenosina do tipo A1 tem importante participação no controle de crises convulsivas em peixe-zebra. Além disso, observamos que as enzimas ecto-5´-nucleotidase e ADA, além dos transportadores de nucleosídeos estão diretamente envolvidos no controle dos níveis extracelulares de adenosina e, consequentemente, no controle do desenvolvimento de crises convulsivas neste teleósteo. Além disso, esclarecemos a ocorrência de dados controversos relacionados à via de sinalização mTOR em estresse oxidativo. Estudos sugeriram a ativação desta via em estresse oxidativo baseados na interpretação equivocada da fosforilação das proteínas RSK e MSK pelo anticorpo anti-fosfo-Thr389-S6K, além da fosforilação da proteína S6, regulada neste caso pela via de sinalização MAPK. Este estudo pode contribuir para um maior entendimento das vias de sinalização envolvidas nos mecanismos de controle de crises convulsivas e representar uma alternativa para o desenvolvimento de fármacos antiepilépticos, aumentando as opções terapêuticas em epilepsia. Nossos resultados também podem contribuir para futuros estudos referentes à caracterização e modulação da via de sinalização TOR em peixe-zebra.

Made available in DSpace on 2013-10-11T13:35:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000451400-Texto+Completo-0.pdf: 16861193 bytes, checksum: 8e59e1dc262f6d66b6ff62e7eca281b9 (MD5) Previous issue date: 2013 / Human tuberculosis (TB) is a major global health threat. The disease’s increasing prevalence, coupled with the emergence of drug-resistant strains and the devastating effects of co-infection with human immunodeficiency virus (HIV) indicate an urgent need for the development of new and more efficient drugs to combat the disease's causative agent, Mycobacterium tuberculosis. Global health authorities have also begun to recognize the need for drugs that can kill the mycobacteria in its different physiological states including but not limited to latent TB infection. A more comprehensive understanding of the bacilli's nucleotide metabolic pathways, in particular purine and pyrimidine salvage pathways, could aid in the development of new therapeutic strategies to reduce the incidence of TB worldwide. Nucleoside hydrolase catalyzes the irreversible hydrolysis of N-glycosidic bond of ribonucleosides, forming α-D-ribose and the corresponding base. This work describes the amplification, cloning, expression and purification of the iunH-encoding purine nucleoside hydrolase from M. tuberculosis (MtIAGU-NH). Results from steadystate kinetic experiments indicate that MtIAGU-NH has broad substrate specificity, accepting inosine, adenosine, guanosine, and uridine as substrates. Kinetics analysis utilizing fluorescence spectroscopy of ribose binding to MtIAGU-NH suggests that prior to ligand association there are two pre-existing forms of the enzyme. We determined the intracellular concentrations of inosine, uridine, hypoxanthine, and uracil as well as the reaction’s thermodynamic parameters. Thermodynamic activation parameters (Ea, ΔG#, ΔS#, ΔH#) for the MtIAGU-NH-catalyzed chemical reaction, along with results from mass spectrometry, isothermal titration calorimetry (ITC), pH-rate profile experiments, multiple sequence alignment, and molecular docking experiments are also presented. Knockout experiments of the iunH gene indicate that this gene is not essential for the growth of M. tuberculosis H37Rv underutilized experimental conditions. The data presented here contribute to our understanding of MtIAGU-NH, providing a solid basis for the development of efficient prophylactic and therapeutic strategies to reduce the global incidence of TB. / A tuberculose humana (TB) é considerada uma ameaça à saúde global. O aumento na prevalência da doença, a emergência de cepas resistentes e a coinfecção com o vírus da imunodeficiência humana levaram à urgente necessidade do desenvolvimento de novas drogas mais eficientes para o combate do agente causativo da TB, Mycobacterium tuberculosis. Além disso, há a necessidade de novas drogas contra a micobactéria nos seus diferentes estados fisiológicos, incluindo a TB latente. Um maior entendimento sobre as vias metabólicas de nucleotídeos do bacilo da TB, em particular as vias de salvamento de purinas e pirimidinas, levariam ao desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas para controlar a incidência global de TB. A hidrolase de nucleosídeos catalisa a hidrólise irreversível da ligação N-glicosídica de ribonucleosídeos, dando origem à α-D-ribose e sua base livre correspondente. Este trabalho descreve a amplificação e clonagem do gene iunH, e a expressão e purificação da enzima recombinante hidrolase de nucleosídeos purínicos de M. tuberculosis (MtIAGU-NH). Os resultados de cinética no estado estacionário mostram que a MtIAGU-NH possui uma ampla especificidade pelos substratos, utilizando inosina, adenosina, guanosina e uridina como substratos. As medidas cinéticas da ligação da ribose à MtIAGU-NH por espectroscopia fluorimétrica sugerem a existência de duas formas da enzima em equilíbrio, relacionadas à associação ao ligante. As concentrações intracelulares de inosina, uridina, hipoxantina e uracil foram determinadas e os parâmetros termodinâmicos, estimados. Os parâmetros termodinâmicos de ativação (Ea, ΔG#, ΔS#, ΔH#) para a reação química catalisada pela MtIAGU-NH, além dos resultados de espectrometria de massa, calorimetria de titulação isotérmica, experimento de perfil de pH, alinhamento de múltiplas sequências e experimentos de docagem molecular também são apresentados neste trabalho. O nocaute do gene iunH mostrou que este não é essencial para o crescimento do bacilo M. tuberculosis H37Rv nas condições experimentais empregadas. Os resultados aqui descritos deverão ser úteis para um melhor entendimento sobre a enzima MtIAGU-NH, fornecendo bases sólidas para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas e preventivas para diminuir a incidência global da TB.

Made available in DSpace on 2013-11-27T18:52:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000450693-Texto+Completo-0.pdf: 903446 bytes, checksum: 6805922c966dfb108b00594643df2744 (MD5) Previous issue date: 2013 / The elderly population, characterized as people over 60 years old, has grown rapidly in recent years in Brazil, and with this increase in life expectancy, age-related changes appear, for example, immunosenescence. Some studies have shown that there are differences in the immunological profile of the elderly, often related to the numbers of T cells. The immune risk profile (IRP) has been defined as CD4/CD8 T-cell ratio <1 and positivity for serum anti-cytomegalovirus (CMV) antibodies. In this study, we investigated patterns of activation and differentiation of T lymphocytes by flow cytometry in an elderly population in IRP, compared with elderly people without risk profile (non-IRP), seeking to identify additional markers for this risk profile immune. For this study we recruited 60 elderly SUS patients in Porto Alegre, aged 60 years, 30 IRP and 30 non-IRP. Lymphocytes were isolated and stimulated in vitro to evaluate the production of cytokines and the expression of transcription factors. The subpopulations of T lymphocytes found were consistent with previous studies in which IRP patients had fewer naive and central memory T cells, as well as an increase was observed in the percentage of T cells CD8 + CD28-T cells and CD8 + PD-1 + in the IRP individuals. Furthermore, there was a reduction in mean fluorescence intensity (MFI) of transcription factors to canonical subtypes of T cell help (CD4 +) in IRP patients when compared to patients without IRP. The percentages of the different subtypes (TH1, TH2, TH17; Treg) of these cells were not different between the two groups. After stimulation with anti-CD3/anti-CD28 antibodies in culture for 24 hours, the concentration of cytokines in culture supernatants increased, but no significant differences between the two groups were found, except for IL-10, which was higher in IRP patients before stimulation. These results suggested that transcriptional mechanisms important in the differentiation of helper T cells are altered in IRP patients, which may affect the immune response of these individuals. / A população de idosos, caracterizada como pessoas com mais de 60 anos, vem aumentando muito nos últimos anos no Brasil, e com esse aumento da expectativa de vida surgem alterações relacionadas com a idade, por exemplo, a imunossenescência. Alguns estudos têm demonstrado que existem diferenças no perfil imunológico dos idosos, frequentemente relacionadas ao número de células T.O perfil de risco imune (IRP) tem sido definido como taxa de células T CD4/CD8<1 e soro positividade para citomegalovírus (CMV). Neste estudo, nós investigamos padrões de ativação e diferenciação de linfócitos T, por citometria de fluxo, em uma população idosa IRP, comparando com a população idosa sem perfil de risco (não-IRP), buscando identificar marcadores adicionais para esse perfil de risco imune. Foram recrutados para esse estudo 60 idosos da rede SUS (sistema único de saúde) de Porto Alegre, com idade superior a 60 anos, sendo 30 IRP e 30 não-IRP. Linfócitos foram isolados e estimulados in vitro para avaliar a produção de citocinas e a expressão de fatores de transcrição. As subpopulações de linfócitos T encontradas foram condizentes com estudos anteriores em que os pacientes IRP possuíam menos células T naive e de memória central, assim como foi observado um aumento nas porcentagens das células T CD8+CD28- e das células T CD8+PD-1+.Além disso, foi observada uma redução na média de intensidade de fluorescência (MFI) dos fatores de transcrição canônicos para subtipos de células T de ajuda (CD4+) em pacientes IRP quando comparados com pacientes não-IRP. As porcentagens dos diferentes subtipos (TH1; TH2; TH17; Treg) dessas células não foram diferentes entre os dois grupos. Após estimulação com anticorpos anti-CD3/anti-CD28 em cultura por 24h, a concentração de citocinas no sobrenadante das culturas aumentou, mas não houve diferença significativa entre os dois grupos em relação à concentração das citocinas em geral, exceto na IL-10 antes da estimulação, que foi maior em pacientes IRP. Esses resultados sugerem que mecanismos transcricionais importantes para a diferenciação de células T de ajuda estão alterados em pacientes IRP, o que pode afetar a resposta imune desses indivíduos.

Made available in DSpace on 2013-10-29T16:24:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000451624-Texto+Completo-0.pdf: 961299 bytes, checksum: 1cc816e2a5732637ef64d561c9f1cccc (MD5) Previous issue date: 2013 / Introduction : Oxaliplatin is an antineoplastic agent widely used in the treatment of some tumors. It is a third-generation platinum compound developed with the purpose of overcoming the limitations of toxicity, tumor resistance and poor oral bioavailability associated to cisplatin administration. Oxaliplatin-associated neurotoxicity represents the main dose limiting and there is not suitable treatment. Increasing doses of oxaliplatin can leed to the development of mechanical allodynia, cold sensitivity and peripheral sensory neuropathy, with increase of symptoms. Furthermore, despite its usefulness, chemotherapy with oxaliplatin increases the rate of developing hepatic damages together with inflammatory activity. This might be termed chemotherapy-associated steatohepatitis (CASH), a most severe form of non-alcoholic fatty liver disease. Therefore, in the presentstudy, we aimed to compare the effect of antioxidant compounds on simultaneous development of oxaliplatin-induced hepato and neurotoxicity in mice. Methods : The Balb/c mice were treated with doses of oxaliplatin (OXA) for 6 weeks, 10 mg/kg, intraperitoneally (i. p), resulting in mechanical allodynia, and hepatic steatosis. We administered antioxidants compounds such as rutin (RUT) (20 mg/Kg/d), resveratrol (RVS) (100 mg/Kg/d), quercetin (QT) (20 mg/Kg/d) and nanoquerecetin (NQT) (20 mg/Kg/d) daily by gavageto Balb/c. N-acetyl-cysteine was used as control. Euthanasiaoccurred onday 43after treatment. We evaluated mechanical nociceptive threshold, ALT/AST, histopathological analysisand MPOactivity. Statistical analyses were made one way ANOVA, followed by Bonferroni post hoc test. Results : The treatments with RSV, RUT or NQT were able to prevent mechanical allodynia when compared to OXA group. Regarding the effect on steatohepatitis, resveratrol, quercetin and quercetin nanoemulsion almost completely reversed the mean liver weight increase by OXA. In accordance with these previous data, histological evaluation depicted attenuation all features of hepatic steatosis evaluated in resveratrol, rutin, quercetin and quercetin nanoemulsion groups. On the other hand, only quercetin and quercetin nanoemulsion treatments were able to reduce neutrophils migration measured by MPO activity. Conclusion : These results suggest that the use of compounds such as resveratrol, rutin, quercetin and quercetin nanoemulsion can beeffective to avoid oxaliplatin-inducing hepato and neurotoxicity in a rodent model. / Introdução : A oxaliplatina é um agente antineoplásico e tem sido amplamenteutilizado no tratamento de vários tumores. É um composto derivado da platina de terceira geração desenvolvido com o propósito de ultrapassar as limitações da toxicidade, a resistência do tumor e a fraca biodisponibilidade oral associada à administração decisplatina. Sintomas de neurotoxicidade estão associados ao uso da oxaliplatina e não existe tratamento adequado. Doses crescentes de oxaliplatina podem levar ao desenvolvimento de sensibilidade a frio e neuropatia sensorial periférica, e a um aumento da intensidade dos sintomas. Além disso, apesar da sua utilidade, a quimioterapia aumenta a taxa de desenvolvimento de danos hepáticos com atividade inflamatória. Esta manifestação pode ser chamada de esteato-hepatite associada à quimioterapia (CASH), uma forma mais grave da doença hepática gordurosa não alcoólica. Deste modo, o presente estudo, objetivou comparar o efeito de alguns compostos antioxidantes no desenvolvimento simultâneo da hepato e neurotoxicidade induzida pela oxaliplatina em camundungos.Métodos : Os camundongos Balb/c foram tratados intraperitonealmente (i. p. ), com doses de 10 mg/kg de oxaliplatina durante 6 semanas, resultando em anodinia mecânica, e indução de esteatose hepática. Os compostos rutina (RUT) (20 mg/Kg/d), resveratrol (RSV) (100 mg/Kg/dia), quercetina (QT) (20 mg/Kg/dia) e nanoquerecetina (NQT) (20 mg/Kg/dia), foram administrados diariamente por gavagem aos camundongos. N-acetilcisteína foi utilizada como controle. A eutanásia ocorreu no 43º dia após o tratamento. Foram analisadas a nocicepção mecânica, as aminotransferases ALT/AST, foi realizada avaliação histopatológica e da atividade da mieloperoxidase. A análise estatística foi realizada por ANOVA de uma via seguida do teste de Bonferroni. Resultados : Os tratamentos comresveratrol, rutinaouquercetina em nanoemulsãoforam capazes de impedira alodiniamecânica, quandocomparados com o grupotratado com oxaliplatina. Em relação aoefeito sobre aesteato-hepatite, os tratamentos com resveratrol, quercetina e quercetina em nanoemulsãoreverteramsignificativamenteoaumento depeso médio do fígadoinduzido pela oxaliplatina. Corroborando com estes dados, a avaliaçãohistológicamostrou uma atenuação em todas as características deesteatose hepática avaliados nos grupostratados com resveratrol, rutina, quercetina e quercetina em nanoemulsão, apresentando características semelhantes ao controle positivo com N-acetilcisteína. Por outrolado, apenasos tratamentoscom quercetina e quercetina em nanoemulsão foram capazes dereduzir a migraçãode neutrófilosmedidapela atividadede mieloperoxidase. Conclusão : Os resultados sugerem que o uso dos compostos resveratrol, rutina, quercetina e quercetina em nanoemulsãopodem se alternativas efetivas para o tratamento.

Made available in DSpace on 2014-07-17T02:00:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000459170-Texto+Completo-0.pdf: 2176701 bytes, checksum: a35f9eb08768c0d90b70f0dca32cbe46 (MD5) Previous issue date: 2014 / The mycobacterial DNA-binding protein 2 (MDP2) of Mycobacterium tuberculosis is a small, basic protein known to bind to DNA in a non-specific manner and to anchor the nucleoid to the plasma membrane, promoting its unpacking. Motivated by a prior intrinsic disorder pre-diction in silico, we have used a complementary set of techniques to characterize this pro-tein, such as heat and chemical stability, gel filtration, limited proteolysis and electrophoret-ic mobility. Our results suggest that the MDP2 is structurally disordered, since it (1) was pre-dicted to be an IDP, having 86 % of its structure disordered; (2) resisted to denaturation in-duced by boiling temperature and to the chemical thrichloroacetic acid (TCA); (3) migrated anomalously on SDS-PAGE, appearing to be 1. 4-fold higher its calculated molecular weight; and (4) was highly sensitive to proteolysis performed by proteinase K in comparison to glob-ular proteins. We also accomplished two experiments to determine the quaternary structure of the MDP2, such as gel-filtration and glutaraldehyde crosslinking. These two experiments showed that the protein has a tendency of self-aggregation, forming large clusters of pro-tein. We also performed the site-directed mutagenesis by allelic exchange in the hns gene, in order to develop a M. tuberculosis strain lacking the protein MDP2. The result of this knock-out showed that the hns gene is not essential for the survival of the mycobacteria, confirm-ing previous results performed by transposon mutagenesis. Combined with previous results related to MDP2 from other works, we speculate that this protein uses its highly disorder N-terminal region to bind to DNA through its KAAK and PAKK sequences in a non-specific man-ner. Thereby the MDP2 may act as a promiscuous protein inside the cell, binding to different regions of nucleoid by forming large clusters of proteins, in order to perform the DNA un-packing and to regulate several genes of the mycobacteria. We hope this work may contrib-ute to a better understanding of the mycobacterial metabolism, since the M. tuberculosis still stands a major global threat. / A proteína micobacteriana ligadora de DNA 2 (MDP2) de Mycobacterium tuberculosis é uma proteína pequena e de caráter básico, conhecida por se ligar ao DNA de uma forma não es-pecífica e de ancorar o nucleóide à membrana plasmática promovendo o seu desempacota-mento. Motivados por uma predição de desordem intrínseca in silico prévia, nós usamos um conjunto de técnicas complementares para caracterizar esta proteína, tais como determina-ção da estabilidade ao calor e a desnaturantes químicos, gel filtração, proteólise limitada e mobilidade eletroforética. Nossos resultados sugerem que a MDP2 é estruturalmente de-sordenada, uma vez que ela (1) foi predita por ser uma proteína intrinsecamente desorde-nada (IDP), possuindo 86 % da sua estrutura desordenada; resistiu à desnaturação induzida por temperatura de fervura e pela ação química do ácido tricloroacético (TCA); (3) migrou anomalamente em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE), aparentando ser 1,4 vezes maior que o seu peso molecular calculado; e (4) foi altamente sensível à proteólise realizada pela protei-nase K, em comparação às proteínas globulares.Nós também realizamos dois experimentos para determinar a estrutura quaternária da proteína, como a gel filtração e o crosslinking por glutaraldeído. Estes dois experimentos mostraram que a proteína tem uma tendência a auto agregação, formando grandes aglomerados em solução. Também foi realizada a muta-gênese sítio-dirigida por troca alélica no gene hns, com o intuito de desenvolver uma cepa de M. tuberculosis sem a proteína MDP2. O resultado deste nocaute mostrou que o gene hns não é essencial para a sobrevivência da micobactéria. Combinado com resultados prévios de outros trabalhos relacionados à MDP2, nós especulamos que esta proteína usa sua região N-terminal altamente desordenada para se ligar ao DNA por meio das suas sequências repetiti-vas KAAK e PAKK de uma forma não específica. Desta forma, a MDP2 deve atuar como uma proteína promíscua dentro da célula, ligando-se a diferentes regiões do nucleóide pela for-mação de grandes aglomerados de proteína, com o objetivo de realizar o desempacotamen-to do DNA e de regular diversos genes micobacterianos. Nós esperamos que este trabalho possa contribuir para um melhor entendimento do metabolismo micobacteriano, uma vez que o M. tuberculosis ainda é uma grande ameaça global.

Made available in DSpace on 2014-07-18T02:01:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000459291-Texto+Completo-0.pdf: 2043101 bytes, checksum: 4e24ba48e0e78b22fe2b62461eb9b386 (MD5) Previous issue date: 2014 / Genotyping of polymorphic short tandem repeats (STRs) loci is widely used in forensic DNA analysis. STR loci eventually present tri-allelic pattern as a genotyping irregularity and, in that situation, the doubt about the tri-allele locus calculation can reduce the analysis strength. Alleles at the TPOX STR locus have 6– 14 different numbers of a four-nucleotide (AATG) repeat motif arranged in tandem. Although tri-allelic genotypes are generally rare, the TPOX tri-allelic pattern has a higher frequency, varying widely among populations. Despite this, there are few accurate reports to disclose the nature of the TPOX third allele. In this work we performed two studies: In the first one we present data obtained from 45 individuals belonging to the same pedigree, in which there were cases of tri-allelic TPOX genotypes. The subjects were apparently healthy with a normal biological development. We noticed six tri-allelic cases in this family, and all of them were women. Karyotype analysis showed no occurrence of partial 2p trisomy. All the tri-allelic cases had the genotype 8–10–11, probably due to three copies of the TPOX STR sequence in all cells (Type 2 tri-allelic pattern). Based on previous data we assumed an allele 10 as the TPOX third allele. The pedigree analyses show evidence that the TPOX extra allele was an allele 10, it is placed far from the main TPOX locus, and that there is a potential linkage of the TPOX extra-allele-10 with one marker on Xq. This was the first study that included a large pedigree analysis in order to understand the nature TPOX tri-allelic pattern. In the second study, we investigate whether there is a single third-extra allele in the TPOX tri-allelic pattern, what it is, and where it is. We looked for TPOX tri-allelic subjects in 75,113 Brazilian families. Considering only the parental generation (mother+father) we had 150,226 unrelated subjects evaluated. From this total, we found 88 unrelated subjects with tri-allelic pattern in the TPOX locus (0. 06%; 88/150,226). Seventeen percent of these subjects (15/88) presented heterozygosis with peak imbalance, which we describe as a derived category to Clayton’s Type 2 tri-allelic pattern (a higher peak of double dose homozygote plus a regular sized peak). In this paper we presented detailed data from 66 trios (mother+father+child; with true biological relationships) where the tri-allelic pattern was observed in the mother or in the father. In 39 of these families (39/66; 59%) the third-extra TPOX allele was transmitted either from the mother or from the father to the child. Our evidence indicated an allele 10 as the thirdextra TPOX allele, and it is on the X chromosome. The present data, which support the previous hypothesis, improve the knowledge about tri-allelic pattern of TPOX CODIS' locus allowing the use of TPOX profile in forensic analyses even when with tri-allelic pattern. This evaluation is now available for different forensic applications. / A genotipagem de short tanden repeats ( STRs ) é amplamente utilizada na análise de DNA forense, contudo eventuais ocorrências de trialelias podem reduzir o poder da análise. Alelos do lócus de STR TPOX tem de 6-14 números diferentes do motivo de repetição em tandem de quatro nucleotídeos (AATG). Apesar dos genótipos tri-alélicos sejam geralmente raro, o padrão tri-alélico do TPOX tem uma alta freqüência, variando amplamente entre as populações. Apesar disso, há poucos relatos precisos para divulgar a natureza do terceiro alelo do TPOX. Neste trabalho nós realizamos dois estudos: No primeiro, apresentamos os dados obtidos a partir de 45 indivíduos pertencentes à mesma linhagem, em que houve casos de genótipos tri-alélicos do TPOX. Os indivíduos foram aparentemente saudável, com um desenvolvimento biológico normal. Percebemos seis casos tri-alélicos nesta família, e todos eles foram em mulheres. A análise do cariótipo mostrou nenhuma ocorrência de trissomia parcial 2p. Todos os casos trialélicos tinham o genótipo 8-10-11, provavelmente devido a três cópias da seqüência do STR TPOX em todas as células (Padrão tri-alélico tipo 2). Com base nos dados anteriores, assumimos o alelo 10 como sendo o terceiro alelo do TPOX. As análises do pedigree mostraram evidências de que o alelo extra do TPOX foi o alelo 10, é localizado distante do lócus principal do TPOX, e que existe um potencial de ligação entre o alelo- extra-10 do TPOX com um marcador em Xq. Este foi o primeiro estudo que incluiu uma grande análise do pedigree, a fim de compreender a natureza do padrão tri-alélico do TPOX. No segundo estudo, investigamos se há um único terceiro extra-alelo no padrão tri-alélico do TPOX, o que é ele, e onde está. Nós pesquisamos por indivíduos tri-alélicos no lócus TPOX em 75. 113 famílias brasileiras. Considerando apenas a geração parental (mãe + pai) tivemos 150. 226 indivíduos não relacionados avaliados. Desse total, encontramos 88 indivíduos não relacionados com o padrão tri-alélico no lócus TPOX (0,06%, 88/150, 226). Dezessete por cento destes indivíduos (15/88) apresentaram heterozigoses com desbalanço de picos, que descrevemos como uma categoria derivada do padrão tri-alélico de Clayton Tipo 2 (um pico mais alto de homozigoto dose dupla, mais um pico de tamanho regular). Neste trabalho, apresentamos dados detalhados de 66 trios (mãe + pai + filho; com verdadeiras relações biológicas) onde o padrão tri-alélico foi observado na mãe ou no pai. Em 39 destas famílias (39/66; 59%) o terceiro alelo-extra do TPOX foi transmitido tanto a partir da mãe ou do pai para a criança. Nossas evidências indicaram o alelo 10 como sendo o terceiro alelo-extra do TPOX, e ele está no cromossoma X. Os dados apresentados, os quais suportam as hipóteses anteriores, melhoram o entedimento sobre o padrão tri-alélico do lócus TPOX do CODIS permitindo o uso do perfil TPOX em análises forense, mesmo quando com o padrão tri-alélico. Essa avaliação está agora disponível para diferentes aplicações forenses.

Made available in DSpace on 2014-07-19T02:01:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000459408-Texto+Completo-0.pdf: 1270061 bytes, checksum: a4594eb8c40c25e57008dc9d40066c93 (MD5) Previous issue date: 2014 / We evaluated haplotype and allele frequencies, as well as statistical forensic parameters, for 23 Y-chromosome short tandem repeats (STRs) loci of the PowerPlex®Y23 system (DYS19, DYS385a/b, DYS389I/II, DYS390, DYS391, DYS392, DYS393, DYS437, DYS438, DYS439, DYS448, DYS456, DYS458, DYS635, Y-GATA-H4, DYS481, DYS533, DYS549, DYS570, DYS576, DYS643) in a sample of 150 apparently healthy males, resident in south Brazil. A total of 150 different haplotypes were identified. The highest gene diversity was observed for the single locus marker DYS570 (GD = 0. 7888) and for a two-locus system DYS385 (GD = 0. 9009). We also examined 150 father-son pairs by the same system, and observed a total of 13 mutations were identified in the 3,450 father-son allelic transfers, with an overall mutation rate across the 23 loci of 3. 768 x 10-3 (95% CI = 3. 542 x 10-3 to 3. 944 x 10-3). In all cases there was only one locus mutated with gain/loss of repeats in the son (5 one-repeat gains, and 7 one-repeat and 1 two-repeat losses); we observed no instances of mutations involving a non-integral number of repeats. / Foram avaliadas as frequências alélicas e haplotípicas, bem como os parâmetros estatísticos forenses, para 23 lócus Short Tandem Repeat (STRs) de cromossomo Y presentes no kit comercial PowerPlex®Y23 system (DYS19, DYS385a/b, DYS389I/II, DYS390, DYS391, DYS392, DYS393, DYS437, DYS438, DYS439, DYS448, DYS456, DYS458, DYS635, Y-GATA-H4, DYS481, DYS533, DYS549, DYS570, DYS576, DYS643) em uma amostra de 150 homens saudáveis, residentes no sul do Brasil. Um total de 150 haplótipos diferentes foram identificados. A maior diversidade genética foi observada para o marcador de lócus único DYS570 (GD = 0,7888) e para o lócus duplo DYS385 (GD = 0,9009). Também foram analisados 150 de pares de pai-filho pelo mesmo sistema, e um total de 13 mutações foram observadas em 3. 450 transferências alélicas entre pais-filhos, com uma taxa geral de mutação nos 23 lócus de 3. 768 x 10-3 (95% CI = 3. 542 x 10-3 - 3. 944 x 10-3). Em todos os casos foi encontrado apenas um lócus mutado com ganho ou perda de repetições no filho (5 ganhos de repetição única, 7 perdas de repetição única e 1 perda de dupla-repetição). Não foi observado nenhum caso de mutação envolvendo um número não integral de mutações.

Made available in DSpace on 2014-07-19T02:02:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000459527-Texto+Completo-0.pdf: 855354 bytes, checksum: 2ebbe767e99c1ddc288d33fdf6ff1ebe (MD5) Previous issue date: 2013 / Salmonella enterica is an important pathogen that causes gastroenteritis, and is transmitted to human through the consumption of contaminated food, especially from animal origin. The use of antimicrobials for therapeutic purposes in veterinary medicine and as growth promoters in animals used for food production has been considered one of the causes of emergence and spread of multi-drug resistant (MDR) S. enterica, representing a major risk to public health. Thus, the aim of this study was to determine antimicrobial resistance profiles as well as to characterize the main determinants involved on phenotypes of resistance in S. enterica isolates from poultry by-product meal and from other samples derived of poultry production chain, especially from environment of broiler houses. A total of 203 S. enterica isolates was analyzed, being 106 from poultry by-product meal and 97 isolated mainly from drag swabs. Higher percentages of resistance were detected in S. enterica isolated from drag swab when compared with isolates from poultry by-product meal. The highest percentages of resistance were found to sulfonamides followed by tetracycline, trimethoprim-sulfamethoxazole, nalidixic acid, streptomycin and spectinomycin. The majority of isolates was sensitive to ciprofloxacin and enrofloxacin. MDR phenotypes were detected in 37 (18. 2%) isolates and the profile penta-resistant (ampicillin, chloramphenicol, streptomycin, tetracycline and sulphamethoxazole) was detected in S. Heidelberg, S. Cerro and two S. Senftenberg. Class 1 integrons was found in 26 isolates (12. 7 %), and did not detect the presence of class 2 integron. A S. Senftenberg isolated from environment was found to harbor two class 1 integrons: one integron with a typical 3’CS, and the other with an atypical 3′CS linked to the qacH–sul3. The sul1, sul2 and sul3 genes were detected in 18. 7%, 32. 5% and 31. 2% S. enterica phenotypically resistant to sulfonamide, respectively. blaCMY, blaCTX-M and blaTEM genes were detected in 23. 8%, 9. 5% and 85. 7% of isolates resistant to β -lactams, respectively. Resistance determinants tetA, tetB and tetC were observed in 70%, 10% and 10% of isolates resistant to tetracycline, respectively. aadA and aadB genes were detected in 26. 1% and 32. 1% of isolates resistant to aminoglycosides, as well as the presence of strA and strB genes in 44. 4% and 34. 9% of S. enterica isolates phenotypically resistant to streptomycin. The presence of a heterogeneous profile of antimicrobial determinants and mobile genetic elements in the isolates analyzed indicates the potential risk that these bacteria represent to human health. / A Salmonella enterica é um importante patógeno causador de gastrenterite transmitido para humanos através do consumo de alimentos contaminados, principalmente os de origem animal. O uso de antimicrobianos para fins terapêuticos na medicina veterinária e como promotores de crescimento em animais destinados à produção de alimentos tem sido apontado como uma das causas do surgimento e disseminação de S. enterica multi-resistentes (MDR), constituindo um grande risco para a saúde publica. Dessa forma, o objetivo do presente trabalho foi determinar o perfil de resistência a antimicrobianos, bem como caracterizar os principais determinantes envolvidos nos fenótipos de resistência em isolados de S. enterica provenientes de farinhas de aves e de outras amostras oriundas da cadeia produtiva do frango, especialmente do ambiente de criação. Um total de 203 isolados de S. enterica foi analisado, sendo 106 oriundos de farinhas de aves e 97 provenientes, principalmente, de suabes de arrasto. Percentuais mais elevados de resistência foram detectados em S. enterica isoladas de suabe de arrasto, quando comparadas com isolados de farinhas de aves. Os maiores percentuais de resistência foram encontrados para sulfonamida, seguida por tetraciclina, trimetoprim-sulfametoxazol, ácido nalidíxico, estreptomicina e espectinomicina.A maioria dos isolados foi sensível à ciprofloxacina e à enrofloxacina. Fenótipos de MDR foram observados em 37 (18,2%) isolados, sendo que o perfil penta-resistente (ampicilina, cloranfenicol, estreptomicina, sulfametoxazol e tetraciclina) foi detectado em S. Heidelberg, S. Cerro e em duas S. Senftenberg. Integrons de classe 1 foram detectados em 26 isolados (12,7%), e não foi observada a presença de integron de classe 2. Uma S. Senftenberg isolada a partir do ambiente apresentou dois integrons de classe 1: um com um 3’CS típico e outro com 3′CS atípico ligado a qacH–sul3. Os genes sul1, sul2 e sul3 foram detectados, respectivamente, em 18,7%, 32,5% e 31,2% dos isolados de S. enterica fenotipicamente resistentes à sulfonamida. Os genes blaCMY, blaCTX-M e blaTEM foram detectados 23,8%, 9,5% e 85,7% dos isolados resistentes aos β-lactâmicos, respectivamente. Os determinantes de resistência tetA, tetB e tetC foram observados em 70%, 10% e 10% dos isolados resistentes à tetraciclina, respectivamente. Os genes aadA e aadB foram encontrados em 26,1% e 32,1 % dos isolados resistentes aos aminoglicosídeos, assim como a presença dos genes strA e strB foi detectada em 44,4% e 34,9% dos isolados de S. enterica fenotipicamente resistentes à estreptomicina. A presença de um perfil heterogêneo de determinantes de resistência e de elementos genéticos móveis nos isolados analisados indica o potencial risco que estas bactérias representam para a saúde humana.