The purpose of this study was the investigation of several transport systems expressed at the BBB. The identification and functional characterization of such transport systems is essential to provide a basis for strategies to regulate drug disposition into the brain. Immortalized rat brain endothelial cells (RBE4 cells) have been used in this study as an in vitro model of the BBB. The present study has shown that the RBE4 cells are a suitable model of the BBB for transporter studies. These cells do express the amino acid transport systems L and y+, which are known to be present at the BBB. The uptake of L-tryptophan, a neutral amino acid transported by system L, exhibited a half saturation constant (Kt) of 31 µM and a maximal velocity rate (Vmax) of about 1 nmol/mg/min in RBE4 cells. The kinetic constants of the L-arginine uptake, representing system y+ transport activity, into RBE4 cells were determined with a Kt value of about 55 µM and a Vmax of 0.56 nmol/mg/min. Furthermore the expression of two sodium dependent transporters, the 5-HT transporter (SERT) and the organic cation/carnitine transporter OCTN2, was shown at the RBE4 cells. Uptake studies with radiolabeled 5-HT exhibited a saturable, sodium dependent transport at RBE4 cells with a Kt value of about 0.40 µM and a Vmax of about 52 fmol/mg/min. L-carnitine and TEA (tetraethylammonium) are known to be transported by the OCTN2 transporter. The uptake of L-carnitine into RBE4 cells was shown to be sodium dependent and saturable with a Kt value of 54 µM and a maximal velocity of about 3.6 pmol/mg/min. In contrast, the organic cation TEA follows a sodium independent uptake mechanism at RBE4 cells. Also a sodium independent choline uptake into the cells was discovered but the molecular identity remained unknown. This saturable choline transport exhibited a Kt value of about 22 µM and a maximal velocity of about 52 pmol/mg/min.

In contrast to mammals, some fish and amphibians have retained the ability to regenerate complex body structures or organs, such as the limb, the tail, the eye lens or even parts of the heart. One major difference in the response to injury is the appearance of a mesenchymal growth zone or blastema in these regenerative species instead of the scarring seen in mammals. This blastema is thought to largely derive from the dedifferentiation of various functional cell types, such as skeletal muscle, skin and cartilage. In the case of multinucleated skeletal muscle fibres, cell cycle re-entry into S-phase as well as fragmentation into mononucleated progenitors is observed both in vitro and in vivo. In order to identify molecules that initiate dedifferentiation of cells at the wound site in amphibians we have established a cellular assay with a cultured newt myogenic cell line. Using this assay we have found a serum activity that stimulates cell cycle re-entry in differentiated multinucleated newt myotubes. The activity is present in serum of all mammalian species tested so far and, interestingly, thrombin proteolysis amplifies the activity from both serum and plasma. We think this serum factor provides a link between wounding and regeneration and its identification will be a key step in understanding the remarkable differences in wound healing between mammals and amphibians. In the course of this PhD thesis we have characterized the serum factor as a thermo-labile, pH- and proteinase K-sensitive, high molecular weight protein that is resistant to denaturing conditions such as SDS, urea or organic solvents. Surprisingly, under denaturing conditions the activity behaves as a low molecular weight protein that displays charge heterogeneity on isoelectric focusing. Using these characteristics of the serum factor we have performed a systematic investigation of commonly used protein chromatography modes and separation techniques to develop a successful purification procedure. After four column chromatography steps -- cation exchange, hydrophobic interaction, heparin affinity and size exclusion chromatography under denaturing conditions -- we have achieved a 2,000-fold purification starting from a commercially available Crude Bovine Thrombin preparation. This represents about 40,000-fold purification over bovine serum. Silver stained gels of the most purified fractions revealed ten major protein bands. In order to finally identify the cell cycle re-entry factor, we are currently analyzing the purification by quantitative mass spectrometry by correlating the abundance of tryptic peptides with activity in sequential fractions across a chromatography run.

The purpose of this study was the investigation of several transport systems expressed at the BBB. The identification and functional characterization of such transport systems is essential to provide a basis for strategies to regulate drug disposition into the brain. Immortalized rat brain endothelial cells (RBE4 cells) have been used in this study as an in vitro model of the BBB. The present study has shown that the RBE4 cells are a suitable model of the BBB for transporter studies. These cells do express the amino acid transport systems L and y+, which are known to be present at the BBB. The uptake of L-tryptophan, a neutral amino acid transported by system L, exhibited a half saturation constant (Kt) of 31 µM and a maximal velocity rate (Vmax) of about 1 nmol/mg/min in RBE4 cells. The kinetic constants of the L-arginine uptake, representing system y+ transport activity, into RBE4 cells were determined with a Kt value of about 55 µM and a Vmax of 0.56 nmol/mg/min. Furthermore the expression of two sodium dependent transporters, the 5-HT transporter (SERT) and the organic cation/carnitine transporter OCTN2, was shown at the RBE4 cells. Uptake studies with radiolabeled 5-HT exhibited a saturable, sodium dependent transport at RBE4 cells with a Kt value of about 0.40 µM and a Vmax of about 52 fmol/mg/min. L-carnitine and TEA (tetraethylammonium) are known to be transported by the OCTN2 transporter. The uptake of L-carnitine into RBE4 cells was shown to be sodium dependent and saturable with a Kt value of 54 µM and a maximal velocity of about 3.6 pmol/mg/min. In contrast, the organic cation TEA follows a sodium independent uptake mechanism at RBE4 cells. Also a sodium independent choline uptake into the cells was discovered but the molecular identity remained unknown. This saturable choline transport exhibited a Kt value of about 22 µM and a maximal velocity of about 52 pmol/mg/min.

Die bakterielle Meningitis ist trotz der Anwendung modernster Antibiotika mit einer hohen Letalität und neurologischen Spätkomplikationen verbunden. Ein entscheidendes Ereignis ist dabei der Zusammenbruch der Blut-Hirn-Schranke (BHS). Die genauen Mechanismen, die zu ihrer Schädigung führen, sind bis heute unklar. In dieser Arbeit wurde untersucht, ob lebende Pneumokokken in einem Zellkulturmodell der BHS zu einer apoptotischen Zellschädigung von zerebralen Endothelzellen, als wichtigstem zellulären Bestandteil der BHS, führen und damit zu ihrer strukturellen Schädigung beitragen. Mittels verschiedener Detektionsmethoden (TUNEL, Fluoreszenzmikroskopie, Elektronenmikroskopie) konnte nachgewiesen werden, daß Streptococcus pneumoniae zu einem apoptotischen endothelialen Zelltod führt. Eine Beteiligung von Caspasen konnte weder mit direkter Aktivitätsmessung noch mittels Inhibitionsexperimenten oder dem Nachweis von Caspase-spezifischen Substraten gezeigt werden. Insgesamt sind die Morphologie der Zellkerne und die spezifische Degradation der endothelialen DNS hinweisend für einen Apoptosis-Inducing-Factor-vermittelten Zelltod ohne Caspasenbeteiligung. Diese Form des Zelltodes ist bereits in anderen Zellmodellen, bisher jedoch nicht bei zerebralen Endothelzellen beschrieben worden. Auf Seiten des Bakteriums konnten Wasserstoffperoxid und Pneumolysin als Auslöser der Apoptose identifiziert werden. Die zytotoxische Potenz des Pneumolysins ist dabei an dessen Poren-formende Aktivität gebunden. Die Ergebnisse sind von potentieller klinischer Relevanz, da es bei einer Bakteriämie und während der Invasion der Pneumokokken in das ZNS zu einem direkten Kontakt zwischen Bakterien und zerebralen Endothelzellen kommt und sich daraus eine Möglichkeit zur Entwicklung adjuvanter Therapien ergeben könnte. / Despite sufficient antibiotic treatment, pneumococcal meningitis has remained a disease associated with high mortality and neurological sequelae. The disruption of the blood brain barrier (BBB) is regarded a key event in the initial phase of pneumococcal meningitis. However, the exact molecular mechanisms involved in this process are still unknown. The aim of this study was to determine if living pneumococci are able to induce apoptosis in cerebral endothelial cells - the main cellular component of BBB - and therefore might contribute to its damage. Using several different detection methods (TUNEL, fluorescence and electron microscopy), induction of apoptotic cell death of endothelial cells by pneumococci could be verified. An accompanying activation of caspases was not detectable, despite the use of specific detection techniques such as inhibition experiments, direct enzyme measurements and detection of caspase-specific protein cleavage. These results as well as the specific nuclear morphology and degradation of endothelial DNA suggest an involvement of the mitochondrial protein Apoptosis inducing factor (AIF). This is the first time this specific form of apoptotic, AIF-driven cell death has been described to be engaged in endothelial cells. On the part of the bacterium, pneumolysin and hydrogen peroxide were identified as the two main inducers of apoptosis. The cytotoxic potency of pneumolysin is related to its pore-forming activity. These results are of clinical relevance since pneumococci are known to reside in close proximity to cerebral endothelial cells during bacteriemia and their entry into the CNS. These findings could contribute to the development of adjuvant treatment of bacterial meningitis.

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Neue aussichtsreiche Pharmazeutika scheitern regelmäßig in späten Entwicklungsphasen1 und stehen somit nicht als wertvolle Wirkstoffe zur Verfügung. Ein Grund hierfür ist die komplexe Pharmakinetik und der Mangel an geeigneten in-vitro Modellen. Daher befasst sich diese Dissertation mit der Entwicklung neuartiger in-vitro Membranmodelle am Beispiel der Blut-Hirn-Schranke (BHS). Zu diesem Zweck wird der aktuelle Stand der Technik vorgestellt und anschließend das Konzept eines Mikrofluidikchips, in welchem mittels Dielektrophorese an eine zuvor erstellte Polyamidmembran CaCo-2-Zellen assembliert wurden. Die Auslegung und Optimierung des Chip-Designs, die Entwicklung der in-situ Membran sowie die Ermittlung der Randbedingungen sind wesentliche Bestandteil dieser Arbeit. Es konnte mittels FEM-Simulationen und Assemblierungsversuchen ein Modell erzeugt werden, mit dem ein Chipdesign entwickelt werden konnte, dass zum einen ein günstigeres Verhältnis von Zellflächen- und Abluminalen Volumen aufweist und zum anderen möglichst wenig Zellen für den Aufbau benötigt. Dieses System bietet somit ein hohes Potenzial für die Herstellung verbesserter in-vitro Modelle. Jedoch konnte auch durch die Charakterisierung mit Rhodamin, Fluorescein und FITC-Dextran aufgezeigt werden, dass dieser Vorteil durch spezifische und unspezifische Bindungen an der größeren Oberfläche z.T. reduziert wird, abhängig vom verwendeten Chipmaterial und untersuchten Wirkstoff. Als neuartig kann die in-situ Herstellung einer vertikalen Polyamidmembran in einem Polymerchip bezeichnet werden, die im Rahmen dieser Arbeit entwickelt wurde. Für diese wurden die Parameter zur optimale Collagenbeschichtung für die Zelladhäsion ermittelt, sowie der Einfluss auf die Zellvitalität untersucht. Des Weiteren wurde das Medium zur Dielektrophorese und zur Kultivierung der Zellen ohne CO2-Begasung optimiert.:1 Abkürzungsverzeichnis 2 Formelzeichen 3 Einleitung 4 Grundlagen 5 Chipdesign 6 Herstellung und Charakterisierung der Stützmembran 7 Entwicklung des Zellkulturmodells 8 Zusammenfassung 9 Ausblick 10 Anhang 11 Literaturverzeichnis 12 Abbildungsverzeichnis / New promising pharmaceuticals regularly fail at late stages of development1 and thus do not become available as valuable active substances. Two of the main reasons for such failures are the complex pharmacokinetics and the lack of adequate in-vitro models. Therefore, this dissertation focuses on the development of novel in-vitro membrane models at the example of the blood-brain-barrier (BBB). It starts by presenting current investigations and the state-of-the-art technology and continues with the concept for a microfluidic chip in which CaCo-2 cells were assembled with dielectrophoresis on an in-situ membrane. The essential part of this work was to design and optimize this microfluidic chip, to develop an in-situ membrane to catch the assembled cells and to investigate the required boundary conditions. FEM simulations and assembling experiments conducted to the creation of a model to develop a chip design with a better ratio between cell area and abluminal volume, as well a low number of cells needed for the creation of this model. Such system might have a high potential to establish more sensitive in-vitro models than the current Transwell model. However, it was also demonstrated that this advantage is reduced by specific and nonspecific binding on the larger surface, depending on the chip material and the investigated test substance, shown during the chip characterization by using Rhodamine, Fluorescein and FITC-Dextran. Furthermore, the creation of a vertical polyamide in-situ membrane in a polymer chip like in this work, can be described as novel. To assemble cells on this supporting membrane, a protocol for a collagen coating as well for the dielectrophoresis medium were developed. Also, a modified culture medium was investigated, to allow the cultivation on standard atmospheric conditions.:1 Abkürzungsverzeichnis 2 Formelzeichen 3 Einleitung 4 Grundlagen 5 Chipdesign 6 Herstellung und Charakterisierung der Stützmembran 7 Entwicklung des Zellkulturmodells 8 Zusammenfassung 9 Ausblick 10 Anhang 11 Literaturverzeichnis 12 Abbildungsverzeichnis

Dendritic cells (DC) constitute a heterogeneous leukocyte population having in common a unique capacity to induce primary T cell responses and are therefore most attractive candidates for immunomodulatory strategies. Two populations of blood DC (CD11c+ CD123dim and CD11c– CD123high) have been defined so far. However, their direct isolation for experimental purposes is hampered by their low frequency and by the lack of selective markers allowing large scale purification from blood. Here we describe the monoclonal antibody (mAb) M-DC8, which was generated by immunizing mice with highly enriched blood DC. This mAb specifically reacts with 0.2–1% of blood leukocytes and enables their direct isolation by a one-step immunomagnetic procedure from fresh mononuclear cells. These cells can be differentiated from T cells, B cells, NK cells and monocytes using lineage-specific antibodies. M-DC8+ cells express HLA class II molecules, CD33 and low levels of the costimulatory molecules CD86 and CD40. Upon in vitro culture M-DC8+ cells spontaneously mature into cells with the phenotype of highly stimulatory cells as documented by the upregulation of HLA-DR, CD86 and CD40; in parallel CD80 expression is induced. M-DC8+ cells display an outstanding capacity to present antigen. In particular, they proved to be excellent stimulators of autologous mixed leukocyte reaction and to activate T cells against primary antigens such as keyhole limpet hemocyanin. Furthermore, they induce differentiation of purified allogeneic cytotoxic T cells into alloantigen-specific cytotoxic effector cells. While the phenotypical analysis reveals similarities with the two known blood DC populations, the characteristic expression of Fc=γRIII (CD16) and the M-DC8 antigen clearly defines them as a novel population of blood DC. The mAb M-DC8 might thus be a valuable tool to determine circulating DC for diagnostic purposes and to isolate these cells for studies of antigen-specific T cell priming. / Dieser Beitrag ist mit Zustimmung des Rechteinhabers aufgrund einer (DFG-geförderten) Allianz- bzw. Nationallizenz frei zugänglich.

Polymere Nanopartikel sind ein vielversprechender Ansatz für die Diagnose und Therapie von Krankheiten. Sie ermöglichen den Einsatz von schwerlöslichen oder instabilen Wirkstoffen. Ein weiterer Vorteil ist die Möglichkeit das Targetings, durch gezielte Modifikationen des Nanopartikels wird der Wirkstoff zum Zielort transportiert und kann dort in der gewünschten Form freigesetzt werden; dadurch könnten bei erhöhter Wirksamkeit die Nebenwirkungen von Medikamenten reduziert werden. Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung von physikalischen und biochemischen Eigenschaften von Nanopartikeln bestehend aus einem abbaustabilen Polystyren- Kern und einer biologisch abbaubaren Schale aus Polybutylcyanoacrylat. Es werden Methoden beschrieben, um die Größe, Struktur und den Abbau dieser Wirkstoffträger zu untersuchen. Die untersuchten Nanopartikel zeigen RAYLEIGH-Streuung, sowohl Größe als auch Abbau können durch Messung des Absorptionsspektrums bestimmt werden. Weiterhin konnten diese Eigenschaften mit Hilfe von dynamischer und statischer Lichtstreuung sowie Neutronenkleinwinkelstreuung untersucht werden. Bei letzterer Methode konnte gezeigt werden, dass die Schale größtenteils abgebaut werden kann, während der Kern intakt bleibt. In einem weiteren Teil der Arbeit wurde die Überwindung der Blut-Hirn-Schranke durch polymere Nanopartikel untersucht. Dabei wurde der fluoreszierende Thioflavine als Modellwirkstoffe eingesetzt. Das Durchdringen der Blut-Hirn-Schranke konnte nur mit Nanopartikeln erreicht werden, an deren Oberfläche ein Apolipoprotein E-Peptid gekoppelt war. Es konnte gezeigt werden, das die Nanopartikelschale im Gehirn abgebaut wird, der Wirkstoff freigesetzt wird und an Amyloid β, einem Marker der Alzheimer-Krankheit, bindet.

Einleitung: Mangan (Mn) ist ein essentielles Spurenelement, welches als integraler Bestandteil von Metalloenzymen oder als Kofaktor zahlreiche Stoffwechselprozesse katalysiert. Häufig wird der Versorgungsstatus von Pferden über eine Blutanalyse im Serum überprüft, obwohl wissenschaftlich belegte Referenzbereiche für Pferde bislang nicht etabliert wurden. Es liegen für Pferde kaum Untersuchungen vor, die Effekte einer Supplementierung bei definierter Mn-Aufnahme betrachtet haben. In der Literatur finden sich im Allgemeinen nur wenige Untersuchungen zu Mn bei Pferden. Ziel der Studie: Das Ziel dieser Untersuchung war die Etablierung von Mn-Referenzintervallen für adulte Warmblutpferde im Plasma, Serum und Vollblut sowie die Überprüfung von Effekten einer oralen Mn-Supplementierung mit unterschiedlichen Verbindungen (organisch vs. anorganisch) auf die Mn-Konzentrationen im Blut und in der Milch von Stuten und auf die Mn-Blutkonzentrationen von deren Saugfohlen. Tiere, Material und Methoden: Für die Referenzwerterhebung wurden von 270 gesunden, adulten Warmblutpferden im Alter von 3-25 Jahren einmalig Blutproben gewonnen, um im Lithium Heparin (LH)-Plasma, Serum und Vollblut die Mn-Konzentration mittels Atomabsorptionsspektrometrie (AAS) und Massenspektrometrie mit induktiv gekoppeltem Plasma (ICP-MS) zu analysieren. Zeitgleich entnommene Futterproben ermöglichten die Bestimmung des Mn-Gehaltes der korrespondierenden Fütterung. In eine 90-tägige, randomisierte, placebo-kontrollierte Supplementierungsphase wurden 33 laktierende Stuten und deren Saugfohlen einbezogen und in drei Fütterungsgruppen (Placebo n = 11, MnChelat n = 11, MnSulfat n = 11) eingeteilt. Zusätzlich zur Basisration (Heu ad libitum, Mischration: Mn-Aufnahme ca. 100 mg/kg Trockenmasse (TM)) erhielten die Stuten täglich 200 g eines Ergänzungsfutters entweder als Placebo oder mit 560 mg Mn als Mn-Sulfat oder Mn-Chelat zugesetzt. Blut- und Milchanalysen wurden mittels ICP-MS an 14-tägig gewonnenen Proben von Stuten und Fohlen durchgeführt. Die Daten wurden unter Verwendung der kommerziellen Software Statistica®, IBM SPSS Statistics 27 und XLSTAT statistisch ausgewertet. Die Referenzintervalle wurden nach den Empfehlungen des Clinical and Laboratory Standards Institute und der International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine berechnet, wonach sie den Bereich zwischen 2,5. und 97,5. Perzentil der analysierten Mn-Konzentrationen umfassen. Ein Methodenvergleich für die AAS und ICP-MS erfolgte mittels Passing-Bablok-Regression. Daten aus der Mn-Supplementierungsstudie wurden mittels des Shapiro-Wilks-Testes auf Normalverteilung überprüft. Die Daten waren nicht normalverteilt, sodass Tests für nicht-parametrische Daten angewendet wurden. Das Signifikanzniveau lag bei p < 0,05. Die Darstellung der Daten erfolgt als Median und dem 25./75. Perzentil. Ergebnisse: Die Mn-Aufnahme (587 – 1702 mg/Tag) war bei allen Pferden deutlich höher als die Mn-Versorgungsempfehlung von 485-545 mg/Tag. Die Pferde zeigten bei der Referenzwerterhebung im Vollblut mit medianen Mn-Konzentrationen von 12,4 µg/l (Interquartilsbereich: 9,10-16,1 µg/l) signifikant höhere Mn-Werte (p < 0,0001) als im korrespondierenden Serum (Median: 1,65 µg/l; Interquartilsbereich: 1,39-1,95 µg/l) oder LH-Plasma (Median: 1,35 µg/l; Interquartilsbereich: 1,01-1,71 µg/l). Diese Ergebnisse ließen sich auch durch die Supplementierungsstudie bestätigen. Die Stuten wiesen im Vollblut (Median: 15,6 µg/l; Interquartilsbereich: 12,8 - 18,5 µg/l) zehnfach höhere Mn-Konzentrationen als im Serum (Median: 1,54 µg/l; Interquartilsbereich: 1,20 - 1,90 µg/l) auf. Auch die Fohlen wiesen 16,4-fach höhere Mn-Konzentrationen im Vollblut (Median: 21,3 µg/l; Interquartilsbereich: 16,7 - 28,1 µg/l) im Vergleich zum Serum (Median: 1,50 µg/l; Interquartilsbereich: 1,30 - 1,70 µg/l) auf. Die Mn-Vollblutspiegel der Fohlen entsprachen der 1,6-fachen Mn-Konzentration ihrer Mutterstuten und unterschieden sich signifikant (p < 0,01). Die Milch enthielt mediane Mn-Konzentrationen von 0,012 mg/kg. Die Mn-Supplementierung hatte keinen Effekt auf die Mn-Spiegel in der Milch oder im Blut von Stuten und deren Fohlen. Im Methodenvergleich ergaben sich für LH-Plasma und Serum zwischen der AAS und der ICP-MS statistisch signifikante Abweichungen in den Mn-Bestimmungen, wohingegen beide Verfahren für das Vollblut vergleichbare Ergebnisse lieferten. Schlussfolgerung: Vollblut zeigt durchschnittlich 10-fach höhere Mn-Konzentrationen als Serum oder LH-Plasma. Bei der Bewertung von Mn-Konzentrationen im Blut muss daher beachtet werden, welches Probenmaterial analysiert wurde und welche Methode angewandt wird, da es zwischen AAS und ICP-MS in Serum und Plasma zu relevanten Unterschieden kommen kann. Die Mn-Supplementierung beeinflusste die Mn-Konzentrationen im Blut nicht. Darüber hinaus waren die Mn-Spiegel im Vollblut der Fohlen im Vergleich zu den Stuten höher, obwohl die Mn-Konzentrationen unabhängig von der Supplementierung in der Stutenmilch niedrig waren. Aufgrund des geringen Mn-Gehaltes in der Milch ist eine frühzeitige Mn-Ergänzung, vorzugsweise über Raufutter notwendig, um die Mn-Versorgung der Fohlen sicherzustellen. Die kalkulierte Mn-Aufnahme der Pferde in dieser Studie zeigt, dass aufgrund der hohen Mn-Gehalte im Raufutter ein Mn-Mangel in der Praxis selten vorkommt.:Inhaltsverzeichnis Seite 1 Einleitung 1 2 Literaturübersicht 2 2.1 Vorkommen und chemische Eigenschaften von Mangan 2 2.2 Manganstoffwechsel 3 2.2.1 Absorption und Verdaulichkeit 3 2.2.2 Transport im Blut 3 2.2.3 Retention und Speicherung 4 2.2.4 Exkretion 4 2.3 Funktionen von Mangan im Stoffwechsel 5 2.3.1 Modulation von oxidativem Stress 5 2.3.2 Kohlenhydratstoffwechsel 5 2.3.3 Fettstoffwechsel 6 2.3.4 Harnstoffsynthese 6 2.3.5 Fruchtbarkeit und Reproduktion 7 2.3.6 Knorpel- und Knochenstoffwechsel 7 2.4 Manganmangel 7 2.5 Toxizität von Mangan 8 2.6 Mangan in der Pferdefütterung 9 2.6.1 Manganbedarf von Pferden 9 2.6.2 Manganversorgung von Stute und Fohlen 10 2.6.3 Mangangehalte in pferdetypischen Futtermitteln 10 2.6.3.1 Native Mangangehalte in Futtermitteln 10 2.6.3.2 Rechtliche Grundlagen zur Manganergänzung 11 2.6.3.3 Manganverbindungen zur Ergänzung 12 2.7 Diagnostik der Manganversorgung 12 2.7.1 Referenzintervalle 12 2.7.2 Blut 13 2.7.2.1 Plasma und Serum 13 2.7.2.2 Vollblut 13 2.7.3 Haar 14 2.7.4 Leber und andere Gewebe 14 2.7.5 Mangan-abhängige Superoxid-Dismutase 15 3 Publikationen 16 3.1 Mangankonzentrationen im Vollblut, Plasma und Serum adulter Warmblutpferde an drei Standorten in Deutschland 16 3.2 Effekte einer oralen Mangan-Supplementierung mit unterschiedlichen Verbindungen auf die Mangan-Vollblut- und Serumkonzentrationen von Stuten und Saugfohlen 32 4 Diskussion 45 4.1 Manganreferenzintervalle im Blut und Supplementierungseffekte 45 4.2 Diagnostik in der Praxis 48 4.3 Schlussfolgerungen 49 5 Zusammenfassung 50 6 Summary 52 7 Literaturverzeichnis 54 8 Anhang 65 8.1 Liste der Kongressbeiträge im Rahmen dieser Arbeit 65 8.2 Sonstige Kongressbeitrage 65 9 Danksagung 66 / Introduction: Manganese (Mn) is an essential trace element that catalyzes numerous metabolic processes as an integral component of metalloenzymes or as a cofactor. The supply status of horses is often monitored by means of blood serum analysis, although scientifically proven reference ranges for horses have not yet been established. There are only limited studies available for horses that have examined the effects of supplementation with a defined Mn intake. In general, there are only few studies on Mn in horses in the literature. Aim of the study: The aim of this study was to establish Mn reference intervals for adult warm-blooded horses in plasma, serum and whole blood and to investigate the effects of oral Mn supplementation with different compounds (organic vs. inorganic) on the Mn concentrations in the blood and milk of mares and the Mn concentrations in the blood of their suckling foals. Animals, material and methods: For the reference value survey, blood samples were taken once from 270 healthy, adult warm-blooded horses aged 3-25 years in order to determine the Mn concentration in lithium heparin (LH) plasma, serum and whole blood by means of atomic absorption spectrometry (AAS) and inductively coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS). Accompanying feed samples were taken to confirm the Mn content of the corresponding feed. In a 90-day, randomized, placebo-controlled supplementation phase, 33 lactating mares and their suckling foals were included and divided into three feeding groups (placebo n = 11, MnChelat n = 11, MnSulfat n = 11). In addition to the routine ration (hay ad libitum, mixed ration: Mn intake approx. 100 mg / kg dry matter), the mares received 200 g of a supplementary feed daily either as a placebo or with 560 mg of Mn added as Mn sulfate or Mn chelate. Blood and milk analysis were performed using ICP-MS on samples taken from mares and foals biweekly. All data were statistically assessed with commercial software packages (Statistica®, IBM SPSS Statistics 27, XLSTAT). The reference intervals were calculated according to the recommendations of the Clinical and Laboratory Standards Institute and the International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine, according to which they range between 2.5. and 97.5. percentile of the analyzed Mn concentrations. A comparison of methods for AAS and ICP-MS was carried out using Passing-Bablok regression. Data from the Mn supplementation study were checked for normal distribution using the Shapiro-Wilks test. As the data were not normally distributed, tests for non-parametric data were subsequently used for analyses. Level of significance was set at p < 0.05. Data are presented as median and 25. /75. percentile. Results: In all horses Mn intake (587-1702 mg/day) was significantly higher than the current recommendations for Mn supply (485-545 mg/day). Analyses verified significantly (p < 0.0001) higher Mn whole-blood concentrations in horses (median 12.4 µg/L; interquartile range: 9.10-16.1 µg/L) than in the corresponding serum (median: 1.65 µg/L; interquartile range: 1.39-1.95 µg/L) or LH plasma (median: 1.35 µg/L; interquartile range: 1.01-1.71 µg/L). These results could also be confirmed by the supplementation study. The mares showed 10-fold Mn concentrations in whole blood (median: 15.6 µg/L; interquartile range: 12.8-18.5 µg/L) compared to the serum (median: 1.54 µg/L; interquartile range: 1, 20-1.90 µg/L). The foals also had Mn whole blood concentrations 16.4 times higher (median: 21.3 µg/L; interquartile range: 16.7-28.1 µg/L) compared to the serum Mn concentrations (median: 1.50 µg/L; interquartile range: 1.30-1.70 µg/L). Additionally, Mn whole blood levels of the foals corresponded to 1.6 times the Mn concentration of their dams and thus differed significantly (p < 0.01). The milk contained median Mn concentrations of 0.012 mg/kg. Mn supplementation had no effect on Mn levels in milk or blood of mares and their foals. A comparison of methods showed statistically significant deviations in the Mn determinations for LH plasma and serum between the AAS and the ICP-MS, whereas they provided comparable results for whole blood. Conclusion: Whole blood shows an average of 10 times higher Mn concentrations than serum or LH plasma. When evaluating Mn concentrations, it must therefore be taken into consideration which sample material is analyzed and which method is used, as relevant differences were found between AAS and ICP-MS in serum and plasma. Blood Mn concentrations were not affected by the Mn supplementation. However, the Mn levels differed significantly between serum and whole blood. In addition, the Mn concentrations in whole blood of suckling foals were higher compared to their dams, although the Mn concentrations in the mare's milk were low regardless of the supplementation. Due to low Mn content in milk, early Mn supplementation, preferably by forages, is necessary to ensure that foals are supplied with Mn according to their requirement. The calculated Mn intake of the horses in this study shows that due to the high Mn content in roughage, Mn deficiency rarely occurs in practice.:Inhaltsverzeichnis Seite 1 Einleitung 1 2 Literaturübersicht 2 2.1 Vorkommen und chemische Eigenschaften von Mangan 2 2.2 Manganstoffwechsel 3 2.2.1 Absorption und Verdaulichkeit 3 2.2.2 Transport im Blut 3 2.2.3 Retention und Speicherung 4 2.2.4 Exkretion 4 2.3 Funktionen von Mangan im Stoffwechsel 5 2.3.1 Modulation von oxidativem Stress 5 2.3.2 Kohlenhydratstoffwechsel 5 2.3.3 Fettstoffwechsel 6 2.3.4 Harnstoffsynthese 6 2.3.5 Fruchtbarkeit und Reproduktion 7 2.3.6 Knorpel- und Knochenstoffwechsel 7 2.4 Manganmangel 7 2.5 Toxizität von Mangan 8 2.6 Mangan in der Pferdefütterung 9 2.6.1 Manganbedarf von Pferden 9 2.6.2 Manganversorgung von Stute und Fohlen 10 2.6.3 Mangangehalte in pferdetypischen Futtermitteln 10 2.6.3.1 Native Mangangehalte in Futtermitteln 10 2.6.3.2 Rechtliche Grundlagen zur Manganergänzung 11 2.6.3.3 Manganverbindungen zur Ergänzung 12 2.7 Diagnostik der Manganversorgung 12 2.7.1 Referenzintervalle 12 2.7.2 Blut 13 2.7.2.1 Plasma und Serum 13 2.7.2.2 Vollblut 13 2.7.3 Haar 14 2.7.4 Leber und andere Gewebe 14 2.7.5 Mangan-abhängige Superoxid-Dismutase 15 3 Publikationen 16 3.1 Mangankonzentrationen im Vollblut, Plasma und Serum adulter Warmblutpferde an drei Standorten in Deutschland 16 3.2 Effekte einer oralen Mangan-Supplementierung mit unterschiedlichen Verbindungen auf die Mangan-Vollblut- und Serumkonzentrationen von Stuten und Saugfohlen 32 4 Diskussion 45 4.1 Manganreferenzintervalle im Blut und Supplementierungseffekte 45 4.2 Diagnostik in der Praxis 48 4.3 Schlussfolgerungen 49 5 Zusammenfassung 50 6 Summary 52 7 Literaturverzeichnis 54 8 Anhang 65 8.1 Liste der Kongressbeiträge im Rahmen dieser Arbeit 65 8.2 Sonstige Kongressbeitrage 65 9 Danksagung 66

The steroid module of the Athlete Biological Passport (ABP) is based on the analysis of six endogenous steroids in urine samples and a Bayesian statistical approach. However, the urinary steroid concentrations may be affected by confounders like microbial degradation, possible co-administration of diuretics as masking agents, insufficient conjugate hydrolysis or UGT2B17 gene polymorphisms affecting glucuronidation. Therefore, it can be helpful to use other matrices (ABP blood and serum samples) to quantify steroids and thereby support noticeable deviations in the Athlete Biological Passport, for example, abnormally increased urinary testosterone/epitestosterone (T/E) ratios. Aim of the study was to investigate the feasibility to re-use plasma obtained from athlete ABP blood samples for measuring a steroid profile. Therefore, testosterone, androstenedione, cortisol and cortisone were quantified in 36 intra-individual matching ABP blood and serum samples. The steroid levels measured in both matrices showed a high agreement indicating a good stability uninfluenced by storage temperature and duration. Our results pointed out the possibility to expand the athlete ABP blood analysis for steroid profiling.