Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e do Desenvolvimento, Florianópolis, 2015. / Made available in DSpace on 2015-10-06T04:06:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 334691.pdf: 804006 bytes, checksum: 0752fbbe5b1b5e200587dc173c23168f (MD5) Previous issue date: 2015 / Este trabalho propôs estudar a ação do Fator de Crescimento Fibroblástico 18 (FGF18) durante o processo de expansão das células do cúmulus, ma-turação oocitária e desenvolvimento embrionário inicial. Os experimen-tos desenvolvidos utilizaram ovários provenientes de abatedouro e matu-rados durante 24h em meio de cultura suplementados ou na ausência de diferentes dosagens de FGF18 dependendo do ensaio proposto. O pri-meiro experimento desenvolvido utilizou 24 Complexos do cúmulus oophorus (CCOs) e avaliou diferentes doses de Hormônio folículo esti-mulate (FSH) (0, 1, 10, 50, 100 e 500 ng/ml) a fim de obter concentrações com diferentes efeitos sobre a expansão das células do cúmulus. Neste experimento, foi demonstrado que a suplementação do meio de maturação in vitro com 100 e 500 ng/ml (P< 0,05) resultam na expansão das células do cúmulus, sendo a dose de 500 ng/ml culminar em uma maior taxa de expansão. O segundo experimento visou avaliar a maturação nuclear de CCOs após o período de incubação com 100ng/ml de FGF18 nas concen-trações de FSH do experimento 1. Após o período de incubação da matu-ração in vitro, oócitos foram fixados e corados com HOESCHT-33342 para avaliar a taxa de oócitos que atingiram o estágio de metáfase II da meiose. Os resultados deste experimento demonstram que FGF18 não in-fluenciou a maturação oocitária (P< 0,05). O experimento 3 visou avaliar diferentes concentrações de FGF18 (100, 500 e 1000 ng/ml) sobre a ma-turação oocitária e expansão das células do cúmulus durante o período de incubação de 24h. Foram utilizados 50 CCOs por grupo em quatro repli-cações. Foi demonstrado que FGF18 não afetou a maturação e expansão dos CCOs nos grupos avaliados (P<0,05). O quarto experimento avaliou a suplementação de FGF18 em diferentes etapas da produção in vitro de embriões. Foram elaborados três grupos: controle (ausência de FGF18 em todos as etapas), FGF-MIV (CCOs tratados somente durante a maturação in vitro (MIV) com 100ng/ml de FGF18) e FGF-CIV (zigotos tratados somente durante o cutivo in vitro (CIV) com 100 ng/ml de FGF18). Os resultados apresentam menores taxas quantitativas e qualitativas no grupo FGF-CIV (P<0,05). O experimento 5 teve como objetivo avaliar a expres-são de diferentes genes (GADD54B, 53BP1, RAD52, Interferon-tau, FasL e Cox2) nos grupos do experimento 4. Apenas COX2 se apresentou menos expresso no grupo FGF-MIV. Conclui-se que o FGF18 não influ-encia nos processos de expansão das células do cúmulus e maturação oo-citária. No entanto, foi observado que a suplementação deste fator às eta-pas da PIV reduz a taxa de embriões produzidos, tal como retardo no de-senvolvimento destas células, entretanto, os mecanismos moleculares no controle deste evento ainda não estão elucidados.<br> / Abstract : This work proposed to study the Fibroblast Growth Factor 18 (FGF18) during the cumulus expansion, oocyte maturation and the early embryo development. The experiments used ovaries from slaughterhouses and matured for 24 hours in culture medium in the presence or not of FGF18 depending on the proposed test. The first experiment used 24 cumulus- oocyte complex (COCs) to to evaluate different doses of follicle stimulat-ing hormone (FSH) (0, 1, 10, 50, 100 and 500 ng / ml) to obtain concen-trations with different effects on the expansion of the cumulus cells. This experiment demonstrated that supplementation of the in vitro maturation medium with 100 and 500 ng / ml (P <0.05) result in cumulus expansion. The dose of 500 ng/ml culminate in an increased growth rate. The second experiment aimed avaliate the COC?s nuclear maturation after incubation period with 100 ng/ml FGF18, using the FSH doses of the first experi-ment. After the in vitro maturation, oocytes were fixed and stained with Hoechst 33342 to evaluate the rate of oocytes that reached the metaphase II stage. The results of this experiment demonstrate that FGF18 did not affect oocyte maturation (P <0.05). The third experiment was performed to evaluate different concentrations of FGF18 (100, 500, and 1000 ng / ml) on oocyte maturation and cumulus expansion during the 24 h incuba-tion period. 50 COCs were used per group on four replicates. It was shown that FGF18 did not affect the maturation and expansion of COCs in the study groups (P <0.05). The fourth experiment evaluate the supplementa-tion of FGF18 in different stages of in vitro production. Three groups were established: control (absence of FGF18 in all stages), FGF-IVM (COCs treated only during in vitro maturation (IVM) with 100 ng / ml FGF18) and FGF-IVC (zygotes treated only during the in vitro cultive (IVC) 100 ng / ml FGF18). The results show lower rates qualitative and quantitative FGF-IVC group (P <0.05). The experiment 5 aimed to eval-uate the expression of different genes (GADD54B, 53BP1, RAD52, in-terferon-tau, FasL and COX 2) in the embryos derived of the fourth assay. Only COX2 was downregulated in the FGF-IVM group. We conclude that the FGF18 does not influence the processes of the cumulus expansion cells and oocyte maturation. It was observed that FGF18 supplementation to the IVP steps reduces the rate of embryo production, such as delay in the development of these cells, however, the molecular mechanisms in-volved in this event are not deciphered.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:25:25Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-03-28Bitstream added on 2014-06-13T18:26:27Z : No. of bitstreams: 1 000736004.pdf: 627827 bytes, checksum: 411ff86dc11bb8a1a240b7427a561cdf (MD5) / A maturação in vitro (MIV) é considerada uma das etapas mais desafiadoras da produção in vitro (PIV) de embriões bovinos. O meio de MIV deve fornecer condições necessárias para que a maturação citoplasmática e nuclear ocorra de modo próximo ao fisiológico. As gonadotrofinas hipofisárias são essenciais para que o oócito adquira (in vivo) a competência para ser fertilizado; entretanto, se as gonadotrofinas (hipofisárias ou coriônicas) são essenciais, na MIV, as concentrações a serem utilizadas ainda são controversas. Os objetivos, com este estudo, foram estabelecer concentrações otimizadas de gonadotrofinas coriônicas (eCG e hCG) para a substituição daquelas comumente utilizadas de FSH e LH; comparar o efeito de baixas concentrações de eCG e/ou de hCG, isoladamente ou em conjunto com gonadotrofinas hipofisárias; e analisar a necessidade da utilização do FSH e do LH, individualmente, na PIV de embriões livre de suplementação proteica. Complexos cumulus-oócito (CCOs) obtidos de ovários de vacas provenientes de abatedouro, foram selecionados e utilizados em três experimentos: 1) CCOs maturados em meio MIV com seis concentrações distintas de eCG (0; 0,015; 0,15; 1,3; 1,5 e 4 UI mL-1 ) dando origem aos grupos experimentais (C+; E1; E2; E3; E4 e E5, respectivamente), e seis concentrações distintas de hCG (0; 0,05; 0,5; 0,67; 2 e 5 UI mL-1), originando também seis grupos experimentais (C+; H1; H2; H3; H4 e H5, respectivamente); 2) Meio MIV com concentrações mínimas funcionais de eCG e hCG obtidas no experimento anterior, resultando em sete grupos experimentais: sem quaisquer gonadotrofinas; apenas eCG (0,015 UI mL-1); apenas hCG (0,05 UI mL-1); eCG mais hCG; eCG mais LH; hCG mais FSH; e SFB com FSH (0,5 μg mL-1) e LH (5 μg mL-1); e 3) MIV na presença de FSH (0,5 μg mL-1) ou LH (5 μg mL-1) sem nenhuma suplementação proteica. Os CCOs maturados foram fertilizados e... / The in vitro maturation (IVM) is considered one of the most challenging steps of in vitro production (IVP) of bovine embryos. The IVM medium must provide the conditions required for nuclear and cytoplasmic maturation to occur similarly to physiological. The pituitary gonadotropins are essential components that enable oocytes for fertilization (in vivo), but as the gonadotropins (pituitary or chorionic) are essential for IVM, their employed concentrations are still indefinite. We aimed to establish optimal concentrations of chorionic gonadotropin (eCG and hCG) to replace those of FSH and LH commonly used; to compare the effect of low concentrations of eCG and/or hCG alone or in combination with pituitary gonadotropins; and to analyze how necessary is the use of FSH and LH, individually, on the IVP of embryos free from any protein source. Cumulus-oocyte complexes (COCs), obtained from ovaries of slaughterhouse were selected and used in three experiments: 1) COCs matured on the IVM medium with six different concentrations of eCG (0, 0.015, 0.15, 1.3; 1.5 and 4 IU ml-1) yielding the experimental groups (C +, E1, E2, E3, E4 and E5, respectively) and six different concentrations of hCG (0, 0.05, 0.5, 0, 67, 2 and 5 IU ml-1), also yielding six experimental groups (C +, H1, H2, H3, H4 and H5, respectively); 2) IVM medium with minimal concentrations functional of eCG and hCG obtained in the previous experiment, resulting in seven groups: without any gonadotropin; only eCG (0.015 IU mL-1); only hCG (0.05 IU mL-1); eCG plus hCG, eCG plus LH; hCG plus FSH; FCS with FSH (0.5 mg ml-1) and LH (5 mg ml-1); and 3) IVM in the presence of FSH (0.5 mg mL-1) or LH (5 mg ml-1), without protein supplementation. The matured COCs were fertilized and cultured in incubator (38.3 °C, 5% CO2 and maximum humidity). Embryo development was evaluated in terms of cleavage, blastocyst and hatching rates (at 72, 168 and 240 hours post-insemination, ...

Orientador: Marcelo Fábio Gouveia Nogueira / Banca: Anthony César de Souza Castilho / Banca: Gisele Zoccal Mingoti / Resumo: A maturação in vitro (MIV) é considerada uma das etapas mais desafiadoras da produção in vitro (PIV) de embriões bovinos. O meio de MIV deve fornecer condições necessárias para que a maturação citoplasmática e nuclear ocorra de modo próximo ao fisiológico. As gonadotrofinas hipofisárias são essenciais para que o oócito adquira (in vivo) a competência para ser fertilizado; entretanto, se as gonadotrofinas (hipofisárias ou coriônicas) são essenciais, na MIV, as concentrações a serem utilizadas ainda são controversas. Os objetivos, com este estudo, foram estabelecer concentrações otimizadas de gonadotrofinas coriônicas (eCG e hCG) para a substituição daquelas comumente utilizadas de FSH e LH; comparar o efeito de baixas concentrações de eCG e/ou de hCG, isoladamente ou em conjunto com gonadotrofinas hipofisárias; e analisar a necessidade da utilização do FSH e do LH, individualmente, na PIV de embriões livre de suplementação proteica. Complexos cumulus-oócito (CCOs) obtidos de ovários de vacas provenientes de abatedouro, foram selecionados e utilizados em três experimentos: 1) CCOs maturados em meio MIV com seis concentrações distintas de eCG (0; 0,015; 0,15; 1,3; 1,5 e 4 UI mL-1 ) dando origem aos grupos experimentais (C+; E1; E2; E3; E4 e E5, respectivamente), e seis concentrações distintas de hCG (0; 0,05; 0,5; 0,67; 2 e 5 UI mL-1), originando também seis grupos experimentais (C+; H1; H2; H3; H4 e H5, respectivamente); 2) Meio MIV com concentrações mínimas funcionais de eCG e hCG obtidas no experimento anterior, resultando em sete grupos experimentais: sem quaisquer gonadotrofinas; apenas eCG (0,015 UI mL-1); apenas hCG (0,05 UI mL-1); eCG mais hCG; eCG mais LH; hCG mais FSH; e SFB com FSH (0,5 μg mL-1) e LH (5 μg mL-1); e 3) MIV na presença de FSH (0,5 μg mL-1) ou LH (5 μg mL-1) sem nenhuma suplementação proteica. Os CCOs maturados foram fertilizados e ... / Abstract: The in vitro maturation (IVM) is considered one of the most challenging steps of in vitro production (IVP) of bovine embryos. The IVM medium must provide the conditions required for nuclear and cytoplasmic maturation to occur similarly to physiological. The pituitary gonadotropins are essential components that enable oocytes for fertilization (in vivo), but as the gonadotropins (pituitary or chorionic) are essential for IVM, their employed concentrations are still indefinite. We aimed to establish optimal concentrations of chorionic gonadotropin (eCG and hCG) to replace those of FSH and LH commonly used; to compare the effect of low concentrations of eCG and/or hCG alone or in combination with pituitary gonadotropins; and to analyze how necessary is the use of FSH and LH, individually, on the IVP of embryos free from any protein source. Cumulus-oocyte complexes (COCs), obtained from ovaries of slaughterhouse were selected and used in three experiments: 1) COCs matured on the IVM medium with six different concentrations of eCG (0, 0.015, 0.15, 1.3; 1.5 and 4 IU ml-1) yielding the experimental groups (C +, E1, E2, E3, E4 and E5, respectively) and six different concentrations of hCG (0, 0.05, 0.5, 0, 67, 2 and 5 IU ml-1), also yielding six experimental groups (C +, H1, H2, H3, H4 and H5, respectively); 2) IVM medium with minimal concentrations functional of eCG and hCG obtained in the previous experiment, resulting in seven groups: without any gonadotropin; only eCG (0.015 IU mL-1); only hCG (0.05 IU mL-1); eCG plus hCG, eCG plus LH; hCG plus FSH; FCS with FSH (0.5 mg ml-1) and LH (5 mg ml-1); and 3) IVM in the presence of FSH (0.5 mg mL-1) or LH (5 mg ml-1), without protein supplementation. The matured COCs were fertilized and cultured in incubator (38.3 °C, 5% CO2 and maximum humidity). Embryo development was evaluated in terms of cleavage, blastocyst and hatching rates (at 72, 168 and 240 hours post-insemination, ... / Mestre

Orientador: Roberto Sartori Filho / Banca: João Carlos Pinheiro Ferreira / Banca: Margot Alves Nunes Dode / Resumo: Objetivou-se com o presente estudo avaliar a criotorerância de mórulas e blastocistos produzidos in vivo de doadoras da raça Sindi e Nelore (Bos indicus) e Holandês Preto e Branco (HPB - Bos taurus). No Experimento 1, 24 fêmeas lactantes e não lactantes da raça Sindi foram superovuladas com 100 mg de FSH suíno com protocolos em que as duas últimas aplicações de FSH foram substituídas ou não por 300 UI de eCG. Sete dias após a indução da ovulação, os embriões foram colhidos e avaliados quanto ao estágio de desenvolvimento embrionário e grau de qualidade. Dois terços dos embriões foram destinados à criopreservação, dos quais metade foi congelada pelo método convencional, com curva de resfriamento de -0,5ºC/min e a outra metade foi vitrificada pela técnica de Cryotop. Em seguida, foram descongelados e transferidos para receptoras sincronizadas, de maneira contemporânea aos embriões frescos. No Experimento 2, 31 fêmeas da raça Nelore foram superovuladas com 133 mg de FSH suíno e os dois terços dos embriões colhidos foram criopreservados e transferidos semelhantemente ao Experimento 1. No Experimento 3, 67 vacas lactantes e novilhas da raça HPB foram superovuladas com 500 e 300 UI de FSH suíno, respectivamente, e após a colheita dos embriões foram adotados os mesmos procedimentos realizados nos Experimentos 1 e 2. Os resultados foram analisados por modelos lineares generalizados e estão apresentados na forma de média dos quadrados mínimos ± erro padrão. Nos Experimentos 1 e 2, os embriões transferidos a fresco apresentaram maior taxa de concepção aos 30 dias do que os vitrificados e congelados (54,8±7,4a, 17,7±7,3b e 19,5±6,6%b; respectivamente; P 0,0013) na raça Sindi (n=231 embriões) e (46,0±6,1a; 31,2±5,4b e 28,1±5,3%b; respectivamente, P 0,04) na raça Nelore (n=297 embriões). O estágio de desenvolvimento embrionário parece não... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The aim of this study was to evaluate the cryotolerance of morulae and blastocysts produced in vivo in Sindhi and Nelore (Bos indicus) and Holstein (Bos taurus) donnors. In Experiment 1, 24 lactating and non-lactating Sindhi donnors were superovulated with 100 mg porcine FSH with protocols in which the last two FSH treatments were replaced or not by 300 IU eCG. Embryos were collected 7 days after ovulation induction and embryo development and quality degree were accessed. Two thirds of the embryos were cryopreserved, by the conventional freezing or Cryotop method. After that, embryos were thawed and transferred to synchronized recipients, simultaneously to fresh embryos. In Experiment 2, 31 Nelore cows were superovulated with 133 mg porcine FSH and two thirds of the embryos were cryopreserved and transferred similarly to Experiment 1. In Experiment 3, 67 Holstein lactating dairy cows and heifers were superovulated with 500 and 300 IU pFSH, respectively, and the same procedures were performed as in Experiments 1 and 2. Results were analyzed using generalized linear models and are presented as least squares means ± standard error. In Experiments 1 and 2, fresh embryos had a higher conception rate at Day 30 than those vitrified and frozen (54.8±7.4a, 17.7±7.3b and 19.5±6.6%b; respectively; P 0.0013) in Sindhi donnors (n=231 embryos) and (46.0±6.1a; 31.2±5.4b and 28.1±5.3%b; respectively; P 0.04) in Nelore donors (n = 297 embryos). Embryo developmental stage seems to have not influenced conception rates of Zebu embryos, especially cryopreserved ones. Finnaly, in Experiment 3, conception rates of fresh and cryopreserved embryos were similar (37.4±12.3, 24.5±11.3 and 21.0±9.5%; respectively, P>0.15) and also no difference was detected for the cryotolerance of morulae versus blastocysts (P>0.10) / Mestre

Orientador: Marcelo Fábio Nogueira / Banca: Fernanda da Cruz Landim e Alvarenga / Banca: Marcos Roberto Chiaratti / Banca: Flávio Vieira Meirelles / Banca: Lawrence Charles Smith / Resumo: Na literatura, não há descrição de que células trofectodérmicas sejam adequadas para a agregação (sem utilizar a fusão ou a microinjeção) e forma cão de embrião quimérico. O presente trabalho buscou validar um modelo para gerar blastocistos quiméricos, pela agrega ção de tecido trofectodérmico, primeiramente validando-o em camundongos e posteriormente testando a sua eficácia na espécie bovina. Nesta, duas técnicas para a reconstrução de blastocistos foram investigadas, mediante a agregação de um fragmento de trofectoderme (TE) com a massa celular interna (MCI) ou com células tronco induzidas a pluripotência (iPS). Os embriões foram bissectados com lâmina, assistida por micromanipulador, exceto no Experimento 1 e 2 (embriões bovinos) em que a bissecação utilizou microlâmina, por em controlada manualmente. De acordo com o delineamento de cada experimento, os embriões, os fragmentos embrionários e/ou as células iPS, foram depositados em micropoços preenchidos com meio KSOMaa (camundongo) ou SOF (gado bovino). Após 24 horas, a taxa de agregação (TA) das estruturas nos micropoços foi avaliada morfologicamente, mediante a detecção de uma única e coesa massa celular ou pela re-expansão e reorganização do blastocisto. Na validação em camundongos, foram utilizados dois hemiblastocistos ou MCI e TE derivados de embriões produzidos in vivo das linhagens Swiss Webster e C57BL/6/EGFP. Três experimentos foram conduzidos para caracterizar: 1) a eficácia da agregação de embriões em estágios pós-compactação; 2) o efeito do aumento de fragmentos embrionários e a utilização de um agente aglutinante biológico (fitohemaglutinina) na agregação; e 3) a exequibilidade da reconstrução do blastocisto pela aproximação entre MCI e fragmento de TE. Na segunda parte do trabalho, foram utilizados embriões bovinos produzidos in vitro em 5 experimentos: 1) utilização de fitohemaglutinina ... / Abstract: There is no report in the literature that trophectoderm cells can be used for aggregation (except in combination with fusion or microinjection techniques) and develop aggregates into a chimeric embryo. We aimed to validate a model to generate chimeric blatocysts using the trophectodermic tissue for aggregation in mice and replicate the validated technique in bovine embryos. We tested two methods of reconstruction in order to aggregate a trophectoderm fragment with either the inner cell mass (ICM) or the induced pluripotent stem (iPS) cells. Embryos were bisected by a blade assisted by micromanipulator, except in experiment 1 and 2 (bovine embryos) in which embryos were bisected by a manually controlled microblade. According to each experimental design, embryos, embryonic fragments and/or iPS cells were deposited in microwells lled with KSOMaa (mice) or SOF (bovine cattle). After 24 h the aggregation rate (AR) was assessed morphologically by the detection of a single, cohesive cell mass or by a re-expanded and reorganized blastocyst. In mice we used two demi-blastocysts or ICM and TE derived from in vivo produced Swiss Webster and C57BL/6/EGFP embryos. Three approaches aimed to characterize: 1) the e ectiveness of aggregation in post-compaction embryos; 2) the e ect on aggregation of increasing embryonic fragments and the use of the cell agglutination agent, phytohemagglutinin-L; and 3) the feasibility of reconstructing blastocysts by culturing ICM and TE fragments in close contact. In the bovine experiment we used in vitro produced embryos in 5 approaches to assess: 1) the effect of phytohemagglutinin-L in the aggregation of post-compaction demi-embryos; 2) blastocyst reconstruction using manually sectioned structures (ICM and TE); 3) microinjection of TE fragments into morula; 4) blastocyst reconstruction using structures (ICM and TE) sectioned with micromanipulator; and 5) production of chimeric ... / Doutor

Orientador: Fernanda da Cruz Landim / Resumo: O objetivo do presente estudo foi avaliar o benefício da substituição do soro fetal bovino (SFB) pelo fator de crescimento semelhante à insulina tipo I (IGF-1) durante a maturação in vitro (MIV) ou cultivo in vitro (CIV), sobre qualidade embrionária e expressão de genes em embriões pré- e pós-compactação. Delineamento experimental foi fatorial 3 x 3 (três suplementos de MIV e três de CIV), com 9 grupos experimentais. Foram realizadas 20 réplicas (oócitos ≈ 400/grupo). Complexos cúmulus-oócito (COCs) graus I e II foram maturados in vitro com a adição de 10% de SFB (SFB), ou 3 mg/mL polivinil-álcool (PVA), ou PVA + 100 ng/mL de IGF-1 (IGF) a 38,5 ºC em 5% de CO2 em ar por 22 a 24 horas. Foram fertilizados e incubados durante 18 horas. Os zigotos foram cultivados com a adição de: 2,5% de SFB (SFB), ou 3 mg/mL de PVA (PVA), ou PVA + 100 ng/mL de IGF-1 (IGF) por sete dias a 38,5ºC em 5% de CO2 em ar. As taxas de clivagem e blastocisto foram avaliadas após 48 e 168 horas de cultivo, respectivamente. A técnica simplificada de coloração diferencial de células da massa celular interna (MCI) e trofoectoderma (TE) foi utilizada para avaliar a distribuição celular de blastocistos (n = 155) e a técnica de TUNEL para avaliação do índice de apoptose (n = 207). Concentrações de glicose e lactato obtidas do meio MIV utilizaram-se para analisar o metabolismo de glicose. mRNA foi extraído de embriões de 6 – 8 células colhidos após 66 horas post-inseminação (4 pools de 15 embriões por grupo) e d... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Doutor

Made available in DSpace on 2015-03-03T11:52:38Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-07-28Bitstream added on 2015-03-03T12:06:14Z : No. of bitstreams: 1 000810245_20160728.pdf: 63604 bytes, checksum: a150945822a93489f6d371a15780582b (MD5) Bitstreams deleted on 2016-07-29T12:53:56Z: 000810245_20160728.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2016-07-29T12:54:50Z : No. of bitstreams: 1 000810245.pdf: 1452897 bytes, checksum: 04a40d2aa763c6094fd5a4d34baabaa6 (MD5) / A classificação morfológica embrionária possui grande importância para inúmeras técnicas laboratoriais (desde pesquisas básicas às aplicadas na reprodução assistida). Entretanto, o método utilizado para realizar a classificação dos embriões em diferentes graus de qualidade sempre foi baseado na subjetividade do avaliador e, por mais que sejam estabelecidos padrões de graus de qualidade e descrições das características morfológicas que categorizam um embrião em cada grau, não há atualmente um método preciso que possa gerar resultados consistentes e confiáveis. Assim, nosso trabalho resultou no desenvolvimento de um software capaz de realizar a classificação da qualidade morfológica de blastocistos bovinos. Utilizamos como base de funcionamento técnicas de inteligência artificial (mais especificamente de Redes Neurais Artificiais e Algoritmos Genéticos). Resultados indicam uma taxa de acerto global de 79,2% na classificação de blastocistos bovinos em 3 graus de qualidade, sendo que para os blastocistos classificados como Excelentes ou Bons (Classe 1) a taxa de acerto é de 82,6%, para os blastocistos classificados como Regulares (Classe 2) é de 16,7% e para os blastocistos classificados como Pobres (Classe 3) a taxa de acerto é de 91,7% / Embryonic morphological classification has great importance for numerous laboratory techniques (from basic to applied research in assisted reproduction). However, the method used to perform the classification of embryos in varying degrees of quality has always been based on the subjectivity of the evaluator. Although quality standards and descriptions of morphological characteristics that categorize an embryo in each grade are established, currently there is not an accurate method that can generate consistent and reliable results. Thus, our work resulted in the development of a software able to perform the classification of morphological quality of bovine blastocysts. Artificial Intelligence techniques (such as Artificial Neural Networks and Genetic Algorithms) were used in the development. Results indicate an overall accuracy of 79.2% in the classification of bovine blastocysts in 3 degrees of quality. For blastocysts classified as Excellent or Good (Class 1) the hit rate is 82.6%, for blastocysts classified as Regular (Class 2) is 16.7% and for blastocysts classified as poor (Class 3) the hit rate is 91.7%

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:08Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-04-26Bitstream added on 2014-06-13T20:42:44Z : No. of bitstreams: 1 000741947.pdf: 4654580 bytes, checksum: b05e20e66d52ef92df24a9907af04254 (MD5) / Na literatura, não há descrição de que células trofectodérmicas sejam adequadas para a agregação (sem utilizar a fusão ou a microinjeção) e forma cão de embrião quimérico. O presente trabalho buscou validar um modelo para gerar blastocistos quiméricos, pela agrega ção de tecido trofectodérmico, primeiramente validando-o em camundongos e posteriormente testando a sua eficácia na espécie bovina. Nesta, duas técnicas para a reconstrução de blastocistos foram investigadas, mediante a agregação de um fragmento de trofectoderme (TE) com a massa celular interna (MCI) ou com células tronco induzidas a pluripotência (iPS). Os embriões foram bissectados com lâmina, assistida por micromanipulador, exceto no Experimento 1 e 2 (embriões bovinos) em que a bissecação utilizou microlâmina, por em controlada manualmente. De acordo com o delineamento de cada experimento, os embriões, os fragmentos embrionários e/ou as células iPS, foram depositados em micropoços preenchidos com meio KSOMaa (camundongo) ou SOF (gado bovino). Após 24 horas, a taxa de agregação (TA) das estruturas nos micropoços foi avaliada morfologicamente, mediante a detecção de uma única e coesa massa celular ou pela re-expansão e reorganização do blastocisto. Na validação em camundongos, foram utilizados dois hemiblastocistos ou MCI e TE derivados de embriões produzidos in vivo das linhagens Swiss Webster e C57BL/6/EGFP. Três experimentos foram conduzidos para caracterizar: 1) a eficácia da agregação de embriões em estágios pós-compactação; 2) o efeito do aumento de fragmentos embrionários e a utilização de um agente aglutinante biológico (fitohemaglutinina) na agregação; e 3) a exequibilidade da reconstrução do blastocisto pela aproximação entre MCI e fragmento de TE. Na segunda parte do trabalho, foram utilizados embriões bovinos produzidos in vitro em 5 experimentos: 1) utilização de fitohemaglutinina... / There is no report in the literature that trophectoderm cells can be used for aggregation (except in combination with fusion or microinjection techniques) and develop aggregates into a chimeric embryo. We aimed to validate a model to generate chimeric blatocysts using the trophectodermic tissue for aggregation in mice and replicate the validated technique in bovine embryos. We tested two methods of reconstruction in order to aggregate a trophectoderm fragment with either the inner cell mass (ICM) or the induced pluripotent stem (iPS) cells. Embryos were bisected by a blade assisted by micromanipulator, except in experiment 1 and 2 (bovine embryos) in which embryos were bisected by a manually controlled microblade. According to each experimental design, embryos, embryonic fragments and/or iPS cells were deposited in microwells lled with KSOMaa (mice) or SOF (bovine cattle). After 24 h the aggregation rate (AR) was assessed morphologically by the detection of a single, cohesive cell mass or by a re-expanded and reorganized blastocyst. In mice we used two demi-blastocysts or ICM and TE derived from in vivo produced Swiss Webster and C57BL/6/EGFP embryos. Three approaches aimed to characterize: 1) the e ectiveness of aggregation in post-compaction embryos; 2) the e ect on aggregation of increasing embryonic fragments and the use of the cell agglutination agent, phytohemagglutinin-L; and 3) the feasibility of reconstructing blastocysts by culturing ICM and TE fragments in close contact. In the bovine experiment we used in vitro produced embryos in 5 approaches to assess: 1) the effect of phytohemagglutinin-L in the aggregation of post-compaction demi-embryos; 2) blastocyst reconstruction using manually sectioned structures (ICM and TE); 3) microinjection of TE fragments into morula; 4) blastocyst reconstruction using structures (ICM and TE) sectioned with micromanipulator; and 5) production of chimeric ...

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:29:14Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-05-28Bitstream added on 2014-06-13T20:59:30Z : No. of bitstreams: 1 mattos_mcc_me_botfmvz.pdf: 2029467 bytes, checksum: 940e4724967df5043139371eecb13c64 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Objetivou-se com o presente estudo avaliar a criotorerância de mórulas e blastocistos produzidos in vivo de doadoras da raça Sindi e Nelore (Bos indicus) e Holandês Preto e Branco (HPB - Bos taurus). No Experimento 1, 24 fêmeas lactantes e não lactantes da raça Sindi foram superovuladas com 100 mg de FSH suíno com protocolos em que as duas últimas aplicações de FSH foram substituídas ou não por 300 UI de eCG. Sete dias após a indução da ovulação, os embriões foram colhidos e avaliados quanto ao estágio de desenvolvimento embrionário e grau de qualidade. Dois terços dos embriões foram destinados à criopreservação, dos quais metade foi congelada pelo método convencional, com curva de resfriamento de –0,5ºC/min e a outra metade foi vitrificada pela técnica de Cryotop. Em seguida, foram descongelados e transferidos para receptoras sincronizadas, de maneira contemporânea aos embriões frescos. No Experimento 2, 31 fêmeas da raça Nelore foram superovuladas com 133 mg de FSH suíno e os dois terços dos embriões colhidos foram criopreservados e transferidos semelhantemente ao Experimento 1. No Experimento 3, 67 vacas lactantes e novilhas da raça HPB foram superovuladas com 500 e 300 UI de FSH suíno, respectivamente, e após a colheita dos embriões foram adotados os mesmos procedimentos realizados nos Experimentos 1 e 2. Os resultados foram analisados por modelos lineares generalizados e estão apresentados na forma de média dos quadrados mínimos ± erro padrão. Nos Experimentos 1 e 2, os embriões transferidos a fresco apresentaram maior taxa de concepção aos 30 dias do que os vitrificados e congelados (54,8±7,4a, 17,7±7,3b e 19,5±6,6%b; respectivamente; P 0,0013) na raça Sindi (n=231 embriões) e (46,0±6,1a; 31,2±5,4b e 28,1±5,3%b; respectivamente, P 0,04) na raça Nelore (n=297 embriões). O estágio de desenvolvimento embrionário parece não... / The aim of this study was to evaluate the cryotolerance of morulae and blastocysts produced in vivo in Sindhi and Nelore (Bos indicus) and Holstein (Bos taurus) donnors. In Experiment 1, 24 lactating and non-lactating Sindhi donnors were superovulated with 100 mg porcine FSH with protocols in which the last two FSH treatments were replaced or not by 300 IU eCG. Embryos were collected 7 days after ovulation induction and embryo development and quality degree were accessed. Two thirds of the embryos were cryopreserved, by the conventional freezing or Cryotop method. After that, embryos were thawed and transferred to synchronized recipients, simultaneously to fresh embryos. In Experiment 2, 31 Nelore cows were superovulated with 133 mg porcine FSH and two thirds of the embryos were cryopreserved and transferred similarly to Experiment 1. In Experiment 3, 67 Holstein lactating dairy cows and heifers were superovulated with 500 and 300 IU pFSH, respectively, and the same procedures were performed as in Experiments 1 and 2. Results were analyzed using generalized linear models and are presented as least squares means ± standard error. In Experiments 1 and 2, fresh embryos had a higher conception rate at Day 30 than those vitrified and frozen (54.8±7.4a, 17.7±7.3b and 19.5±6.6%b; respectively; P 0.0013) in Sindhi donnors (n=231 embryos) and (46.0±6.1a; 31.2±5.4b and 28.1±5.3%b; respectively; P 0.04) in Nelore donors (n = 297 embryos). Embryo developmental stage seems to have not influenced conception rates of Zebu embryos, especially cryopreserved ones. Finnaly, in Experiment 3, conception rates of fresh and cryopreserved embryos were similar (37.4±12.3, 24.5±11.3 and 21.0±9.5%; respectively, P>0.15) and also no difference was detected for the cryotolerance of morulae versus blastocysts (P>0.10)

Orientador: Marcelo Fábio Gouveia Nogueira / Co-orientador: José Celso Rocha / Banca: Fernando Frei / Banca: Andrea Cristina Basso / Resumo: A classificação morfológica embrionária possui grande importância para inúmeras técnicas laboratoriais (desde pesquisas básicas às aplicadas na reprodução assistida). Entretanto, o método utilizado para realizar a classificação dos embriões em diferentes graus de qualidade sempre foi baseado na subjetividade do avaliador e, por mais que sejam estabelecidos padrões de graus de qualidade e descrições das características morfológicas que categorizam um embrião em cada grau, não há atualmente um método preciso que possa gerar resultados consistentes e confiáveis. Assim, nosso trabalho resultou no desenvolvimento de um software capaz de realizar a classificação da qualidade morfológica de blastocistos bovinos. Utilizamos como base de funcionamento técnicas de inteligência artificial (mais especificamente de Redes Neurais Artificiais e Algoritmos Genéticos). Resultados indicam uma taxa de acerto global de 79,2% na classificação de blastocistos bovinos em 3 graus de qualidade, sendo que para os blastocistos classificados como Excelentes ou Bons (Classe 1) a taxa de acerto é de 82,6%, para os blastocistos classificados como Regulares (Classe 2) é de 16,7% e para os blastocistos classificados como Pobres (Classe 3) a taxa de acerto é de 91,7% / Abstract: Embryonic morphological classification has great importance for numerous laboratory techniques (from basic to applied research in assisted reproduction). However, the method used to perform the classification of embryos in varying degrees of quality has always been based on the subjectivity of the evaluator. Although quality standards and descriptions of morphological characteristics that categorize an embryo in each grade are established, currently there is not an accurate method that can generate consistent and reliable results. Thus, our work resulted in the development of a software able to perform the classification of morphological quality of bovine blastocysts. Artificial Intelligence techniques (such as Artificial Neural Networks and Genetic Algorithms) were used in the development. Results indicate an overall accuracy of 79.2% in the classification of bovine blastocysts in 3 degrees of quality. For blastocysts classified as Excellent or Good (Class 1) the hit rate is 82.6%, for blastocysts classified as Regular (Class 2) is 16.7% and for blastocysts classified as poor (Class 3) the hit rate is 91.7% / Mestre