Ce manuscrit est consacré au développement de méthodes de dérivation intra-capillaire ultrasensible et de méthodes de séparation électrocinétique hautement résolutives en vue d’une intégration dans un outil microfluidique de diagnostic de la maladie d’Alzheimer. La partie bibliographique situe d'abord le contexte épidémiologique et neurophysiopathologique de la maladie d’Alzheimer ainsi que les outils de diagnostic actuellement utilisés. Ensuite, l'état de l'art sur l'utilisation de méthodes de séparation électrocinétique, ainsi que les outils analytiques disponibles pour améliorer l’analyse d’échantillon biologique sont présentés. La partie expérimentale a porté tout d'abord sur le développement de méthodes de dérivation intra-capillaire permettant une détection ultrasensible de biomarqueurs de la maladie d’Alzheimer, en particulier l’ubiquitine, dans le liquide céphalo-rachidien. Le travail expérimental s’est ensuite prolongé par le développement d’une méthode de séparations hautement résolutives en puce en verre de différentes formes de peptides beta-amyloïdes, biomarqueurs pertinents en vue d’un diagnostic de la maladie d’Alzheimer. Pour terminer, l’apport de deux nouveaux substrats polymériques, le COC et le thiolène, pour la microfabrication de puce d’électrophorèse capillaire a été démontré. / This work is dedicated to the development of highly sensitive intra-capillary derivatization methods and highly resolutive electrokinetic separation methods, with the aim to integrate them in a microfluidic diagnostic tool of Alzheimer’s disease. The bibliographic chapter explains the epidemiologic and neurophysiopathologic background of Alzheimer’s disease and describes the diagnostic tools currently used. Then, a state of the art related to the use of electrokinetic separation methods, as well as the analytical techniques available to improve the analyses of biological samples, is presented. The first experimental part focused on the development of intra-capillary derivatization methods allowing highly sensitive detection of Alzheimer’s disease biomarkers, especially ubiquitine, in the cerebrospinal liquid. The second part was dedicated to the development of a capillary electrophoresis method, in a glass chip, capable of separating with a high resolution different forms of beta-amyloid peptides, which are relevant biomarkers of Alzheimer’s disease. Finally, the usefulness of new polymeric materials, such as COC and thiolene, for the manufacturing of microchip device was demonstrated. A careful study of their physico-chemical properties led to the development of relevant strategies for surface treatment, so as to minimize the adsorption of proteins. For the first time, a thiolene chip covered with a new copolymer allowed an electrokinetic separation of proteins.

Le parasite Echinococcus multilocularis cause l’échinococcose alvéolaire (EA), infection fatale si non prise en charge. Le traitement médical, pour les patients inopérables, est uniquement parasitostatique, et présente des effets secondaires. Néanmoins, chez certains patients, la viabilité du parasite régresserait suffisamment pour envisager un arrêt de ce traitement. Actuellement, les biomarqueurs pour estimer la viabilité parasitaire ne sont qu’indirects, évaluant la réponse immunitaire du patient. Trois études ont été menées, visant à évaluer des biomarqueurs, innovants ou déjà disponibles sur le marché.Nous avons étudié la présence d’ADN libre circulant (ADNlc), au moment du diagnostic, mais aussi quelques mois après la mise en place du traitement. Notre étude valide pour la première fois la présence d’ADNlc dans les cas d’EA, sur modèle animal puis sur des échantillons de patients. Même si la méthode n’est pas encore utilisable en diagnostic ou en suivi, c’est un point de départ vers l’utilisation de l’ADNlc pour la prise en charge de l’EA.De plus, nous avons mené une étude exploratoire sur des lésions parasitaires chez la souris et chez un patient ayant reçu un traitement médicamenteux très court. A partir d’un même échantillon, nous avons analysé l’ADN, afin d’estimer la proportion de cellules parasitaires, et nous avons quantifié différents transcrits parasitaires, afin d’estimer la viabilité du parasite de manière directe. Cet axe a permis de choisir la cible la plus transcrite : elle pourrait être utilisée sur une cohorte plus large, puis corrélée avec les biomarqueurs indirects utilisés aujourd’hui.Enfin, nous avons évalué un test de diagnostic rapide de l’échinococcose kystique, présentant de fortes réactions croisées en cas d’EA.Ces travaux ouvrent de nouvelles perspectives, principalement pour améliorer le suivi des patients atteints d’EA. / The parasite Echinococcus multilocularis is the causative agent of alveolar echinococcosis (AE), a fatal infection if not adequately managed. Medical treatment, for inoperable patients, is only parasitostatic, with many side effects. Nevertheless, in some patients, the viability of the parasite could regress sufficiently for treatment to be stopped. Currently, biomarkers for estimating parasite viability are only indirect, evaluating the immune response of the patient. Three studies were conducted to evaluate biomarkers that are innovative or already available on the market.We investigated the presence of circulating cell-free DNA (ccfDNA) at diagnosis, and after a few months of treatment. For the first time, our study identified the presence of ccfDNA in cases of AE, in an animal model and in human samples. Although the method cannot yet be used for diagnosis or follow-up, it is a starting-point for the use of ccfDNA in the management of AE.In addition, we conducted an exploratory study of parasitic lesions in mice, and in a patient who had only received medical treatment for a very short time. We analyzed DNA to estimate the proportion of parasite cells present in each sample. We then quantified different parasite transcripts from each sample, in order to directly estimate parasite viability. This approach allowed us to identify the most abundantly transcribed gene, which could potentially be used to study a larger cohort, in order to correlate results with the indirect biomarkers used today.Finally, we evaluated a rapid diagnostic test for cystic echinococcosis, which produces strong cross-reactions in the case of AE infection.This work opens new perspectives, mainly to improve the follow-up of patients with AE.

Le cancer colorectal est le troisième cancer le plus répandu dans le monde avec plus d’un million de patients diagnostiqués chaque année, dont 50% auront une évolution métastatique de leur maladie. Les récentes études pour améliorer les traitements du cancer colorectal métastatique (CCRm) ont permis le développement d’anticorps monoclonaux, le cetuximab et le panitumumab, capables d’inhiber l’activation des récepteurs au facteur de croissance épidermique (EGFR) et les voies de signalisation en aval (RAS/RAF/MAPK et PI3K/AKT/mTOR), responsables de la croissance cellulaire, la prolifération, l’inhibition de l’apoptose, l’invasion et de l’évolution métastatique. Cependant, dans les études incluant des patients dont les tumeurs sont « RAS sauvage », c’est à dire exemptes de mutation des gènes KRAS et NRAS, le taux de réponse aux thérapies à base de cetuximab ou du panitumumab sont de l’ordre de 40 à 60% seulement, ce qui signifie qu’une grande partie des patients traités échappent au traitement par le biais d’autres mécanismes. La présence d’altérations d’autres gènes comme PIK3CA, BRAF est responsable en partie des cas où les patients ne présentent pas de réponse. De plus, la surexpression ou l’altération de protéine comme PTEN, PI3K, AKT impliquées dans les voies de signalisation RAS/RAF/MAPK et PI3K/AKT/mTOR peuvent avoir un impact significatif sur la prolifération cellulaire ou l’apoptose. L’absence ou la surexpression des protéines sous leur forme active phosphorylée pourrait présenter un intérêt pour prédire la réponse aux anti-EGFR chez les patients dont les tumeurs sont « RAS sauvage ». Dans ce travail, nous avons tout d’abord développé des techniques pour le génotypage des gènes RAS et PIK3CA à partir d’échantillons de tumeurs colorectales fixées au formol et incluses en paraffine, puis dans un second temps, nous avons validé ces méthodes selon la norme ISO 15189, puis dans un dernier temps, nous avons étudié l’expression des phosphoprotéines en aval des récepteurs à l’EGF ainsi que les statuts mutationnels des gènes KRAS, NRAS, BRAF, PIK3CA à partir de 100 échantillons de tumeurs congelées issues de patients atteints d’un CCRm et traités par un anti-EGFR. Sur 100 échantillons de tumeurs, 60 ne présentaient pas de mutation des gènes RAS. Parmi les patients dont les tumeurs ne présentaient pas de mutation des gènes RAS, 45,0% présentaient une réponse tumorale partielle ou complète et 55,0% étaient en maladie stable ou évolutive lorsqu’ils étaient traités par un anti-EGFR. Les patients dont les tumeurs présentaient une mutation des gènes RAS avaient une survie sans progression (PFS) significativement plus faible (HR=3.04 [1.91; 4.83];p<0.001) ainsi qu’une survie globale (OS) plus faible (HR=2.49 [1.56; 3.97];p<0.001). La PFS et la survie globale (OS) étaient significativement plus élevées chez les patients dont les tumeurs étaient « RAS sauvage ». L’expression de pAKT, pERK1/2 et pMEK1 étaient significativement plus faibles chez les patients dont les tumeurs étaient sauvages que chez les patients présentant des tumeurs RAS mutées (p=0,0246 ; p=0,004 ; p=0,0110 respectivement) et aucune différence significative d’expression entre les tumeurs RAS sauvage et RAS mutées n’a été démontrée pour pEGFR, pGSK3, pIGFR et pP90SRK. Chez les patients présentant des tumeurs RAS sauvage, le taux de réponse était significativement supérieur pour les tumeurs surexprimant pEGFR et pAKT au dessus des seuils calculés (p=0,0258 et p=0,0277 respectivement). Aucune différence significative n’a été trouvée entre le taux de réponse et l’expression des autres phosphoprotéines. Notre étude montre qu’associer la mesure de l’expression des phosphoprotéines de signalisation en aval d’EGFR, à l’analyse du statut mutationnel des gènes RAS, BRAF, PIK3CA pourrait présenter un intérêt dans la prédiction de la réponse aux thérapies anti-EGFR chez les patients atteints d’un cancer colorectal métastatique / Colorectal cancer is the third most common cancer worldwide with more than one million patients diagnosed each year, among 50% will develop metastatic disease. Recent efforts to improve the treatment of metastatic colorectal cancer (mCRC) has led to the development of monoclonal antibodies such as cetuximab and panitumumab, that inhibit the activation of the Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) and its downstream pathways (namely RAS/RAF/MAPK and PI3K/AKT/mTOR) that promote cell growth, proliferation, inhibition of apoptosis, invasion and metastasis. However, from studies including “RAS wild-type” i.e. KRAS and NRAS wild-type tumors, the response rates to cetuximab or panitumumab therapy ranged from only 40 to 60% which results in a large fraction of patients without any known causes for treatment failure. The presence of alterations in other genes such as PIK3CA or BRAF in the EGFR-dependent signaling pathways is responsible for some of the non-responding cases. Moreover, overexpression or alterations of proteins such as PTEN, PI3K, AKT, involved in the RAS/RAF/MAPK or PI3K/AKT/mTOR signaling pathways can have a significant impact on cell proliferation or apoptosis. Absence or overexpression of proteins under their active phosphorylated forms may be of interest to predict response to anti-EGFR in RAS wild-type patients. In this work, we first developed assays to assess RAS and PIK3CA mutations in formalin fixed paraffin embedded colorectal tumors, then we validated these assays according to ISO 15189 and we finally studied expression of downstream signalling phosphoproteins and KRAS, NRAS, BRAF and PIK3CA status in 100 frozen samples of patients with mCRC and treated with anti-EGFR. Among the 100 tumor samples, 60 were RAS wild-type. Among the RAS wild-type patients, 45.0% achieved a complete or partial response, and 55.0% had a stable disease or progression (p<0.001) when treated with anti-EGFR. Patients with a RAS mutation had significant lower progression-free survival (PFS) (HR=3.04[1.91; 4.83];p<0.001) and overall survival (OS) (HR=2.49[1.56; 3.97];p<0.001). PFS and OS were significantly higher in RAS wild-type patients. Expression of pAKT, pERK1/2 and pMEK1 was significantly lower in RAS wild-type patients than in RAS mutated patients (p=0.0246; p=0.004; p=0.0110 respectively) and no significant difference was observed between RAS wild-type and RAS mutated tumors in the expression of pEGFR, pGSK3, pIGFR, pP70S6K and pP90SRK. In RAS wild-type patients, response rate was significantly higher for tumors that overexpressed pEGFR and pAKT above the calculated threshold (p=0.0258 and p=0.0277 respectively). No significant relation was found between response rate and the level of expression of the other phosphoproteins. Our study shows that combining the analysis of the expression of EGFR downstream signalling phosphoproteins, RAS, BRAF or PIK3CA status could be of interest to predict the response to anti-EGFR therapies in patients with mCRC

Le MTX est un agent anticancéreux utilisé à hautes doses pour le traitement des hémopathies malignes et de certaines tumeurs solides. Il présente une importante variabilité pharmacocinétique (PK) traduite par des surexpositions à l'origine de toxicités très sévères, surtout lors d'une administration à haute dose. Les retards d'élimination du MTX surviennent encore de manière inattendue et il n'existe à ce jour aucun biomarqueur qui permette un diagnostic précoce du risque de surexposition. Nos travaux ont focalisé sur les déterminants de l'élimination rénale du MTX, et en particulier le rôle du transporteur MRP2/ABCC2 dans ce processus. Ce travail s'inscrit donc (1) dans la recherche de biomarqueurs métabolomiques urinaires prédictifs de la PK du MTX et (2) dans l'identification de substrats endogènes de MRP2 parmi un panel de 217 acides organiques urinaires analysés par chromatographie gazeuse couplée à la spectrométrie de masse. Nos analyses ont abouti à un profil de 28 anions organiques endogènes, prédictifs de la CL MTX. L'outil était en revanche mal adapté à la prédiction des retards d'élimination. Pour la 2eme partie, nos résultats tendent à montrer que 8 métabolites urinaires sont des bio-marqueurs potentiels de l'activité de MRP2. Leur utilisation en clinique nécessite encore des études confirmatoires. / MTX is an anticancer agent used at high doses for the treatment of malignant haemopathies and some solid tumors. It presents an important pharmacokinetic variability (PK), manifested by overexposures causing very severe toxicities, especially when administered at high doses. Delayed elimination of MTX still occurs unexpectedly and there is currently no biomarker that allows early diagnosis of the risk of overexposure. Our work focused on the determinants of renal elimination of MTX, and particularly on the role of MRP2 / ABCC2 in this process. This work is therefore devoted to (1) the search for metabolomic biomarkers predictive of MTX PK and (2) the identification of endogenous substrates of MRP2, from a panel of 217 urinary organic acids analyzed by gas chromatography-mass spectrometry. Our analyses resulted in a profile of 28 endogenous organic anions, predictive of CL MTX. The tool was, on the other hand, poorly adapted to the prediction of delayed elimination. For the second part, our results tend to show that 8 urinary metabolites are potential biomarkers of MRP2 activity. Their clinical use still requires confirmatory studies.

Le but de ce travail de thèse est de démontrer l’intérêt d’un macrophyte aquatique submergé, Myriophyllum alterniflorum pour la détection de contaminants dans l’environnement. Des études in situ ont été réalisées pendant 28 jours sur cinq milieux aquatiques, affectés par différents types de pression anthropique, durant trois campagnes de terrain (printemps 2015, automne 2015 et printemps 2016), pour déterminer si l’accumulation des contaminants dans la plante et si des biomarqueurs du myriophylle peuvent être utilisés pour détecter la présence de contaminants dans les eaux. L’accumulation des contaminants au cours du temps était corrélée avec les teneurs des contaminants dans l’eau ; l’influence de la durée d’exposition a été étudiée. Au cours des trois campagnes, la réponse des biomarqueurs, teneur en MDA et activité de nitrate réductase était corrélée avec les teneurs en contaminants dans l’eau et dans la plante ; cependant l’influence de la durée d’exposition sur l’évolution de la réponse des biomarqueurs est moindre par rapport à celle de l’accumulation des contaminants. Ainsi, l’étude des biomarqueurs pourrait permettre une évaluation plus fiable de la qualité des masses d’eau que le suivi de l’accumulation dans la plante. Au cours de la campagne printemps 2015, un panel de biomarqueurs plus large a été étudié afin de définir les biomarqueurs les plus pertinents pour détecter spécifiquement les pressions liées aux activités urbaines ou industrielles. Une méthodologie d’évaluation de la qualité des eaux est proposée, en considérant un protocole d’analyse des biomarqueurs : un premier dosage de Chlb et MDA est simple et moins coûteux. Quand aucune preuve d'impact anthropique n'est montrée, aucune analyse complémentaire n'est requise. En revanche, lorsqu’une altération est mise en évidence, l’analyse d'autres biomarqueurs plus spécifiques tels que les activités G6PDH et γ-GCS sera nécessaire. La réponse de l'activité γ-GCS est spécifique du stress métallique, ainsi, la réponse de ce biomarqueur devrait amener à réaliser l’analyse des métaux/métalloïdes dans M. alterniflorum. / The aim of this thesis is to demonstrate the interest of a submerged aquatic macrophyte, Myriophyllum alterniflorum for the detection of contaminants in the environment. In situ studies were conducted over 28 days in five aquatic environments, affected by different levels of anthropogenic pressure, during three field seasons (spring 2015, autumn 2015 and spring 2016), to determine whether the accumulation of contaminants in the plant and whether biomarkers can be used to detect the presence of contaminants in water. The accumulation of contaminants over time was correlated with the levels of contaminants in the water; the influence of the duration of exposure has been studied. In all three campaigns, biomarker response, MDA content, and nitrate reductase activity were correlated with contaminant levels in water and in the plant; however, the influence of the duration of exposure on the evolution of the biomarker response is lower compared to the accumulation of contaminants. Thus, the study of biomarkers could allow a more reliable assessment of the quality of water bodies than the monitoring of contaminant accumulation in the plant. During the spring 2015 campaign, a much broader biomarker panel was investigated to define the most relevant biomarkers for assessing water quality. A methodology for evaluating water quality is proposed, considering a biomarker analysis protocol: a first assay of Chlb and MDA is simple and less expensive. When no evidence of human impact is shown, no further analysis is required. On the other hand, when an alteration is highlighted, the analysis of other more specific biomarkers such as G6PDH and γ-GCS activities will be necessary. The response of γ-GCS activity is specific for metal stress, so the response of this biomarker should lead to the analysis of metals / metalloids in M. alterniflorum.

L'imagerie par résonance magnétique (IRM) permet maintenant d'observer différents types de tissus avec des résolutions de plus en plus fines. L'arbre vasculaire artériel et veineux est explorable et les flux peuvent y être caractérisés de façon non invasive. Le versant artériel de l'arbre vasculaire peut être obtenu par une imagerie dite par « temps de vol » et le versant veineux par une imagerie en contraste de phase. Le développement de reconstructions de cartographies de susceptibilité magnétique (QSM) permet d'améliorer le niveau de détails atteignable sur les veines en fournissant en plus la possibilité de quantifier des paramètres physiologiques comme la saturation veineuse en oxygène. La mise en place d'algorithmes et outils dédiés permet la reconstruction in-silico d'une architecture cohérente sujet-spécifique. Par ailleurs grâce à l'emploi de séquences de la dynamique telles que le contraste de phase dynamique et l'imagerie par marquage des protons artériels du sang, les débits artériels, veineux, et perfusionnels sont mesurables. L'intégralité de ces acquisitions est non invasive, donc applicable à l'intégralité des sujets passant des IRM. Sur la base de ces données anatomiques et dynamiques, un modèle complet et sujet-spécifique de l'hydrodynamique intracrânienne est proposé. Le flux sanguin et cérébro-spinal est décrit dans ce modèle par les équations bilans fondamentales de l'hydrodynamique : conservation de la masse, conservation de la quantité de mouvement. Pour tenir compte de l'adaptation du diamètre des vaisseaux aux pressions on introduit pour chaque compartiment un paramètre d'élasticité de la paroi et une équation correspondante. Grâce aux données d'imagerie IRM, les compartiments sanguins des artères aux veines, le parenchyme cérébral et le système ventriculaire sont inclus. Le modèle permet de simuler la répartition des flux et des pressions dans les différents compartiments de la vascularisation du patient ainsi que d'évaluer les effets d'occlusions localisées sur l'ensemble de l'architecture. / The magnetic resonance imaging (MRI) allows the observation of various kind of tissues with always increasing resolution. The arterial and venous vascular trees can be explored, and the flows can be characterized in a noninvasive way. As an example, the arterial part of the tree can be obtained using so-called “Time Of Flight” MRI, and the venous part with phase contrast techniques. The development of quantitative susceptibility maps (QSM) improves the level of details achievable regarding veins; furthermore, it provides a new way to estimate physiological parameters such as venous saturation in oxygen. Eventually the implementation of dedicated algorithms and tools allows the in-silico reconstruction of a subject-specific coherent architecture. Moreover, due to the use of dynamic imaging sequences such as the dynamic phase contrast imaging and the arterial spin labeling, the arterial, venous and cerebral blood flow are measurable. All of these sequences are noninvasive and so usable on every subjects. Based on these anatomical and dynamics data, a full subject-specific model of the brain hydrodynamics is proposed here. The blood and cerebrospinal flow are described using basic balance equations of the hydrodynamics: continuity and momentum. To take into account of the adaptation of vessel diameter to the pressure, a wall elasticity parameter is added for each compartment together with the corresponding equation. Thanks to the MRI data, all the blood compartments, from arteries to vein, the cerebral parenchyma and the ventricular system are included. The model is able to simulate the flow and pressure repartition in all compartments of the subjects as well as show the impact of a located occlusion on the whole architecture.

L’allergie ou l’hypersensibilité de type I est une réponse inappropriée du système immunitaire à une substance étrangère à l’organisme, nommée « allergène ». L’immunothérapie allergénique (ITA) est actuellement le seul traitement sur le marché qui permet de traiter l’étiologie de la maladie allergique par opposition aux traitements symptomatiques qui diminuent temporairement les manifestations allergiques. Son action consiste à réduire la sensibilité de l’organisme vis-à-vis de l’allergène en modulant progressivement la réponse immunitaire dirigée contre ce dernier. L’objectif de cette thèse était de définir des biomarqueurs d’efficacité clinique utilisables dans le cadre des traitements de l’ITA. La stratégie de recherche est basée sur une hypothèse qui consiste à suggérer que les cellules dendritiques (DCs) sont impliquées dans le succès de l’immunothérapie. En particulier, nous supposons que le traitement induit une baisse des DCs de type 2 (DC2), qui induisent des lymphocytes T auxiliaires de type 2 (TH2), et une augmentation des DCs régulatrices (DCreg), qui induisent des lymphocytes T régulateurs. La première partie de cette thèse a consisté à mettre au point des conditions de culture induisant des DC2. Pour cela, un criblage de molécules biologiques et pharmacologiques a été entrepris sur les DCs dérivées des monocytes afin d’induire in vitro des DC2 et a conduit à la mise au point d’un mélange de plusieurs molécules, dont certaines sont impliquées dans les mécanismes de l’allergie. Le phénotype des DC2 obtenu a été étudié ainsi que la polarisation des lymphocytes T induite après co-cultures en comparaison avec des DCs de type 1 (DC1) et des DCreg.La deuxième partie de cette thèse a consisté à analyser, à l’échelle moléculaire, les différents types de DCs induites (DC1, DC2 et DCreg). Pour cela, deux techniques ont été utilisées, une analyse transcriptomique par puces à ADN et une analyse protéomique par spectrométrie de masse sans marquage, pour comparer le transcriptome et le protéome des DCs induites. Le différentiel d’expression des marqueurs les plus pertinents a été validé au niveau transcriptionnel et protéique.Dans la troisième partie de cette thèse, le suivi des marqueurs dans des cellules du sang de patients allergiques traités ou non par ITA lors d’une étude clinique randomisée, contrôlée, en double aveugle, a permis de définir six nouveaux candidats biomarqueurs d’efficacité de l’immunothérapie, dont trois spécifiques des DC2 et trois autres spécifiques des DCreg. Ces marqueurs pourront être suivis lors des traitements d’ITA pour distinguer les patients répondeurs des non-répondeurs. / Allergy or type I hypersensitivity is an inappropriate response of the immune system to a foreign substance in the body, called "allergen". Allergen immunotherapy (AIT) is currently the only treatment on the market that can handle the etiology of allergic disease versus symptomatic treatments that temporarily reduce allergic manifestations. Its action is to reduce the sensitivity of the body against allergens.The aim of this thesis was to define biomarkers of clinical efficacy of AIT. The research strategy is based on the following hypothesis: dendritic cells (DCs) are involved in the success of immunotherapy. In particular, we assume that the treatment induces a decrease in DCs type 2 (DC2), which induce type 2 helper T cells, and an increase of regulatory DCs (DCreg), which induce regulatory T cells.First, we defined optimal culture conditions inducing the polarization of in vitro immature monocyte-derived DCs (MoDCs) toward a DC2 pattern. After screening several biological and pharmaceutical agents, we selected a cocktail of six molecules with some of them are pro-allergenic molecules. The phenotype of those DC2 cells and the CD4+ T cell polarization induced after coculture were characterized extensively in comparison with type 1 DC (DC1) and DCreg.In a second part, we compared the transcriptomes and the proteomes of MoDCs polarized into DC1, DC2 and DCreg by using cDNA microarrays together with label-free mass spectrometry. The differential expression of the most relevant markers was confirmed at the transcriptional and protein level. In the third part, markers were also followed in the peripheral blood from allergic patients enrolled in a randomized, double-blind, placebo-controlled AIT study. The expression of three DC2 markers was down-regulated and of three DCreg markers was up-regulated in patients who responded to the treatment and correlated with clinical efficacy. These markers could be used as follow-up read-outs of AIT efficacy in order of to discriminate responders from nonresponders.

L’insuffisance rénale aiguë (IRA) représente une complication fréquente de lachirurgie cardiaque pédiatrique sous circulation extracorporelle (CEC). Son traitement resteessentiellement conservateur, visant à prévenir l’aggravation de l’atteinte rénale, ousubstitutif, par épuration extrarénale (EER). L’EER précoce améliore le pronostic des adultesen défaillance multiviscérale, mais ceci n’a pas été montré chez l’enfant après chirurgiecardiaque. Le diagnostic de l’IRA repose actuellement sur une diminution du débit defiltration glomérulaire (DFG), reflété par la hausse de la créatinine sérique (sCr), et laréduction de la diurèse. Ces critères traduisent une perte de la fonction glomérulaire ; orl’atteinte initiale dans l’IRA post-chirurgicale se situe au niveau tubulaire. Ces critères sontpeu spécifiques et tardifs, et risquent de retarder le diagnostic et la prise en charge de l’IRA.Des nouveaux biomarqueurs rénaux, traduisant la présence d’une lésion tubulaire, dont leNeutrophil Gelatinase-Associated Lipocaline urinaire (NGALu) est le plus populaire,permettraient un diagnostic plus précoce.Objectif. L’objectif de ce travail est triple : (i) explorer l’association entre le délai de la miseen route de l’EER et le pronostic à court et moyen terme chez le patient < 1an qui développeune IRA post-chirurgie cardiaque ; (ii) explorer les performances diagnostiques desvariations précoces de la sCr pour l’IRA sévère ; et (iii) explorer les performancesdiagnostiques de l’élévation de NGALu pour l’IRA sévère dans des populations similaires depatients < 1an.Méthode. Une cohorte monocentrique rétrospective de patients < 1an constituée sur 10 ansa servi pour étudier l’association entre le délai de la mise en route de l’EER et la survie àcourt et moyen terme. La technique de pondération inverse par le score de propension a étéutilisée afin de réduire le biais associé aux changements des pratiques inhérents à la longuepériode d’inclusion. Une deuxième cohorte monocentrique rétrospective de patients < 1anconstituée sur 3 ½ ans a servi pour étudier les performances diagnostiques des variationsprécoces de la sCr pour l’IRA sévère. Enfin, une troisième cohorte monocentriqueprospective de patients < 1an constituée sur 18 mois a servi pour étudier les performancesdiagnostiques de NGALu pour l’IRA sévère. Pour l’étude des deux biomarqueurs, sCr etNGALu, la méthodologie utilisée a été similaire : partition des trajectoires individuelles devariation, puis analyse de l’association avec un critère composite (recours à l’EER et/oudécès postopératoire) et définition du profil à faible risque d’IRA; enfin, utilisation de laméthodologie des courbes ROC et des tables de reclassification pour quantifier leursperformances diagnostiques respectives.Résultats. La mise en route de l’EER le jour de la chirurgie ou le lendemain a été associéeavec une augmentation d’environ 45% de la survie à 30 et 90 jours. La variation de la sCrdans les 2 jours suivant la chirurgie a été spécifique mais peu sensible et peu discriminantepour le diagnostic de l’IRA sévère ; le profil à faible risque, rencontré chez près de 50% despatients a été une diminution durable d’environ 25% de la sCr par rapport à la valeur basale.NGALu a été discriminant et prédictif pour le critère composite ; la concentration de NGALu aaugmenté dans les 2 heures suivant la chirurgie, et est restée élevée chez les patientsprésentant le critère composite.Discussion et conclusions. Si la prise en charge précoce par EER de l’IRA sévère est unepriorité en termes de pronostic chez le patient < 1an, alors il faut se munir de moyensdiagnostiques précoces et performants. La variation précoce de la sCr est peu sensible etpeu discriminante. En revanche, l’élévation précoce de l’NGALu présente d’excellentesperformances diagnostiques pour l’IRA sévère, faisant de NGALu un marqueur rénalprometteur dans la population < 1an bénéficiant d’une chirurgie cardiaque. / Acute kidney injury (AKI) is common following congenital cardiac surgery withcardiopulmonary bypass (CPB). To date, no prophylactic intervention has proved to beuseful for the prevention of postoperative AKI. When AKI occurs, treatment is mainlysupportive and, when severe, requires renal replacement therapy (RRT). Several reportshave shown better outcome with early RRT in adults with multiorgan failure. No such data isavailable in children undergoing cardiac surgery, and criteria for RRT vary among centres.The definition of AKI is a reduction in the glomerular filtration rate (GFR), and the diagnosis isbased on an increase in serum creatinine (sCr) and a reduction in urine output; these arefunctional criteria, translating the consequences of glomerular injury. However, it iscommonly admitted that the first pathophysiologic finding in AKI following cardiac surgery istubular injury. Besides, the functional criteria are late, are not specific, and may delay thediagnosis of AKI. Novel AKI biomarkers, specific of tubular injury are available nowadays,with urine Neutrophil Gelatinase-Associated Lipocaline (uNGAL) being the most popular –they may allow for an early diagnosis of AKI.Objectifs. The aim of this work was: (i) explore associations between the delay to RRT, earlyand mid-term outcome in patients younger than 1 year of age who develop AKI followingcardiac surgery; (ii) assess the accuracy of early sCr variations and (iii) of uNGAL for severeAKI in two similar populations aged < 1 year.Methods. A single centre retrospective cohort of patients aged < 1 year undergoing surgeryover 10 years was used to asses the association between the delay to RRT et short and midtermsurvival. Inverse probability of treatment weighting was used to reduce bias due tochanges in practices that occurred during the long study period. A second retrospectivecohort of patients aged < 1 year undergoing surgery over 3 ½ years was used to asses theaccuracy of early sCr variations for the diagnosis of severe AKI. Finally, a third prospectivecohort of patients aged < 1 year undergoing surgery over 18 month was used to asses theaccuracy of uNGAL for the diagnosis of severe AKI. The study of both sCr and uNGAL useda similar methodology: first clustering of all individual trajectories of variation, enablingassessment of the association with a composite outcome (need for RRT and/or death) andidentification of the « normally expected » postoperative evolution of both sCr an uNGAL,associated with the best outcome; second, use of ROC curves and reclassification tables toassess the accuracy of each biomarker for the diagnosis of AKI.Results. Early RRT, initiated on the day of surgery or on day 1 following surgery, wasassociated with a 45% increase in 30-days and 90-days survival. Early sCr variation, within 2days of surgery, had a good specificity but was lacking sensitivity and discrimination for thediagnosis of severe AKI; the « expected » sCr evolution was a persistent 25% postoperativereduction relative to baseline. uNGAL had good discrimination and predictive ability for thecomposite outcome; uNGAL concentration increased within 2 hours of surgery, andremained high in patients with the composite outcome.Discussion and conclusions. If early RRT improves outcome in patients aged < 1 yearswith AKI following cardiac surgery, then it becomes important to perform an early diagnosisof severe AKI. To date, diagnosis of AKI is based on early sCr variations, but such variationslack sensitivity and discrimination for the diagnosis of severe AK. On the other hand, theincrease in uNGAL within hours of surgery has excellent accuracy for the diagnosis of severeAKI, making uNGAL a promising AKI biomarker in patients aged < 1 year undergoing cardiacsurgery with cardiopulmonary bypass.

Les dernières avancées dans le domaine de l’imagerie par résonance magnétique permettent aujourd’hui de mieux comprendre l’anatomie et le fonctionnement du cerveau humain. L’IRM s’avère d’ailleurs aujourd’hui un outil clé pour la recherche de biomarqueurs d’imagerie dans la plupart des pathologies cérébrales. Nous nous sommes intéressés dans le cadre de cette thèse à l’étude de la connectivité anatomique des noyaux gris centraux, structures impliquées dans de nombreuses boucles cortico-sous-cortico-corticales, et dont l’atteinte est à l’origine de troubles moteurs à l’instar de la maladie de Huntington, du syndrome Gilles de la Tourette et de la maladie de Parkinson. Nous avons pour cela effectué plusieurs développements méthodologiques qui permettent de segmenter les noyaux gris centraux et d’inférer leur connectivité anatomique. Tout d’abord, nous avons développé une méthode de segmentation des noyaux gris centraux à partir de différents contrastes et capable de s’adapter à des cas pathologiques présentant une forte modification de ces structures. Ensuite, nous avons développé des méthodes robustes d’analyse et de sélection des fibres reliant les différentes structures cérébrales, obtenues à l’aide de méthodes de tractographie par IRM du processus de diffusion cérébrale. Ces nouvelles méthodes de sélection présentent l’avantage de tenir compte d’a priori anatomiques, et fournissent ainsi des résultats plus proches de la réalité que les résultats obtenus dans la littérature. Nous avons également développé une méthodologie permettant de construire des cartes de connectivité surfaciques afin de projeter les connexions des noyaux gris centraux sur la surface corticale et de comparer le profil de connectivité corticale des noyaux gris au sein d’une population et entre populations. Enfin, nous avons utilisé ces outils pour étudier les modifications putatives de la connectivité anatomique des noyaux gris centraux dans la maladie de Huntington et dans le syndrome Gilles de la Tourette. / The recent advances in magnetic resonance imaging helped understanding brain anatomy and function. Today, MR imaging is a key tool for inferring imaging-based biomarkers for most neuropathologies. In this work, we focused on the anatomical connectivity of the basal ganglia which are involved in several cortico-subcortical loops and which dysfunction is the origin of motor disorders like Huntington and Parkinson diseases and Gilles de la Tourette syndrome. We developed several tools allowing the segmentation of the basal ganglia and inferring their anatomical connectivity. First, we developed a method for deep nuclei segmentation using several contrasts and that was adapted for pathological cases presenting high modifications in the morphology of these structures. Second, we developed robust methods for the analysis and the selection of the fiber tracts linking different brain structures and obtained using dMRI and tractography methods. These novel tools have the advantage of taking into account anatomical prior knowledge. Therefore the obtained results are closer to the real anatomy than those obtained using the tools available in the literature. We also developed surface connectivity maps that project the cortical connections of the deep nuclei directly on the cortical surface and that allow the comparison of the connectivity profile of the deep nuclei between different subjects and different groups. Finally, we used these tools to study the putative modifications of the anatomical connectivity of the deep nuclei in the Huntington disease and Gilles de la Tourette syndrome.

Les vaisseaux rétiniens sont accessibles par la visualisation du fond d'œil grâce notamment aux rétinophotographies. Cette visualisation donne donc un accès direct à l'étude de la microcirculation humaine. Depuis 1999, le logiciel IVAN® permet une analyse «semi-automatique» du calibre vasculaire rétinien. L'analyse de la littérature retrouve que les variations du calibre vasculaire rétinien sont le reflet cumulatif du poids de naissance, de facteurs génétiques, de l'âge, des facteurs de risques cardiovasculaires, de la fonction rénale et de l'inflammation. Les méta-analyses d'études épidémiologiques suggèrent un rôle prédictif des calibres vasculaires rétiniens sur les évènements cardiovasculaires : un calibre artériel rétinien étroit serait prédictif de maladie coronaire chez les femmes et augmenterait la mortalité cardiovasculaire globale ; un large calibre veineux serait prédictif d'accident vasculaire cérébral. Cette thèse a pour objectif d'approfondir les connaissances sur les déterminants des calibres vasculaires rétiniens chez les sujets indemnes d'athérosclérose clinique (antécédent de maladie coronaire, d'accident vasculaire cérébral, d'artériopathie des membres inférieurs). Depuis 2007, en partenariat avec l'université de Melbourne, nous avons acquis le logiciel IVAN® et l'agrément permettant son utilisation en recherche clinique et épidémiologique a été obtenu en 2008. Dans un premier article, nous avons mis en évidence une relation linéaire entre calibre artériel et veineux et fonction rénale mesurée par des méthodes gold standard (filtration glomérulaire mesurée par la clairance de 99mTc-DTPA et ratio albuminurie/créatinurie) sur 80 sujets de la cohorte de médecine interne-hypertension artérielle de l'hôpital Lapeyronie, suggérant des déterminants communs de ces lésions précoces d'organes cibles. Dans un deuxième article, nous avons tout d'abord confirmé le lien entre dilatation veineuse rétinienne et inflammation systémique, puis observé une relation entre calibre artériel étroit et stress oxydatif sur les participants de la cohorte POLA (pathologies oculaires liées à l'âge). Cela est d'une importance particulière car cela suggère que la microcirculation rétinienne, dont des associations avec la macrocirculation carotidienne et cardiaque ont été retrouvées, serait particulièrement sensible au stress oxydatif et à l'inflammation, de façon indépendante des facteurs de risques cardiovasculaires. Dans un troisième article, nous avons retrouvé une relation entre malnutrition biologique et dilatation veineuse rétinienne sur les participants de la cohorte POLA. Cela suggère que des remaniements microcirculatoires précoces pourraient être un mécanisme associé à l'augmentation du risque cardiovasculaire observé chez les sujets âgés souffrants de malnutrition. Les caractéristiques techniques du logiciel IVAN® limitent sa généralisation en médecine, mais son utilisation permet d'approfondir les connaissances sur les déterminants des variations de calibre des vaisseaux de la rétine. Le futur challenge des études sur la vascularisation rétinienne utilisera probablement l'étude de la géométrie vasculaire rétinienne afin d'améliorer la compréhension de microcirculation humaine. / Retinal photography, by allowing a direct observation of retinal vessels, may thus constitute a practical and noninvasive method for the examination of early changes in human microcirculation. Since 1999-2000, IVAN ® software allows for a "semi-automatic" retinal vascular caliber analysis. In the literature, changes in the caliber of retinal vessels have been shown to reflect the cumulative effects of birth weight, genetic factors, aging process, cardiovascular risk factors, renal function, and inflammation. In meta analyses from epidemiological studies, wider retinal venules and narrower arterioles were associated with an increased risk of coronary heart disease in women and an increased risk of global cardiovascular mortality, while wider retinal venular caliber predicted stroke. The aim of the current research is thus to improve the knowledge of retinal vascular calibers determinants in subjects free of clinical evidence of atherosclerosis (either stroke or coronary and peripheral artery disease). In 2007, Melbourne University provided us IVAN ® software and the agreement for its use in clinical and epidemiological research was obtained in 2008. In a first article, an inverse linear relationship between retinal arterial and venous caliber and renal function measured with gold standard methods (glomerular filtration rate from urinary clearance of 99mTc-DTPA and urinary albumin ⁄ creatinine ratio.) was observed in 80 subjects from the cohort of internal medicine-arterial hypertension-Lapeyronie hospital, suggesting common determinants of these preclinical target organ damages. In a second article, we first confirmed the relationship between a wider retinal venular caliber and inflammation, as well as provided evidence for a novel association between wider retinal arteriolar caliber and oxidative stress quantified by GPx-3 activity in the participants of the POLA (Pathologies Oculaires Liées à l'Age) cohort. This finding is of particular importance as it suggests that retinal microvasculature, which has been related to carotid arterial stiffness and cardiac remodeling, may be particularly sensitive to systemic oxidative stress and systemic inflammation, independently of known cardiovascular risk factors. In a third article based on POLA cohort participants, a retinal venular dilatation appears to be strongly associated with malnutrition biomarkers (albumin and transthyretin). This suggests that early microvascular changes may be one of the mechanisms associated with the observed increased risk of cardiovascular disease among elderly subjects with malnutrition. Technical characteristics of IVAN® software limit its generalization in medicine, but its improved our knowledge about the caliber of retinal vessels changes. The future challenge for retinal microcirculation research will probably use parameters of retinal vascular geometry for a better understanding of human microcirculation.