Submitted by Luanna Matias (lua_matias@yahoo.com.br) on 2015-03-04T20:15:19Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Manoel Lucas da Silva - 2011.pdf: 1006184 bytes, checksum: 822278eea13e5a9617ab8622362a7f8e (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2015-03-05T10:50:05Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Manoel Lucas da Silva - 2011.pdf: 1006184 bytes, checksum: 822278eea13e5a9617ab8622362a7f8e (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-05T10:50:05Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Manoel Lucas da Silva - 2011.pdf: 1006184 bytes, checksum: 822278eea13e5a9617ab8622362a7f8e (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Previous issue date: 2011-11-11 / Outros / In this work, the enzyme alcohol dehydrogenase (ADH), extracted from sunflower seeds, was used in the preparation of base electrodes of carbon paste. Thus studies have been conducted concerning the electrochemical properties and the catalytic ability of this enzyme for the conversion of ethanol into acetaldehyde, which leads to oxidation of the cofactor β-nicotidamina adenine dinucleotide (NADH). We constructed three working electrodes (A, B and C) for use in the detection of ethanol in phosphate buffer 0.1 mol L-1 (supporting electrolyte) at pH 7.4 and 8.0. Other variables in this study was the mode of extraction of the enzyme using deionized water or 0.1 mol L-1 phosphate buffer (pH 7.4) and form of the enzyme in carbon powder, were used for this mineral oil Nujol ® and Teflon ® solutions and glutaraldehyde. The cyclic voltammetry and chronoamperometry were the two methods used to verify the action of the enzyme in solution. The results showed that the electrodes A and B have inferior performance compared with the electrode C. Finally, electrochemical experiments showed that the enzyme alcohol dehydrogenase derived from crude extract of sunflower seeds has catalytic activity for oxidation of ethanol, but the enzyme does not maintain this constant activity, probably due to the absence of the cofactor which can be in the crude extract in a very low concentration, acting as a limiting reagent in the reaction. / Neste trabalho, a enzima álcool desidrogenase (ADH), extraída das sementes de girassol, foi utilizada para a elaboração de eletrodos a base de pasta de carbono. Assim, foram realizados estudos a respeito das propriedades eletroquímicas e da capacidade catalítica desta enzima para a conversão do etanol em acetaldeído, que tem como consequência a oxidação do cofator β-nicotidamina adenina dinucleotídeo (NADH). Foram construídos três eletrodos de trabalho (A, B e C) para serem utilizados na detecção de etanol em solução tampão fosfato 0,1 mol L-1 (eletrólito de suporte) em pH 7,4 e 8,0. Outras variáveis deste estudo foram o modo de extração da enzima utilizando água deionizada ou tampão fosfato 0,1 mol L-1 (pH 7,4) e a forma de aglutinação da enzima no pó de carbono, para isso foram utilizados o óleo mineral Nujol® e soluções de Teflon® e glutaraldeído. As técnicas de voltametria cíclica e cronoamperometria foram os dois métodos utilizados para verificar a ação da enzima em solução. Os resultados mostraram que os eletrodos A e B tiveram o desempenho inferior em comparação com o eletrodo C. Por fim, os experimentos eletroquímicos mostraram que a enzima álcool desidrogenase derivada do extrato bruto das sementes de girassol tem atividade bioeletrocatalítica para a oxidação do etanol, mas a enzima não mantém essa atividade constante, provavelmente devido à ausência do cofator que no extrato bruto possa estar em uma concentração muito baixa, agindo como reagente limitante da reação.

Este trabalho descreve a preparação, a caracterização e o uso de um biossensor de pasta de carbono modificado com a enzima acetilcolinesterase para a quantificação de carbamatos em alimentos, bem como o estudo das constantes de velocidade para a reação enzima/substrato (iodeto de acetiltiocolina) em solução. Inicialmente foram realizados testes de estabilidade, tanto para o substrato quanto para a enzima. Nestes testes, a absorção na região do UV-vis do substrato não apresentou diminuição significativa em 11 dias de análises, já a enzima apresentou uma grande perda de sua atividade com apenas três dias de preparo da solução. Na preparação do eletrodo de trabalho alguns parâmetros foram otimizados, tais como: quantidade de enzima e de ftalocianina de cobalto (CoPC) no eletrodo, bem como a porcentagem de glutaraldeído utilizada. A melhor resposta ocorreu para adição de 2,40x10-3g de enzima, 0,90x10-3g de CoPC (referentes à massa de 0,017g de pasta de carbono) e solução de glutaraldeido 1%. A seguir, realizou-se um experimento baseado na inibição da atividade da enzima, causada pela imersão do eletrodo na solução contendo o pesticida carbaril nas concentrações 5,00x10-5 e 1,00x10-4 mol L-1. Notou-se que, com o aumento da concentração do carbaril, houve aumento na inibição da atividade enzimática. Desta forma o eletrodo apresentou-se apto para determinação analítica de pesticidas. Estas medidas foram realizadas em meio de tampão fosfato 0,1 mol L-1, pH 7,4 e com tempo de incubação para o carbaril, metomil e aldicarbe foram de 8, 12 e 15 minutos, respectivamente. Os limites de detecção (LD) e quantificação (LQ) obtidos utilizando-se o biossensor amperométrico para o carbaril foram de 2,00x10-6 mol L-1 (0,40 mg L-1) e 6,70 x 10-6 mol L-1 (1,30 mg L-1), para o metomil de 1,88 x 10-7mol L-1 (30,45 micro g L-1) e 6,26 x 10-7 mol L-1 (0,10 mg / L-1) e para o aldicarbe de 1,10x10-6 mol L-1 (0,20 mg L-1) e 3,60x10-6 mol L-1 (0,70 mg L-1). Para a formulação comercial Lannate (metomil) os LD e LQ foram 2,13x10-7 mol L-1 (34,50 micro g L-1) e 7,09x10-7 mol L-1(0,12 mg L-1), respectivamente. As medidas de HPLC apresentaram LD e LQ de 1,58 x 10-8 mol L-1 (3,18 micro g L-1) e 5,27x10-8 mol L-1 (10,60 micro g L-1) para o carbaril e de 9,02 x 10-10 mol L-1 (0,15 micro g L-1) e 3,00 x 10-9 mol L-1 (48,60 micro g L-1) para o metomil. Testes de recuperação foram realizados usando ambas as técnicas para o carbaril e Lannate. As recuperações utilizando-se o biossensor mostraram-se eficientes, variando de 76,83 a 106,67% para o carbaril e de 78,00 a 96,50% para a Lannate, enquanto que nas medidas de HPLC, as recuperações foram de 78,00 a 108,33% para o carbaril e de 57,00 a 99,50% para o Lannate. A recuperação para o aldicarbe no tomate foi de 62,40 %. As análises da enzima em solução mostraram que a metodologia empregada neste estudo é adequada para a determinação das constantes de velocidade para a etapa lenta da reação AchE/AchI. Observou-se que os valores destas constantes são dependentes da concentração dos pesticidas fenitrothion (organofosforado) e carbaril (carbamato), em baixa concentração ambos apresentaram constantes de velocidade similares, mas com o aumento dessa concentração, o fenitrothion apresentou menor constante de velocidade em relação ao carbaril, sugerindo que este apresenta maior inibição da enzima e por conseqüência maior toxicidade no organismo. Esses resultados mostraram uma possível metodologia analítica para a quantificação destes pesticidas, obtendo-se os valores das constantes de velocidade enzimática e suas dependências com as concentrações dos pesticidas em solução. / This work describes the development, characterization and utilization of a carbon paste biosensor based in the acetylcholinesterase enzyme for carbamates determinations in foodstuff, as well as the study of rate constants for enzyme/substrate reaction in solution. Stability tests were initially performed for both the substrate and the enzyme. In these tests, the signal for UV-vis adsorption for the substrate shows no inhibition during 11 days while for the enzyme it has been demonstrated that a considerable loss of activity occurs after three days from the solution preparation. In the electrode preparation, some experimental parameters were optimized, such as the amount of enzyme and the content of cobalt ftalocyanine (CoPC) in the electrode, as well as the employed percentage of glutaraldehide. The highest analytical signals were obtained for the addition of 2.40x10-3 g enzyme, 0.90x10-3 g CoPC (related to the massa of 0,017g of carbon paste) and a 1% glutaraldehide solution. The next step was to carry out an experiment based in the inhibition of enzyme activity by the pesticide. For this, the biosensor was immersed in 5.00x10-5 e 1.00x10-4 mol L-1 carbaryl solutions. It was observed that, by increasing the carbaryl concentration, the electrochemical signal of the sensor was inhibited proportionally. This was indicative that the sensor was adequate to be used in carbaryl monitoring and analytical determinations. The analytical determinations of carbamate pesticides were performed in 0.1 mol L-1 phosphate buffer, pH 7,4, with incubation time of 8, 12 and 15 minutes for carbaryl, metomil and aldicarb, respectively. The detection (LD) and quantification (LQ) limits obtained with the biosensor were 2.00x10-6 mol L-1 (0.40 mg L-1) and 6.70 x 10-6 mol L-1 (1.30 mg L-1) for carbaryl, 1.88x10-7mol L-1 (30.45 micro g L-1) and 6.26x10-7 mol L-1 (0.10 mg / L-1) for metomil and 1.10x10-6 mol L-1 (0.20 mg L-1) and 3.60x10-6 mol L-1 (0.70 mg L-1) for aldicarb. For the commercial formulation of metomil, Lannate, LD and LQ obtained were 2.13x10-7 mol L-1 (34.50 microg L-1) and 7.09x10-7 mol L-1(0.12 mg L-1), respectively. The HPLC measurements showed LD and LQ of 1.58x10-8 mol L-1 (3.18micro g L-1) and 5.27x10-8 mol L-1 (10.60 micro g L-1) for carbaryl and 9.02x10-10 mol L-1 (0.15 micro g L-1) and 3.00x10-9 mol L-1 (48.60 micro g L-1) for metomil. Recovering tests were also done with both analytical techniques for carbaryl and Lannate. The obtained recoveries using the biosensor were in the range of 76.83 to 106.67% for carbaryl and 78.00 to 96.50% for Lannate, while using the HPLC, the recoverings were 78.00 a 108.33% for carbaryl and 57.00 to 99.50% for Lannate. The recovering of aldicarb in tomatoes, with HPLC, were 62.40 %. The study of the enzymatic reaction in solution showed that the employed methodology allows to obtain the rate constant values for the rate determining step of the AchE/AchI reaction. It was observed that these rate constant values were strongly dependent in the pesticide concentrations for fenitrothion (organofosforous) and carbaryl (carbamate). At low concentration levels of the pesticide in the electrolyte, all the rate constants showed similar values but, when the pesticide concentration was raised, fenitrothion was found to exert a more powerful inhibition action for the enzyme activity than carbaryl, thus suggesting its higher toxic character. These results showed the development of a possible analytical methodology for quantification of these pesticides, by calculating the rate constant value and its dependence to the pesticide concentration in solution.

Neste trabalho são apresentados resultados relacionados a estudos sobre o comportamento eletroquímico do lactato e do peróxido de hidrogênio em diversos eletrodos em meio de diferentes pHs utilizando voltametria cíclica. Também foi investigado o comportamento eletroquímico do peróxido de hidrogênio em eletrodos modificados com filmes de hexacianoferratos utilizando eletrodos de platina e carbono vítreo. A vantagem do uso do CTAB na modificação da superfície de carbono vítreo com Azul da Prússia foi confirmada no que se refere à melhora da sensibilidade e da estabilidade das medidas. Numa etapa posterior desenvolveu-se um biossensor para a determinação de lactato pelo monitoramento de peróxido de hidrogênio produzido na reação catalisada de lactato com oxigênio na presença da enzima lactato oxidase. Nessa etapa, o trabalho consistiu em imobilizar a enzima lactato oxidase na superfície do eletrodo, previamente, modificado com Azul da Prússia, com o auxílio de Nafion®. Após a construção do biossensor e a otimização das condições de análise (pH, quantidade de enzima, volume da amostra e vazão) para obtenção de maior sinal analítico no desenvolvimento do método para a determinação de lactato por análise em fluxo, averiguou-se a repetibilidade das medidas (Clactato = 0,28 mmol L-1) obtendo-se um desvio padrão de 2,2% para 18 repetições. A freqüência analítica foi estimada em 160 injeções por hora com limite de detecção de 0,84 µmol L-1 e linearidade até 0,28 mmol L-1 de lactato. O biossensor foi aplicado na quantificação de lactato em amostras alimentares (cervejas alcoólicas e não alcoólicas) e biológicas (sangue liofilizado e recém coletado). Por fim, realizaram-se estudos envolvendo a variação da concentração de lactato sanguíneo em função da intensidade de atividade esportiva. Os resultados obtidos pelo método proposto foram comparados com aqueles oriundos do uso de método de referência. / Results on the investigation of the electrochemical behavior of lactate and hydrogen peroxide at various electrodic surfaces at different pHs using cyclic voltammetry are presented. Experiments were also carried out with platinum and glassy carbon electrodes modified with hexacyanoferrate films. The advantage of using CTAB in the electrodeposition step of Prussian Blue films onto glassy carbon surfaces was confirmed taking into account both the stability and sensitivity of measurements. The immobilization of lactate oxidase onto glassy carbon electrodes modified with a Prussian Blue layer using Nafion® was performed to fabricate a biosensor for lactate. The biosensor was used in the development of a FIA amperometric method for the determination of lactate. Under optimal operating conditions (pH = 6.9, E = -0.1 V), the linear response of the method was extended up to 0.28 mmol L-1 lactate with a limit of detection of 0.84 µmol L-1. The repeatability of the method for injections of a 0.28 mmol L-1 lactate solution was 2.2 % (n = 18). The analytical frequency was calculated as 160 injections h-1. The usefulness of the method was demonstrated by determining lactate in beer (alcoholic and nonalcoholic beers) and blood samples (lyophilized and freshly collected). Finally, the influence of physical exercise on the blood lactate level was studied. Results obtained by using the proposed amperometric detector compared well with the reference method.

Este trabalho teve como objetivo o desenvolvimento de biossensores eletroquímicos baseados na imobilização de duas enzimas diferentes em filmes de polipirrol (PPI) eletrodepositados, a fitase e a polifenol oxidase (PFO), esta última na forma de extrato bruto do fruto de abacate. Como a fitase hidrolisa cataliticamente ácido fítico (AF) em íons fosfatos, foram preparados biossensores por imobilização da enzima sobre filmes de PPI para a detecção indireta de ácido fítico via íons fosfatos. Foram utilizados dois métodos de imobilização; no primeiro, a enzima, fitase, foi imobilizada ao filme de PPI por imersão do filme em uma solução contendo a enzima por um período de 2 h, no segundo, a fitase foi encapsulada em lipossomos de dipalmitoil fosfatidil glicerol (DPPG) e depois foi imobilizada nos filmes de PPI depositados em eletrodos impressos. O segundo método se mostrou melhor para a detecção de ácido fítico, pois levou a um maior alcance linear e um baixo valor de limite de detecção. Neste caso, verificou-se que o DPPG preservou a integridade enzimática e levou a biossensores mais estáveis e sensíveis. Já para a PFO, que catalisa a oxidação de compostos fenólicos a quinonas, foram preparados biossensores para a detecção indireta de catecol. Para esta enzima, foram utilizados três métodos de imobilização: adsorção, ligação cruzada e confinamento, sendo o último que levou a melhores respostas. O método de confinamento consiste na adição da enzima, juntamente com o monômero, à solução de eletropolimerização, quando se procede com a metodologia normal de preparo dos filmes de PPI, que foram caracterizados por: microscopia de força atômica (AFM), microscopia eletrônica de varredura (MEV), espectroscopia de infravermelho por transformada de Fourier (FTIR) e espectroscopia de reflexão e absorção no infravermelho com modulação da polarização (PM-IRRAS). Estas técnicas de caracterização permitiram com que a presença da enzima fosse associada às modificações das características estruturais e morfológicas dos filmes de PPI. / This doctoral thesis reports on the development of electrochemical biosensors based on the immobilization of enzymes phytase and polyphenol oxidase (PPO) (the latter in the form of crude extract of avocado fruit) on electrodeposited polypyrrole films (PPY). As phytase catalytically hydrolyzes phytic acid (PA) in phosphate ions, biosensors were prepared by its immobilization on PPY films for the indirect detection of PA via phosphate ions. In the first method the enzyme was maintained on the PPY film for a period of 2 h, whereas in the second, it was encapsulated in Dipalmitoyl Phosphatidyl glycerol (DPPG) and immobilized on printed electrodes. The second system proved more viable for the detection of PA and showed broader linear range and low detection limit because DPPG preserved the integrity of the enzyme and produced more stable and sensitive biosensors. Regarding PPO, which catalyzes the oxidation of phenolic compounds to quinones, biosensors for the indirect detection of catechol via the formation of quinone in solution were prepared. Three methods of immobilization were used: adsorption, cross-linking and confinement. The latter yielded favorable results in comparison to other methods. The films were characterized by atomic force microscopy (AFM), scanning electron microscopy (SEM) spectroscopy, fourier transform infrared (FTIR) spectroscopy and reflection absorption and infrared polarization modulation (PM-IRRAS) techniques and revealed the presence of the enzyme and a modification in the structural characteristics and morphology of the films.

Nos últimos anos, o desenvolvimento de novas plataformas biossensoras trouxe importantes avanços à área médica, incluindo maior rapidez na detecção de biomarcadores, menor custo de análise e portabilidade. Essa tese traz a descrição do desenvolvimento de três tipos de biossensores que visam à auxiliar o diagnóstico de diferentes doenças. No primeiro capítulo, detalha-se a construção de um dispositivo microfluídico baseado em papel para a quantificação simultânea de dois biomarcadores da doença de Alzheimer: Fetuína B e Clusterina. O dispositivo foi capaz de quantificar as proteínas estudadas de maneira precisa e de baixo custo através do uso de técnicas eletroquímicas e colorimétricas, apresentando limites de detecção na ordem de p-nmol/L. O segundo capítulo trata do desenvolvimento de um imunossensor eletroquímico para a quantificação de melatonina. O dispositivo foi capaz de detectar a biomolécula em amostras biológicas rapidamente e com boa especificidade, diferenciando a melatonina de componentes com alta semelhança estrutural. Por fim, o terceiro capítulo descreve um genossensor eletroquímico para diagnóstico e determinação do traço da doença genética mais comum no Brasil, a anemia falciforme. O sensor foi capaz de diferenciar sequências normais de mutadas de maneira simples e rápida, sendo adequado para o diagnóstico e a determinação de seu traço. Esperamos que os dispositivos aqui apresentados levem à diagnósticos mais acessíveis fornecendo assim melhores condições de saúde à população. / The development of new biosensor platforms has brought important advances to the medical field, including faster detection of biomarkers, lower cost of analysis and portability. This thesis provides a description of the development of three biosensors that aim to assist the diagnosis of three different diseases. The first chapter describes the construction of a paper-based microfluidic device for the simultaneous quantification of two Alzheimer\'s disease biomarkers: Fetuin B and Clusterin. The device was able to quantify the studied proteins in a precise and low cost manner through the use of electrochemical and colorimetric techniques, presenting limits of detection in the order of p-nmol/L. The second chapter details the the development of an electrochemical immunosensor for the quantification of melatonin. The device was able to detect the biomolecule in biological samples quickly and with good specificity, differentiating melatonin from components with high structural similarity. Finally, the third chapter describes an electrochemical genosensor for diagnosis and determination of the trait of the most common genetic disease in Brazil, sickle cell anemia. The sensor was able to differentiate normal and mutated sequences in a simple and fast manner, being suitable for the diseases diagnosis and the determination of its trait. Therefore, we expect the devices presented here to lead to more accessible diagnoses, providing better health conditions for the population.

As galectinas são proteínas que se ligam a -galactosídeos por meio do domínio de reconhecimento de carboidratos (CRD do inglês, Carbohydrate Recognition Domain) e que participam de vários processos de reconhecimento celular, sinalização, adesão e destinação intracelular de proteínas recém-sintetizadas. A primeira galectina, Galectina-1 (Gal-1), foi identificada em 1976 e possui um papel importante na progressão e proliferação tumoral, angiogênese, resistência a drogas e processos inflamatórios. Assim, é interessante a construção de dispositivos com Galectinas imobilizadas, preservando o CRD para o estudo de mecanismos e/ou detecção destas doenças. Neste trabalho a produção e caracterização de uma proteína recombinante fusionada, a MBP-Gal-1, foi descrita. A proposta do projeto foi pautada na hipótese de que a fusão da MBP à Gal-1 seria uma excelente estratégia para imobilização orientada da proteína de interesse, (Gal-1), sobre eletrodos modificados com filme polimérico, auxiliando na preservação da atividade da biomolécula imobilizada para posterior desenvolvimento de biossensor. A MBP-Gal-1 foi purificada utilizando 2 colunas com resinas diferentes: sepharose/lactose e amilose onde foi possível comprovar a atividade/preservação dos sítios ativos da Gal-1 e MBP, respectivamente. A proteína fusionada teve seu estado oligomérico estimado e seu raio hidrodinâmico determinado pela técnica Espalhamento Dinâmico da Luz sendo que a mesma se encontrava na forma monomérica com raio hidrodinâmico de 4 nm ± 1,26. A massa molecular de 57,834 kDa para a MBP-Gal-1 foi obtida através da técnica de Espectrometria de Massas MALDI-TOF/TOF. O PPB, material polimérico empregado na modificação dos eletrodos de carbono vítreo e ouro, foi sintetizado e teve sua estrutura confirmada pela técnica de Ressonância Magnética Nuclear; este material foi utilizado para a realização dos ensaios de Espectroscopia de Impedância Eletroquímica (EIE) e Ressonância de Plásmons de Superfície (SPR) para a construção do biossensor. Os ensaios EIE utilizando eletrodo de carbono vítreo modificado com PPB mostraram a importância da imobilização orientada da sonda (MBP-Gal-1) para garantir a preservação da atividade biológica da mesma, uma vez que os resultados relativos ao aumento da Resistência à Transferência de Carga (Rtc), após adição do alvo (lactose), foram da ordem de 80% a mais para a proteína fusionada MBP-Gal-1 quando comparados à proteína nativa Gal-1. Os ensaios de SPR revelaram maior SPR efetiva para a MBP-Gal-1 imobilizada sobre superfície de eletrodo Au-SPR modificado com PPB o qual apresentou bom desempenho na detecção de lactose. / Galectins are proteins that bind to -galactosides by the Carbohydrate Recognition Domain (CRD) and participate in various processes of cell recognition, signaling, adhesion and intracellular destination of newly synthesized proteins. The first galectin, Galectin-1 (Gal-1), was identified in 1976 and plays an important role in tumor progression and proliferation, angiogenesis, drug resistance and inflammatory processes. Thus, it is interesting to desing devices with immobilized Galectins, preserving its CRD for the study of mechanisms and /or detection of such diseases. In this work the production and characterization of a fused recombinant protein, MBP-Gal-1, has been described. The project goal was based on the hypothesis that the fusion of the MBP to Gal-1 would be an excellent strategy for oriented immobilization of the protein of interest, (Gal-1), onto PPB- modified electrodes, promoting the preservation of the biomolecule activity immobilized for further development of a biosensor. MBP-Gal-1 was purified using 2 columns with different resins: sepharose/lactose and amylose and it was possible to prove the activity/preservation of both CRDs from Gal-1 and MBP, respectively. Dynamic Light Scattering showed that MBP-Gal-1 was in a monomeric form and with a hydrodynamic radius of 4 nm ± 1,26. The molecular mass of 57.834 kDa for MBP-Gal-1 was obtained by the technique of MALDI-TOF/TOF Mass Spectrometry. The PPB, a polymeric material used in the modification of glassy carbon and gold electrodes, was synthesized and its structure was confirmed by the Nuclear Magnetic Resonance (NMR); this material was used to carry out the Electrochemical Impedance Spectroscopy (EIS) and Surface Plasmon Resonance (SPR) tests for the construction of the biosensor. EIS assays using PPB-modified glassy carbon electrode showed the importance of probe-immobilization (MBP-Gal-1) to ensure the preservation of the biological activity of the protein, since the results related to the increase in Resistance of Charge Transfer (Rct), after addition of the target (lactose), were 80% higher for the fused protein MBP-Gal-1 when compared to the Gal-1 native-form protein. The SPR assays revealed a greater effective SPR for MBP-Gal-1 immobilized onto PPB-modified Au-SPR electrode surface which showed good performance in the detection of lactose.

As galectinas são proteínas que se ligam a -galactosídeos por meio do domínio de reconhecimento de carboidratos (CRD do inglês, Carbohydrate Recognition Domain) e que participam de vários processos de reconhecimento celular, sinalização, adesão e destinação intracelular de proteínas recém-sintetizadas. A primeira galectina, Galectina-1 (Gal-1), foi identificada em 1976 e possui um papel importante na progressão e proliferação tumoral, angiogênese, resistência a drogas e processos inflamatórios. Assim, é interessante a construção de dispositivos com Galectinas imobilizadas, preservando o CRD para o estudo de mecanismos e/ou detecção destas doenças. Neste trabalho a produção e caracterização de uma proteína recombinante fusionada, a MBP-Gal-1, foi descrita. A proposta do projeto foi pautada na hipótese de que a fusão da MBP à Gal-1 seria uma excelente estratégia para imobilização orientada da proteína de interesse, (Gal-1), sobre eletrodos modificados com filme polimérico, auxiliando na preservação da atividade da biomolécula imobilizada para posterior desenvolvimento de biossensor. A MBP-Gal-1 foi purificada utilizando 2 colunas com resinas diferentes: sepharose/lactose e amilose onde foi possível comprovar a atividade/preservação dos sítios ativos da Gal-1 e MBP, respectivamente. A proteína fusionada teve seu estado oligomérico estimado e seu raio hidrodinâmico determinado pela técnica Espalhamento Dinâmico da Luz sendo que a mesma se encontrava na forma monomérica com raio hidrodinâmico de 4 nm ± 1,26. A massa molecular de 57,834 kDa para a MBP-Gal-1 foi obtida através da técnica de Espectrometria de Massas MALDI-TOF/TOF. O PPB, material polimérico empregado na modificação dos eletrodos de carbono vítreo e ouro, foi sintetizado e teve sua estrutura confirmada pela técnica de Ressonância Magnética Nuclear; este material foi utilizado para a realização dos ensaios de Espectroscopia de Impedância Eletroquímica (EIE) e Ressonância de Plásmons de Superfície (SPR) para a construção do biossensor. Os ensaios EIE utilizando eletrodo de carbono vítreo modificado com PPB mostraram a importância da imobilização orientada da sonda (MBP-Gal-1) para garantir a preservação da atividade biológica da mesma, uma vez que os resultados relativos ao aumento da Resistência à Transferência de Carga (Rtc), após adição do alvo (lactose), foram da ordem de 80% a mais para a proteína fusionada MBP-Gal-1 quando comparados à proteína nativa Gal-1. Os ensaios de SPR revelaram maior SPR efetiva para a MBP-Gal-1 imobilizada sobre superfície de eletrodo Au-SPR modificado com PPB o qual apresentou bom desempenho na detecção de lactose. / Galectins are proteins that bind to -galactosides by the Carbohydrate Recognition Domain (CRD) and participate in various processes of cell recognition, signaling, adhesion and intracellular destination of newly synthesized proteins. The first galectin, Galectin-1 (Gal-1), was identified in 1976 and plays an important role in tumor progression and proliferation, angiogenesis, drug resistance and inflammatory processes. Thus, it is interesting to desing devices with immobilized Galectins, preserving its CRD for the study of mechanisms and /or detection of such diseases. In this work the production and characterization of a fused recombinant protein, MBP-Gal-1, has been described. The project goal was based on the hypothesis that the fusion of the MBP to Gal-1 would be an excellent strategy for oriented immobilization of the protein of interest, (Gal-1), onto PPB- modified electrodes, promoting the preservation of the biomolecule activity immobilized for further development of a biosensor. MBP-Gal-1 was purified using 2 columns with different resins: sepharose/lactose and amylose and it was possible to prove the activity/preservation of both CRDs from Gal-1 and MBP, respectively. Dynamic Light Scattering showed that MBP-Gal-1 was in a monomeric form and with a hydrodynamic radius of 4 nm ± 1,26. The molecular mass of 57.834 kDa for MBP-Gal-1 was obtained by the technique of MALDI-TOF/TOF Mass Spectrometry. The PPB, a polymeric material used in the modification of glassy carbon and gold electrodes, was synthesized and its structure was confirmed by the Nuclear Magnetic Resonance (NMR); this material was used to carry out the Electrochemical Impedance Spectroscopy (EIS) and Surface Plasmon Resonance (SPR) tests for the construction of the biosensor. EIS assays using PPB-modified glassy carbon electrode showed the importance of probe-immobilization (MBP-Gal-1) to ensure the preservation of the biological activity of the protein, since the results related to the increase in Resistance of Charge Transfer (Rct), after addition of the target (lactose), were 80% higher for the fused protein MBP-Gal-1 when compared to the Gal-1 native-form protein. The SPR assays revealed a greater effective SPR for MBP-Gal-1 immobilized onto PPB-modified Au-SPR electrode surface which showed good performance in the detection of lactose.

Segundo dados da Organização Mundial de Saúde, até o ano de 2030 a diabetes será a sétima enfermidade causadora de morte no mundo. A diabetes se caracteriza pela variação do nível de glicose no sangue dada ingestão de alimentos ou realização de certas tarefas. Além disso, já é sabido pela comunidade científica atual que células cancerígenas possuem metabolismo diferente quando comparadas a células normais, consumindo uma maior quantidade de açúcar devido a essa anormalidade. No presente trabalho serão apresentados, basicamente, dois tipos de biossensores que possuem grande potencial para tornarem-se monitores contínuos de glicose. Ambos os biossensores utilizam a enzima glicose oxidase como catalisador específico da reação de oxidação do carboidrato. O primeiro apresenta estrutura em escala micrométrica, tem por objetivo a quantificação de glicose em solução em ambiente extracelular e se baseia no sistema EGFET (Extended Gate Field Effect Transistor) com substrato de Fluorine Tin Oxide (FTO). Além do mais, foram utilizados dois protocolos de imobilização da glicose oxidase: quitosana (com uma janela de detecção de 1 a 5mM de glicose) e glutaraldeído (com janela de detecção de 0 a 15 mM de glicose). O segundo apresenta estrutura em escala nanométrica, tem por objetivo a quantificação de glicose em ambiente intracelular e baseia-se no sistema de nanopipetas de quartzo. Com esse dispositivo foi possível estipular a concentração de glicose livre dentro de três linhas de células distintas: Fibroblastos humanos entre 0 e 2.8mM; MCF-7 maior que 4.7 mM; MDA-MB-231entre 3.6 e 4.5 mM. / According to the World Health Organization, until 2030 diabetes will be the 7th cause of death worldwide. This disease is characterized by variation on blood glucose levels due to ingestion of specific food and tasks performing. Moreover, it is already known that cancer cells have a different metabolism when compared to normal cells and these abnormal cells have a higher sugar intake due to this abnormality. This work will present, basically, two types of biosensors with great potential to become continuous glucose monitors. Both biosensors use the enzyme glucose oxidase as carbohydrate oxidation catalyzer. The first one presents a micro-metric structure and its goal is to quantify glucose concentration in an extracellular solution. This device is based in EGFET (Extended Gate Field Effect Transistor) system and uses FTO as substrate. Furthermore, two immobilization protocols were used to fix the enzyme to the FTO: chitosan (with final range of 1~5mM of glucose) and glutaraldehyde (with final range of 0~15mM of glucose). The second is a nano-structured biosensor based on nanopipette system and its goal is to quantify intracellular glucose concentration. With this device was possible to stipulate free glucose molecules inside different cell lines: between 0 and 2.8mM for human Fibroblasts; greater than 4.7 mM for MCF-7; and between 3.6 and 4.5 mM for MDA-MB-231.

A utilização descontrolada de pesticidas tem provocado no decorrer dos anos a intoxicação de milhares de pessoas no mundo, uma vez que, seus resíduos têm sido depositados em alimentos, em solos e em ambientes aquáticos. Assim, a construção de duas novas plataformas sensoras para a detecção de pesticidas é o objetivo desse trabalho. Na primeira plataforma foi utilizado o polieletrólito catiônico polietilenoimina (PEI) em conjunto com o polissacarídeo extracelular algal (PSE) produzido pela microalga criptofícea Cryptomonas tetrapirenoidosa preparados através da técnica de deposição \"spin-coating\". E a segunda plataforma foi produzida por eletrodeposição pulsada, entre um potencial de redução e um de oxidação, utilizando nanoestruturas de óxido de zinco (ZnO). Para caracterizar as plataformas, foram utilizadas as técnicas de microscopia eletrônica de varredura com fonte de emissão de campo (FEG-SEM), difração de raios X (XRD), espectroscopia de absorção ultravioleta-visível (UV-Vis), microscopia de força atômica (AFM) e espectroscopia de reflexão-absorção no Infravermelho com modulação da polarização (PM-IRRAS). Através da imobilização da enzima polifenol oxidase na forma de extrato bruto em sua fonte natural (fruto abacate), as plataformas de PEI/PSE e ZnO, foram avaliadas como biossensores de catecol e do inseticida carbaril. De modo comparativo, as plataformas de PEI/PSE sem a presença imobilizada da enzima também foram estudadas para a detecção do catecol e do carbaril. A simplicidade na formação e na construção dessas plataformas vem qualificá-las como viáveis a serem produzidas em escala industrial e com baixo custo de processamento. E diante dos resultados obtidos no desenvolvimento desses biossensores destaca-se a eficiência e a rapidez de detecção, o que os tornam economicamente promissores e competitivos em termos de aplicações ambientais. / The uncontrolled use of pesticides has resulted over the years the intoxication of thousands of people in the world, since their waste has been deposited in food, in soil and aquatic environments. Thus, the construction of two new sensors platforms for pesticide detection is the objective of this work. At first platform was used cationic polyelectrolyte polyethyleneimine (PEI) along with the extracellular algal polysaccharide (EPS) produced by microalgae criptofícea Cryptomonas tetrapirenoidosa prepared by deposition technique \"spin-coating\". The second platform was produced by pulsed electrodeposition between a reduction and an oxidation potential using nanostructures zinc oxide (ZnO). To characterize the platforms, we used the techniques of field emission gun scanning electron microscopy (FEG-SEM), X-ray diffraction (XRD), ultraviolet visible absorption spectroscopy (UV-Vis), atomic force microscopy (AFM), and polarization modulation infrared reflection-absorption spectroscopy (PM-IRRAS). By immobilization of the polyphenol oxidase enzyme as a crude extract in their natural source (avocado fruit), platforms PEI/PSE and ZnO, they were evaluated as catechol and carbaryl insecticide biosensors. In a comparative way, the platforms PEI/PSE without the presence of immobilized enzyme were also studied for detection of catechol and carbaryl. The simplicity in the formation and construction of these platforms comes qualify them as viable to be produced on an industrial scale and low cost processing. And on the results obtained in the development of such biosensors stand out the efficiency and speed of detection, which make them economically promising and competitive in terms of environmental applications.

Ao longo dos anos a medicina vem se desenvolvendo rapidamente e junto com ela desenvolvem-se os métodos e processos de diagnósticos. Estes métodos ficam mais rápidos, precisos e cada vez menos invasivos graças ao desenvolvimento de dispositivos diagnósticos a cada dia menores e que produzam respostas confiáveis. Os biossensores são, sem dúvida, os grandes responsáveis pela miniaturização, barateamento e rapidez de diversos métodos diagnósticos e procedimentos clínicos utilizados diariamente. Dentre os diferentes tipos de biossensores existentes, destacamos os biossensores embasados em transistores de efeito de campo (FETs), mais precisamente os biossensores a base de transistor de efeito de campo de porta estendida (EGFET). Analisamos nesse trabalho os procedimentos de medida utilizando filmes finos de óxido de estanho dopados com flúor (FTO) como membrana sensível a íons H+ acoplados à porta de um EGFET, que podem servir de base para a construção de um biossensor no futuro. Já existem artigos na literatura atual que fazem uso de FTO como membrana sensível a íons H+ e OH-. Entretanto, nenhum dos artigos disponíveis faz um bom controle de alguns parâmetros, em alguns casos relativamente simples, ou se fazem não deixam claro de que maneira estão controlando esses parâmetros. Tais parâmetros são de fundamental importância na resposta final dos sensores uma vez que eles interferem significativamente no sinal dos mesmos. Mostramos no presente trabalho que parâmetros como a luz, a sequência em que os pHs são medidos pela amostra, o procedimento de limpeza das amostras e até as características morfológicas das amostras são importantes no processo de adsorção e retirada de íons da superfície da membrana. Mostramos também que cada amostra necessita uma rotina diferente quanto à sequência de medidas e até mesmo procedimentos de limpeza para que seu rendimento seja máximo, e como diferentes amostras evoluem ao longo do tempo. Como solução aos problemas citados, descrevemos o uso correto de duas amostras que apresentaram reprodutibilidade em seus dados e invariância entre os resultados coletados por diferentes sequências de medidas. Por fim, deixamos uma proposta sobre a dinâmica que ocorre durante os processos de adsorção e retirada de íons H+ e OH- na superfície dos filmes. Com base em nossa proposta fizemos cálculos teóricos estimados da quantidade de cargas que são adsorvidas na superfície do filme para as diferentes situações encontradas durante os experimentos. / Over the years the medicine has been developing rapidly and along with it develop methods and diagnostic procedures. These methods become faster, more accurate and less invasive thanks to the development of diagnostic devices each day minors and producing reliable answers. The biosensors are undoubtedly the major responsible for miniaturization, cheaper and rapidity of various diagnostic methods and clinical procedures used every day. Among the different types of existing biosensors, we highlight the biosensors grounded in field effect transistors (FETs), more precisely the biosensor based in extended gate field effect transistor (EGFET). We analyzed on this work measurement procedures using tin oxide thin films doped with fluorine (or fluorine tin oxide FTO) as sensitive the membrane to H+ ions bounded to the gate of an EGFET, which can serve as a basis for building a biosensor in the future. Articles has already been written reporting the use of the FTO as sensitive membrane to ion H+ and OH-. However, none article available makes a good control of some parameters, in some cases relatively simple, or if they do not make it clear the way they are controlling these parameters. These parameters are of crucial importance in the final response of the sensors since they interfere significantly in signal of the sensors. So, we shown in this work, which parameters as light, the sequence in which the pHs are measured by the sample, the cleaning procedure of samples and even the morphological characteristics of the samples are important in the process of adsorption and ion withdrawal of membrane surface. We shown also that each sample requires a different routine on the following measures and even cleaning procedures for your maximum income is, and how different samples evolve over time. As a solution to the problems cited, we describe the correct use of two samples that showed reproducibility in your data and invariance between the results collected by different sequences of measures. Finally, we leave a proposal on the dynamics that occurs during adsorption processes and withdrawal ion H+ and OH- on the surface of the films. Based on our proposal did theoretical calculations estimated quantity of loads that are adsorb on the surface of the film for the different situations encountered during experiments.