La pourriture bleue causée par Penicillium expansum est l'une des maladies les plus dommageables des fruits pomaceae (pommes et poires). Outre des dégâts directs, cette maladie pose un problème de santé publique car l'agent pathogène produit des mycotoxines nocives pour l'homme et les animaux dont la plus sérieuse est la patuline. La croissance du champignon pathogène et la production de patuline requièrent des conditions physico-chimiques particulières. Les informations existantes à ce propos demeurent cependant modestes et insuffisantes pour envisager de développer des moyens de lutte contre l'apparition du champignon. Par ailleurs, la patuline reste avec l'ochratoxine A, les seules toxines dont la voie de biosynthèse n'a pas encore été complètement établie, tant sur le plan chimique que moléculaire. Cette étude apporte dans un premier temps des données complémentaires sur les facteurs physico-chimiques (température, pH….) qui conditionnent la croissance de P. expansum de même que sa capacité à produire la patuline. La connaissance de ces besoins et de ces conditions conduit en pratique à lutter et contrôler la contamination par la patuline tout le long de la chaine alimentaire. Dans un deuxième temps, cette thèse apporte des améliorations spectaculaires sur le plan fondamental, en termes d'élucidation de la voie de biosynthèse de la patuline. Le cluster des gènes impliqués dans la biosynthèse de cette mycotoxine chez l'espèce la plus préoccupante P. expansum a été entièrement identifié et caractérisé. Pour lever encore plus le voile sur la biosynthèse de cette mycotoxine, la caractérisation du facteur de régulation spécifique de cette voie (patL) a été également établie. Une perturbation de ce gène a provoqué une incapacité de production de patuline et une sévère diminution de l'expression des gènes Pat. De même, grâce à ce mutant déficient, il a été montré que la patuline pourrait agir comme facteur de virulence lors du développement de la moisissure dans les pommes. La caractérisation de la dernière étape de la voie de biosynthèse de la patuline a ensuite été entreprise par mutagenèse dirigée du gène patE du cluster de la patuline, chez la même espèce. Ce dernier code pour une Glucose méthanol Choline (GMC) oxydoréductase responsable de la conversion de l'ascladiol en patuline. L'ascladiol est également une molécule clé de la dégradation de la patuline par diverses espèces bactériennes ou de levures et plus particulièrement lors de la fermentation alcoolique. La non-toxicité de l'ascladiol accumulé chez le mutant ∆patE a été démontrée sur une lignée cellulaire intestinale humaine (Caco-2), suggérant que la patuline perd sa toxicité avec l'ouverture du deuxième cycle. Finalement, un système de détection et de quantification de P. expansum par PCR en temps réel a été développé en ciblant un gène hautement spécifique de la voie de biosynthèse de la patuline, patF. Cette approche préventive nous a ainsi permis d'avoir une estimation rapide de la contamination en patuline dans les pommes à partir de la quantification d'ADN de P. expansum. En conclusion, l'ensemble de ces travaux qui s'inscrivent dans le cadre de la gestion du risque « patuline » dans la filière fruit a permis d'amener des réponses tant sur le plan fondamental que sur le plan appliqué avec le séquençage du cluster, le développement d'un outil de diagnostic et la démonstration que l'ascladiol ne présentait aucune cytotoxicité. / Among diseases affecting apples, blue mold caused by Penicillium expansum is a major concern causing yield and quality losses due to the production of mycotoxins, of which patulin is the most alarming one. This mycotoxin was proven to be harmful for humans and animals. The pathogen growth and the patulin production occur under specific physico-chemical conditions (temperature, pH…). However, the description of these conditions in literature remains largely insufficient for the development of strategies to fight the development of the fungus. Furthermore, patulin remains, along with ochratoxin A, the only toxins for which the biosynthetic pathway is not fully established yet at both chemical and molecular levels. Firstly, this study provides supplementary data on the physico-chemical factors that modulate P. expansum growth and its ability to produce patulin. The acquaintance of these conditions leads, in practice, to the control of the patulin contamination along the food chain. Secondly, significant improvements were brought on the fundamental level, especially by elucidating the patulin biosynthetic pathway. The cluster of genes involved in the biosynthesis of this mycotoxin was fully identified and characterized in the species of greatest concern P. expansum. In order to reveal additional info on the biosynthesis of this mycotoxin, the specific factor of the pathway (patL) was characterized. The disruption of this gene has led to failure in patulin production and an important decrease in Pat genes expression. Furthermore, pathogenesis studies, using this same deficient strain showed that patulin potentially acts as a virulence factor during P. expansum development on apples. The last step of the patulin biosynthetic pathway was later characterized by site-directed mutagenesis of the patE gene in the same species. This gene encodes a Glucose Methanol Choline (GMC) oxidoreductase that is responsible for the conversion of ascladiol to patulin. Ascladiol is not only the last intermediate in the patulin pathway but also the main product of patulin degradation during the alcoholic fermentation of apple juice. The non-toxicity of ascladiol accumulated by the ΔpatE strain was proved against the human Caco-2 cell line. Finally a Real time PCR assay was developed to specifically detect and quantify P. expansum. This was done by targeting a highly specific gene from the patulin gene cluster in P. expansum, patF. This predictive approach allowed the quick estimation of the patulin content via the quantification of the P. expansum DNA in apples. To conclude, this thesis is part of the patulin's risk management study in the fruit sector; it provides significant improvements on both fundamental and practical levels. These advances are mainly characterized by the sequencing of the patulin gene cluster, the development of a molecular diagnostic tool and the demonstration of the non-cytotoxicity of ascladiol.

La découverte de nouvelles entités naturelles est un processus particulièrement long et coûteux ; il faut donc réussir le plus tôt possible à détecter les composés connus dans les matrices étudiées, afin de ne pas les ré-isoler inutilement. C’est tout l’enjeu de l’annotation (c’est-à-dire l’identification partielle mais rapide de composés) et de la déréplication (autrement dit, l’application de l’annotation en vue d’écarter les molécules déjà connues du processus d’isolement).Grâce à sa sensibilité inégalée et à l’avènement de l’ère du « big data », la chromatographie liquide à haute performance couplée à la spectrométrie de masse tandem (CLHP-SM/SM) s’est imposée comme l’un des outils de référence dans cette démarche. En effet, son utilisation implique bien souvent le recours à des méthodes de traitement informatiques, comme le « molecular networking », de par la quantité considérable de données générées.La thèse se présente donc en deux parties : la première, portée sur l'extraction de nouveaux composés à partir d'une plante de la famille des Apocynaceae déjà très étudiée, Picralima nitida. La seconde propose une application des réseaux moléculaires à de la chimie biomimétique en mélanges, autour des alcaloïdes de type « 3-alkylpipéridines ». / The discovery of new natural products is a very long and expensive process ; it is therefore important to detect previously known compounds in the studied matrices, to avoid an useless second isolation. This is the aim of annotation (partial but quick identification of compounds) and of dereplication (application of annotation to avoid reisolation).Thanks to its unequaled sensibility and to the "big data" era, the high performance liquid chromatography hyphenated to tandem mass spectrometry has become a reference technique in this field. Indeed, its use is generally implemented by informatic tools, as "molecular networking", because of the large amount of generated data.This thesis is divided into two parts : the first one deals with extraction of new compounds from a very well-known Apocynaceae plant, Picralima nitida. The second one is about the application of "molecular networking" to biomimetic chemistry in mixtures, especially about "3-alkylpiperidines" alkaloids.

Metals, essential constituents of a vast number of products and industrial processes, are paradoxically confronted to a scarcity issue without precedents. Among the emerging technologies for sustainable metal recovery, bio-electrochemical systems (BES) stand at a research state with a potential application on low-content metal streams. They are based on electroactive bacteria that can exchange electrons with their environment to drive an (electro)chemical metal precipitation. The feasibility of three configurations of BES aiming to recover metals at low-energy and low-chemicals consumption was explored. A first approach inspired on metal-bacteria interactions aimed to transform gold and chromium ions into added-value products. A polarized cathode promoting the metal reduction and symbiotically producing metallic nanoparticles on bacteria was studied. A second configuration used a halophilic bioanode to recover a panel of metals including transition metals and rare earth elements from marine environments. Metals were not directly precipitated by the contact with bacteria, but via a gas-diffusion cathode coupled to the bioanode. The third configuration considered a neodymium electrochemical reduction coupled to an oxidation catalyzed by a bioanode. Here, the conventional metal-containing aqueous system was replaced by an ionic liquid, an emerging solvent suitable for REE electrodeposition. / Les métaux, composants essentiels d'un grand nombre de produits et de processus industriels, sont paradoxalement confrontés à un problème de pénurie sans précédent. Parmi les technologies émergentes pour la récupération durable des métaux, les systèmes bio-électrochimiques (BES) sont à la recherche d’une application potentielle sur des matrices aqueuses de métaux à faible teneur. Ils sont basés sur des bactéries dites électro-actives, pouvant échanger des électrons avec leur environnement afin de conduire une précipitation de (électro)chimique du métal. Le but étant d’explorer différents procédés de récupération de métaux à faible consommation d'énergie et de produits chimiques, trois configurations de BES ont été abordés. Une première approche inspirée des interactions métal-bactérie visait à transformer les ions d’or et de chrome en produits à valeur ajoutée. Une cathode polarisée favorisant la réduction des métaux et produisant de manière symbiotique des nanoparticules métalliques sur des bactéries a été étudiée. Une seconde configuration utilisait une bioanode halophile pour récupérer un panel de métaux comprenant des métaux de transition et des éléments de terres rares provenant d’environnements marins. Les métaux ne sont pas précipités directement par le contact avec les bactéries mais par une cathode à diffusion gazeuse couplée à la bioanode. La troisième configuration envisageait une réduction électrochimique au néodyme couplée à une oxydation catalysée par une bioanode. Le système aqueux contenant un métal conventionnel a été remplacé par un liquide ionique, un solvant émergent avantageux pour l'électrodéposition de terres rares.

Les sélénoprotéines sont des protéines auxquelles des sélénocystéines, soit le 21e acide aminé, sont incorporées durant leur traduction. Plus précisément, la sélénocystéine (Sec) est un dérivé métabolique de la sérine, mais structurellement équivalent à une cystéine dont on a remplacé l'atome de soufre par du sélénium. Elle se distingue des autres acides aminés puisqu’elle possède sa propre synthétase qui sert à convertir la sérine en Sec alors que le résidu est déjà fixé à l’ARNt. La position d’une Sec sur l’ARNm est indiquée par le codon UGA étant habituellement un signal STOP introduisant le concept de recoding. Grâce à une machinerie métabolique spécifique à l'ARNtSec et à la présence d’un SecIS (Selenocystein Insertion Sequence) sur l’ARNm, ce codon permet la présence d'une Sec dans la protéine. Il est connu que la synthèse débute avec l’acétylation de l’ARNt[Ser]Sec par la seryl-ARNt synthétase (SerRS) afin de donner la seryl-ARNt[Ser]Sec. Cette dernière est subséquemment phosphorylée par l’O-phosphoséryl-ARNt[Ser]Sec kinase (PSTK) qui donnera l’O-phosphoséryl-ARNt[Ser]Sec. Par la suite, un complexe de plusieurs protéines et cofacteurs, agissant comme machinerie pour l’incorporation des Sec durant la traduction, s’associe avec l’ARNt[Ser]Sec puis l’ARNm et, finalement, les composantes du ribosome. Parmi ces protéines, SepSecS catalyse l’étape finale de la synthèse des Sec en convertissant le O-phosphoseryl-ARNt[Ser]Sec en selenocysteinyl-ARNt[Ser]Sec utilisant le sélénophosphate comme source de sélénium. Des études récentes montrent que l’association avec SECp43 serait nécessaire pour que SepSecS joue son rôle et soit ségrégée au noyau pour s’associer à la machinerie de biosynthèse des sélénoprotéines, soit le complexe moléculaire qui reconnaît le codon UGA. Parmi les protéines de la machinerie de biosynthèse des sélénoprotéines que nous avons analysées, il y a eEFSec, RPL30, SPS2, SPS1, SBP2 et NSEP1. Nos résultats d’analyse de la dynamique de l’interaction entre les constituants de la machinerie de biosynthèse et d’incorporation des Sec, confirment plusieurs données de la littérature, mais remettent en question le modèle jusqu’à maintenant établi. Une meilleure compréhension de la dynamique des interactions entre ses constituants et la régulation de cette dynamique permet d’émettre des hypothèses quant au rôle de la machinerie de biosynthèse des sélénoprotéines et de l’importance de sa complexité. Nous avons analysé les interactions in vivo dans des cellules HEK293T au moyen de la technique de Protein-Fragment Complementation Assay (PCA) en couplant, par un clonage moléculaire, les gènes de chacune des protéines d’intérêt avec des fragments des gènes de la protéine luciférase (hRluc). Nous avons ainsi réalisé une fusion en N-terminal et en C-terminal des fragments de luciférase pour chacune des protéines d’intérêt. Puis, nous avons analysé la dynamique des interactions avec les composantes de la machinerie de biosynthèse des Sec. D’autres travaux seront essentiels afin de bâtir sur les résultats présentés dans cette recherche. / Selenoproteins are proteins that incorporate selenocysteines, which is called the 21st amino acid, during their translation. Specifically, selenocysteine (Sec) is a metabolic derivate of serine, which is structurally equivalent to Cys except for replacement of sulfur with an atom of selenium in the δ-position. It differs from other amino acids since a unique synthetase converts the serine into Sec while the residue is already attached to the tRNA. The codon for Sec on the mRNA is a UGA codon that is usually a STOP signal, introducing the concept of "recoding". Through a specific metabolic machinery for the tRNASec and the presence of a SecIS (Selenocysteine Insertion Sequence) on the mRNA, this codon allows the incorporation of the Sec into the protein. However, the mechanism of biosynthesis of this amino acid and its incorporation into proteins is not well understood. It is known that the synthesis starts with the acetylation of tRNA[Ser]Sec by seryl-tRNA synthetase (SerRS) to give the seryl-tRNA[Ser]Sec. The latter is subsequently phosphorylated by the O-phosphoseryl-tRNA[Ser]Sec kinase (PSTK) which will generate the O-phosphoseryl-tRNA[Ser]Sec. Subsequently, a large complex of several proteins and cofactors acting as machinery for incorporation of Sec during translation, associates with tRNA[Ser]Sec and the mRNA and finally, the components of the ribosome. Among these proteins, SepSecS catalyzes the final step in the biosynthesis of Sec converting O-phosphoseryl-tRNA[Ser]Sec into selenocysteinyl-tRNA[Ser]Sec using monoselenophosphate as a source of selenium. Recent studies showed that the association with SECp43 would be required for SepSecS to play its role to segregate into the nucleus to be associated with the machinery that recognizes the UGA codon. Among the proteins of the biosynthesis machinery of selenoproteins that we analyzed, there are eEFSec, RPL30, SPS2, SPS1, SBP2 and NSEP1. Results of analysis of the dynamics of the interaction between the components of the Sec biosynthetic machinery confirm some data from the literature, but conflict with the model so far established. A better understanding of the dynamics of interactions between its constituents and the reaction of this process would allow us to make assumptions about the role of the biosynthetic machinery of selenoproteins and the importance of its complexity. We analyzed the dynamics of interaction in vivo in HEK293T cells using a Protein-Fragment Complementation Assay (PCA) based on a humanized Renilla luciferase (hRLuc) by coupling, by molecular cloning, genes encoding each protein of interest with gene encoding fragments of the luciferase protein (hRluc). We have thus achieved an expression of fusion of N-terminal and C-terminal fragments for each luciferase protein of interest. Then, we analyzed the dynamics of the interaction with the components of the Sec biosynthetic machinery. Further work will be essential to build on the results presented in this research.

Notre équipe est l’un des partenaires du projet international PoMaRé (« Invertébrésbenthiques de Polynésie, Martinique et de la Réunion »). Nous travaillons encollaboration directe avec le Dr Cécile Debitus de l’IRD en Polynésie française, sonéquipe étant notamment en charge de collecter des échantillons d’éponges marinesdans différents atolls du Pacifique.Au laboratoire, nous nous sommes intéressés particulièrement à deux espècesabondantes en Polynésie : Dactylospongia metachromia et Dactylospongia elegans.Notre travail a consisté à isoler leurs métabolites spécialisés majoritaires : lesilimaquinones, puis à réaliser diverses études autour de ces deux sesquiterpènesquinoniques épimériques. Le travail s’est organisé de la façon suivante :- Extraction des ilimaquinones : les ilimaquinones ont été isolées de l’éponge Dactylospongia metachromia avec un rendement > 3 %. Une étude de la variation de leur pourcentage respectif par rapport à la géographie de collecte de l’éponge a été entreprise. Impliquant plus d’une centaine d’échantillons, c’est la première fois qu’une étude d’une telle ampleur est réalisée. L’éponge D. elegans a également été étudiée, nos études ont révélé la présence de l’ilimaquinone mais aussi d’une structure proche : l’isospongiaquinone.- Modifications structurales autour des ilimaquinones : Par voie chimique : des modifications ont été étudiées sur les ilimaquinones afin de cerner leur réactivité, divers analogues ont ainsi été obtenus. Entre autres, les substances naturelles isospongiaquinone, 5-epi-isospongiaquinone et néomamanuthaquinone ont pu être hémisynthétisées. Lors de ces études, une nouvelle réaction a été découverte modifiant la quinone de façon surprenante dans des conditions oxydantes. Par voie enzymatique : des micro-organismes ont été utilisés pour réaliser des biotransformations sur le squelette de l’ilimaquinone, trois composés ont été obtenus. Ces modifications ont touché à la fois la décaline et la quinone de notre substrat. Une réaction de fonctionnalisation originale a d’ailleurs pu être observée pour la première fois.- Modélisation moléculaire et électrochimie : une étude de modélisation moléculaire nous a permis de calculer l’énergie de formation des ilimaquinones en nous basant sur les hypothèses de biosynthèse que nous pouvons maintenant mieux appréhender. Finalement une étude d’électrochimie nous a permis d’évaluer les propriétés oxydo-réductrices de ces molécules naturelles à fortes potentialités en termes d’activités biologiques. / Our team is one of the partners of the international project PoMaRe ("Benthic Invertebrates of Polynesia, Martinique and Reunion"). We worked directly with Dr. Cécile Debitus from the IRD in French Polynesia, her team was in charge of collecting samples of marine sponges in different atolls of the Pacific.In the laboratory, we focused particularly on two abundant species in Polynesia: Dactylospongia metachromia and Dactylospongia elegans. Our job was to isolate their major metabolites: the ilimaquinones and perform various studies around these two epimeric sesquiterpene quinones.The work was organized as follows:- Extraction of ilimaquinones: ilimaquinones were isolated from the sponge Dactylospongia metachromia with a yield > 3%. A study of the variation of their respective percentage in relation with the geography of collection was undertaken, involving more than one hundred samples. This is the first study of this scale to be achieved. The sponge D. elegans was also studied, our results revealed the presence of ilimaquinone but also a nearby structure: isospongiaquinone.- Structural modifications of ilimaquinones:* Chemical modifications: structural changes were studied on ilimaquinones to delimit their reactivity: various analogues have been obtained. Among others, natural substances isospongiaquinone, 5-epi-isospongiaquinone and neomamanuthaquinone have been obtained. In these studies, a new reaction was discovered modifying the quinone surprisingly under oxidizing conditions.* Enzymatic modifications: micro-organisms were used to carry out biotransformations on the skeleton of ilimaquinone, three compounds were obtained. These changes have affected both the decalin and the quinone of our substrate. An original reaction has also been observed for the first time.- Molecular modeling and electrochemistry: a molecular modeling study has allowed us to calculate the energy of formation of ilimaquinones based on biosynthesis assumptions that we can now better understand. Finally an electrochemistry study evaluated the redox properties of these natural molecules with high potential in terms of biological activity.

Les plantes sont soumises durant leur vie à de nombreux stress environnementaux. Face à ces contraintes, les végétaux ont développé au cours de l'évolution différentes stratégies. La plus emblématique est la mise en place du métabolisme spécialisé, représenté par une grande diversité chimique et fonctionnelle. Bien que ce métabolisme soit de plus en plus étudié ces dernières années, de nombreuses lacunes persistes à son propos, liées notamment (i) à la complexité des modifications métabolomiques engendrées par la perception de stress, (ii) aux coûts et avantages que ces métabolites imputent à la plante les accumulant, et (iii) aux voies métaboliques menant à cette diversité de composés. Pour appréhender ces différentes problématiques, nous avons adopté une stratégie combinant des approches de phytochimie, de biologie moléculaire et de génétique. Dans un premier temps, nous avons étudié les changements métaboliques globaux engendrés par l’application de deux stress environnementaux, l’ozone et la blessure mécanique, sur une plante modèle au laboratoire, le panais, en fonction du temps. Les résultats de ces travaux nous ont permis d’identifier 40 métabolites différentiellement accumulés dans ces conditions, dont certaines furocoumarines. Par la suite, nous avons focalisé notre étude sur ces molécules en évaluant leurs profils d’accumulation, en condition de stress par blessures mécaniques, par la biais d’analyses différentielles. A partir de ces données, nous avons initié la recherche et l'identification de gènes candidats potentiellement impliqués dans cette voie à partir de plusieurs banques transcriptomiques et génomiques de panais. La fonction des gènes sélectionnés a été évalué par des approches d'expression hétérologue dans la levure. En parallèle de ces travaux, nous avons développé une stratégie destinée à mieux comprendre le coût métabolique de la synthèse de métabolites spécialisés. Pour ce faire, nous avons adapté aux furocoumarines une technique de clonage multigénique permettant de transférer dans une plante, et en une seule opération, plusieurs gènes impliqués dans la même voie de biosynthèse. Cette méthode nous a permis d'initier la génération de lignées stables ayant intégré les deux premiers gènes de la voie. Ces plantes seront comparées à des plantes sauvages et permettront ainsi d’étudier les coûts métaboliques et physiologiques de l’introduction de cette nouvelle voie de biosynthèse ainsi que ses bénéfices en termes de défense de la plante. / Plants are subjected to many environmental stresses during their life. Faced with these constraints, plants have developed different strategies during their evolution. The most emblematic is the establishment of a specialized metabolism, represented by a great chemical and functional diversity. Although this metabolism has been studied more and more in recent years, many gaps remain, related in particular (i) to the complexity of the metabolomic changes generated by the perception of stress, (ii) to the costs and benefits that these metabolites impute to the producing plant, and (iii) to the metabolic pathways leading to the diversity of compounds. To cope with these different issues, we adopted a strategy combining approaches of phytochemistry, molecular biology and genetics. First, we studied global metabolic changes caused by the application of two environmental stresses, ozone and mechanical wounding, on parsnip. The obtained results allowed us to identify 40 metabolites differentially accumulated under these conditions, including some furocoumarins. Subsequently, we focused our study on these molecules by evaluating their accumulation profiles under mechanical wounding stress condition, using differential analyzes. From this data, we initiated the search and identification of candidate genes potentially involved in this pathway based on transcriptomic and genomic parsnip libraries analyses. The function of the selected genes was evaluated by heterologous expression approach in yeast. In parallel to this work, we have developed a strategy to better understand the metabolic cost of specialized metabolites synthesis. To do this, we have adapted a multigene cloning method to furocoumarines, allowing to transfer several genes involved in the same pathway in a plant, in a single operation. This method allowed us to initiate the generation of stable lines having integrated the first two genes of the pathway. These plants will be compared to wild plants and will thus allow to study the metabolic and physiological costs of the introduction of this new biosynthetic pathway and its benefits in terms of plant defense.

Les quinones sont des composés largement répandus dans la nature, aussi bien dans le règne végétal, qu'animal ou microbien. Ces molécules sont biosynthétisées à partir d'un petit nombre d'intermédiaires simples. Le noyau des naphtoquinones, en particulier, peut être synthétisé à partir de quatre précurseurs principaux l'acétate, la toluhydroquinone, le p-hydroxybenzoate et le shikimate. L'objet du présent travail est l'étude de la biosynthèse des naphtoquinones végétales ou bactériennes dérivant de l'acide shikimique (acide trihydroxy-3,4,5 cyclohexène-1 carboxylique), et la recherche des intermédiaires de cette voie de biosynthèse. Etant donné, à l'origine, l'absence quasi-totale de résultats expérimentaux dans ce domaine et le développement important qu'il a acquis en même temps que nous commencions notre travail, celui-ci a été constamment lié dans son développement aux données les plus récentes parues dans la littérature. Quelques études antérieures avaient montré que l'acide shikimique devait être le précurseur commun des acides aminés aromatiques et de plusieurs facteurs de croissance aromatiques (acide dihydroxy-2,3 benzoique, dihydroxy-3,4 benzoique, p-aminobenzoique et p-hydroxybenzoique) ainsi que de la ménaquinone de Escherichia coli (16,17). Lorsque nous commençons ce travail, on sait seulement que l'acide shikimique est incorporé in toto dans les ménaquinones bactériennes, de telle sorte que son carboxyle devient un des carbonyles de la quinone. Trois questions se posent alors: - Sur lequel des carbones 2 ou 6 adjacents au carboxyle, le cycle naphtoquinonique se ferme-t-il ? - Quelle est la molécule qui fournit les trois carbones nécessaires à la fermeture du cycle quinonique de la naphtoquinone, et quel est le mécanisme de cette fermeture ? - Le cycle naphtoquinonique ainsi formé est-il incorporé de façon symétrique ou non dans les ménaquinones, c'est-à-dire le carboxyle de l'acide shikimique est-il incorporé indifféremment dans les deux carbonyles quinoniques, ou sélectivement dans l'un des deux ? Pour résoudre la première question, LEISTNER et ZENK d'une part et M. LEDUC dans notre laboratoire d'autre part, ont utilisé l'acide shikimique [14 C-1,6]. Cette méthode nécessite une dégradation laborieuse des quinones formées. Nous avons, quant à nous, synthétisé un acide shikîmique [3H-3] marqué au tritium en une position spécifique, ce qui permet une dégradation simple et univoque. Une réponse partielle à la deuxième question a été donnée par CAMPBELL. Il montrait, en 1969, que le glutamate est capable d'apporter ses carbones 2, 3 et 4 pour la fermeture du cycle naphtoquinonique, mais il ne disposait pas alors des résultats de notre laboratoire lui permettant d'induire correctement le mécanisme de cette biosynthèse. Nous avons pu postuler la formation d'un intermédiaire, I'acide ortho-succinoylbenzoique OBS, dont nous avons pu prouver l'existence par synthèse et incorporation dans les quinones étudiées . L'existence de cet intermédiaire et la possibilité que nous avons eue de réaliser sur l'OSB différents marquages spécifiques nous ont permis de répondre à la troisième question, à savoir, l'incorporation orientée ou non de l'OSB dans les quinones. En même temps, différentes équipes montraient que d'autres quinones existant dans les végétaux telles que la lawsone, la juglone et différentes anthraquinones dérivaient aussi de l'acide shikimique; il nous a semblé intéressant d'appliquer nos techniques à l'étude très voisine de la biosynthèse de ces quinones. Pour la clarté de l'exposé, nous présentons dans le premier chapître les méthodes de synthèse des précurseurs radioactifs, dans le deuxième, les méthodes d'isolement et de dégradation des quinones. Les trois chapîtres suivants rapportent l'incorporation dans les ménaquinones, les naphtoquinones végétales et les anthraquinones végétales. Dans le sixième chapître, nous discutons nos résultats et proposons un schéma général de biosynthèse des quinones dérivant de l'acide shikimique. La partie expérimentale de ce travail est rassemblée après l'exposé théorique.

Les sélénoprotéines sont des protéines auxquelles des sélénocystéines, soit le 21e acide aminé, sont incorporées durant leur traduction. Plus précisément, la sélénocystéine (Sec) est un dérivé métabolique de la sérine, mais structurellement équivalent à une cystéine dont on a remplacé l'atome de soufre par du sélénium. Elle se distingue des autres acides aminés puisqu’elle possède sa propre synthétase qui sert à convertir la sérine en Sec alors que le résidu est déjà fixé à l’ARNt. La position d’une Sec sur l’ARNm est indiquée par le codon UGA étant habituellement un signal STOP introduisant le concept de recoding. Grâce à une machinerie métabolique spécifique à l'ARNtSec et à la présence d’un SecIS (Selenocystein Insertion Sequence) sur l’ARNm, ce codon permet la présence d'une Sec dans la protéine. Il est connu que la synthèse débute avec l’acétylation de l’ARNt[Ser]Sec par la seryl-ARNt synthétase (SerRS) afin de donner la seryl-ARNt[Ser]Sec. Cette dernière est subséquemment phosphorylée par l’O-phosphoséryl-ARNt[Ser]Sec kinase (PSTK) qui donnera l’O-phosphoséryl-ARNt[Ser]Sec. Par la suite, un complexe de plusieurs protéines et cofacteurs, agissant comme machinerie pour l’incorporation des Sec durant la traduction, s’associe avec l’ARNt[Ser]Sec puis l’ARNm et, finalement, les composantes du ribosome. Parmi ces protéines, SepSecS catalyse l’étape finale de la synthèse des Sec en convertissant le O-phosphoseryl-ARNt[Ser]Sec en selenocysteinyl-ARNt[Ser]Sec utilisant le sélénophosphate comme source de sélénium. Des études récentes montrent que l’association avec SECp43 serait nécessaire pour que SepSecS joue son rôle et soit ségrégée au noyau pour s’associer à la machinerie de biosynthèse des sélénoprotéines, soit le complexe moléculaire qui reconnaît le codon UGA. Parmi les protéines de la machinerie de biosynthèse des sélénoprotéines que nous avons analysées, il y a eEFSec, RPL30, SPS2, SPS1, SBP2 et NSEP1. Nos résultats d’analyse de la dynamique de l’interaction entre les constituants de la machinerie de biosynthèse et d’incorporation des Sec, confirment plusieurs données de la littérature, mais remettent en question le modèle jusqu’à maintenant établi. Une meilleure compréhension de la dynamique des interactions entre ses constituants et la régulation de cette dynamique permet d’émettre des hypothèses quant au rôle de la machinerie de biosynthèse des sélénoprotéines et de l’importance de sa complexité. Nous avons analysé les interactions in vivo dans des cellules HEK293T au moyen de la technique de Protein-Fragment Complementation Assay (PCA) en couplant, par un clonage moléculaire, les gènes de chacune des protéines d’intérêt avec des fragments des gènes de la protéine luciférase (hRluc). Nous avons ainsi réalisé une fusion en N-terminal et en C-terminal des fragments de luciférase pour chacune des protéines d’intérêt. Puis, nous avons analysé la dynamique des interactions avec les composantes de la machinerie de biosynthèse des Sec. D’autres travaux seront essentiels afin de bâtir sur les résultats présentés dans cette recherche. / Selenoproteins are proteins that incorporate selenocysteines, which is called the 21st amino acid, during their translation. Specifically, selenocysteine (Sec) is a metabolic derivate of serine, which is structurally equivalent to Cys except for replacement of sulfur with an atom of selenium in the δ-position. It differs from other amino acids since a unique synthetase converts the serine into Sec while the residue is already attached to the tRNA. The codon for Sec on the mRNA is a UGA codon that is usually a STOP signal, introducing the concept of "recoding". Through a specific metabolic machinery for the tRNASec and the presence of a SecIS (Selenocysteine Insertion Sequence) on the mRNA, this codon allows the incorporation of the Sec into the protein. However, the mechanism of biosynthesis of this amino acid and its incorporation into proteins is not well understood. It is known that the synthesis starts with the acetylation of tRNA[Ser]Sec by seryl-tRNA synthetase (SerRS) to give the seryl-tRNA[Ser]Sec. The latter is subsequently phosphorylated by the O-phosphoseryl-tRNA[Ser]Sec kinase (PSTK) which will generate the O-phosphoseryl-tRNA[Ser]Sec. Subsequently, a large complex of several proteins and cofactors acting as machinery for incorporation of Sec during translation, associates with tRNA[Ser]Sec and the mRNA and finally, the components of the ribosome. Among these proteins, SepSecS catalyzes the final step in the biosynthesis of Sec converting O-phosphoseryl-tRNA[Ser]Sec into selenocysteinyl-tRNA[Ser]Sec using monoselenophosphate as a source of selenium. Recent studies showed that the association with SECp43 would be required for SepSecS to play its role to segregate into the nucleus to be associated with the machinery that recognizes the UGA codon. Among the proteins of the biosynthesis machinery of selenoproteins that we analyzed, there are eEFSec, RPL30, SPS2, SPS1, SBP2 and NSEP1. Results of analysis of the dynamics of the interaction between the components of the Sec biosynthetic machinery confirm some data from the literature, but conflict with the model so far established. A better understanding of the dynamics of interactions between its constituents and the reaction of this process would allow us to make assumptions about the role of the biosynthetic machinery of selenoproteins and the importance of its complexity. We analyzed the dynamics of interaction in vivo in HEK293T cells using a Protein-Fragment Complementation Assay (PCA) based on a humanized Renilla luciferase (hRLuc) by coupling, by molecular cloning, genes encoding each protein of interest with gene encoding fragments of the luciferase protein (hRluc). We have thus achieved an expression of fusion of N-terminal and C-terminal fragments for each luciferase protein of interest. Then, we analyzed the dynamics of the interaction with the components of the Sec biosynthetic machinery. Further work will be essential to build on the results presented in this research.

Dans le cadre de ce travail, nous avons poursuivi l’étude de la biosynthèse d’alcaloïdes défensifs des coccinelles. Trois espèces ont été plus particulièrement étudiées :Adalia bipunctata (qui produit l’adaline [32]), Coccinella septempunctata (contenant la coccinelline [29]) et Harmonia axyridis (produisant l’harmonine [34]).<p>Afin d’identifier le (ou les) acide(s) gras précurseur(s) de ces alcaloïdes, nous avons dans un premier temps synthétisé des acides gras spécifiquement marqués. Nous avons ainsi préparé les acides [14-3H]myristique, [16-3H]palmitique, [18-3H]stéarique, [18-13C]stéarique et [11,11,12,12,13,13,14,14,15,15,16, 16,17,17,18,18,18-2H]stéarique.<p>Les différents acides gras marqués au tritium sur le méthyle terminal ont ensuite été incorporés successivement chez les trois espèces de coccinelles mentionnées ci-dessus, en utilisant la technique d’incorporation in vitro mise au point par Laurent et al. ( )<p>Les incorporations chez Adalia bipunctata ont montré que l’acide myristique est incorporé préférentiellement dans l’adaline. <p>Chez Coccinella septempunctata par contre, l’acide stéarique est incorporé dans la coccinelline environ 25 fois plus efficacement que les acides myristique et palmitique.<p>Enfin, les incorporations chez Harmonia axyridis ont établi que l’acide stéarique est le précurseur de l’harmonine. De plus, grâce à l’incorporation de l’acide [11,11,12,12,13,13,14,14,15,15,16,16,17,17,18,18,18-2H]stéarique, le mécanisme de formation de l’amine secondaire a été précisé.<p>/<p>In spite of their red-orange colors, which could increase risks of predation, Coccinellidae are rarely exploited as food sources by predators. Many of them owe their protection, at least in part, to the presence of repellents and, in some cases, toxic alkaloids in the hemolymph emitted during a process called "reflex bleeding". Previous studies have shown that the biosynthesis of these alkaloids is related to fatty acid metabolism. <p>In our doctoral thesis, we wanted to clarify what are the fatty acids precursors of adaline (Adalia bipunctata), coccinelline (Coccinella septempunctata) and harmonine (Harmonia axyridis), with the use of various techniques of labelling (3H, D, 13C, etc.).<p> / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Le grain de maïs est composé de 3 compartiments : l’embryon et l’albumen issus de la double fécondation et l’enveloppe d’origine maternelle. Le développement du grain et l’accumulation de réserves demande l’établissement d’une communication étroite entre l’embryon et l’albumen pour coordonner leur développement respectif. Si, des régulateurs majeurs impliqués dans le développement de la graine d’Arabidopsis ont été décrits, ces connaissances restent parcellaires chez les céréales. Les objectifs de ma thèse consistaient d’une part à étudier le contrôle de la communication entre l’embryon et l’albumen et d’autre part la régulation du remplissage du grain de maïs. Par l’analyse de lignées transgéniques sous exprimant ZmZHOUPI (ZmZOU-RNAi), nous avons établi que ce facteur de transcription à domaine bHLH, bien que s’exprimant exclusivement dans l’albumen, affecte significativement le développement de l’embryon (taille de l’embryon, persistance du suspenseur). L’analyse de données RNAseq (grains sauvages versus grains ZmZOU-RNAi) a permis d’identifier des gènes cibles potentiels de ZmZOU. De plus, nous avons montré que 3 facteurs de transcription de type bHLH homologues d’INDUCER OF CBP EXPRESSION (ICE) forment un partenariat avec ZmZOU.D’autre part, nous avons étudié les homologues d'ABA INSENSITIVE3, FUSCA3 et LEAFY COTYLEDON2 (AFL) qui forment un réseau de facteurs de transcription, à domaine B3, régulant l’accumulation d’huile et de protéines de réserves dans l’embryon d’Arabidopsis. Grâce à des analyses phylogénétiques et d’expression, nous avons établi que chez le maïs le réseau AFL, constitué de 5 membres (ZmAFLs), est partiellement conservé. Par dosages et analyse d’expression, nous avons montré que ZmAFL4, en particulier, est impliqué dans le contrôle de la biosynthèse de l’amidon dans l’albumen. / Maize kernel is composed of three major compartments: an embryo and an endosperm both produced by double fertilization and the maternally derived seed coat. Seed development and reserves accumulation demands coordination and thus communication between embryo and endosperm allowing specific growth of each compartment. While major regulators involved in seed development have been already described in Arabidopsis, knowledge in cereals remains limited. My thesis purposes were to study on one hand the control of communication between embryo and endosperm and on the other hand regulation of maize kernel filling.By analysis of transgenic lines knock down ZmZHOUPI (ZmZou-RNAi), we showed that this bHLH domain transcription factor, exclusively expressed in endosperm, affect significantly embryo development, size of embryo proper and suspensor persistence. RNAseq data analyses let find putative direct targets of ZmZOU. Additionally, we identified ZmZOU partners, 3 bHLH domain transcription factor homologs of INDUCER OF CBP EXPRESSION (ICE).Furthermore, we studied homologs of three B3 domain transcription factors named ABA INSENSITIVE3, FUSCA3 et LEAFY COTYLEDON2 (AFL) which form a regulatory network governing oil and seed storage proteins accumulation in Arabidopsis embryo. By phylogenetic and expression analysis, we established that 5 genes (ZmAFLs) constitute in maize a partially conserved AFL network. Through dosage and expression analysis, we established that particularly ZmAFL4 is involved in starch biosynthesis regulation.