Le travail de thèse présenté s'inscrit dans le vaste domaine des biocapteurs appliqués au secteur biomédical.<br /> Le biocapteur développé est destiné à la mesure de concentration de substances chimiques. De nombreux biocapteurs optiques ont déjà été mis au point pour la détection de ces substances. L'originalité de notre travail réside dans l'utilisation d'une réaction biochimique à proximité du coeur d'une fibre optique pour modifier les conditions de résonance d'une cavité Fabry-Pérot par couplage évanescent.<br /> Le principe de ce capteur s'articule autour de deux techniques de<br />metrologie optique :<br />• Fonctionnalisation biochimique de l'interface cavité-milieu extérieur pour que la concentration de la substance cible modifie l'indice effectif de l'onde se propageant dans la cavité Fabry-Pérot par couplage évanescent.<br />• Interférométrie : mesure précise de la longueur optique de la cavité pour suivre l'évolution de l'indice effectif.<br /> L'intérêt d'un tel système est d'offrir un capteur de dimensions très réduites (taille proche d'une fibre optique). La réalisation sur une même fibre de plusieurs capteurs avec différentes longueurs de cavité fournit une sonde multiparamétrique, interrogeable par les<br />techniques classiques d'interférométrie (modulation de cohérence).

La cryopréservation par vitrification est une technique qui devrait permettre de rallonger considérablement les durées de conservation des greffons en abaissant leur température de stockage jusqu'à – 196°C. Elle nécessite l'utilisation de solutions cryoprotectrices (contenant des antigels biocompatibles) pour empêcher la cristallisation de glace dans les tissus, ainsi que des vitesses de variation de la température relativement rapides. La calorimétrie différentielle à balayage permet de déterminer les vitesses requises pour la vitrification des solutions cryoprotectrices. L'exemple de l'éthylène glycol est présenté, complétant les informations connues sur ce cryoprotecteur dans la plage des concentrations concernant la vitrification. Au niveau de la procédure de vitrification, la méthode du recuit a permis d'éviter l'apparition de fractures dans des volumes importants de solution cryoprotectrice. Le cas particulier de la solution VM3 (21st Century Medicine) est détaillé. Il permet de montrer que la stabilité de l'état amorphe ainsi que la quantité de glace cristallisée au réchauffement sont influencées par la température et la durée du recuit. Une analyse sur l'influence du type et de la forme du container porte-échantillon par rapport à la qualité du verre fabriqué a été commencée en parallèle, mais les limites du dispositif cryogénique utilisé nous ont poussé à développer un nouveau cryostat automatisé, permettant de faire des études systématiques dans des conditions reproductibles. Ce cryostat, entièrement conçu et construit au CRTBT, représente le prototype de ce que nous souhaitons proposer à des médecins pour les aider dans leur étude clinique de la cryopreservation des systèmes biologiques. Sa précision de mesure et sa facilité d'utilisation nous a pour le moment permis de mettre en évidence différents événements ayant lieu pendant la vitrification et le réchauffement de nos échantillons.

Pour résoudre de novo la structure de protéines par cristallographie, il est nécessaire de calculer les phases des facteurs de structure à partir des intensités des rayons X diffractés. Pour ce but, les méthodes SAD et MAD se servent de la diffusion anomale d'atomes présents dans le cristal de la protéine. L'introduction de ces diffuseurs anomaux dans les cristaux est une des étapes clés de la résolution de structure des protéines.<br />Nous avons étudié une classe de huit complexes de gadolinium servant à insérer les diffuseurs anomaux dans les cristaux de protéine. Le gadolinium présente une forte diffusion anomale et avec le rayonnement X d'un générateur de laboratoire et dans son seuil d'absorption LIII.<br />Une étude cristallographique menée avec cette classe de complexes et avec huit protéines différentes a permis de démontrer le potentiel élevé des complexes pour la préparation de dérivés à fort pouvoir de phasage. En effet, pour un grand nombre des dérivés testés, les phases expérimentales calculées ont mené à des cartes de densité expérimentale d'excellente qualité, permettant la construction aisée du modèle de la protéine.<br />L'affinement de la structure des complexes liés à la protéine a permis de comprendre l'interaction des différents complexes avec les protéines.<br />L'utilisation des complexes a permis de résoudre la structure de quatre nouvelles protéines.<br />Nous avons également étudié des méthodes physico-chimiques alternatives à la cristallographie dans le dessein de détecter la fixation d'un complexe sur une protéine en tenant compte de la particularité de l'interaction qui est caractérisée par une constante de d'association faible.

- Nous avons implementé dans un programme académique une méthode de calcul de la tension interfaciale par dynamique moléculaire (méthode auparavant décrite dans la littérature).<br /><br />- L'implémentation a été testée sur un système d'interface modèle simple: interface liquide-vapeur d'alcanes. Les résultats donnent une estimation très correcte des tensions interfaciales.<br /><br />- Nous avons alors étudié une interface entre deux liquides immiscibles, et comparé nos résultats avec les prédictions issues de la théorie des ondes capillaires. Nous proposons une explication du désaccord constaté.<br /><br />- Ensuite, nous avons etudié la dynamique moléculaire de la surfactine (biosurfactant) à l'interface eau-hexane, en fonction de la concentration interfaciale.<br /><br />- Enfin, nous avons etudié la topologie et le profil de pression latérale de membranes de tétraetherlipides, en fonction de la stéréochimie des cyclopentanes présents dans le domaine hydrophobique de la membrane.

Dans la partie "adhésion", nous avons montré que la dynamique d'adhésion<br />de vésicules induite par des ligands spécifiques était gouvernée soit par la diffusion<br />de ligands dans la membrane, soit par le temps de réaction entre le ligand et le<br />récepteur, dépendant de la préparation chimique des surfaces. Au contraire, les<br />premières étapes de l'adhésion de cellules semblent être contrôlées par la<br />dissipation visqueuse à l'intérieur de la cellule.<br />Dans la partie "tubes de membrane", nous avons étudié la formation et<br />l'élongation de tubes de membrane. Tout d'abord, en formant des tubes à partir de<br />vésicules adhérées, nous avons montré que l'élongation des tubes s'accompagne<br />d'un étirement élastique de la membrane. Ensuite, en analysant expérimentalement<br />et théoriquement l'interaction et la coalescence de deux tubes membranaires, nous<br />avons proposé une méthode pour déterminer la rigidité de courbure de vésicules<br />lipidiques. Enfin, nous avons revisité la description mécanique de tubes extraits de<br />globules rouges et nous avons mis en évidence un comportement rhéofluidifiant de<br />la membrane durant l'élongation, indiquant l'influence du squelette de spectrine.

Dans la cellule des organismes vivants, le solvant (l'eau) joue un rôle très important dans la stabilisation des structures tridimensionnelles des macromolécules biologiques et lors de leurs interactions. Les méthodes théoriques de simulations de modélisation moléculaire permettent de compléter les informations partielles sur l'hydratation des biomolécules obtenues par les méthodes expérimentales. Nous avons développé un nouveau modèle de solvatation semi-implicite pour représenter le solvant en modélisation moléculaire. Ce modèle décrit le solvant comme des particules microscopiques dont les propriétés diélectriques découlent des lois macroscopiques de l'électrostatique. Nous obtenons ainsi à l'équilibre électrostatique un fluide de particules de Lennard-Jones non polaires, polarisables par le champ électrique créé par le soluté. Ce modèle a l'intérêt de prendre en compte la structure moléculaire du solvant tout en calculant efficacement l'énergie libre électrostatique de solvatation du système. De plus, il est d'un faible coût numérique comparé aux méthodes explicites. Après avoir implémenté notre modèle dans un programme de dynamique moléculaire et l'avoir paramétré de façon simple, nous l'avons appliqué à plusieurs peptides, protéines et acides nucléiques (ADN et ARN de transfert). Les trajectoires de ces simulations sont stables sur une à deux nanosecondes, et les structures obtenues sont tout à fait en accord avec les méthodes expérimentales et les méthodes théoriques de solvatation explicites. Notre modèle permet également de retrouver les sites préférentiels d'hydratation des molécules étudiées identifiés expérimentalement ou théoriquement, malgré l'absence de liaisons hydrogène dans notre solvant. De plus, nous observons de bonnes corrélations entre les énergies libres électrostatiques de solvatation calculées avec notre modèle et celles calculées avec les méthodes de résolution de l'équation de Poisson-Boltzmann, et ces résultats paraissent très encourageants.

L'objectif de cette thèse est de caractériser l'influence de facteurs protéiques sur la dynamique du cytosquelette cellulaire au moyen d'outils de micromanipulation contrôlés. Nous avons déterminé la réponse microrhéologique du réseau d'actine pour des cellules uniques. Nous avons appliqué grâce à un système de pinces optiques des forces statiques et oscillantes à des microbilles de verres attachées de manière spécifique au réseau d'actine de divers types cellulaires. Dans le cas statique nous avons mesuré des modules élastiques dans la gamme 29

Les virus sont des objets biologiques dont les mécanismes de prolifération restent mal compris, et dont la taille et l'organisation du génome rendent la cristallisation difficile. Nous avons étudié les modifications structurales d'un virus sphérique de plante, le Virus de la Mosaïque du Brome (BMV), ainsi que les interactions entre particules virales en solution afin de définir des conditions de cristallisation. Le gonflement de la capside lors de l'entrée du virus dans les cellules de plantes est impliqué dans la prolifération virale. Dans un premier temps, nous avons modélisé la capside du BMV, sous sa forme compacte à pH 5,9 et sous sa forme gonflée à pH 7,5, par reconstruction tridimensionnelle à partir de clichés de cryomicroscopie. Nous avons ainsi pu observer le réarrangement de l'ARN entre les deux états. Nous avons ensuite étudié les interactions entre particules virales en solution par diffusion des rayons X aux petits angles. Nous avons fait varier plusieurs paramètres physico-chimiques comme le pH, et la concentration en sels et en polymères, afin d'induire des interactions attractives entre virus en solution. En effet, la cristallisation des protéines a lieu en régime attractif. Grâce aux résultats obtenus par l'utilisation de polyéthylène glycol (PEG), nous avons pu déterminer des conditions de cristallisation du BMV, et montrer la corrélation existant entre la nature des interactions en solution et la cristallisation de macromolécules de la taille du BMV. Nous avons également mis en évidence qu'un excès de PEG provoque la précipitation microcristalline des virus. L'étude de la cinétique d'apparition et de croissance des microcristaux nous a permis de mieux caractériser les étapes précoces de cristallisation du BMV en présence de PEG.

L'immobilisation de protéines ancrées à des lipides à l'interface air-eau ou solide-eau permet aux protéines d'interagir avec des molécules en solution. Dans le cas des cadhérines, protéines d'adhérence cellulaire, ce système mime la surface d'une cellule. Les interactions entre domaines extracellulaires de cadhérines nécessitent la présence d'ions calcium. Des monocouches de C-cadhérine et de VE-cadhérine formées à la surface de l'eau ont été étudiées en variant la concentration en calcium de la solution. La densité massique surfacique apparente de protéines a été évaluée par ellipsométrie. Le profil de densité électronique des monocouches a été déterminé par réflectivité des rayons X en ncidence rasante. Les résultats obtenus suggèrent que les cadhérines forment des complexes antiparallèles pouvant en partie être dissociés par l'appauvrissement de la solution en calcium. La résonance des plasmons de surface a permis d'évaluer la densité de molécules déposées sur un substrat solide.

Une tessellation de Voronoï est un moyen de diviser l'espace 3D en régions associées avec chaque élément d'un ensemble discret de points dans le but de caractériser leurs relations topologiques. Le processus associe à chacun de ces éléments un polyèdre, appelé cellule de Voronoï, défini par les intersections des plans de contact construits à mi chemin entre les points. Chaque cellule contient donc le voisinage le plus proche du point qui lui est associé et ses faces définissent les contacts avec ses plus proches voisins. Pour un ensemble donné de points, la décomposition en cellules de Voronoï est unique et absolue car il n'y a pas d'espace vide entre les cellules. De plus les caractéristiques des cellules telles que le nombre de face, le volume etc. sont des sources d'information utiles pour étudier l'organisation des points dans l'espace. Pour les structures protéiques deux échelles d'investigation peuvent être envisagées. Le niveau atomique qui est le plus représenté dans la littérature associe chaque cellule avec chaque atome ou groupe d'atomes présent dans la structure. Le second niveau associe chacune des cellules avec chaque résidu représenté par un point pouvant être un atome réel (le carbone alpha par exemple) ou un point virtuel comme le centre géométrique de la chaîne latérale. Le travail de thèse présenté ici décrit ces dernières tessellations tout d'abord d'un point de vue mathématique puis de manière plus concrète en l'appliquant aux structures protéiques et en étudiant les diverses propriétés des cellules. Deux applications concrètes sont ensuite présentées. La première est une étude statistique de la proximité des extrémités N terminale et C terminale des chaînes polypeptidiques, la seconde est une procédure d'attribution des structures secondaires régulières.