O objetivo do experimento foi determinar as taxas de sobrevivência pós vitrificação de blastocistos murinos (experimento 1) expostos à duas associações de crioprotetores e envasados em micropipetas de quartzo (QMC) ou de vidro (GMP) e, (experimento 2) comparar as taxas de sobrevivência obtidas na vitrificação dos embriões envasados em QMC de dois diâmetros internos (0,1 mm ou 0,2 mm). No experimento 1, blastocistos murinos coletados no dia 4 de desenvolvimento foram selecionados morfologicamente e divididos aleatoriamente em seis grupos. Grupo 1 (Controle 1): embriões colocados em cultivo imediatamente após a coleta. Grupo 2: embriões expostos a 10% PROH + 10% EG + 0,5% PVA em PBSm (ES1) por 1 min e em seguida expostos a 20% PROH + 20% EG + 0,5% PVA em PBSm (VS1) por no máximo 30 seg, período em que foram envasados em QMC. Grupo 3: idem ao Grupo 2 com envase em GMP. Grupo 4: embriões expostos a 10% DMSO + 10% EG + 0,5% PVA em PBSm (ES2) por 1 min e em seguida expostos a 20% DMSO + 20% EG + 0,5% PVA em PBSm (VS2), por no máximo 30 seg, período em que foram envasados em QMC. Grupo 5: idem ao grupo 4 com envase em GMP. Após a exposição às soluções de vitrificação, os capilares foram imediatamente imersos em N2 líquido. Grupo 6 (Controle 2): embriões não vitrificados colocados em cultivo somente após o final dos procedimentos dos grupos tratados. No segundo experimento, a exemplo do primeiro, foram formados os seguintes grupos: Grupo 1 (controle 1): embriões colocados em cultivo imediatamente após a coleta; Grupo 2: embriões envasados em QCM de 0,1mm de diâmetro; Grupo 3: embriões envasados em QCM de 0,2mm de diâmetro; Grupo 4 (controle 2): embriões não vitrificados colocados somente após o término da vitrificação. Para vitrificação foi utilizado o tratamento 4 do experimento 1. Nos dois experimentos, os embriões vitrificados foram reaquecidos pela exposição a 0,25M de sacarose em PBSm, a 37°C, durante 5min para a retirada do crioprotetor. Após, os embriões foram transferidos para o cultivo in vitro em meio KSOM durante 72h. As taxas de eclosão dos blastocistos nos grupos do experimento 1 foram: G1: 83,07% (54/65), G2: 47,3% (23/49), G3: 38,4% (20/52), G4: 60,4% (29/48), G5: 41,1 (21/51), G6: 77,4% (55/71). No segundo experimento, as taxas de eclosão dos blastocistos foram: G1: 82,5% (33/40), G2: 55,3% (17/31), G3: 58,5% (22/38), G4: 82,0% (41/50). Os resultados observados nos experimentos mostraram que não houve diferença significativa na taxa de eclosão entre os grupos experimentais, entretanto, todos foram inferiores (P>0,05) aos controles. As soluçõesutilizadas, os GMP e os dois diâmetros do QCM testados permitiram que blastocistos murinos vitrificados apresentassem taxas de sobrevivência in vitro semelhantes entre si. / The aim of the experiment was to determine the survival rates after vitrification of mice blastocysts exposed to two different associations of cryoprotectants and loaded in quartz microcapillaries (QCM) or glass microcapillaries (GMP) and, later, to compare the embryo survival rates obtained with murine blastocysts loaded into QMC with two internal diameters (0.1 mm or 0.2 mm). In experiment 1, the murine blastocysts were collected on day 4 of development and morphologically selected and randomly divided into six groups. Group 1 (control 1): not vitrified blastocysts cultured into KSOM drops immediately after collection. Group 2: embryos exposed for 1 minute at 10% PROH, 10% EG, 0.5% PVA in PBSm(ES1) and after exposed to 20% PROH, 20% EG, 0.5% PVA in PBSm (VS1) within 30 seconds, then loaded in QMC. Group 3: the same to group 2 however loaded in GMP. Group 4: exposed to 10% DMSO, 10% EG, 0.5% PVA in PBSm(ES2) and after exposed to 20% DMSO, 20% EG, 0.5% PVA in PBSm(VS2), loaded in QMC. Group 5: the same to group 4 however loaded in GMP. After exposure to vitrification solutions, the capillaries were immediately immersed in LN2. Group 6 (Control 2): not vitrified embryos placed in culture only after the end of vitrification of the treated groups. The second experiment consisted of the following groups: Group 1 (control 1) embryos transferred to culture immediately after collection; Group 2: embryos loaded in QCM with 0.1 mm internal diameter, and Group 3: embryos loaded in QCM with 0.2 mm internal diameter diameter, and Group 4 (control 2): not vitrified embryos placed in culture only after the end vitrification procedures. Groups 2 and 3 were exposed to ES2 and VS2 and later loaded in QMC 0.1 or 0.2 mm in diameter, immediately immersed in LN2. Blastocysts were warmed by exposure to 0.25 M sucrose in PBSm at 37 °C for 5min to remove the cryoprotectant. After warming, the embryos were transferred to 100 μL drops of KSOM during 72 hours. Hatching rates were observed in groups of experiment 1 were: G1: 83.07% (54/65), G2: 47.3% (23/49), G3: 38.4% (20/52), G4: 60.4% (29/48), G5: 41.1 (21/51), G6: 77.4% (55/71). In the second experiment, the blastocyst hatching rates were: G1: 82.5% (33/40), G2: 55.3% (17/31), G3: 58.5% (22/38), G4: 82% (41/50). The results observed in both experiments showed no significant difference in embryo hatching rates among the experimental groups, but all were inferior (P>0.05) to controls. The vitrification solutions used, the GMP and the QCM at two diameters tested provided similar embryo survival rates.

O objetivo do experimento foi determinar as taxas de sobrevivência pós vitrificação de blastocistos murinos (experimento 1) expostos à duas associações de crioprotetores e envasados em micropipetas de quartzo (QMC) ou de vidro (GMP) e, (experimento 2) comparar as taxas de sobrevivência obtidas na vitrificação dos embriões envasados em QMC de dois diâmetros internos (0,1 mm ou 0,2 mm). No experimento 1, blastocistos murinos coletados no dia 4 de desenvolvimento foram selecionados morfologicamente e divididos aleatoriamente em seis grupos. Grupo 1 (Controle 1): embriões colocados em cultivo imediatamente após a coleta. Grupo 2: embriões expostos a 10% PROH + 10% EG + 0,5% PVA em PBSm (ES1) por 1 min e em seguida expostos a 20% PROH + 20% EG + 0,5% PVA em PBSm (VS1) por no máximo 30 seg, período em que foram envasados em QMC. Grupo 3: idem ao Grupo 2 com envase em GMP. Grupo 4: embriões expostos a 10% DMSO + 10% EG + 0,5% PVA em PBSm (ES2) por 1 min e em seguida expostos a 20% DMSO + 20% EG + 0,5% PVA em PBSm (VS2), por no máximo 30 seg, período em que foram envasados em QMC. Grupo 5: idem ao grupo 4 com envase em GMP. Após a exposição às soluções de vitrificação, os capilares foram imediatamente imersos em N2 líquido. Grupo 6 (Controle 2): embriões não vitrificados colocados em cultivo somente após o final dos procedimentos dos grupos tratados. No segundo experimento, a exemplo do primeiro, foram formados os seguintes grupos: Grupo 1 (controle 1): embriões colocados em cultivo imediatamente após a coleta; Grupo 2: embriões envasados em QCM de 0,1mm de diâmetro; Grupo 3: embriões envasados em QCM de 0,2mm de diâmetro; Grupo 4 (controle 2): embriões não vitrificados colocados somente após o término da vitrificação. Para vitrificação foi utilizado o tratamento 4 do experimento 1. Nos dois experimentos, os embriões vitrificados foram reaquecidos pela exposição a 0,25M de sacarose em PBSm, a 37°C, durante 5min para a retirada do crioprotetor. Após, os embriões foram transferidos para o cultivo in vitro em meio KSOM durante 72h. As taxas de eclosão dos blastocistos nos grupos do experimento 1 foram: G1: 83,07% (54/65), G2: 47,3% (23/49), G3: 38,4% (20/52), G4: 60,4% (29/48), G5: 41,1 (21/51), G6: 77,4% (55/71). No segundo experimento, as taxas de eclosão dos blastocistos foram: G1: 82,5% (33/40), G2: 55,3% (17/31), G3: 58,5% (22/38), G4: 82,0% (41/50). Os resultados observados nos experimentos mostraram que não houve diferença significativa na taxa de eclosão entre os grupos experimentais, entretanto, todos foram inferiores (P>0,05) aos controles. As soluçõesutilizadas, os GMP e os dois diâmetros do QCM testados permitiram que blastocistos murinos vitrificados apresentassem taxas de sobrevivência in vitro semelhantes entre si. / The aim of the experiment was to determine the survival rates after vitrification of mice blastocysts exposed to two different associations of cryoprotectants and loaded in quartz microcapillaries (QCM) or glass microcapillaries (GMP) and, later, to compare the embryo survival rates obtained with murine blastocysts loaded into QMC with two internal diameters (0.1 mm or 0.2 mm). In experiment 1, the murine blastocysts were collected on day 4 of development and morphologically selected and randomly divided into six groups. Group 1 (control 1): not vitrified blastocysts cultured into KSOM drops immediately after collection. Group 2: embryos exposed for 1 minute at 10% PROH, 10% EG, 0.5% PVA in PBSm(ES1) and after exposed to 20% PROH, 20% EG, 0.5% PVA in PBSm (VS1) within 30 seconds, then loaded in QMC. Group 3: the same to group 2 however loaded in GMP. Group 4: exposed to 10% DMSO, 10% EG, 0.5% PVA in PBSm(ES2) and after exposed to 20% DMSO, 20% EG, 0.5% PVA in PBSm(VS2), loaded in QMC. Group 5: the same to group 4 however loaded in GMP. After exposure to vitrification solutions, the capillaries were immediately immersed in LN2. Group 6 (Control 2): not vitrified embryos placed in culture only after the end of vitrification of the treated groups. The second experiment consisted of the following groups: Group 1 (control 1) embryos transferred to culture immediately after collection; Group 2: embryos loaded in QCM with 0.1 mm internal diameter, and Group 3: embryos loaded in QCM with 0.2 mm internal diameter diameter, and Group 4 (control 2): not vitrified embryos placed in culture only after the end vitrification procedures. Groups 2 and 3 were exposed to ES2 and VS2 and later loaded in QMC 0.1 or 0.2 mm in diameter, immediately immersed in LN2. Blastocysts were warmed by exposure to 0.25 M sucrose in PBSm at 37 °C for 5min to remove the cryoprotectant. After warming, the embryos were transferred to 100 μL drops of KSOM during 72 hours. Hatching rates were observed in groups of experiment 1 were: G1: 83.07% (54/65), G2: 47.3% (23/49), G3: 38.4% (20/52), G4: 60.4% (29/48), G5: 41.1 (21/51), G6: 77.4% (55/71). In the second experiment, the blastocyst hatching rates were: G1: 82.5% (33/40), G2: 55.3% (17/31), G3: 58.5% (22/38), G4: 82% (41/50). The results observed in both experiments showed no significant difference in embryo hatching rates among the experimental groups, but all were inferior (P>0.05) to controls. The vitrification solutions used, the GMP and the QCM at two diameters tested provided similar embryo survival rates.

O objetivo do experimento foi determinar as taxas de sobrevivência pós vitrificação de blastocistos murinos (experimento 1) expostos à duas associações de crioprotetores e envasados em micropipetas de quartzo (QMC) ou de vidro (GMP) e, (experimento 2) comparar as taxas de sobrevivência obtidas na vitrificação dos embriões envasados em QMC de dois diâmetros internos (0,1 mm ou 0,2 mm). No experimento 1, blastocistos murinos coletados no dia 4 de desenvolvimento foram selecionados morfologicamente e divididos aleatoriamente em seis grupos. Grupo 1 (Controle 1): embriões colocados em cultivo imediatamente após a coleta. Grupo 2: embriões expostos a 10% PROH + 10% EG + 0,5% PVA em PBSm (ES1) por 1 min e em seguida expostos a 20% PROH + 20% EG + 0,5% PVA em PBSm (VS1) por no máximo 30 seg, período em que foram envasados em QMC. Grupo 3: idem ao Grupo 2 com envase em GMP. Grupo 4: embriões expostos a 10% DMSO + 10% EG + 0,5% PVA em PBSm (ES2) por 1 min e em seguida expostos a 20% DMSO + 20% EG + 0,5% PVA em PBSm (VS2), por no máximo 30 seg, período em que foram envasados em QMC. Grupo 5: idem ao grupo 4 com envase em GMP. Após a exposição às soluções de vitrificação, os capilares foram imediatamente imersos em N2 líquido. Grupo 6 (Controle 2): embriões não vitrificados colocados em cultivo somente após o final dos procedimentos dos grupos tratados. No segundo experimento, a exemplo do primeiro, foram formados os seguintes grupos: Grupo 1 (controle 1): embriões colocados em cultivo imediatamente após a coleta; Grupo 2: embriões envasados em QCM de 0,1mm de diâmetro; Grupo 3: embriões envasados em QCM de 0,2mm de diâmetro; Grupo 4 (controle 2): embriões não vitrificados colocados somente após o término da vitrificação. Para vitrificação foi utilizado o tratamento 4 do experimento 1. Nos dois experimentos, os embriões vitrificados foram reaquecidos pela exposição a 0,25M de sacarose em PBSm, a 37°C, durante 5min para a retirada do crioprotetor. Após, os embriões foram transferidos para o cultivo in vitro em meio KSOM durante 72h. As taxas de eclosão dos blastocistos nos grupos do experimento 1 foram: G1: 83,07% (54/65), G2: 47,3% (23/49), G3: 38,4% (20/52), G4: 60,4% (29/48), G5: 41,1 (21/51), G6: 77,4% (55/71). No segundo experimento, as taxas de eclosão dos blastocistos foram: G1: 82,5% (33/40), G2: 55,3% (17/31), G3: 58,5% (22/38), G4: 82,0% (41/50). Os resultados observados nos experimentos mostraram que não houve diferença significativa na taxa de eclosão entre os grupos experimentais, entretanto, todos foram inferiores (P>0,05) aos controles. As soluçõesutilizadas, os GMP e os dois diâmetros do QCM testados permitiram que blastocistos murinos vitrificados apresentassem taxas de sobrevivência in vitro semelhantes entre si. / The aim of the experiment was to determine the survival rates after vitrification of mice blastocysts exposed to two different associations of cryoprotectants and loaded in quartz microcapillaries (QCM) or glass microcapillaries (GMP) and, later, to compare the embryo survival rates obtained with murine blastocysts loaded into QMC with two internal diameters (0.1 mm or 0.2 mm). In experiment 1, the murine blastocysts were collected on day 4 of development and morphologically selected and randomly divided into six groups. Group 1 (control 1): not vitrified blastocysts cultured into KSOM drops immediately after collection. Group 2: embryos exposed for 1 minute at 10% PROH, 10% EG, 0.5% PVA in PBSm(ES1) and after exposed to 20% PROH, 20% EG, 0.5% PVA in PBSm (VS1) within 30 seconds, then loaded in QMC. Group 3: the same to group 2 however loaded in GMP. Group 4: exposed to 10% DMSO, 10% EG, 0.5% PVA in PBSm(ES2) and after exposed to 20% DMSO, 20% EG, 0.5% PVA in PBSm(VS2), loaded in QMC. Group 5: the same to group 4 however loaded in GMP. After exposure to vitrification solutions, the capillaries were immediately immersed in LN2. Group 6 (Control 2): not vitrified embryos placed in culture only after the end of vitrification of the treated groups. The second experiment consisted of the following groups: Group 1 (control 1) embryos transferred to culture immediately after collection; Group 2: embryos loaded in QCM with 0.1 mm internal diameter, and Group 3: embryos loaded in QCM with 0.2 mm internal diameter diameter, and Group 4 (control 2): not vitrified embryos placed in culture only after the end vitrification procedures. Groups 2 and 3 were exposed to ES2 and VS2 and later loaded in QMC 0.1 or 0.2 mm in diameter, immediately immersed in LN2. Blastocysts were warmed by exposure to 0.25 M sucrose in PBSm at 37 °C for 5min to remove the cryoprotectant. After warming, the embryos were transferred to 100 μL drops of KSOM during 72 hours. Hatching rates were observed in groups of experiment 1 were: G1: 83.07% (54/65), G2: 47.3% (23/49), G3: 38.4% (20/52), G4: 60.4% (29/48), G5: 41.1 (21/51), G6: 77.4% (55/71). In the second experiment, the blastocyst hatching rates were: G1: 82.5% (33/40), G2: 55.3% (17/31), G3: 58.5% (22/38), G4: 82% (41/50). The results observed in both experiments showed no significant difference in embryo hatching rates among the experimental groups, but all were inferior (P>0.05) to controls. The vitrification solutions used, the GMP and the QCM at two diameters tested provided similar embryo survival rates.

Ureaplasma diversum pode causar infecções e ativar a resposta imune, estando relacionado com infertilidade em bovinos. Devido à importância dos macrófagos nessas infecções e a relação direta com blastocistos bovinos, o estudo teve o objetivo avaliar o perfil imune in vitro destas células após a infecção experimental por U. diversum. Demonstrou-se capaz de promover resposta inflamatória em macrófagos murinos e bovinos e blastocistos bovinos, com ativação do TLR2 e secreção de IL-1β e TNF-α. A ativação inflamatória pode estar relacionada com a presença de um componente de superfície capaz de induzir uma resposta desse tipo, como lipoproteínas associadas aos lipídeos de membrana (LAMPs), mas as de U. diversum ainda não foram totalmente caracterizadas. Estes resultados associados ao sequenciamento do genoma de U. diversum, permite avanço na compreensão da biologia molecular de infecções por micoplasma. Assim, fomenta-se a discussão da importância e relevância das micoplasmoses, especialmente por U. diversum, na reprodução e bovinocultura no cenário brasileiro. / Ureaplasma diversum can cause infection and activate the immune response, and is associated with infertility in cattle. Due to the importance of macrophages in these infections and the direct relationship with bovine blastocysts, the study aimed to evaluate the immune profile in vitro of these cells after experimental infection U. diversum. It has been shown capable of promoting inflammatory response in murine and bovine macrophages and bovine blastocysts, with activation of TLR2 and IL-1β secretion and TNF-α. The inflammatory activation may be related to the presence of a surface component capable of inducing a response of that type, such as lipoproteins associated with lipid membrane (LAMP\'s), but U. diversum lipoproteins have not been fully characterized. These results associated with the sequencing of the U. diversum genome allows improvement in understanding the molecular biology of mycoplasma infections. Thus, encourages the discussion of the importance and relevance of mycoplasmosis, especially U. diversum, reproduction and cattle in the Brazilian scene.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:35:11Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-02-27Bitstream added on 2014-06-13T20:06:42Z : No. of bitstreams: 1 borges_jc_dr_jabo.pdf: 527084 bytes, checksum: 74a9732f86335b470c5edaba6623feba (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Efeitos deletérios dos radicais livres causam a lipoperoxidação da membrana plasmática dos gametas feminino e masculino e dos embriões cultivados in vitro, sendo responsável por perda da produção in vitro de embriões e redução da fertilidade in vivo. O estudo foi realizado com objetivo de investigar o efeito protetor do diluidor de sêmen contendo antioxidante submetido à criopreservação e avaliado por testes complementares (teste de termo resistência, hiposmótico e fluorescência), pela inseminação artificial e fertilização in vitro. Ejaculados de cinco touros foram agrupados nos seguintes tratamentos: 1 – Diluidor Tris – gema (controle – Dil C); 2 – Diluidor Tris –gema + Trolox 200mM (antioxidante-Dil T). Amostras com os diluidores com concentração final de 25 x 106 espermatozóides/ palheta foram envasadas em palhetas de 0,25 mL. Em uma fazenda localizada no Mato Grosso do Sul – MS, foram inseminadas 300 novilhas Nelore, e para cada touro realizou-se 60 inseminações artificiais (palhetas descongeladas em 35°C por 20 seg). Oócitos com citoplasma homogêneo e cumulus compacto de ovário de vacas de abatedouro foram selecionados e maturados em grupos de 25 por gota em 100μl de meio TCM 199 com SFB, FSH, hCG e estradiol, piruvato de sódio e amicacina, por 24 horas, sob óleo mineral, e foram cultivados com 5% CO2 e 95% umidade em ar, a 38,5ºC. Depois da maturação, os oócitos foram colocados em gotas com TALP contendo BSA, PHE e 10μg/ml de heparina com 1x 106 espermatozóides móveis por ml. Quatro palhetas (duas – DC e duas – DT) do mesmo touro e ejaculado foram descongeladas e cada palheta foi processada por um método de separação espermática para recuperação do sobrenadante: método de lavagem (duas centrifugações de 36xg por 5 min em 2ml de TL-sêmen) e gradiente de Percoll (45 e 90%, submetido a centrifugação a 500xg por 30 min)... / Deleterious effects of free radicals cause lipoperoxidation of the plasmatic membrane of female and male gametes and in vitro cultured embryos, being responsible for losses in in vitro production of embryos and reduction in in vivo fertility. The objective of this study was to investigate the protective effects of semen extender containing antioxidant submitted to cryopreservation and evaluated by artificial insemination, in vitro fertilization and complementary tests (hyposmotic, fluorescence, and thermal resistance tests). Ejaculates from 5 bulls were treated with Tris egg yolk extender (control-CE) alone or supplemented with 200ml Trolox in the extender (antioxidant-AE). The samples with the extenders with a final concentration of 25 x 106 spermatozoa/ml were placed into 0.25 ml straws. Three hundred Nelore heifers from a cattle farm in Mato Grosso do Sul - MS, were separated into 5 groups of 60 animals. For artificial insemination, the straws were thawed at 35°C for 20 sec and the females in each group were inseminated with semen of the same bull, using 30 female for each semen extender treatment. For in vitro fertilization, oocytes with homogeneous cytoplasm and compact cumulus, collected from ovaries of slaughtered cows were selected and maturated in groups of 25 in droplets of 100μl TCM 199 medium with FCS, FSH, hCG and estradiol, sodium pyruvate and amicacin, for 24 hours, under mineral oil, in atmosphere of 5% CO2 and 95% humidity in air, at 38.5ºC. After maturation, the oocytes were placed in droplets with TALP containing BSA, PHE and 10μg/ml of heparin with 1x 106 motile spermatozoa/ml...(Complete abstract, click electronic access below)

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / The Binder of Sperm Protein 1 (BSP1) is a protein produced by seminal vesicles of animals. It helps into the fertilization process of oocytes, promoting sperm capacitation, mediating the ligation from itself with the oviduct epithelium, and increasing the motility in the oviduct. When spermatozoa with purified BSP1 were incubated, acrosomal reaction rates were determined with and without the presence of heparin, as controls. The percentage of acrosomal reaction was higher (p <0.05) in control 1 (44.5%) compared with the other treatments (BSP1:10 Âg/mL: 24.5%; 20 Âg/mL: 25.5%; 40 Âg/mL: 26.0 %), and lower the rate (p> 0.05) when sperm were incubated only in Fert-TALP medium without heparin (14.5%). Cleavage and blastocyst rates were evaluated on days two and seven respectively, after fertilize oocytes in a medium containing BSP1. 1274 cumulus- oocyte complexes were recovered and incubated for 18 hours with frozen-thawed ejaculated semen in a Fert-TALP medium, containing: only heparin, 10, 20 or 40 &#956;g/mL of BSP1. Cleavage and blastocyst rates (34.1  4.4 vs 40.8  5.0%) were similar (p> 0.05) when incubation was made with 10 Âg/mL of BSP1 and heparin, respectively. However, the concentrations of 20 and 40 Âg/mL decreased the formation of blastocysts (22.4  2.9 and 19.3  4.1%) compared with heparin (40.8  5.1%, p <0.02). Subsequently, cumulus- oocyte complexes (n = 2239) were incubated with frozen-thawed ejaculated semen. Spermatozoa were selected by a gradient of 45% -90% Percoll containing: only heparin, 10, 20, 40 &#956;g/mL of BSP1 and there was a control 2 of Percoll without heparin or BSP1. Cleavage rate was similar (p> 0.05) for the incubation with concentrations of 10, 20 and 40 &#956;g/mL of BPS1 (67.7  3.0, 68.7  3.5, 75.2  3.8, respectively). However, these rates were similar when it was used just heparin and when oocytes were incubated with 40Âg/mL of BSP1 (78.9  1.7 vs 75.2  3.8%). For blastocyst rates was found that they were similar (p> 0.05) when the selection was made with heparin (44.1  4.3%) and 40 Âg/mL of BSP1 (30.0  3.3%). Finally, 1213 cumulus-oocyte complexes were recovered and incubated with freeze-thawed epididymal semen in Fert-TALP medium, which contained: only heparin, with heparin, and 10, 20 or 40 Âg/mL of BSP1. Cleavage and blastocyst rates were similar after incubation with and without heparin, but the concentration of 40Âg/mL of BSP1 produced higher cleavages rates (79.0  1.1%) than control 1 (68.5  1.3%, p <0.05). About blastocyst rates, there were rates significantly higher when concentrations of 20 and 40 Âg/mL of BSP1 were used (35.6  2.5 and 41.1  2.0%) than with (24.7  3.2; p <0.05) and without heparin (27.3  1.6%; p <0.0003). In conclusion, BSP1 allowed proper cleavage and development, when the protein was added to the fertilization medium and the Percoll gradient using ejaculated semen, and to the fertilization medium when used epididymal sperm, without requiring the use of heparin. / A âBinder of Sperm Protein 1â (BSP1) à uma proteÃna produzida pelas vesÃculas seminais dos animais, que ajuda no processo de fertilizaÃÃo do oÃcito promovendo a capacitaÃÃo espermÃtica, mediando a sua ligaÃÃo com o epitÃlio do oviduto e aumentando sua motilidade no oviduto. As taxas de reaÃÃo de acrossoma dos espermatozoides foram determinadas ao serem incubados com BSP1 purificado, e com e sem a presenÃa de heparina, como controles. A porcentagem de reaÃÃo de acrossoma foi maior (p<0.05) no controle 1 (44.5%) comparado com os tratamentos restantes (BSP1: 10 Âg/mL: 24.5%; 20 Âg/mL: 25.5%; 40 Âg/mL: 26.0%), sendo menor esta taxa (p>0.05) quando os espermatozoides sà foram incubados no meio Fert-TALP sem heparina (14.5%). As taxas de clivagem e de blastocistos foram avaliadas nos dias dois e sete respectivamente, depois de fertilizar oÃcitos em um meio que continha BSP1. Foram recuperados 1274 COCs e incubados durante 18 horas com sÃmen ejaculado congelado- descongelado em meio Fert-TALP, que continha: sà heparina, 10, 20 ou 40 Âg/mL de BSP1. As taxas de clivagem e de blastocistos (34.1  4.4 vs 40.8  5.0%) foram similares (p>0.05) quando se fez a incubaÃÃo com 10 Âg/mL de BSP1 e heparina, respectivamente. PorÃm, as concentraÃÃes de 20 e 40 Âg/mL diminuÃram a formaÃÃo de blastocistos (22.4  2.9 e 19.3  4.1%) em relaÃÃo com a heparina (40.8  5.1%; p < 0.02). Posteriormente foram incubados COCs (n= 2239), com sÃmen ejaculado congelado-descongelado que foi selecionado por um gradiente de Percoll 45%-90% que continha: sà heparina, 10, 20 ou 40 Âg/mL de BPS1 e foi realizado um controle 2 de Percoll sem heparina nem BSP1. A taxa de clivagem foi similar (p > 0.05) para a incubaÃÃo com as concentraÃÃes de 10, 20 e 40 Âg/mL de BSP1 (67.7Â3.0, 68.7Â3.5, 75.2Â3.8). PorÃm, estas taxas foram similares quando sà foi usada heparina e quando se incubou com 40 Âg/mL de BSP1 (78.9Â1.7 vs 75.2Â3.8%). Para as taxas de blastocistos encontrou-se que foram similares (p > 0.05) quando se fez a seleÃÃo com heparina (44.1Â4.3%) e com 40 Âg/mL de BSP1 (30.0Â3.3%). Finalmente, foram recuperados 1213 complexos cumulus-oÃcitos e incubados com espermatozoides epididimÃrios congelados-descongelados em meio Fert-TALP, que continham: sà heparina, sem heparina, e 10, 20 ou 40 Âg/mL de BSP1. As taxas de clivagem e de blastocistos foram similares apÃs as incubaÃÃes com e sem heparina, mas a concentraÃÃo de 40 Âg/mL de BSP1 produziu maiores taxas de clivagem (79.0  1.1%) que o controle 1 (68.5  1.3%; p < 0.05). Quanto Ãs taxas de blastocistos, encontraram-se maiores taxas quando foram usadas as concentraÃÃes de 20 e 40 Âg/mL de BSP1 (35.6  2.5 e 41.1  2.0%) que com (24.7  3.2; p < 0.05) e sem heparina (27.3  1.6%; p < 0.0003). Em conclusÃo, a BSP1 adicionada ao meio de fertilizaÃÃo e ao gradiente de Percoll quando usado o sÃmen ejaculado, e ao meio de fertilizaÃÃo quando usados espermatozoides epididimÃrios, permitiu clivagem e desenvolvimento prÃprio, sem a necessidade do uso de heparina.

Os mecanismos pelos quais a produção in vitro de embriões (PIVE) bovinos gera embriões com excessivo acúmulo lipídico, com elevado estresse celular e com reduzida criotolerância ainda são desconhecidos. Também permanece desconhecido quando essas alterações acontecem, se acontecem desde a maturação oocitária e o papel que as células do cumulus possuem neste mecanismo. O objetivo do presente trabalho foi estudar e comparar o metabolismo lipídico e homeostase celular, além dos perfis de miRNAs, durante a maturação oocitária e o desenvolvimento embrionário inicial in vivo e in vitro em bovinos. Para isso, o trabalho foi dividido em 4 estudos. No Estudo 1, intitulado \"A maturação in vitro gera complexos cumulus-oócitos metabolicamente desregulados e estressados em bovinos\" foram analisadas as células do cumulus e oócitos de complexos cumulus-oócitos (COCs) imaturos e maturados in vivo e in vitro. Foram realizadas análises de quantificação de lipídeos, espécies reativas de oxigênio (EROs), glutationa reduzida (GSH), razão ATP/ADP assim como expressão de mRNAs e miRNAs relacionados com as vias de metabolismo e homeostase celular. A partir dos dados obtidos neste estudo, concluímos que a maturação in vitro (MIV) provoca aumento de lipídeos no COC, diminuição de GSH e da atividade mitocondrial nos oócitos, acompanhado por uma desregulação massiva das vias relacionadas a metabolismo e homeostase nas células do cumulus da MIV. No Estudo 2, intitulado \"A proteína ligadora de ácidos graxos 3 (Fatty Acid Binding Protein 3 - FABP3) e as projeções transzonais estão envolvidas no acúmulo lipídico durante a maturação in vitro em oócitos bovinos\" foi constatado aumento do conteúdo lipídico e da expressão da FABP3 nas células do cumulus da MIV, quando comparado ao sistema in vivo. Ainda, imunolocalizamos a FABP3 dentro das projeções transzonais (TZPs) e verificamos um aumento concomitante da FABP3 e dos lipídeos oocitários nas primeiras 9 horas da MIV. Mediante a remoção das TZPs às 9 horas da MIV e consequente diminuição lipídica observada no oócito, concluímos que existe um possível transporte de ácidos graxos a partir das células do cumulus até o oócito mediante FABP3 e TZPs. No Estudo 3, intitulado \"Alterações no metabolismo lipídico e homeostase celular entre embriões bovinos produzidos in vivo e in vitro\", verificamos que, mesmo utilizando um cultivo in vitro com baixa tensão de oxigênio e sem soro, os blastocistos da PIVE possuem maiores níveis de lipídeos e EROs que aqueles produzidos in vivo. Além disso, constatamos que essas alterações nos lipídeos durante a PIVE não estão acompanhadas de alterações de expressão, porém, existe um aumento na expressão de genes relacionados com estresse. No último estudo, \"O sistema in vitro altera o perfil de miRNAs durante a maturação oocitária e desenvolvimento embrionário inicial em bovino\", constatamos as diferenças no perfil de miRNAs e nas vias reguladas por estes nas células do cumulus e oócitos maturados in vivo e in vitro e em blastocistos produzidos in vivo e in vitro. Verificamos uma maior regulação por miRNAs durante a maturação nas células do cumulus comparado ao oócito. Além do mais, tanto no COC quanto nos blastocistos, os miRNAs mostraram regular vias importantes do metabolismo, comunicação celular e vias de sinalização importantes para a maturação e desenvolvimento embrionário inicial. Conjuntamente, este trabalho permitiu elucidar as diferenças que a PIVE provoca no metabolismo e homeostase celular e na expressão de miRNAs. / The mechanism through which in vitro embryo production (IVEP) generates embryos with higher lipid accumulation, overstressed and with reduced cryotolerance is unknown. It is also unknown when these alterations take place, if occurs since the oocyte maturation and the role of cumulus cells in this mechanism are also unknown. The aim of the present work was to study and compare the lipid metabolism and cellular homeostasis, as well as the miRNAs profile during oocyte maturation and early in vivo and in vitro embryo development in bovines. For that, the present work was divided in 4 studies. In Study 1, entitled \"in vitro maturation generates metabolically disrupted and overstressed cumulus-oocyte complexes in bovines\" cumulus cells and oocytes from immature and in vivo and in vitro matured cumulus-cells complexes (COC) were analyzed. Analysis of lipid stores, oxygen reactive species (ROS), reduced glutathione and ATP/ADP ratio quantification, as well as mRNAs and miRNAs involved with metabolism and cellular homeostasis pathways were performed. From the obtained data in this study, we concluded that in vitro maturation (IVM) leads to an increase of lipids in the COC, a decrease of oocyte GSH and mitochondrial activity, as well as a massive deregulation in metabolism and homeostasis related pathways in MIV cumuls cells. In Study 2, \"Fatty Acid Binding Protein 3 and transzonal projections are involved on lipid accumulation during in vitro maturation in bovine oocytes\" we observed an increase of lipid accumulation and FABP3 expression in MIV cumulus cells when compared to the in vivo system. Furthermore, we immunolocalized the FABP3 inside the transzonal projections (TZPs) and verified a concomitant increase of FABP3 and oocyte lipids on the first 9 hours of MIV. By removing the TZPs at 9 hours of MIV and by the consequent lipid decrease observed in the oocyte, we concluded that there is a possible traffic of fatty acids from the cumulus cells to the oocyte mediated by FABP3 and TZPs. In Study 3, entitled \"Alterations in lipid metabolism and cellular homeostasis between in vivo and in vitro produced bovine embryos\", we observed that, even though under serum free and low oxygen tension used during in vitro culture was used, IVP blastocysts had higher lipid and ROS levels than the counterparts produced in vivo. Moreover, we found that these lipid alterations during IVP are not followed by corresponding genes expression alterations, however, there is an increase of the expression of stress related genes. In the last study, \"in vitro system alters miRNAs profile during oocyte maturation and early embryo development in bovines\", we observed differences in miRNAs profiles and in pathways modulated by them in in vivo and in vitro matured cumulus cells and oocytes and in in vivo and in vitro produced blastocysts. We observed an intense miRNAs regulation during maturation in cumulus cells when compared to the oocyte. Furthermore, in both COC and blastocysts, miRNAs regulated important metabolism, cellular communication pathways, as well as important signaling pathways for maturation and early embryo development. Taken together, the findings of the present work allowed us to elucidate the differences caused by IVEP on cell metabolism and homeostasis as well as on miRNAs expression.

Os mecanismos pelos quais a produção in vitro de embriões (PIVE) bovinos gera embriões com excessivo acúmulo lipídico, com elevado estresse celular e com reduzida criotolerância ainda são desconhecidos. Também permanece desconhecido quando essas alterações acontecem, se acontecem desde a maturação oocitária e o papel que as células do cumulus possuem neste mecanismo. O objetivo do presente trabalho foi estudar e comparar o metabolismo lipídico e homeostase celular, além dos perfis de miRNAs, durante a maturação oocitária e o desenvolvimento embrionário inicial in vivo e in vitro em bovinos. Para isso, o trabalho foi dividido em 4 estudos. No Estudo 1, intitulado \"A maturação in vitro gera complexos cumulus-oócitos metabolicamente desregulados e estressados em bovinos\" foram analisadas as células do cumulus e oócitos de complexos cumulus-oócitos (COCs) imaturos e maturados in vivo e in vitro. Foram realizadas análises de quantificação de lipídeos, espécies reativas de oxigênio (EROs), glutationa reduzida (GSH), razão ATP/ADP assim como expressão de mRNAs e miRNAs relacionados com as vias de metabolismo e homeostase celular. A partir dos dados obtidos neste estudo, concluímos que a maturação in vitro (MIV) provoca aumento de lipídeos no COC, diminuição de GSH e da atividade mitocondrial nos oócitos, acompanhado por uma desregulação massiva das vias relacionadas a metabolismo e homeostase nas células do cumulus da MIV. No Estudo 2, intitulado \"A proteína ligadora de ácidos graxos 3 (Fatty Acid Binding Protein 3 - FABP3) e as projeções transzonais estão envolvidas no acúmulo lipídico durante a maturação in vitro em oócitos bovinos\" foi constatado aumento do conteúdo lipídico e da expressão da FABP3 nas células do cumulus da MIV, quando comparado ao sistema in vivo. Ainda, imunolocalizamos a FABP3 dentro das projeções transzonais (TZPs) e verificamos um aumento concomitante da FABP3 e dos lipídeos oocitários nas primeiras 9 horas da MIV. Mediante a remoção das TZPs às 9 horas da MIV e consequente diminuição lipídica observada no oócito, concluímos que existe um possível transporte de ácidos graxos a partir das células do cumulus até o oócito mediante FABP3 e TZPs. No Estudo 3, intitulado \"Alterações no metabolismo lipídico e homeostase celular entre embriões bovinos produzidos in vivo e in vitro\", verificamos que, mesmo utilizando um cultivo in vitro com baixa tensão de oxigênio e sem soro, os blastocistos da PIVE possuem maiores níveis de lipídeos e EROs que aqueles produzidos in vivo. Além disso, constatamos que essas alterações nos lipídeos durante a PIVE não estão acompanhadas de alterações de expressão, porém, existe um aumento na expressão de genes relacionados com estresse. No último estudo, \"O sistema in vitro altera o perfil de miRNAs durante a maturação oocitária e desenvolvimento embrionário inicial em bovino\", constatamos as diferenças no perfil de miRNAs e nas vias reguladas por estes nas células do cumulus e oócitos maturados in vivo e in vitro e em blastocistos produzidos in vivo e in vitro. Verificamos uma maior regulação por miRNAs durante a maturação nas células do cumulus comparado ao oócito. Além do mais, tanto no COC quanto nos blastocistos, os miRNAs mostraram regular vias importantes do metabolismo, comunicação celular e vias de sinalização importantes para a maturação e desenvolvimento embrionário inicial. Conjuntamente, este trabalho permitiu elucidar as diferenças que a PIVE provoca no metabolismo e homeostase celular e na expressão de miRNAs. / The mechanism through which in vitro embryo production (IVEP) generates embryos with higher lipid accumulation, overstressed and with reduced cryotolerance is unknown. It is also unknown when these alterations take place, if occurs since the oocyte maturation and the role of cumulus cells in this mechanism are also unknown. The aim of the present work was to study and compare the lipid metabolism and cellular homeostasis, as well as the miRNAs profile during oocyte maturation and early in vivo and in vitro embryo development in bovines. For that, the present work was divided in 4 studies. In Study 1, entitled \"in vitro maturation generates metabolically disrupted and overstressed cumulus-oocyte complexes in bovines\" cumulus cells and oocytes from immature and in vivo and in vitro matured cumulus-cells complexes (COC) were analyzed. Analysis of lipid stores, oxygen reactive species (ROS), reduced glutathione and ATP/ADP ratio quantification, as well as mRNAs and miRNAs involved with metabolism and cellular homeostasis pathways were performed. From the obtained data in this study, we concluded that in vitro maturation (IVM) leads to an increase of lipids in the COC, a decrease of oocyte GSH and mitochondrial activity, as well as a massive deregulation in metabolism and homeostasis related pathways in MIV cumuls cells. In Study 2, \"Fatty Acid Binding Protein 3 and transzonal projections are involved on lipid accumulation during in vitro maturation in bovine oocytes\" we observed an increase of lipid accumulation and FABP3 expression in MIV cumulus cells when compared to the in vivo system. Furthermore, we immunolocalized the FABP3 inside the transzonal projections (TZPs) and verified a concomitant increase of FABP3 and oocyte lipids on the first 9 hours of MIV. By removing the TZPs at 9 hours of MIV and by the consequent lipid decrease observed in the oocyte, we concluded that there is a possible traffic of fatty acids from the cumulus cells to the oocyte mediated by FABP3 and TZPs. In Study 3, entitled \"Alterations in lipid metabolism and cellular homeostasis between in vivo and in vitro produced bovine embryos\", we observed that, even though under serum free and low oxygen tension used during in vitro culture was used, IVP blastocysts had higher lipid and ROS levels than the counterparts produced in vivo. Moreover, we found that these lipid alterations during IVP are not followed by corresponding genes expression alterations, however, there is an increase of the expression of stress related genes. In the last study, \"in vitro system alters miRNAs profile during oocyte maturation and early embryo development in bovines\", we observed differences in miRNAs profiles and in pathways modulated by them in in vivo and in vitro matured cumulus cells and oocytes and in in vivo and in vitro produced blastocysts. We observed an intense miRNAs regulation during maturation in cumulus cells when compared to the oocyte. Furthermore, in both COC and blastocysts, miRNAs regulated important metabolism, cellular communication pathways, as well as important signaling pathways for maturation and early embryo development. Taken together, the findings of the present work allowed us to elucidate the differences caused by IVEP on cell metabolism and homeostasis as well as on miRNAs expression.

En un intento de optimizar el sistema de fecundación in vitro en la especie porcina se estudió la influencia de distintas condiciones de maduración y de cocultivo de los gametos. Se evaluó la reducción del tiempo de coincubación de los gametos a 10 min observándose un claro efecto del ratio espermatozoides:ovocito. El estudio de las necesidades de los espermatozoides en términos de aditivos del medio de fecundación y tiempo de coincubación reveló variaciones entre verracos. La utilización de un tiempo de coincubación tan corto como 2 min fue suficiente para obtener unas tasas de penetración y monospermia similares a las alcanzadas por los sistemas de FIV tradicionales. El sistema de FIV en pajuela con 10 min de coincubación aumentó la penetración monoespérmica y mejoró la calidad de los blastocistos. La adición de 5 nM de 9- cis ácido retinoico al medio de maduración aumentó significativamente la formación de blastocistos. / The present study was conducted in an attempt to optimize porcine in vitro fertilization system. For this purpose, the influence of maturation and gamete coculture conditions were studied. The coincubation time may be reduced to 10 min to increase the efficiency of fertilization depending on the sperm:oocytes ratio. The needs of boar spermatozoa for IVF, in terms of additives to IVF medium and coincubation times vary among boars. The use of coincubation time as brief as 2 min is long enough to obtain good fertilization rates similar to those achieved from current long term exposure times in IVF. A straw IVF system in combination with a 10 min coincubation increased monospermic penetration and the quality of blastocysts compared with the microdrop-IVF system. The addition of 5 nM of 9- cis retinoic acid in the IVM medium increased blastocyst formation rate, suggesting that RA may play an important role during IVM.