Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-graduação em Biologia Vegetal. / Made available in DSpace on 2012-10-21T22:49:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 224669.pdf: 195363417 bytes, checksum: d4ae2cd433c0faa70e32f11307f4465f (MD5) / O trabalho em pauta tem como objetivo ampliar o conhecimento lignitafoflorístico do Permiano da Bacia do Paraná, em Santa Catarina, através do estudo taxonômico de lenhos oriundos do Planalto de Canoinhas, norte do Estado. Para isso foram realizadas seis viagens de campo para coleta de material, obtendo-se um total de seis fragmentos lenhosos, coletados em afloramentos fossilíferos existentes na área em questão. Destes, duas amostras integralmente preservadas foram selecionadas, uma proveniente da Formação Rio Bonito (CP/P 110), Município de Mafra; e uma da Formação Teresina (CP/P 112), Município de Monte Castelo. Além destes, foi incorporada a pesquisa uma amostra já existente no acervo paleontológico do CENPÁLEO (CP/P 111), oriunda do mesmo local de CP/P 110. O material coletado, foi mensurado e fotografado, então foi submetido à laminação petrográfica no Instituto de Geociências/USP e a analise anatômica em microscópio óptico no Laboratório de Paleobotânica do Departamento de Botânica, CCB, UFSC e no Laboratório de Microscopia do CENPÁLEO, UnC/Mafra, durante a qual foram descritas as características anatômicas de cada exemplar. A identificação taxonômica foi realizada através de comparação dos lenhos obtidos com espécimes de mesma idade, descritos na literatura. Desta constatou-se que CP/P111 possuía muitas semelhanças, entre estas, medula diafragmada, pontoações radiais dos traqueídeos do tipo subpodocarpóide, campos de cruzamento do tipo filocladóide e o xilema primário endárqueo, com Retemedulloxylon refertum Merlotti 1998a, espécie já descrita, optando-se por designa-lo como sendo a mesma espécie. O outro fragmento coletado em Mafra, CP/P 110, apesar de ser muito semelhante a Aterradoxylon Merlotti 1999b quanto as pontoações radiais dos traqueídeos e dos campos de cruzamento e o xilema primário endárqueo, possui características diferentes como, uma medula maciça e heterogênea composta por células parenquimáticas e células secretoras, que o diferencia dos demais espécimes consultados na literatura, portanto, optou-se por criar um novo gênero e espécie, Mafroxylon belavistense. O espécime CP/P 112, constituído apenas por um manto radicular, foi possível se observar à existência de inúmeros anéis compostos por fibras esclerenquimáticas, os quais estão imersos em células parenquimáticas. No interior destes anéis também foi encontrado parênquima, e em seu centro ocorre a incidência de um círculo de origem parenquimática, inédito na literatura, onde o xilema primário exárqueo esta imerso. Como o espécime somente era constituído pelo manto radicular, não foi possível determinar a qual espécie este fragmento pertence, mas devido as suas afinidades ao gênero Psaronius Cotta 1832, como uma actinostele com 6 pontas, optou-se por coloca-lo como pertencente ao mesmo gênero. Neste espécime foi constatada a presença de uma epífita desconhecida e de Tubicalis sp., que representa uma pequena pteridófita epifítica, com protostelos exárqueos e xilema entre as células parenquimáticas. Estas se apresentam normalmente arredondadas em vista transversal e alongadas em altura longitudinalmente.

Made available in DSpace on 2015-12-10T14:24:17Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-07-20. Added 1 bitstream(s) on 2015-12-10T14:30:27Z : No. of bitstreams: 1 000854092.pdf: 4152129 bytes, checksum: 2349bde07b4af6efb99d75bc7ad08203 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Programa de Apoio ao Desenvolvimento Científico (PADC) da Faculdade de Ciências Farmacêuticas - UNESP / O fator da tradução 5A (eIF5A) é altamente conservado em arqueas e eucariotos e essencial para a viabilidade celular. eIF5A é a única proteína conhecida que contém o aminoácido essencial hipusina, gerado através de uma modificação pós-traducional conhecida como hipusinação e que ocorre em duas etapas enzimáticas catalisadas pelas enzimas desoxi-hipusina sintase (Dys1) e desoxi-hipusina hidroxilase (Lia1). Apesar de eIF5A ter sido relacionada recentemente com a etapa da elongação da tradução, a função específica de eIF5A nesse processo, bem como o papel do resíduo de hipusina ainda não estão descritos. Com esse intuito, este trabalho aprofundou inicialmente a caracterização do mutante dys1-1, mutante condicional da enzima desoxi-hipusina sintase. Os resultados revelaram que o mutante dys1-1 apresenta defeito no perfil polissomal característico de fatores que atuam na etapa da elongação da tradução, diminuição da ligação de eIF5A nos polissomos e redução dos níveis de síntese proteica total. Além disso, foram realizadas análises de interação genética envolvendo eIF5A e dirigidas por hipóteses, à partir de dados já publicados ou resultados obtidos previamente pelo laboratório. Nestas análises foi identificada letalidade sintética entre mutantes de ASC1 e o mutante dys1-1, assim como interações genéticas negativas (synthetic sick) entre o mutante tif51A-1 e mutantes de genes relacionados com secreção, mais especificamente com a translocação de proteínas para o retículo endoplasmático pela via co-traducional. Finalmente, foram realizados rastreamentos de interações genéticas em larga escala por Synthetic Genetic Array (SGA), utilizando diferentes mutantes de eIF5A e duas coleções de linhagens mutantes de S. cerevisiae (linhagens nocautes e mutantes sensíveis a temperatura). Os resultados revelaram, respectivamente, 338 e 239 genes das coleções de linhagens nocautes e mutantes... / The translation factor 5A (eIF5A) is highly conserved in arqueas and eukaryotes and essential for cell viability. eIF5A is the only protein known to contain the essential amino acid hypusine, generated by a post-translational modification known as hypusination which occurs in two enzymatic steps catalyzed by the enzymes deoxyhypusine synthase (DYS1) and deoxyhypusine hydroxylase (Lia1) enzymes. Although eIF5A has been implicated with the elongation step of translation, its specific function and the role of the hypusine residue is still unknown. For this purpose, this work further characterized the dys1-1 mutant, a conditional mutant of the deoxyhypusine synthase. The results revealed that the dys1-1 mutant shows a polysome profile defect characteristic of translation elongation factors, decrease of eIF5A binding to the polysome fractions and reduction of the total protein synthesis rate. Furthemore, genetic interaction analyses of eIF5A driven by hypotheses, from published and previous data obtained in our laboratory, were performed and revealed synthetic lethality between ASC1 mutants and the dys1-1 mutant and negative genetic interactions (synthetic sick) between the tif51A-1 mutant and mutants of genes related with secretion, specifically those involved with the co-translational translocation of proteins into the endoplasmic reticulum. Finally, high throuput genetic interaction analyses by Synthetic Genetic Array (SGA) were carried out using different eIF5A mutants and two S. cerevisiae mutant strain collections (deletion strains and temperature-sensitive mutants). The results showed, respectively, 338 and 239 genes of the deletion mutant and the temperature-sensitive mutant collections interacting with eIF5A mutants. A total of 577 positive and negative genetic interactions were observed. Moreover, the gene ontology analysis revealed genes involved with cell cycle (53%), DNA repair (18%), translation (16%) and vesicular trafficking/... / FAPESP: 11/50801-4

Orientador : Prof. Dr. Silvio Marques Zanata / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 12/12/2016 / Inclui referências : f. 65-70 / Resumo: A ubiquitinação está envolvida em vários processos no organismo, desde ciclo celular até vias de sinalização de apoptose. Por esse amplo envolvimento, é de extrema importância uma fina regulação que é realizada por enzimas chamadas deubiquitinases (DUBs) que hidrolisam ligações isopeptídicas. Dentre todas as DUBs, USP é a família mais extensa tendo como membro USP2 que possui duas isoformas fruto de processamento alternativo: USP2a (de 69kDa) e USP2b (de 45kDa) que se diferenciam apenas na região N-terminal. Alguns estudos relacionam essas isoformas com a via da p53, miogênese, tumores de próstata, agressividade de tumores de mama e manutenção dos níveis de Na+ e pressão sanguínea. Apesar desses estudos, a distribuição tecidual da USP2 ainda não está completamente estabelecida. A presença de duas isoformas distintas de processamento e a inexistência de anticorpos comerciais que possam distinguir entre as duas isoformas justifica a produção de reagentes confiáveis para o estudo de USP2. Desde modo, o objetivo foi produzir anticorpo monoclonal, isoforma específico, para USP2a e clonar, produzir proteína recombinante em bactérias e superexpressar USP2b em células eucariontes. USP2a foi produzida em E. coli BL21(DE3)STAR fusionada com etiqueta de histidina e purificada por coluna de Ni-NTA. A proteína purificada foi usada para imunizar camundongos balb/c. O soro policlonal desses animais foi testado por western blot para a presença de anticorpo anti-USP2a quanto ao reconhecimento da proteína endógena e superexpressa em linhagens de próstata LNCaP e RWPE-1 tendo dois animais positivos usados para a fusão com mieloma. Os hibridomas após a diluição limitante foram varridos por ELISA chegando-se a um clone 4GD2 que reconheceu USP2a superexpressa em HEK293T e não reconheceu USP2b superexpressa em HEK293T, indicando que obteve-se sucesso na produção de um anticorpo monoclonal isoforma específico para USP2a. Além disso, a isoforma USP2b foi clonada com sucesso nos vetores pET28a(+) e pcDNA3.1(-)6his. Esta isoforma não foi expressa em E. coli mesmo com várias mudanças no sistema, desde cepa bacteriana até temperatura, meio e tempo de expressão, mas foi superexpressa em HEK293T. As ferramentas produzidas serão de extrema importância para estudos de mapeamento tecidual, análise de cinética e busca de novos parceiros moleculares para essas isoformas. Palavras-chave: USP2, USP2a, USP2b, anticorpo monoclonal, proteína recombinante. / Abstract: Several physiological processes involve ubiquitylating modification, from cell cycle to apoptosis pathways. Because this involvement has a large range, it is extremely important that this post-translational modification be tightly regulated. Enzymes called deubiquitinases (DUBs) hydrolyze isopeptide bond and have a pivotal role in this regulation. Among all DUBs, the USP is the largest family. USP2, a member of this family, has two isoforms from alternative splicing: USP2a (69kDa) and USP2b (45kDa) and differences rely within their N-terminal regions. These isoforms have related to p53 pathway, myogenesis, prostate tumors, breast tumors aggressiveness and maintenance of Na+ levels and blood pressure. Despite these studies, the tissue distribution of USP2 is not completely established. Absences of commercial antibody that recognize specific isoforms justify the production of reliable reagents to study USP2. Thus, the aims of this study were (1) to express both USP2a and USP2b in heterologous bacterial system; (2) to overexpress USP2b in mammalian cells and (3) to produce monoclonal antibodies specific to USP2a isoform. USP2a was produced in E. coli BL21(DE3)STAR fused with polyhistidine tag and purified by Ni-NTA column. The purified protein was used to immunize Balb/c mice strain. We have tested the polyclonal serum of these animals by western blot to the presence of antibody anti-USP2a that recognize endogenous and overexpressed protein in prostate line LNCaP and RWPE-1. Two animals were positive and employed in fusion procedures. After hybridoma supernatant screenings for anti-USP2a presence by ELISA, we isolated the clone 4GD2, which was stable and still secreting antibodies after several freeze-thaw cycles. Monoclonal antibody 4GD2 recognizes USP2a overexpressed in HEK293T cells and does not cross-react with USP2b, suggesting that MoAb 4GD2 is highly specific. In addition, USP2b was successfully cloned in pET28a(+) and pcDNA3.1(-)6his vectors, both expression vectors for prokaryotic and eukaryotic systems, respectively. We were not able to express successfully USP2b in E. coli under different protocols (e.g. temperature, medium and time parameters changes), however we expressed His-tagged USP2b in HEK293T cells. The produced tools will be extremely important in further studies, such as tissue and temporal USP2 expression mapping, USP2 expression and disappearing kinetics in cell lines and characterization of new molecular partners for this DUB. Key words: USP2, USP2a, USP2b, monoclonal antibody and recombinant protein.

Orientadora : Profª. Drª. Dorly de Freitas Buchi / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 20/03/2015 / Inclui referências : fls. 66-72 / Resumo: A pele, o maior órgão do corpo humano, principal interface entre o organismo e o meio ambiente, está constantemente exposta a fatores físicos, químicos e biológicos. Essas interações podem ocorrer de forma exacerbada e prejudicial, resultando em reações adversas, como processos inflamatórios cutâneos. Dentre o grupo de substâncias que podem apresentar riscos à saúde humana via exposição dérmica, têm-se os corantes têxteis. Inúmeros corantes têm sido empregados no tingimento de tecidos, entretanto, estudos têm mostrado que diversos grupos de corantes comumente utilizados são capazes de induzir efeitos deletérios aos organismos expostos, por exemplo, danos no DNA e reações alérgicas. O fato dos vestuários poderem conter substâncias químicas nocivas e o conhecimento de que, mesmo após sucessivas lavagens, os corantes são capazes de migrarem e penetrarem na pele em casos de transpiração intensa, a necessidade de uma melhor avaliação da segurança destes produtos tem se mostrado relevante e de caráter imediato. Métodos alternativos à experimentação animal (métodos in vitro) são atualmente utilizados para avaliar o potencial nocivo de diferentes produtos, tanto pelo setor acadêmico como industrial. O objetivo desse trabalho foi avaliar as respostas celulares relacionados a um possível processo inflamatório de dois corantes têxteis [Reactive Red 120 (RR120) - grupo azo e Reactive Blue 19 (RB19) - grupo antraquinona] comumente empregados no tingimento de fibras de algodão. A fim de mimetizar a via de exposição dérmica foram utilizadas duas linhagens celulares murinas, fibroblastos (BALB 3T3) e macrófagos (RAW 264.7). Para tanto, após a definição da faixa de concentração tóxica de cada corante teste por ensaios de citotoxicidade (MTT e NRU), foram avaliadas a produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) em conjunto com a detecção e quantificação de citocinas inflamatórias. A condição geral das células da pele foi determinada pela avaliação da morfologia celular através de técnicas de microscopia de luz e eletrônica de varredura. Para a análise estatística foi utilizada a análise de variância ANOVA seguido do teste de Tukey. As culturas celulares expostas a estes corantes por 24 horas mostraram, tanto através da microscopia de luz quanto na eletrônica de varredura, que os corantes em estudo possuem ação citotóxica nas concentrações acima de 500 ?g/ml. As duas linhagens celulares aumentaram a liberação de ROS, com maior destaque para o corante RB19. A ação inflamatória dos corantes RR120 e RB19 foi então detectada nos fibroblastos pelo aumento na liberação das proteínas Monocyte Chemoattractant Protein-1 (MCP-1) e IL-6, caracterizando uma resposta imunológica do tipo celular. Já nos macrófagos, foram detectados aumento na liberação de IL-10, inibidora da resposta imunológica do tipo celular e ativadora de linfócitos B, e diminuição na liberação de MCP-1 e TNF, caracterizando uma resposta imunológica do tipo humoral. Estes resultados indicam que os corantes RR120 e RB19 podem ser nocivos quando em contato com o tecido cutâneo em concentrações acima de 500 ?g/ml. Nos permite concluir também que o potencial de uma substância química em causar respostas inflamatórias cutâneas possa ser previsto com testes in vitro, através da utilização de técnicas como microscopia de luz, microscopia eletrônica de varredura, testes bioquímicos básicos e citometria de fluxo, métodos alternativos a serem considerados na substituição à experimentação animal. Palavras-chave: corantes têxteis reativos; células de pele murina in vitro; respostas inflamatórias; exposição dérmica. / Abstract: The skin, the largest organ of the human body, the main interface between the organism and the environment, constantly exposed to physical, chemical and biological factors. These interactions may occur exacerbated and harmful, resulting in adverse reactions, such as skin inflammation. Among the group of substances that may pose risks to human health through dermal exposure, have been the textile dyes. Numerous dyes have been used in fabric dyeing, however, studies have shown that various dyes groups commonly used are capable of inducing deleterious effects to the exposed organisms, for example, DNA damage and allergic reactions. The fact of garments may contain harmful chemicals and the knowledge that, even after repeated washings, the dyes are able to migrate and penetrate the skin in cases of heavy sweating, the need for better safety assessment of these products has proven relevant and immediacy. Alternative methods to animal experiments (in vitro methods), currently used to evaluate the harmful potential of different products, both by academia and industry. The objective of this study was to evaluate the cellular responses related to a possible inflammatory process of two textile dyes [Reactive Red 120 (RR120) - azo group and Reactive Blue 19 (RB19) - anthraquinone group] commonly used in the dyeing of cotton fibres. To mimic via of dermal exposure were used two murine cell lines, fibroblasts (BALB 3T3) and macrophages (RAW 264.7). To this end, after defining the range of toxic concentration of each dye test for cytotoxicity assays (MTT and NRU) were evaluated the production of reactive oxygen species (ROS) in conjunction with the detection and quantification of inflammatory cytokines. Determined the general condition of the skin cells by evaluation of cell morphology by techniques of light and scanning electron microscopy. For statistical analysis, we used the ANOVA followed by Tukey test. Cell cultures exposed to these dyes for 24 hours showed both through light microscopy and scanning electron, the dyes studied have cytotoxic action at concentrations above 500 ?g/ml. Both cell lines increased the release of ROS, most notably the RB19 dye. Detected the inflammatory action of RB19 and RR120 dyes in fibroblasts by increasing the release of Monocyte Chemoattractant Protein-1 proteins (MCP-1) and IL-6, featuring an immune response of cellular type. However in macrophages were detected increase in the release of IL-10, an inhibitor of immune response on the cell type and activating B-lymphocytes, and reduction in release of MCP-1 and TNF, featuring an immune response of humoral type. These results indicate that the RR120 and RB19 dyes can be harmful when in contact with the skin tissue at concentrations above 500 ?g/ml. Also allows us to conclude that the potential of a chemical to cause cutaneous inflammatory responses can be predicted with in vitro tests, using techniques such as light microscopy, scanning electron microscopy, basic biochemical tests and flow cytometer, alternative methods to consider in the replacement of animal experiments. Key words: reactive textile dyes; murine skin cells in vitro; inflammatory responses; dermal exposure.

Orientadora : Profª Drª Olga Meiri Chaim / Coorientador : Prof. Dr. Silvio Sanches Veiga / Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 01/02/2017 / Inclui referências : f. 110-130 / Resumo: As fosfolipases de aranhas do gênero Loxosceles, também conhecidas como toxinas dermonecróticas, são as toxinas do veneno melhor caracterizadas do ponto de vista bioquímica e biológica e estão relacionadas a diversos eventos, como hemólise, coagulação intravascular disseminada, edema e indução de resposta inflamatória. Os principais substratos lipídicos para estas toxinas são a esfingomielina e lisofosfatidilcolina que, após sua hidrólise, geram como produtos a ceramida-1-fosfato e o ácido lisofosfatídico, respectivamente, lipídeos bioativos que estão envolvidos em diversos processos celulares, incluindo a modulação da resposta inflamatória. A toxina LiRecDT1, a primeira isoforma de fosfolipase recombinante de L. intermedia caracterizada, além de promover o recrutamento de neutrófilos em pele de coelho, se liga à membrana de células endoteliais de aorta de coelho, promovem alterações morfológicas e induzem a reorganização de microdomínios de membrana caracterizados por lipid rafts, porém, os mecanismos envolvidos neste processo ainda permanecem desconhecidos. Desta forma, os objetivos deste trabalho compreenderam a análise dos mecanismos moleculares da ação do veneno e da LiRecDT1 após a interação com a membrana de células endoteliais, visando determinar as alterações morfológicas das células, alterações bioquímicas da membrana plasmática, e a possível internalização da toxina recombinante. Primeiramente, as toxinas LiRecDT1 e LiRecDT1/H12A (isoforma mutada com atividade residual) foram expressas em cepa de E. coli e então avaliadas em relação à sua atividade esfingomielinásica, de modo que as toxinas foram obtidas com alto grau de pureza e tanto o veneno como a LiRecDT1 apresentaram atividade esfingomielinásica, sendo que a LiRecDT1/H12A apresentou atividade residual. Em seguida, foi verificado que o veneno promove a desadesão de células endoteliais de aorta de coelho (RAEC) e que a LiRecDT1 promove a vacuolização citoplasmática e alteração na morfologia celular após 2 horas de incubação com a toxina, sendo que este evento é observado até 24 horas. Ainda, a interação da LiRecDT1 com a membrana plasmática destas células foi avaliada por microscopia de fluorescência confocal, TIRF, e de super-resolução, onde foi possível visualizar que a LiRecDT1 se liga à membrana das células e promove a reorganização de lipid rafts após 1 hora, e se liga à caveolina-1 presente nestes domínios de maneira tempo-dependente. Ainda, os dados da microscopia de super-resolução sugeriram a possível endocitose da LiRecDT1, o que foi comprovado pela co-localização com proteínas do sistema endossomo/lisossomo após 1 e 4 horas, por microscopia confocal. Sendo assim, fica evidente que a toxina interage com a membrana plasmática de células endoteliais, especificamente com microdomínios de lipid rafts, e é internalizada e endereçada para compartimentos do sistema endossomo/lisossomo. Contudo, novos estudos devem ser realizados a fim de caracterizar possíveis parceiros moleculares para a LiRecDT1, assim como investigar vias de sinalização ativadas/inativadas decorrentes da reorganização dos microdomínios de membrana. Além disso, é discutida a possibilidade de a LiRecDT1 estar sendo enviada para a membrana ou até mesmo ser exocitada após a sua internalização, de modo que outros destinos intracelulares para a toxina recombinante podem ser exploradas. Palavras-chace: Fosfolipases-D, L. intermedia, lipid rafts, endocitose / Abstract: Phospholipases from Loxosceles spiders, also known as dermonecrotic toxins, are the best-characterized toxins in the venom regarding their biochemical and biological activities, and they are related to several events such as hemolysis, disseminated intravascular coagulation, edema, and induction of inflammatory responses. Their main lipid substrates are sphingomyelin and lysophosphatidylcholine, that, agter hydrolysis, generate ceramide-1-phosphate and lysophosphatidic acid as subproducts, respectively, which are bioactive lipids involved in cellular processes including the modulation of inflammatory responses. The toxin LiRecDT1, the first characterized recombinant phospholipase isoform from L. intermedia, besides recruiting neutrophils in rabbit skin, binds rabbit aorta endothelial cells membrane, and induce lipid raft reorganization, however, the mechanisms that drive such process remain unknown. Thus, the objectives os this work regarded the analysis of the molecular mechanisms of action of the venom and LiRecDT1 after interaction with endothelial cell membrane, aiming to determine the cell morphological alterations, plasma membrane biochemical alterations, and the possible internalization of the recombinant toxin. First, the toxins LiRecDT1 and LiRecDT1/H12A (mutated isoform with residual activity) were expressed in an E. coli strain and then evaluated in relation to their sphingomyelinase activity. The toxins were obtained with high putiry levels and the venom and LiRecDT1 showed sphingomyelinase activity, and LiRecDT1/H12A showed only residual activity. After, it was shown that the venom promotes rabbit aorta endothelial cell (RAEC) detachment, and that LiRecDT1 induces cell vacuolization and cell morphology alteration after two hours incubation with the toxin, event still observed after 24 hours. Moreover, the interaction of LiRecDT1 with the plasma membrane of these cells was evaluated by confocal fluorescence microscopy, TIRF, and superresolution microscopy, where it was observed that LiRecDT1 binds the cell membrane and promote lipid raft reorganization after 1 hour, and binds caveolin- 1 present in these domains in a time-dependent manner. Data from the superresolution microscopy suggested the possible LiRecDT1 endocytosis, which was proved to be true after the co-localization with proteins present in endosome/lysosome compartments after 1 and 4 hours, by confocal microscopy. Thus, its evident that the toxin interacts with endothelial cell plasma membrane , especifically with lipid rafts, and is internalized and sent to endosomal/lysosomal compartments. However, more studies must be taken in order to characterize possible molecular partners for LiRecDT1, as well as investigate signaling pathways modulated by the reorganization of lipid rafts. Besides, the possibility of LiRecDT1 being sent to the membrane or even being exocytosed after its internalization is discussed, as other intracellular targets for the recombinant toxin may be explored. Key words: Phospholipases-D, L. intermedia, lipid rafts, endocytosis.

Made available in DSpace on 2015-04-09T12:28:23Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-08-29Bitstream added on 2015-04-09T12:48:12Z : No. of bitstreams: 1 000810624_20170829.pdf: 165327 bytes, checksum: 7335e36c8ac7360ff615beba6af27f84 (MD5) Bitstreams deleted on 2017-09-01T13:14:02Z: 000810624_20170829.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2017-09-01T13:15:01Z : No. of bitstreams: 1 000810624.pdf: 2405456 bytes, checksum: b0b79d0ba3d3f1f429b64fb272de2c61 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Muitos peptídeos extraídos de plantas e secreções de animais exibem um amplo espectro de atividade antimicrobiana contra bactérias gram-positivas, negativas, fungos e parasitas. Devido a essa característica e ao crescente aumento da resistência dos microrganismos patogênicos às formas de tratamento convencionais, especula-se a utilização destes peptídeos como possíveis novos fármacos. Por isso, várias técnicas experimentais e teóricas que fazem uso de sistemas miméticos do ambiente membranar têm sido utilizadas para se estudar os mecanismos de ação desta classe de peptídeos. No presente trabalho, utilizam-se simulações por Dinâmica Molecular com o intuito de investigar a influência de algumas características de interação peptídeo-peptídeo e peptídeo-membrana sobre a eficiência biológica de Protonectinas e Jeleínas. Protonectina e Protonectina 1-6 são peptídeos antimicrobianos, o primeiro apresenta atividade hemolítica, de degranulação de mastócitos e quimiotática, enquanto o segundo apresenta somente a atividade quimiotática. Dados experimentais indicam que a associação destes dois peptídeos (proporção 1:1) gera uma forma de estrutura supramolecular agregada e também aumenta as atividades hemolíticas e de degranulação de mastócitos, enquanto a atividade quimiotática decresce acentuadamente, ou seja, em associação eles apresentam um comportamento mais acentuado de interação com membranas. Tendo em vista estes resultados, especulam-se, neste trabalho, quais as interações entre Protonectina/Protonectina 1-6 (mistura) que estariam associadas à formação de tal estrutura agregada e quais as implicações desta estrutura no mecanismo de interação com membrana. Os resultados das simulações em água e micela de SDS para estes peptídeos indicam que há a tendência de agregação entre Protonectinas puras e Protonectina/Protonectina 1-6, e que esta ocorre por meio de ligações por ... / Many peptides extracted from plants and animal secretions exhibit a broad spectrum of antimicrobial activity against bacteria gram-negative, gram-positive, fungi and parasites. Due this characteristic and the increasing resistance of pathogenic microorganisms to conventional forms of treatment, it is speculated the use of these peptides as potential new drugs. Therefore, various experimental and theoretical techniques that make use of membrane mimetic systems have been used to study the mechanisms of action of this class of peptides. In this work, we use molecular dynamics simulations to understand the influence of some characteristics of interaction peptide-peptide and peptide-membrane on biological efficiency of the Protonectins and Jelleines. Protonectin and Protonectin 1-6 are antimicrobial peptides, the first shows hemolytic activity, mast cell degranulation and chemotaxis, while the second presents chemotactic activity. Experimental data indicate that the association between those two peptides (1:1) generates a supramolecular aggregate structure and also increases the hemolytic and mast cell degranulation activities, while the chemotactic activity decreases, i.e., in combination they exhibit accentuated behavior of the interaction with membranes. Based on these results in this work, we speculate, which the interactions between Protonectin/Protonectin 1-6 (mixture) that would be associated with the formation of aggregate structure and the implications of this structure in the interaction with membrane mechanism. The results of the simulations in water and SDS micelle for these peptides indicate that there is a tendency of aggregation between pure Protonectins and Protonectin/Protonectin 1-6, and that this occurs through intermittent hydrogen bonds. Furthermore, it was found that the electrostatic interactions between the mixture of peptides is less favorable than for the pure Protonectins, influencing the distance between the ...

Made available in DSpace on 2014-08-27T14:36:43Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-05-29Bitstream added on 2014-08-27T15:57:07Z : No. of bitstreams: 1 000778127.pdf: 1378513 bytes, checksum: d1d6783639c75c24813a467c1ea25eae (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Nesta tese estudamos a biologia de populações de sistemas hospedeiro-parasita, com especial atenção para os efeitos produzidos por múltiplas infecções de diferentes parasitas numa dada população de hospedeiros. Tal situação se assemelha a múlpiplas espécies competindo por um mesmo recurso. Com os parasitas competindo por hospedeiros, diversos resultados no nível populacional podem ocorrer. Se ambos parasitas não puderem infectar um hospedeiro conjuntamente, então o parasita mais apto elimina o menos apto. Quando co-infecções são possíveis, o padrão muda e a coexistência pode ser estabelecida. Finalmente, se um parasita pode deslocar o outro, o assim chamado efeito intraguilda, o resultado dependerá fortemente da taxa de geração de novos hospedeiros, a qual é determinada por fatores ambientais. Nós estudamos este sistema por meio de um modelo matemático su?cientemente abrangente para dar conta destas situações. Procedemos passo-a-passo: começamos com um modelo matemático simples para o caso de um parasita e um hospedeiro. Ao progredirmos para outros casos nosso modelo matemático passa a incluir novos termos até chegarmos num modelo completo. Há dois métodos de análise envolvidos. Estudamos analiticamente a estabilidade do estado livre de infecções, o que nos permite dar condições sobre a capacidade dos parasitas de invadir uma população não infectada/parasitada. Por outro lado, usamos métodos numéricos para estudar o comportamento para grandes tempos, que em todos os casos tende a um ponto ?xo. O foco é saber qual parasita prevelacerá ou se haverá coexistência, além de determinar as condições que regulam o resultado da interação. Através de diagramas de bifurcação analisamos a importância da riqueza de recursos do ambiente, relacionada à taxa de produção de novos hospedeiros. Encontramos que os estados assimptóticos dependem fortemente... / In this thesis we study the population biology of host-parasite systems, with a systematic view of the e?ects produced by multiple infections of di?erent parasites on a same host population. This situation is akin to multiple species competing for a shared resource. As parasites compete for a host, several outcomes at the population level can appear. If both parasites cannot jointly infect the same host, then the ?ttest parasite eliminates the other. When confection is possible, the pattern changes, and coexistence of both parasites becomes possible. Finally, if a parasite can displace the other within the host, the so-called intraguild e?ect, the outcome will strongly be dependent on the income rate of new hosts, which is determined by environmental factors. We studied this system through a mathematical model which is broad enough to encompass these situations. We proceed by steps: ?rst we framed a simple mathematical model for a single parasite/host case and as we progress to other cases, our mathematical model includes new terms and ?nally it is shaped into a complete model. Our methods are twofold. We study analytically the stability of the disease-free state, which allows us to give conditions for the ability of the parasites to invade a disease-free/non-infected population. On the other hand, we resort to numerical methods to study the long-term behavior of the system, which in all cases tends to a ?xed point. The main focus is to know which parasite prevails or if they are able to coexist, and determine the conditions that regulate this outcome . Through bifurcation diagrams we analyzed the importance of the richness of the environment, de?ned by the rate of production of new hosts. We found that the long-term states depend crucially on this rate. Our main original contribution is related to the study of the intraguild e?ect. Depending of the host income rate we can have four di?erent states, which are a disease...

Made available in DSpace on 2014-12-02T11:16:51Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-03-01Bitstream added on 2014-12-02T11:21:18Z : No. of bitstreams: 1 000736345.pdf: 468289 bytes, checksum: da2279b84ff09b68ec04531f532d4521 (MD5) / Os bancos de mexilhões são conhecidos engenheiros de ecossistema que agregam uma diversificada fauna associada. A exploração antrópica dos mexilhões pode alterar a estrutura e distribuição desses bancos e consequentemente influenciar a composição da fauna associada. Para testar a influencia da pesca sobre os mexilhões e sua fauna associada utilizamos da técnica do quadrado (15X15 cm, n=8) raspando bancos com mexilhões em um de três estágios de desenvolvimento (recrutas, juvenis, adultos). A fauna associada foi separada dos mexilhões, identificada e quantificada (abundancia, biomassa, riqueza e diversidade). Os mexilhões foram mensurados em relação à tamanho, peso, e volume (total e intersticial). Amostras de mexilhões obtidas diretamente de pescadores das mesmas praias de estudo foram analisadas quantos aos mesmos parâmetros, para posterior comparação por análises estatísticas descritivas (ANOVA) e multivariadas exploratórias (nMDS e PERMANOVA). Observou-se a presença de bancos diferenciados, com mexilhões de um mesmo tamanho e com valores de fauna correspondente. Sendo, a presença dos pescadores pode influenciar a distribuição e composição dos bancos de mexilhões, afetando no seu recrutamento e consequentemente pode afetar a fauna associada a esses bancos

A caracterização das mutações nos genes katG, ahpC e inhA e sua correlação com a resistência à isoniazida em isolados de Mycobacterium tuberculosis tem sido descrita. A mutação S315T no gene katG é a mais freqüentemente encontrada e pode fornecer rápida informação para a seleção do tratamento anti-tuberculose, para a vigilância epidemiológica da resistência e, possivelmente rastrear a transmissão de linhagens resistentes. Dessa forma, o objetivo do trabalho foi o desenvolvimento de um Ensaio de Hibridização Reversa (EHR) para a rápida identificação da mutação no códon 315 do gene katG em M. tuberculosis. Após a padronização da metodologia com 180 DNAs de M. tuberculosis isolados de cultura, o teste foi aplicado a 46 DNAs isolados de amostras clínicas e foram testados para a detecção de mutantes katG315 resistentes à isoniazida. Quando aplicado em DNA de cultura o teste pôde detectar com sucesso a mutação mais comum no katG315 (AGC ACC) em todas as linhagens estudadas em comparação com o seqüenciamento de DNA. Em relação às amostras clínicas, o EHR apresentou concordância com o seqüenciamento em todas as amostras com baciloscopia positiva. O teste desenvolvido apresenta um bom potencial para a rápida identificação da resistência à isoniazida em regiões com uma elevada prevalência de mutantes katG315 entre isolados de M. tuberculosis resistentes à isoniazida. / Mutations in katG, ahpC and inhA genes were identified and have been correlated with isoniazid resistance in Mycobacterium tuberculosis isolates, mutation in katG S315T being the most frequent. Rapid detection of this mutation could therefore improve the choice of an adequate anti-TB regimen, epidemiological monitoring of isoniazid resistance and, possibly to track transmission of resistant strains. Reverse Hybridization Assay (RHA) is a simple technique for the rapid identification of katG315 mutation in M. tuberculosis. The assay was standardized with 180 DNAs isolated from cultures of M. tuberculosis and was applied to 46 clinical specimens and tested for the detection of isoniazid-resistant katG315 mutants. When the test was applied to the DNA from cultured M. tuberculosis it was possible to successfully detect the most common mutation at katG315 (AGC ACC) in all isolates studied in comparison with DNA sequencing. For clinical samples, the RHA presented agreement with the sequencing in all samples with smear positive. The developed test presents a good potential for the rapid identification of isoniazid resistance in regions with a high prevalence of katG315 mutants among isoniazid-resistant M. tuberculosis isolates.

Nesse trabalho foi desenvolvido um Teste Colorimétrico de Hibridização Reversa (TCHR-TB) que verifica a presença de mutações em uma região específica do gene rpoB, que confere resistência à rifampicina. Foram analisados 156 DNAs de M. tuberculosis obtidos de cultura. Quando comparado com teste convencional de susceptibilidade às drogas, a sensibilidade e a especificidade do TCHR-TB foi 92.3% e 98.0% respectivamente. Comparando com o seqüenciamento, o qual é considerado padrão ouro, a sensibilidade e a especificidade do TCHR-TB foram 90% e 100%, respectivamente. Mutações no códon 531 seguido de mutações no códon 526 são as mutações mais comuns mundialmente, sendo responsáveis por aproximadamente 75% das amostras resistentes à RIF. O TCHR-TB detectou corretamente 100% destas mutações. O método desenvolvido pôde também detectar mutações no gene rpoB de DNA de M. tuberculosis extraídos diretamente de amostras clínicas. Trinta e três amostras clinicas foram testadas e os resultados do TCHR-TB foram 100% concordantes quando comparados com método das proporções. Os resultados do nosso estudo demonstraram uma alta taxa de concordância do TCHR-TB quando comparado com os testes de sensibilidade convencionais e com o seqüenciamento. O teste pode ser aplicado com sucesso quando se faz necessária uma rápida e sensível detecção de resistência à rifampicina e conseqüentemente um correto gerenciamento dos pacientes. / In this work a Reverse-Line Blot Hybridization (RLBH) assay was developed which allows the detection of mutation in a specific region of rpoB gene, that confer rifampicin resistance, in a panel of 156 DNAs of M. tuberculosis obtained from cultures. When compared to the conventional drug susceptibility testing (DST), sensitivity and specificity of the RLBH were 92.3% and 98.0%, respectively. Comparing to sequencing, which is considered a “gold standard” reference, sensitivity and specificity of the RLBH were 90% and 100%, respectively. Mutations at codon 531, followed by mutation at codon 526 are the most common mutations worldwide accounting for approximately 75% of RIF resistance. The RLBH assay correctly detected 100% of these mutations. The method developed could also detect rpoB mutations of M. tuberculosis in clinical specimens. Thirty-three clinical specimens were tested and the results of RLBH were 100% concordant when compared to DST. The results of our study demonstrate a high concordance rate when the RLBH results were compared to conventional methods and sequencing data. The test can be successfully applied when a rapid sensitivity testing is required for the correct management of patients.