Doctor of Philosophy / Department of Diagnostic Medicine/Pathobiology / Robert L. Larson / Brad J. White / The diagnosis and prevention of bovine respiratory disease (BRD) is challenging due to the multifactorial nature of the disease. Mannheimia haemolytica, Pasteurella multocida, and Histophilus somni are gram negative bacteria that are commonly considered three of the most important bacterial agents involved in the etiology of BRD; all three are also commensals in the upper respiratory tracts of healthy cattle. However, despite decades of study, questions still remain regarding the transmission dynamics and characterization of these bacteria, the ability of diagnostic sampling methods to accurately portray the causative bacteria, and ways to mitigate the effects of risk factors for BRD such as long-distance transportation. Through our research, we have demonstrated how variable the culture results of a single nasopharyngeal swab can be and the challenges of using an individual culture to truly represent animal M. haemolytica status. Additionally, comparison of the diagnostic performance of two antemortem sampling methods, nasopharyngeal swabs (NPS) and bronchoalveolar lavages (BAL), revealed high agreement, high negative predictive values of NPS for the presence of M. haemolytica, P. multocida, and H. somni in the lungs, and the potential for different susceptibility profiles from paired NPS and BAL samples. As agreement and predictive values can vary with disease prevalence, interpretation of diagnostic test results should be done carefully and with due consideration of the sample population in which the test is being applied. An investigation into cattle behavior following a relatively innocuous handling procedure indicated that some behaviors are altered after handling and restraint in a squeeze chute. Additionally, we demonstrated that cattle with different temperament scores may have different activity levels and spend different amounts of time within 1 m of the hay bunk, grain bunk, waterer, and shed after handling. Consequently, there is also the potential to improve upon disease detection algorithms by incorporating behavioral changes that may occur after handling events and the need for careful trial design when behavioral parameters are a trial outcome. Additionally, this study indicated that some behaviors may vary for calves that react differently when handled, which also has potential implications when behavior is considered a variable of interest. Examination of the potential for 1 mg/kg oral meloxicam administered pre-transport to mitigate the effects of long-distance transportation revealed that meloxicam did not have a statistically significant effect on the maintenance of leukocyte function or the reduction of inflammation during or after long-distance transportation in healthy steers. Finally, a report on two separate experiments regarding the effects of 1 mg/kg oral meloxicam administered pre-transport on the movement, feeding, and drinking behaviors and performance of transported and non-transported calves demonstrated that there was a significant day effect on behaviors in transported calves but meloxicam did not affect behavior or performance. However, meloxicam did modify the effect of day on daily distance traveled in non-transported calves but there were no significant within-day comparisons between non-transported meloxicam and non-transported control calves. These results do not provide evidence for the benefit of administering a single dose of 1 mg/kg oral meloxicam prior to long-distance transportation.

Mastitis represents a major issue within the dairy industry responsible for economic loss via decreased animal productivity and associated veterinary costs. Currently, there is a push to identify a phenotypic innate immune response that will yield dairy cows with an enhanced resistance to mastitis. Bovine dermal fibroblasts were used as a cell model to measure the response of individuals to Gram-negative bacterial stimuli through the TLR4 signaling pathway. Fibroblast cultures were isolated from 15 dairy heifers at 5, 11, and 16 months of age in order to determine the variability in responsiveness to LPS as well as to monitor the development of the innate immune response in calves. These individuals displayed a large range in response to LPS as measured by IL-8 production. In addition, response within individuals increased dramatically with age. To determine the cause behind this, DNA methylation was investigated as a potential player in the variation in response described both within an individual over time as well as across individuals. Fibroblast exposure to 5-aza-2'-deoxycytidine, a DNA demethylating agent, increased the cellular response to LPS, but more so in cultures that had previously displayed low responding phenotypes. This suggested that DNA methylation acted as an inhibitor of the innate immune response, and may be responsible for some degree of the variation seen in the LPS response. To determine the effect of epigenetic factors on this response, microarray analysis was conducted on RNA isolated from cells either having been epigenetically modified (DNA demethylation and histone hyperacetylation) or without undergoing any epigenetic treatment. This analysis identified 1,758 genes with altered expression due to epigenetic modification. To focus on DNA methylation's role, methylated CpG island recovery assay (MIRA-Seq) libraries were created from fibroblasts to investigate differential methylation from a group of the same individuals sampled at 5 and 16 months of age. In addition, transcriptomic data were generated by RNA-Seq from fibroblasts collected from the young and older samples and exposed to LPS for 0, 2, and 8 hours to characterize age-associated changes in the innate immune response. Cultures from older animals were much more responsive to LPS as indicated by greater expression of IL-8, IL-6, TNF-α, and CCL20 at various times in response to LPS. TLR4 and CD14 were more highly expressed in older cultures, suggesting these fibroblasts are more able to detect the presence of LPS. Analysis of the bovine fibroblast methylome revealed methylation with remarkable stability except for 20 regions along the genome undergoing major shifts due to age. Similar data were collected from fibroblasts isolated from different individuals displaying either a low or high responding phenotype resulting in 843 regions with differential methylation between groups. This suggests that DNA methylation may be playing a role in both the age-dependent and between animal differential responses to LPS, and also gives the first in depth look at the bovine fibroblast methylome and its stability over time.

La mammite bovine est une inflammation de la glande mammaire causée par un traumatisme ou par une infection. Au Canada, l’agent pathogène le plus souvent retrouvé dans les cas de mammites bovines est Staphylococcus aureus (S. aureus). Cet agent pathogène peut causer des mammites cliniques avec des symptômes graves et apparents, mais il peut aussi provoquer des mammites sous-cliniques ne présentant aucun symptôme. Cette infection engendre des pertes économiques importantes dans le secteur de la production laitière, principalement par le retrait du lait lors d’infection clinique et lorsqu’un antibiotique est utilisé. Il est ainsi important d’apporter de nouveaux outils aux producteurs laitiers pour contrer la mammite bovine. Prédire les symptômes associés à la mammite bovine causée par S. aureus pourrait améliorer la gestion des mammites en identifiant rapidement les souches problématiques. Pour ce faire, une caractérisation génotypique et phénotypique de 587 souches de S. aureus isolées dans l’ensemble du Canada a été effectuée dans le but de prédire l’apparition de symptômes cliniques et la durée de l’infection. Les séries d’isolats provenant du même quartier suivi sur une longue période de temps avec la manifestation d’au moins une mammite clinique ont été comparées aux isolats de séries sans aucune mammite clinique. Cette comparaison a été effectuée dans le but de différencier les deux types d’infection selon les caractéristiques de la souche de S. aureus impliqués. Les facteurs comparés sont la présence de gènes de virulence (seg, lukM et tst), la formation de biofilm in vitro et l’origine clonale des souches de S. aureus selon le typage spa. Des différences significatives ont été trouvées dans la distribution des types spa (p=0,018) et la présence du gène lukM (p=0,009) entre les souches causant des mammites cliniques ou sous-cliniques. Une régression logistique, qui prend en compte tous les facteurs de la comparaison, a été effectuée. Cela a permis de faire l’importante observation qu’à chaque log additionnel de biofilm, les chances d’avoir des signes cliniques augmentent de 97% (p=0,05). Pour déterminer quels facteurs influençaient la durée de l’infection, chaque facteur a été utilisé individuellement dans des tests d’analyse de survie. Aucun facteur n’est ressorti significatif dans ces tests lorsque pris individuellement, mais lorsque tous les facteurs sont pris en compte dans une régression logistique, quelques différences peuvent être observées. Nous avons déterminé que les types spa t529 et t359 ont respectivement 3,5 à 4,5 fois plus de chance de se faire éliminer en comparaison au type spa t13401 (p = 0,047 et 0,019). De nombreux facteurs ont été corrélés avec les types spa, tels que la possession de seg par t529 et la formation de biofilm variable selon le type spa. Ces résultats tendent à montrer qu’un outil de prédiction pourrait être développé avec une caractérisation plus poussée des types spa. L’outil de prédiction pourra alors permettre une meilleure gestion des cas de mammite bovine causés par S. aureus.

Master of Science / Department of Clinical Sciences / Matt Miesner / Minimal research is available pertaining to the suspected acute cardiac injury of cattle experiencing the early signs of respiratory disease. One of the limitations of cardiac disease diagnosis in cattle is the lack of accurate measurement of cardiac disease. Blood biomoarkers such as cardiac troponin I could be used. Cardiac troponin I is a serum biomarker for cardiac injury in humans and many veterinary species. The goal of this thesis is to evaluate biophysical changes including cardiac injury that holstien calves experience during acute pneumonia. The first objective of this research was to evaluate a point of care cardiac troponin I assay for use in the bovine. Purified bovine cardiac troponin I was used to validate the accuracy of the assay over a wide range of concentrations in an in vitro experiment. This point of care assay was capable of accurately identifying bovine cardiac troponin I. An in vivo experiment was conducted to evaluate concentrations of cardiac troponin I in healthy Holstein calves. Concentrations evaluated with the point of care assay were similar to concentrations of a previously validated immunoassay. The second objective was to evaluate biophysical changes including serum biochemistry, complete blood count, cardiac troponin I, and high resolution digital thermography in Holstein calves during the first fourteen days after induction of pneumonia. Fibrinogen concentration increased with lung disease severity. The changes observed were considered clinically significant. Cardiac troponin I increased as pneumonia progressed during the study in this population.

Durante o cultivo in vitro, as células são submetidas a uma série de estímulos estressores e em geral, a heterogeneidade da resposta a estes estímulos não é levada em consideração. O presente estudo foi baseado em um modelo fatorial (2x2x3) criado para avaliar como embriões com cinética de desenvolvimento distinta respondem à combinação de estresse ambiental e metabólico durante o cultivo in vitro. Para isso, embriões rápidos (4 ou mais células às 22 horas de cultura) e Lentos (2 ou 3 células) foram produzidos in vitro, cultivados em 20% ou 5% O2 e também em suplementações de glicose distintas (0.6, 2 e 5mM), resultando em 12 grupos de estudo. Os embriões em estágio de blastocisto foram avaliados em 95 caracteres, incluindo 82 genes, 7 evidências bioquímicas (consumo de glicose, glutamato e piruvato; produção de lactato e ATP), geração de espécies reativas de oxigênio (EROs), atividade mitocondrial e, finalmente, o conteúdo lipídico. Os dados foram normalizados e reunidos em uma matriz que foi analisada em parcimônia, com 500 repetições e Tree-Bissection Reconection como algoritmo (software TNT) em busca de comportamentos semelhantes entre os grupos. Todos os caracteres foram aditivos e igualmente ponderados. Esta análise resultou em uma única árvore ideal, totalmente resolvida. Os resultados mostram os grupos dispostos em dois arranjos principais de acordo com a tensão de oxigênio, exceto os grupos de embriões lentos cultivados em um ambiente de alta glicose (5mM). Num segundo momento, cada um dos grupos pertencentes aos primeiros arranjos foi novamente analisado. A 5% O2 (mais semelhante ao encontrado no útero), os embriões se agruparam de acordo com a cinética de desenvolvimento, independentemente da concentração de glicose no meio de cultura. Nesta condição, embriões rápidos foram mais capazes de atingir o estágio de blastocisto sem sobrecarregar o Metabolismo. Já a 20% O2, a suplementação de glicose foi mais importante para o agrupamento. Em um ambiente de alta glicose, em especial os embriões lentos, apresentaram metabolismo alterado e bloqueio de desenvolvimento. No entanto, embriões cultivados em baixas concentrações de glicose foram mais capazes de ativar mecanismos adaptativos e superar as injúrias causadas pelo estresse. A plasticidade embrionária é uma característica única e com esse trabalho conseguimos demonstrar como o 13 metabolismo se modula para ajudar os embriões a enfrentar condições estressantes enquanto tentam sobreviver a qualquer custo. / During in vitro culture cells are submitted to many stressful stimuli, however, the heterogeneity of the response to those stimuli is usually not considered. This study was based on a factorial experimental design (2x2x3) created to evaluate how embryos with distinct developmental kinetics respond to the combination of environmental and metabolic stress during in vitro culture. For this purpose, Fast (4 or more cells at 22 hours of culture) and Slow embryos (2-3 cells) were produced in vitro using standard protocols, cultured in 20% or 5% O2 and also in distinct glucose concentrations (0, 2 and 5mM), resulting in 12 groups. Blastocysts were evaluated for 95 characters including 82 genes, 7 biochemical evidences: consumption of glucose, glutamate and pyruvate; production of lactate and ATP; generation of reactive oxygen species (ROS), mitochondrial activity and finally the lipid content. Data were normalized and gathered in a matrix that was analyzed under parsimony, with 500 replicates and Tree-Bissection Reconection as the swapping algorithm (TNT software), searching for similar behaviors. All characters were additive and equally weighted. This analysis resulted in a single optimal tree, fully resolved. Results show the groups arranging in two main clusters according to oxygen tension regardless of developmental kinetics and glucose, except the groups of slow embryos cultured in a high glucose environment (5mM). Each cluster was separately analyzed and at 5% of oxygen (more similar to what is found in the uterus), embryos clustered according to developmental kinetics and independently of glucose concentration in culture media. On that condition, embryos with a faster kinetics were more capable of reaching blastocyst stage without overloading the metabolism. At 20% of oxygen, glucose supplementation seems to be more important for the clustering. In a high glucose environment embryos, in special de slow ones, show altered metabolism and block. However embryos cultured in lower glucose concentrations are more capable of activating adaptive mechanisms and overcome stress injuries. The embryonic plasticity is a unique feature and with this work we were able to demonstrate how metabolism modulates to help the embryos face stressful conditions while trying to survive at any cost.

O momento das primeiras divisões celulares pode predizer o potencial de desenvolvimento de um embrião, incluindo sua capacidade de estabelecer prenhez. Além de diferenças relacionadas ao metabolismo, estresse e sobrevivência, embriões com diferentes velocidades de desenvolvimento apresentam padrões transcricionais distintos, principalmente relacionados ao metabolismo energético e lipídico. Como o padrão transcricional é regulado por fatores epigenéticos este estudo visou caracterizar os mecanismos epigenéticos envolvidos neste fenótipo. Para isto, embriões bovinos foram produzidos in vitro utilizando sêmen sexado (fêmeas) e as 40 horas pós inseminação (hpi) foram classificados como Rápidos (4 ou mais células) ou Lentos (2 ou 3 células), permanecendo em cultivo até o estágio de blastocisto (168 hpi) (Capítulo 1) ou sendo avaliados com 40 hpi, 96 hpi ou 168 hpi (Capítulo 2). No capítulo 1, a análise da metilação global do genoma pelo sistema EmbryoGENE Methylation DNA Array (EDMA) identificou 11.584 regiões diferencialmente metiladas (DMRs) (7.976 regiões hipermetiladas em blastocistos derivados do grupo de clivagem rápida FBL - e 3.608 regiões hipermetiladas em blastocistos derivados de embriões de clivagem lenta - SBL). Os FBL apresentaram mais regiões classificadas como hipermetiladas, distribuídas ao longo do genoma, como nos íntrons, exons, promotores e elementos de repetição, enquanto em SBL, as regiões hipermetiladas estavam mais presentes nas ilhas CpG. As DMRs foram agrupadas em relação aos processos biológicos a que estavam envolvidas, e algumas das vias mais afetadas foram relacionadas à sobrevivência/diferenciação celular e metabolismo energético/lipídico. Os perfis dos transcritos dos genes diferencialmente metilados (DMs) relacionados com estas vias também foram avaliados, e a maior parte revelou mudanças na quantificação relativa. No capítulo 2, foi avaliada ao longo do desenvolvimento a presença de metilações e hidroximetilações do DNA e modificações pós-traducionais de histonas (acetilação e trimetilação da lisina 9 da histona 3 e trimetilação da lisina 27 da histona 3 H3K9ac, H3K9me3 e H3K27me3, respectivamente). A cinética das primeiras clivagens influenciou a maioria das modificações epigenéticas estudadas desde os estágios iniciais até o blastocisto (exceto pela hidroximetilação do DNA e H3K27me3). A análise dos transcritos relacionados a inclusão ou remoção dessas modificações corroborou o padrão de modificações encontrado. É possível concluir que a cinética das primeiras clivagens apresenta relação com modificações epigenéticas nos embriões e que se manterão até o final do desenvolvimento pré-implantacional, resultando em blastocistos de padrão transcricional e metabólico distintos, podendo influenciar na viabilidade embrionária. / The timing of the first cell divisions may predict the developmental potential of an embryo, including its ability to establish pregnancy. Besides differences related to metabolism, stress, and survival, embryos with different speeds of development present distinct patterns of gene expression, mainly related to energy and lipid metabolism. As gene expression is regulated by epigenetic factors, and that includes DNA methylation patterns, in this study we compared the global DNA methylation profile of embryos with different kinetics of development in order to identify general pathways and regions that are most influenced by this phenotype. For this, bovine embryos were produced in vitro using sexed semen (females) and the 40 hours post insemination (hpi) were classified as Fast (4 or more cells) or Slow (2 or 3 cells), remaining in culture until the blastocyst stage (168 hpi) (Chapter 1) or evaluated at 40 hpi, 96 hpi or 168 hpi (Chapter 2). In Chapter 1, the analysis of global DNA methylation by EmbryoGENE DNA Methylation Array (EDMA) identified 11,584 differentially methylated regions (DMRs) (7,976 regions hypermethylated in blastocysts derived from the fast cleavage group -FBL- and 3,608 hypermethylated regions in blastocyst derived from the slow cleavage group -SBL). FBL presented more regions classified as hypermethylated, distributed throughout the genome, as in introns, exons, promoters and repeating elements, whereas in SBL, hypermethylated regions were more present in the CpG islands. DMRs were grouped in relation to the biological processes to which they were involved, and some of the most affected pathways were related to cell survival/differentiation and energy/lipid metabolism. Profiles of transcripts of differentially methylated (DMs) genes related to these pathways were also evaluated, and most presented changes in relative quantification. In Chapter 2, the presence of DNA methylations and hydroxymethylations and post-translational histone modifications (histone 3 lysine 9 acetylation and trimethylation and histone 3 lysine 27 trimethylation - H3K9ac, H3K9me3 and H3K27me3, respectively). The kinetics of the first cleavages influenced most of the epigenetic modifications studied from the initial stages to the blastocyst (except DNA hydroxymethylations and H3K27me3). The analysis of the transcripts related to insertion or removal of these modifications corroborated the pattern of modifications. It is possible to conclude that the kinetics of the first cleavages is related with epigenetic modifications in embryos that will be maintained through the pre-implantation development, resulting in blastocysts with different transcriptional and metabolic patterns, which might influence the embryonic viability.

A degeneração testicular é a mais frequente afecção reprodutiva em machos e leva a queda da qualidade espermática e, consequentemente, da fertilidade. Uma das principais causas é o estresse térmico, sendo caracterizada pelo aumento na produção de espécies reativas ao oxigênio, assim, substâncias antioxidantes podem reduzir os impactos negativos ao sêmen desses animais. A melatonina tem alto fator antioxidante, além de atuar na proteção ao DNA espermático e na regulação da apoptose. O presente estudo teve por objetivo avaliar os efeitos do tratamento exógeno com melatonina de longa ação sobre a recuperação do quadro de degeneração testicular em touros da raça Nelore. Para tal, foram realizados dois experimentos. O experimento 1 foi realizado para definir a dose exógena de melatonina (diluída em veículo oleoso e administrada por via intramuscular) que provocaria aumento por tempo prolongado na concentração sérica da mesma em bovinos. Foram utilizadas nove vacas ovariectomizadas distribuídas em três grupos: Controle (somente veículo oleoso); Melatonina 18 mg/50 kg de peso vivo; e Melatonina 27 mg/50 kg de peso vivo. Foram colhidas amostras de sangue no dia da aplicação e 4, 8, 16 e 24 dias após. A concentração de melatonina foi dosada pela técnica de ELISA. Os dados foram analisados utilizando o software Statistical Analysis System (SAS), pela ANOVA, adicionando-se o fator medidas repetidas no tempo. As probabilidades de interações ao longo do tempo foram determinadas pelo comando RANDOM (PROC GLIMMIX do SAS), com nível de significância de 5%. A aplicação de melatonina intramuscular diluída em veículo oleoso, na concentração de 18 mg/50 kg de peso vivo, provocou aumento estável por oito dias na concentração sérica de melatonina em bovinos. No experimento 2 foi avaliado o tratamento com melatonina sobre a degeneração testicular em touros, utilizando a dose estabelecida no experimento 1. A degeneração testicular foi induzida pela colocação de bolsas insuladoras testiculares por 96 horas. Foram utilizados 22 touros da raça Nelore distribuídos em 4 grupos: CON - touros não induzidos à degeneração testicular e não tratados (n=5); DT - touros induzidos à degeneração testicular e não tratados (n=6); ME - touros não induzidos à degeneração testicular e tratados com melatonina exógena (n=5); e DTME - touros induzidos à degeneração testicular e tratados com melatonina exógena (n=6). Foram realizadas colheitas de sêmen e sangue semanalmente, iniciando-se duas semanas antes da colocação das bolsas testiculares; no dia da retirada; e por mais 11 semanas após. Foram analisadas as características clínicas, tais como perímetro escrotal, consistência testicular, homogeneidade testicular (presença de pontos hipercóicos) e hemodinâmica do parênquima e plexo pampiniforme e índice de resistência vascular. As características seminais avaliadas foram volume, concentração, motilidade e vigor subjetivos, análise computadorizada dos espermatozoides, membranas plasmática, acrossomal e mitocondrial, morfologia espermática, peroxidação lipídica e bioquímica do sêmen. O plasma sanguíneo foi utilizado para avaliar a peroxidação lipídica e componentes bioquímicos (proteína total, albumina, GGT, AST, ALT, creatina quinase, triglicérides, colesterol, HDL, BHB e NEFA). Os dados foram analisados utilizando o software SAS, pela ANOVA, adicionando-se o fator medidas repetidas no tempo. As probabilidades de interações ao longo do tempo foram determinadas pelo comando RANDOM (PROC GLIMMIX do SAS), com nível de significância de 5%. A insulação provocou queda na consistência testicular, motilidade, integridade das membranas plasmática e acrossomal e no potencial de membrana mitocondrial, bem como aumentou os defeitos espermáticos e a peroxidação lipídica. O tratamento com melatonina não mostrou influência sobre as características clínicas; contudo, apresentou melhora no vigor (p=0.05), na motilidade total (p=0.05) e no potencial mitocondrial (p=0.003) 15 dias após a aplicação da melatonina. Além disso, a melatonina diminuiu os valores de HDL, colesterol e BHB. O tratamento da degeneração testicular em touros (28 dias após a insulação) utilizando melatonina exógena em veículo de liberação lenta, na dose de 18 mg/kg, é eficiente em melhorar características de vigor, motilidade e potencial mitocondrial espermático. / Testicular degeneration is the most frequent reproductive affection in males and leads to a decrease in sperm quality and, consequently, fertility. One of the main causes is heat stress, being characterized by the increase in the production of reactive oxygen species, thus, antioxidant substances can reduce the negative impacts to the semen of these animals. Melatonin has a high antioxidant factor, besides acting in the protection of sperm DNA and in the regulation of apoptosis. The present study aimed to evaluate the effects of exogenous treatment with long acting melatonin on the recovery of testicular degeneration in Nellore bulls. Therefore, two experiments were conducted. Experiment 1 was performed to define the exogenous dose of melatonin (diluted in oily vehicle and administered intramuscularly) which would cause a prolonged increase in serum concentration of melatonin in cattle. Nine ovariectomized cows were divided into three groups: Control (only oily vehicle); Melatonin 18 mg/50 kg of body weight; and Melatonin 27 mg/50 kg of body weight. Blood samples were collected on the day of application and at 4, 8, 16 and 24 days after administration. The melatonin concentration was measured by ELISA. The data were analyzed using the Statistical Analysis System (SAS) software, by ANOVA, adding the factor repeated measures in time. The probabilities of interactions over time were determined by the RANDOM command (PROC GLIMMIX from SAS), with a significance level of 5%. The application of intramuscular melatonin, diluted in oily vehicle at the concentration of 18 mg/50 kg of live weight, caused stable increase for eight days in the serum concentration of melatonin in cattle. In experiment 2 was evaluated melatonin treatment on testicular degeneration in bulls, using that dose assessed in the experiment 1. Testicular degeneration was induced by the placement of testicular insulation bags for 96 hours. Twenty two Nelore bulls were distributed in 4 groups: CON - bulls not induced to testicular degeneration and untreated (n = 5); DT - bulls induced to testicular degeneration and untreated (n = 6); ME - bulls not induced to testicular degeneration and treated with exogenous melatonin (n = 5); and DTME - bulls induced to testicular degeneration and treated with exogenous melatonin (n = 6). Semen and blood samples were collected weekly, starting two weeks before the placement of testicular bags; on the day of removal; and for another 11 weeks thereafter. Clinical characteristics such as scrotal perimeter, testicular consistency, testicular homogeneity (presence of hypercoic points) and parenchyma and pampiniform plexus hemodynamics and the vascular resistance index were analyzed. The seminal characteristics evaluated were subjective volume, concentration, motility and vigor, computerized analysis of spermatozoa, plasma, acrosomal and mitochondrial membranes, sperm morphology, lipid peroxidation and biochemistry of semen. Blood plasma was used to evaluate lipid peroxidation and biochemical components (total protein, albumin, GGT, AST, ALT, creatine kinase (CK), triglycerides, cholesterol, HDL, BHB and NEFA). Data were analyzed using the SAS software by ANOVA, adding the factor repeated measures in time. The probabilities of interactions over time were determined by the RANDOM command (PROC GLIMMIX from SAS), with a significance level of 5%. Insulation caused reduction on testicular consistence, motility, integrity of plasma membranes, integrity of acrosome, mitochondrial potential, as well as increased sperm defects and lipid peroxidation. Treatment with melatonin showed no influence on clinical characteristics, however, showed improvement in vigor (p = 0.05), total motility (p = 0.05) and mitochondrial potential (p = 0.003) 15 days after melatonin application. Besides that, melatonin decreased HDL, cholesterol and BHB values. The treatment of testicular degeneration in bulls (28 days after insulation) using exogenous melatonin in a slow-release vehicle, at a dose of 18 mg/kg, is efficient in improving sperm characteristics of vigor, motility and mitochondrial potential.

The progesterone (P4) produced by the corpus luteum (CL) is essential for maintenance of pregnancy. On the other hand, the interferon tau (IFNT) produced by the embryo during elongation process, besides being the primary signal for recognition, also is responsible for maintenance of the CL during early pregnancy. The presence of oxytocin receptors (OXTR) in endometrium during expected time of luteolysis is determinant for trigger the uterine release of prostaglandin F2∝ (PGF), which is in charge of CL regression. The IFNT avoid the luteolysis by suppressing the OXTR appearance. However, during second month, accessory CLs are able to regress, indicating that the PGF release occurs with the advancing of the pregnancy and the mechanisms that initiated luteolysis are recovered. Therefore, failures in maintenance of the CL can cause luteolysis and pregnancy loss during this period of 30 to 60 days, which is one of the most important problems in reproductive efficiency in cattle, specially when in vitro produced (IVP) embryos are transferred. Two experiments were designed to study this factors, focused on point when uterus recover its PGF release during pregnancy and to identify possible differences between those mechanisms on pregnancies from IVP or artificial insemination (AI) embryos. The first study evaluated circulating PGF metabolite (PGFM) after an oxytocin challenge throughout first two months of pregnancy in lactating Holstein cows. Treatment with oxytocin did not affected PGFM concentration in d11 pregnant (P) and non-pregnant (NP), on d18 had a little increase in P cows, while increased 2-fold in NP cows. Oxytocin-induced PGFM in P cows on day 25 was greater than d18 P, however was lower than P cows on d53 and d60. Days 32, 39 and 46 of pregnancy had intermediate response. The second study evaluated the oxytocin-induced PGFM in Nelore cows pregnant from AI or IVP embryos on days 17 and 31, and its association with factors that can impact in success of the pregnancy, such as P4 levels, conceptus length on d18 and size of the embryo on d32. Also, OXTR and interferon-stimulated gene 15 (ISG15) gene expression were evaluated and located in uterine endometrium. Embryo size on d32 and P4 on d31, were higher in AI than IVP. Cows from IVP on d17 presented lower oxytocin-induced PGFM than AI in the same day, however, d31 for both groups had higher PGF release after oxytocin. On d31 there was similar PGFM increase in synchronized non-inseminated group (NI). The OXTR are highly suppressed on pregnant cows on d18, especially in IVP group, but were high expressed in NI cows and on d32 for both groups, AI being higher than IVP at this day. The ISG15 had irrelevant expression on NI and d32 groups, while had extremely high expression in d18 pregnant cows for both groups. Concluding, the CL in early pregnancy is maintained by PGF release suppression, while during second month there is oxytocin-induced PGF release, suggesting that other mechanisms are responsible for maintaining CL after d25. In addition, these results demonstrate there are signaling differences between IVP and AI pregnancies, impacting the molecular and endocrine environment that influences PGF release during these time points. / A progesterona (P4) produzida pelo corpo lúteo (CL) é essencial para a manutenção da gestação. Por sua vez, o interferon tau (IFNT) produzido pelo embrião durante o processo de alongamento, além de ser o sinal primário para reconhecimento e manutenção da gestação também é responsável pela manutenção do CL durante a gestação inicial. A presença de receptores de ocitocina (OXTR) no endométrio no momento esperado da luteólise é determinante para liberação uterina de prostaglandina F2∝ (PGF), a qual é responsável pela regressão do CL. O IFNT evita a ocorrência da luteólise por meio da supressão da expressão de OXTR no endométrio. Entretanto, durante o segundo mês de gestação, CLs acessórios, principalmente contralaterais são capazes de regredir, indicando que ocorre liberação de PGF pelo útero conforme a gestação avança, e os mecanismos que iniciam a luteólise são restabelecidos. Portanto, falhas na manutenção do CL podem causar luteólise e perdas gestacionais de 30 para 60 dias, um dos importantes problemas de eficiência reprodutiva em bovinos, principalmente quando embriões produzidos in vitro (PIV) são transferidos. Dois estudos foram delineados para estudar estes fatores, com foco em determinar o momento em que o útero gravídico retoma a liberação de PGF, e identificar prováveis diferenças entre estes mecanismos em gestações de embriões PIV ou de inseminação artificial (IA). O primeiro estudo avaliou a concentração circulante do metabólito de PGF (PGFM) após desafio com ocitocina durante os primeiros dois meses de gestação em vacas Holandesas lactantes. O tratamento com ocitocina não afetou a concentração de PGFM em vacas de d11 prenhes (P) e não-prenhes (NP), no d18 apresentou um ligeiro aumento em vacas P, enquanto aumentou cerca de duas vezes em relação ao nível basal em vacas NP. O aumento de PGFM induzido por ocitocina em vacas P no dia 25 foi maior que P em d18, entretanto foi menor que vacas P nos dias 53 e 60. Os dias 32, 39 e 46 da gestação tiveram resposta intermediária. O segundo estudo avaliou a PGFM circulante em resposta a ocitocina em vacas Nelore prenhes de embriões PIV ou IA, nos dias 17 e 31 de gestação, e sua associação com fatores que podem impactar no sucesso da prenhes, como P4 circulante, tamanho de concepto no d18, e o tamanho de embrião no d32. Além disso, foi avaliada e localizada a expressão de OXTR e do gene estimulado por interferon 15 (ISG15) no endométrio uterino. O tamanho de embrião no dia 32 e a P4 circulante no dia 31 foram maiores no grupo IA. Vacas do grupo PIV d17 apresentaram menor resposta a ocitocina na concentração de PGFM do que as de IA no mesmo dia, contudo no dia 31 ambos os grupos tiveram maior resposta do que PIV d17. As vacas do d31 dos dois grupos tiveram aumento na PGFM similar às vacas não-inseminadas (NI). Os OXTR foram altamente suprimidosnas vacas prenhes do d18, especialmente no grupo PIV, mas com alta expressão em vacas NI e no dia 32 para os dois grupos, sendo a IA com maior expressão que a PIV neste dia. O gene ISG15 apresentou expressão irrelevante em NI e d32 para IA e PIV, mas apresentou expressão extremamente alta no d18 nos dois grupos prenhes. Conclui- se que o CL na gestação inicial é mantido pela supressão da liberação de PGF, enquanto que no segundo mês, ocitocina induz liberação de PGF, sugerindo que outros mecanismos regem a manutenção do CL a partir do dia 25. Além disso, nossos resultados demonstram que há diferenças entre a sinalização de gestações provenientes de embriões PIV e IA, que impactam no ambiente molecular e endócrino, influenciando a liberação de PGF nestes momentos.

Este trabalho teve como objetivo o desenvolvimento de um método de reticulação mais homogênea no pericárdio bovino (PB), utilizado na confecção de válvulas cardíacas, seguindo um tratamento seqüencial e não seqüencial com concentrações crescentes de glutaraldeído (GA), no intervalo entre 0,0010/0e 0,5%, com tempos de reação entre 5 e 90min, e temperatura entre 5 e 45&#176C. Os resultados de temperatura de encolhimento (Is) mostraram que a reticulação do pericárdio bovino é heterogênea, principalmente para baixas concentrações de glutaraldeído (0,001%). Entretanto esta heterogeneidade é menos perceptível para concentrações superiores de GA, principalmente para o tratamento seqüencial, sugerindo uma melhor qualidade de reação de reticulação. Em todos os tratamentos realizados, os melhores resultados foram obtidos para o tratamento seqüencial a 45&#176C, para 90 minutos de reação e 0,10/0 de GA, onde os valores de Ts (&#8773 90&#176C) foram muito próximos daqueles para concentrações superiores de GA (0,5%). Encontrou-se também, nestas condições, os menores valores de hidrólise enzimática (colagenase = 3,80/0e tripsina =1,90/0 ). Estes comportamentos devem estar associados a uma maior concentração de GA monomérico e, portanto, maior eficácia das soluções de GA na promoção das ligações de reticulação e também à exposição de um maior número de sítios de reação da matriz de PB. Os resultados dos ensaios de hidrólise enzimática com colagenase e tripsina, confirmaram a maior eficácia do tratamento seqüencial, principalmente sabendo-se que: a) a reação de PB com GA envolve amino grupos de lisina; b) a tripsina só age sobre ligações peptídicas envolvendo lisina com &#949-amino grupo livre. A partir disto, é possível prever que um maior número de &#949-amino grupos estão bloqueados, não permitindo a ação enzimática nestes locais, mostrando que o material encontra se mais reticulado. Testes mecânicos realizados nos materiais tratados nas condições citadas acima mostraram valores dentro da faixa aceitável para a confecção de válvulas cardíacas para o tratamento seqüencial. / The object of this work was the development of a new procedure for homogeneous crosslinking of bovine pericardium (BP), to improve its properties when used for cardiac valves confection. A sequential treatment with increasing concentrations of glutaraldehyde (GA), from 0.0010/0to 0.5%, was used in temperatures ranging from 5°C to 45°C and reaction times ranging from 5 to 90 min. Shrinkage temperature (Ts) results showed that non-sequential and sequential treatments produced heterogeneous crosslinking of bovine pericardium, mainly for lower concentrations of glutaraldehyde (0.001%). The heterogeneity is less perceptible for greater concentrations of glutaraldehyde, specially in the sequential treatment, suggesting better quality of crosslinking reaction. Best results were obtained for the sequential treatment at 45&#176C, for 90 min and 0.1% of glutaraldehyde, with Ts values (&#8773 90&#176C) very similar to those found for higher glutaraldehyde concentration (0.5%). In these conditions, the smaller values of enzymatic hydrolysis were obtained (collagenase = 3.80/0and tripsin = 1.90/0).This behavior, at 45&#176C, may be associated to the presence of higher monomeric glutaraldehyde concentration, more efficient in the crosslinking promotion, and to the exposition of a great number of reaction sites in bovine pericardium matrix. The results of enzymatic hidrolysis with collagenase and tripsin, confirmed that sequential treatment is more efficient, specially knowing that: a) the GA for BP reaction involved e-amino groups of lisin: b) the tripsin alone act over peptides bonds involving lisin with free e-amino groups. Then, it is possible to predict that a great number of e-amino groups were blocked, not permitting enzimatic action, showing that the materials were more crosslinked. Mechanical tests for materials treated as above demonstrated that for sequential treatment the values are within the acceptable range for cardiac valves construction.

A brucelose bovina é uma zoonose que apresenta importância econômica por ocasionar perdas reprodutivas nas espécies animais acometidas. Em 2001, no Brasil, foi criado o Programa Nacional de Controle e Erradicação da Brucelose e da Tuberculose Animal. Uma das principais medidas instituídas pelo programa é a vacinação de fêmeas entre três e oito meses de idade pela cepa B19. Posteriormente, em 2007, ficaram definidas as normas para a utilização da cepa RB51 em fêmeas maiores que oito meses de idade, e em propriedades que apresentem foco da doença. Sabe-se que esta medida, se utilizada, abreviaria o período de tempo necessário para que a redução da prevalência da brucelose bovina fosse atingida. A fim de estimar a magnitude desta redução, bem como aferir o acumulado de animais a serem protegidos para que a diminuição na prevalência ocorra, foi realizado um modelo matemático associando a proteção de 80% das bezerras por B19, à proteção de 10, 40 e 80% das demais fêmeas por RB51. Para as simulações, foram consideradas as Unidades Federativas que apresentam prevalência da brucelose bovina acima de 2%. Comparando os cenários analisados, pôde-se concluir que a redução do período de tempo necessário para que se atingisse 2% de prevalência pouco diferiu quanto à cobertura vacinal de 40 ou 80% das fêmeas vacináveis. Isto faz com que a primeira alternativa possa, economicamente, ser tida como mais interessante, uma vez que abrangeria um acumulado menor de animais protegidos. Considerando o Estado de Goiás, que apresenta prevalência de 3,01% e um efetivo de 8.336.632 fêmeas bovinas, a proteção das fêmeas jovens por B19 juntamente à proteção de 40% das demais por RB51, faria com que a redução da prevalência alcançasse 2% em quatro anos, com um acumulado de 1.302.130 animais protegidos. Em relação ao Estado de Mato Grosso, que apresenta a maior prevalência, 10,25%, e 8.377.433 fêmeas com mais de 24 meses de idade, foi observado que a frequência da brucelose chegaria a 2% em quinze anos caso a proporção de fêmeas protegidas por RB51 fosse 40%, resultando em um acumulado de 1.656.098 animais. Em comparação à utilização da B19 como única medida preventiva, utilizando a RB51 em 40% das fêmeas vacináveis, se reduziria o período de tempo para se atingir 2% de prevalência de sete para quatro anos no Estado de Goiás, e de 22 para 15 anos no Mato Grosso. Além disso, a determinação dos acumulados a serem vacinados permite que se avalie economicamente a viabilidade ao uso da RB51 / Bovine brucellosis is a zoonosis that play important economic role for causing reproductive losses on animal species that are affected. In 2001, in Brazil, Brazilian National Program for the Control and Eradication of Bovine Brucellosis and Tuberculosis was created. One of the main action proposed by the program is vaccination of female between three to eight months of age by B19 strain. Later, in 2007, were defined the roles for RB51 strain use in females older than eight months, and in herds that are in outbreak situation. It is known that this measure, if used, would short the time needed for bovine brucellosis reduction. In order to estimate the magnitude of this reduction, as well as to measure the accumulated of protected animals for brucellosis prevalence decrease, a mathematical model was done associating protection by B19 in 80% of heifers, to protection by RB51 in 10, 40 and 80% of other females. For simulations, states that presented brucellosis prevalence superior than 2% were considered. Comparing these scenarios was possible to conclude that the time needed to reduce prevalence to 2% were similar between 40 and 80%. This turns the former alternative economically more interesting, once it will cover lower number of protected animals. Considering Goiás State, that presents prevalence of 3.01% and a amount of 8336,632 female bovine, protection of 80% of heifers by B19, along protection of 40% of other females by RB51, would make prevalence reach 2% in four years, with a total of 1302,130 protected animals. Relative to Mato Grosso State, that has the major prevalence, 10.25%, and 8377,433 female older than 24 months of age, were observed that brucellosis frequency would reduce to 2% in 15 years in case of 40% of female protected by RB51, resulting in an amount of 1656,098 animals. In comparison with the use of B19 as single preventive measure, time to reduce prevalence to 2% will reduce from seven to four years in Goiás, and from 22 to 15 years in Mato Grosso. Moreover, determination of accumulated of protected animals allows that RB51 use would be economically evaluated