Nous avons préalablement démontré que l'endothéline-1 (ET-1), un peptide vasoconstricteur de 21 acides aminés, joue un rôle central dans le métabolisme des tissus articulaires et a des fonctions cataboliques sur le cartilage articulaire dans l'ostéoarthrose, en liant son récepteur de type A (ETA). Suite à la relâche du nonapeptide vasodilatateur bradykinine (BK), et l'augmentation d'expression du récepteur B1 des kinines (BKB1), ces médiateurs engendrent un cycle d'inflammation, une destruction du cartilage, et une douleur articulaire. Lors de cette étude, l'efficacité thérapeutique des antagonistes spécifiques du ETA et/ou BKB1 dans un modèle animal d'ostéoarthrose a été testée. Notre hypothèse est que l'antagonisme va diminuer la progression de la pathologie et de la douleur articulaire. L'ostéoarthrose a été induite chez des rats par rupture chirurgicale du ligament croisé antérieur. Les animaux ont été traités par injections intra articulaire hebdomadaires des antagonistes peptidiques spécifiques du ETA et/ou BKB1. La douleur articulaire a été évaluée par le test d'incapacitance statique durant les deux mois postopératoires ; la morphologie articulaire a été examinée post mortem par radiologie et histologie. On constate que le traitement a diminué la douleur et a préservé la morphologie articulaire ; la double inhibition a été plus efficace que la simple inhibition. En conclusion, l'antagonisme double d'ETA et BKB1 améliore la douleur chronique et prévient la dégradation articulaire dans l'ostéoarthrose, ce qui suggère que ces récepteurs peuvent être des cibles thérapeutiques potentiels pour le traitement de cette pathologie. / The author's laboratory has previously shown that endothelin-1 (ET-1), a 21-residue vasoconstrictive peptide, plays a central role in joint tissue metabolism, and has a catabolic function in matrix collagen degradation in osteoarthritis. These effects occur primarily through ligation of the endothelin-1 receptor A subtype (ETA). The subsequent release of the nonapeptide vasodilator bradykinin (BK) in the joint microenvironment, and up-regulation of bradykinin receptor B1 (BKB1) expression, engenders a vicious cycle of synovial membrane inflammation, articular cartilage destruction, and joint pain. In the present work, we describe a preclinical study of the efficacy of treatment of surgically induced osteoarthritis with ETA and/or BKB1 specific peptide antagonists. We hypothesize that antagonism will diminish osteoarthritis progress and articular pain. Osteoarthritis was surgically induced in rats by transection of the anterior cruciate ligament. Animals were subsequently treated with weekly intra-articular injections of specific peptide antagonists of ETA and BKB1. Hind limb pain was measured by the static weight bearing test for two months post-operatively. Post-mortem, knee joints were analyzed radiologically and histologically. Local antagonist treatment diminished overall limb pain, and accelerated postoperative recovery, after disease induction. Treatment also protected joint radiomorphology and histomorphology, with dual antagonism being slightly more protective. ETA and BKB1 dual antagonism improves chronic pain and prevents joint degradation in osteoarthritis. They therefore represent a novel therapeutic target: specific receptor dual antagonism may prove beneficial in disease management.

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:00Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006-06-28. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:25:41Z : No. of bitstreams: 1 Publico-091.pdf: 651136 bytes, checksum: 35401eae81afb55be34c6f47a332e47e (MD5) / Objetivo: Estudar o efeito da obesidade na regulação do sistema calicreína-cininas por meio da expressão dos receptores B1 e B2 de cininas em humanos e camundongos, e as alterações na síntese e funcionalidade dos receptores em tecidos murinos. Métodos: Foram coletados tecido adiposo branco humano e diferentes tecidos de camundongo. Desses tecidos foi extraído o RNA e analisada a expressão dos receptores de cinina por meio da reação em cadeia da polimerase em tempo real. Tecidos como estômago e aorta de camundongos ob/ob e selvagens foram utilizados para extração de proteínas e estudos fisiológicos. Por Western Blotting estudou-se a quantidade de receptor produzida nos animais. O fundus de estômago e aorta abdominal foram utilizados para se obter registros de contrações isométricas para determinação da potência e eficácia dos agonistas em camundongos obesos e magros. Foram aplicadas doses crescentes cumulativas dos agonistas peptídicos dos receptores B1 e B2, bradicinina e des-Arg9-bradicinina. Resultados: Nos experimentos de PCR em tempo real, a expressão gênica dos receptores B1 e B2 de cininas foi mostrada alterada em alguns tecidos dos animais deficientes na produção do hormônio leptina em relação ao controle. Nos tecidos: adiposo branco, aorta, fígado, hipotálamo e estômago, a expressão do receptor B1 apresentou-se aumentada, porém em tecido cardíaco e tecido adiposo marrom, essa estava diminuída. O receptor B2 teve expressão diminuída em tecido adiposo branco e hipotálamo. Nos demais tecidos estudados não houve alteração da expressão do receptor B2. Em humanos, esses receptores apresentaram-se alterados em indivíduos obesos. O estudo foi realizado em tecido adiposo humano de duas regiões de depósito diferentes, visceral e subcutâneo. Foi observada diferença na expressão do mesmo tecido, porém de regiões distintas. Nos tecidos dos camundongos obesos a resposta aos agonistas dos receptores B1 e B2, bradicinina e des-Arg9-bradicinina, respectivamente, foi mostrada diminuida. Em fundus de estômago foi observada diminuição significativa na resposta ao agonista BK em animais obesos e tratados com dieta hiperlipídica. Tais efeitos podem ser devido às conseqüências do aumento excessivo de peso, como inflamação crônica apresentada nesses animais, ou mesmo devido a diabetes tipo II, a qual consiste em uma patologia diretamente relacionada à obesidade, sugerida neste trabalho como fator capaz de alterar a ação do sistema calicreína-cininas em determinados tecidos. Conclusão: Análises de expressão gênica mostraram que a obesidade afeta os receptores de cinina em diversos tecidos de camundongo, assim como em humanos. Análises fisiológicas funcionais mostraram diminuição na resposta ao agonista de B1 em animais obesos. Os dados deste trabalho sugerem que a obesidade afeta a modulação do sistema calicreína-cininas em modelo murino e humano. Dessa forma, uma possível interação entre obesidade e sistema calicreína-cininas poderia estar envolvida nesta patologia, assim como ser um fator para desenvolvimento a sindrome metabólica. / Objectives: To study the effect of obesity on the kallikrein-kinin system through the expression of receptors B1 and B2 on humans and mice, and alterations in the synthesis and functionality of the receptor in murine tissues. Methods: white human adipose tissue and different kinds of mice tissues were collected. RNA was extracted and the kinin receptors expression analyzed through a real-time polymerase chain reaction. Tissues and organs such as stomach and aorta were used for protein extraction and physiological studies. By Western Blotting, receptor quantitation was studied. Stomach fungus and abdominal aorta were used to register isometric contractions to determine the potency and effectiveness of the agonists on obese and control mice. Increasing accumulating doses of bradykinin and des-Arg9-bradykinin, B2 and B1 receptors agonists respectively, were applied. Results: In the real-time PCR experiments, the gene expression of the B1 and B2 receptors were altered in some tissues of the animals deficient for leptin, when compared to the control. In the white adipose tissue, aorta, liver, hypothalamus and stomach, the B1 receptor expression was increased, but in cardiac tissues and brown adipose tissue, it was decreased. The expression of B2 receptor was decreased in white adipose tissue and hypothalamus. In the other studied tissues, no changes was detected in the B2 receptor expression. In humans, these receptors were altered in obese individuals. The study was performed in human adipose tissue from two different regions of depots, visceral and subcutaneous. There was a tendency of different expression in the same tissue, but from different areas. In tissues from obese mice the response to the B2 and B1 agonists, bradykinin and des-Arg9-bradykinin, respectively, had a decreasing tendency. A significant decrease was observed in stomach fundus in response to the BK agonist. Such effects can be due to the increased weight and its consequences, such as chronic inflammation or diabetes type II, which is a pathology directly related to obesity. Conclusion: expression and functional analysis show that obesity affects kinin receptors in many different mouse tissues as well as in humans. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Traumatic brain injury (TBI) is a major cause of death and disability. This condition results in neurological and cognitive impairment. In this context, it has been demonstrated that bradykinin, the main metabolite of the kallikrein-kinins system is involved in the increased permeability of the blood-brain barrier, in edema formation and leukocyte accumulation induced by TBI. Experimental findings also indicate an connection between kinin receptors and the activity of the enzyme nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH)-oxidase, an enzyme that produces superoxide radical. It is known that the kalikrein-kinin and NADPH-oxidase activity participate of neuroinflammation triggered by TBI. However, few studies have evaluated their effects on the development of posttraumatic cognitive impairment. Hence, the present study evaluated the role of kinin receptors (B1 and B2) and the NADPH-oxidase inhibitor (apocynin)in neuromotor deficits, memory impairment, cortical lesion volume, oxidative and inflammatory damage induced by moderate lateral fluid percussion injury in mice. Therefore, we determined the effects of kinin receptors antagonists (des - Arg9-[Leu8]-bradykinin and HOE-140) and apocynin injected subcutaneously 30 min 24 hours post trauma. The present study demonstrated that both, HOE-140 and apocynin, protected against memory impairment triggered by trauma, but showed no effects in motor dysfunction caused by TBI. It should be noted that memory improvements was not due to nonspecific effects over the memory test, because the pharmacological treatment used in this study did no alter locomotor and/or anxiety-like behavioral. Treatment with HOE-140 also attenuated the NADPH-oxidase activity, reinforcing the connection between the B2 receptor and this enzyme. Moreover, both treatments attenuated the ipsilateral cortex inflammation (levels of interleukin-1β, tumoral necrosis factor-α and nitric oxide metabolites) and oxidative damage (lipid peroxidation, protein carbonylation and inhibition of Na+, K+ ATPase) induced by tested model. On the other hand, only treatment with HOE-140 reduced the cerebral edema. The results presented in this study suggest that kinins, through of the B2 receptor and possibly through NADPH-oxidase, are involved in neuroinflammation and oxidative stress caused by trauma. Moreover, it is plausible that excessive activation of B2 receptors and subsequent activation of the enzyme NADPH-oxidase facilitate the cortical lesion progression resulting in deterioration of object recognition memory. / O traumatismo crânio encefálico (TCE) é uma das maiores causas de morte e de incapacitação, resultando frequentemente em disfunções neurológicas e prejuízo cognitivo. Neste contexto, tem sido demonstrado que a bradicinina, o principal metabólito do sistema calicreína-cininas, está envolvida no aumento da permeabilidade da barreira hematoencefálica, na formação de edema e no acúmulo de leucócitos induzidos pelo TCE. Achados experimentais também indicam uma interconexão entre os receptores das cininas e a atividade da enzima Nicotinamida Adenina Dinucleotídeo Fosfato (NADPH)-oxidase. Esta enzima é uma conhecida produtora de radical superóxido e também parece estar envolvida na toxicidade induzida pelo TCE. Embora se conheça o envolvimento do sistema calicreína-cininas e da atividade da NADPH-oxidase na neuroinflamação desencadeada pelo TCE, poucos trabalhos têm avaliado seus efeitos no desenvolvimento do déficit cognitivo pós-traumático. Diante disto, o presente estudo avaliou o papel dos receptores das cininas (B1 e B2) e da apocinina (um inibidor da NADPH-oxidase) nos déficits neuromotor e de memória, bem como no volume de lesão cortical e nas alterações oxidativas e inflamatórias induzidas pelo modelo de lesão cerebral moderada por percussão de fluido lateral em camundongos. Para tanto, avaliou-se os efeitos dos antagonistas dos receptores das cininas dos subtipos B1 (des-Arg9-[Leu8]-bradicinina) e B2 (HOE-140) e da apocinina, injetados subcutaneamente 30 min e 24 horas após o trauma. O presente estudo demonstrou que tanto o HOE-140, como a apocinina protegeram contra o prejuízo de memória desencadeado pelo trauma, mas não apresentaram efeitos estatisticamente significantes sobre a disfunção motora. Cabe salientar que os testes de ansiedade e locomoção indicam que a melhora de memória alcançada com os tratamentos não se devem a interferências inespecíficas sobre a execução do teste de memória. O tratamento com HOE-140 atenuou ainda a atividade da NADPH-oxidase, reforçando a interconexão entre o receptor B2 e a enzima. Além disso, ambos os tratamentos foram eficazes em atenuar, em córtex ipsilateral, os parâmetros inflamatórios (níveis de interleucina-1β, fator de necrose tumoral-α e de metabólitos do óxido nítrico) e o dano oxidativo (lipoperoxidação, carbonilação proteica e inibição da Na+, K+ATPase) induzidos pelo modelo estudado. Por outro lado, apenas o tratamento com HOE-140 obteve uma redução estatisticamente significante sobre o edema cerebral. Os resultados apresentados permitem concluir que as cininas, por ação do receptor B2 e possivelmente da NADPH oxidase, estão envolvidas na neuroinflamação e no estresse oxidativo. Além disso, é plausível que a excessiva ativação dos receptores B2 seguida da ativação da enzima NADPH-oxidase facilite a progressão da lesão cortical repercutindo, desta forma, na deterioração da memória de reconhecimento de objetos.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The aim of this study was to verify the type of angiotensin II (AngII) receptor involved in nuclear maturation of bovine oocytes and the possible participation of bradykinin (BK) as a mediator of AngII in this process. The first experiment was conducted to analyze the type of AngII receptor, for this cumulus-oocyte complexes (COCs) were cultured for 7 or 12h in the presence of follicular hemisections and AngII (10-11M), with or without the antagonists losartan (10-6M; selective for AT1 receptor), PD123319 (10-6M; selective for AT2 receptor) or saralasin (10-7M; AT1 and AT2 antagonist). Additionally, two control groups were used where the oocytes were cultivated in the absence or presence of follicular hemisections (positive and negative control, respectively). Oocytes cultured for 7h in the presence AngII reached 70,4% germinal vesicle breakdown (GVBD). When losartan was added to the maturation medium with AngII, the GVBD oocytes did not have any difference (73,2%), however when COCs were cultured in the presence of AngII + PD123319, the nuclear maturation was lower (52,1%; P<0,05). The cultivation of the oocytes for a larger period (12h) did not cause a significant difference in relation to those 7h treatments (P<0,05). These data indicate that the AT2 receptor mediate the actions of AngII during the nuclear maturation in bovine. In a second experiment, the effect of different concentrations of PD123319 was verified in the oocytes nuclear maturation in the presence of AngII (10-11M) and follicular hemisections. The culture was accomplished by 7h in a similar experimental design as previous experiment and it was verified that the inhibition induced by the antagonist happened in a dose-dependent way and there is lineal relation between concentration of PD and rates of obtained RVG (P=0,0306). To verify the participation of BK in the action mechanism of AT2 receptors, the oocytes were cultured in the presence of AngII (10-11M) and follicular hemisections with or without Hoe-140 (antagonist of B2 receptors of BK) in different concentrations (10-6, 10-7, 10-8 and 10-9M) for 7h. In this experiment, there was not any difference in the rates of GVBD oocytes among the groups treated with the antagonist and the AngII group (P>0,05). These data allow to infer that AngII acts in the nuclear maturation of the bovines oocytes activating the AT2 receptors and that the BK/receptor B2 pathway is not involved in that process. / O objetivo deste estudo foi de verificar o tipo de receptor da angiotensina II (AngII) envolvido na maturação nuclear de oócitos bovinos e a possível participação da bradicinina (BK) como mediadora da AngII nesse processo. O primeiro experimento foi conduzido para analisar o tipo de receptor, para isso os complexos cumulus-oócitos (CCOs) foram cultivados por 7 ou 12h na presença de hemiseções foliculares e AngII (10-11M), com ou sem os antagonistas losartan (10-6M; seletivo para receptores AT1), PD123319 (10-6M; seletivo para receptores AT2) ou saralasina (10-7M; antagonista AT1 e AT2). Adicionalmente, foram utilizados dois grupos controle, onde os oócitos foram cultivados na ausência ou na presença de hemiseções foliculares (controle positivo e negativo, respectivamente). Oócitos cultivados por 7h em presença de AngII atingiram 70,4% de rompimento da vesícula germinativa (RVG). Quando o losartan foi adicionado ao meio de cultivo com AngII, não houve diferença na percentagem de oócitos em RVG (73,2%), porém, quando os CCOs foram incubados na presença de AngII + PD123319, houve queda significativa na maturação nuclear (52,1%; P<0,05). O cultivo dos oócitos por um período maior (12h) não causou diferença significativa em relação a esses tratamentos quando foram realizados às 7h (P<0,05). Esses dados indicam que os receptores AT2 mediam as ações da AngII na maturação nuclear em bovinos. Em um segundo experimento, foi verificado o efeito de diferentes concentrações de PD123319 na maturação nuclear dos oócitos na presença de AngII (10-11M) e hemiseções foliculares. O cultivo foi realizado por 7h em um delineamento similar ao do experimento anterior e verificou-se que a inibição induzida pelo antagonista ocorreu de maneira dosedependente e há relação linear entre concentração de PD e índices de RVG obtidos (P=0,0306). Para verificar a participação da BK no mecanismo de ação dos receptores AT2, os oócitos foram cultivados na presença de AngII (10-11M) e hemiseções foliculares com ou sem Hoe-140 (antagonista de receptores B2 da BK) em diferentes concentrações (10-6, 10-7, 10-8 e 10-9M) por 7h. Nesse experimento, não houve diferença nos índices de oócitos que atingiram RVG entre os grupos tratados com o antagonista e o grupo AngII (P>0,05). Esses dados permitem inferir que a AngII atua na maturação nuclear dos oócitos bovinos ativando os receptores AT2 e que a via BK/receptor B2 não está envolvida nesse processo.

Orientador: Prof. Dr. Carlos Alberto-Silva / Tese (doutorado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Neurociência e Cognição, Santo André, 2018. / Os Peptídeos Potenciadores de Bradicinina (BPPs) são oligopeptídeos presentes na fração de baixo peso molecular (FBP) do veneno da serpente Bothrops jararaca (Bj). Estes peptídeos são descritos como inibidores naturais da Enzima Conversora de Angiotensina. Porém, eles também alteram a atividade catalítica e a expressão da argininosuccinato sintetase (AsS), favorecendo a síntese de Larginina. Este aminoácido participa de várias vias metabólicas importantes, incluindo a formação de poliaminas e agmatina com atividade neuroprotetora amplamente descrita. Além disso, FBP apresenta atividade neuroprotetora contra o estresse oxidativo induzido em cultura de células do hipocampo de ratos. Com isso, o objetivo do presente estudo foi avaliar a possível atividade neuroprotetora da FBP e BPPs sintéticos contra o estresse oxidativo induzido por H2O2 em cultura de células humanas de linhagem SH-SY5Y. A citotoxicidade do veneno bruto (VB), FBP (0,001 ¿ 10 µg/mL) e BPPs [BPP-5a; BPP-7a; BPP-10c; BPP-11e, BPP-12b e BPP-AP (0,1 ¿ 10 µM)] por 3, 6, 12, 24 e 48 h foi avaliada pelo teste de MTT. Para os ensaios de neuroproteção, a cultura de células foi previamente tratada com BPPs (1 µM) ou FBP (0,1 µg/mL) por 4 horas. Em seguida, foi adicionado H2O2 450 µM para indução do estresse oxidativo. Após 20 horas, foram realizados os ensaios de viabilidade celular. Os resultados indicaram que todos os BPPs, com exceção da FBP, foram neuroprotetores. Em especial, os peptídeos BPP-5a, BPP-7a e BPP-10c foram os mais eficientes. Os mecanismos envolvidos na neuroproteção foram avaliados pela análise das espécies reativas de oxigênio (EROs ¿ DCFH), peroxidação lipídica (TBARS), expressão da AsS e iNOS, níveis de nitrito (Griess) e o potencial de membrana mitocondrial (TMRM). Os três peptídeos reduziram a geração de EROs, síntese de NO, expressão de NF-?B e a peroxidação lipídica. Entretanto, apenas o BPP-10c aumentou os níveis de expressão da AsS. Este resultado sugere que o aumento da disponibilidade de L-arginina pode estar relacionado com o seu efeito neuroprotetor. Ainda, o BPP-10c e BPP-5a reduziram as alterações no potencial de membrana mitocondrial frente ao estresse oxidativo, um importante mecanismo na neuroproteção. Curiosamente, o BPP-7a na presença do H2O2 não reduziu a síntese de NO. Este dado sugere a inibição da oxidação do cofator enzimático BH4, um significativo ativador da NOS. Os resultados obtidos até o momento sugerem que os mecanismos envolvidos na neuroproteção são distintos, apesar destes peptídeos possuírem semelhanças estruturais. Este foi o primeiro estudo a demonstrar que os BPPs apresentam atividade neuroprotetora contra o estresse oxidativo. / The Bradykinin Potentiating Peptides (BPP), present in Low Molecular Weight Fraction (LMWF) of Bothrops jararaca (Bj), are described as natural inhibitors of angiotensin conversing enzyme (ACE) and argininossucinate synthase (AsS) activators, improving L-arginine synthesis, the agmatine and polyamines formation, which have neuroprotective properties. Have been demonstrated that LMWF show neuroprotective action on rat hippocampal cell culture. The aim of this study is to evaluate the possible neuroprotective activity of LMWF and BPPs against oxidative stress induced by H2O2 in SHSY5Y human cell line. Initially, the crude venom (CV), LMWF (0.001 ¿ 10 µg/mL) and [BPP-5a; BPP7a; BPP-10c; BPP-11e, BPP-12b e BPP-AP (0.1 ¿ 10 µM)] cytotoxicity were analyzed after 3, 6, 12, 24 e 28 h using MTT assay. For the neuroprotection assays, the cell culture was treated with BPPs (1 µM) or LMWF (0.1 µg/mL) and, after 4 h, H2O2 450 µM was added to induce oxidative stress. The cell viability assay was performed 20 h later. Our results suggest that all BPPs tested (excepting LMWF) were neuroprotective and the peptides BPP-5a, BPP-7a and BPP-10c were the most efficient. The neuroprotection mechanisms were assessed by the reactive oxygen species (ROS ¿ DCFH), lipid peroxidation (TBARS), AsS and iNOS expression, levels of nitrite (Griess) and mitochondrial membrane potential (TMRM) analyses. BPP-5a, BPP-7a and BPP-10c reduced the ROS, NO, NF-?B expression, and the lipid peroxidation. However, only BPP-10c enhanced the AsS expression, suggesting that the increase of L-arginine availability might be related to neuroprotection. In addition, BPP-10c and BPP-5a avoided the mitochondrial membrane potential promoted by H2O2. Interestingly, there is the hypothesis that only BPP-7a inhibited the co-factor BH4 oxidation because did not decrease NO synthesis. Overall, we demonstrated for the first time that the neuroprotective mechanisms of BPPs against oxidative stress could be distinct.

Submitted by Claudinei Pracidelli (cpracide@ipen.br) on 2016-11-11T13:14:25Z No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2016-11-11T13:14:25Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Os venenos de serpentes são complexas misturas de proteínas e peptídeos que apresentam uma variedade de atividades biológicas. Estudos apontam para uma rica diversidade de moléculas bioativas de baixa massa molecular nos venenos, como a crotamina, miotoxina A, peptídeos potenciadores de bradicinina (BPPs) inibidores do tipo Kunitz de serinopeptidases e tripeptídeos inibidores de metalopeptidases. O interesse nestas moléculas está relacionado ao potencial uso como agentes terapêuticos contra diversas patologias, como distúrbios da coagulação e modulação da atividade de metalopeptidases, moléculas estas envolvidas com tumorigenêse e outros processos patológicos como inflamação crônica e distúrbios neurológicos. O veneno da serpente Bitis gabonica rhinoceros provoca alterações fisiopatológicas como severa desordem na coagulação sanguínea e danos teciduais seguidos de necrose. No presente estudo foram isoladas e caracterizadas metalopeptidases e serinopeptidases, além de componentes de baixa massa molecular como inibidor do tipo Kunitz e BPPs. Estes peptídeos foram testados quanto a sua capacidade inibitória frente as peptidases endógenas e sequenciados por espectrometria de massa. Os nossos dados mostram que as peptidases isoladas degradam caseína e não tem atividade sobre colágeno. A serinopeptidase tem atividade &beta;-fibrinogenolítica e o inibidor tipo Kunitz isolado apresenta maior capacidade de inibir a quimotripsina, com valor de Ki= 0,07 &mu;M, mostrando-se um promissor substituto ao fármaco aprotinina. Este peptídeo apresentou também atividade citotóxica em células B16F10 e tênue atividade antimicrobiana. Dentre os BPPs identificados, o peptídeo que possui sequência não canônica apresentou a capacidade de potencializar a ação da bradicinina tanto em ensaio edematogênico quanto de inibição da atividade enzimática da enzima conversora de angiotensina. Esses resultados indicam o potencial de peptídeos de venenos animais para o desenvolvimento de novos agentes terapêuticos para o tratamento de enfermidades como hipertensão e distúrbios de coagulação. / Tese (Doutorado em Tecnologia Nuclear) / IPEN/T / Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP

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Das posttraumatische Hirnödem trägt zur erhöhten Morbidität und Mortalität Schädel-Hirn-traumatisierter Patienten bei. Das vasodilatierende Bradykinin führt als ein Bestandteil des Kallikrein-Kinin-Systems über Bradykinin-2 (B2)-Rezeptoren zu einer Öffnung der Blut-Hirn-Schranke und trägt damit zur Entstehung und Aufrechterhaltung des vasogenen bzw. zytotoxischen Hirnödems bei. Eine selektive Hemmung der B2-Rezeptoren konnte bereits die Ausbreitung des posttraumatischen vasogenen Hirnödems erfolgreich vermindern. Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurde zunächst die Entwicklung des vasogenen Hirnödems, der hemisphäralen Schwellung und der Integrität der Blut-Hirn-Schranke im zeitlichen Verlauf bis 7 Tage nach Controlled Cortical Impact Injury (CCII) an Ratten anhand T2- und T1-gewichteter MRT-Bildgebung charakterisiert. Im zweiten Teil wurde eine mögliche therapeutische Wirkung des spezifischen B2-Antagonisten LF 16.0687 Ms auf das posttraumatische Ödem und der Blut-Hirn-Schrankenöffnung durch Anwendung von MRT- und gravimetrischer Methoden untersucht. In den T2-gewichteten Sequenzen kam es innerhalb von 90 Minuten nach CCII zum prozentual stärksten Anstieg der hemisphäralen Schwellung, ein Maximum lag zwischen 24 und 48 Stunden vor gefolgt von einer Abnahme bis 7 Tage danach. T1-gewichtete Aufnahmen zeigten ein durch die Extravasation von Gadolinium-DTPA erzeugtes Maximum der Kontrastverstärkung innerhalb des Läsionszentrums bereits 6 Stunden nach CCII, während die Kontrastverstärkung in der Ödemperipherie erst nach 48 Stunden Maximalwerte erreichte. Bei einer frühzeitigen Gabe des Kontrastmittels 90 Minuten nach CCII kam es im Verlauf zu einer signifikant höheren Kontrastverstärkung innerhalb der traumatisierten Hemisphäre, vermutlich durch eine Retention des extravasierten Kontrastmittels. Dies könnte für eine frühe Restitution der Blut-Hirn-Schranken Integrität innerhalb der Kontusion sprechen, während der Verschluß perikontusionell erst später erfolgt. LF 16.0687 Ms führte bei frühzeitiger Gabe nach CCII zu einer signifikanten Reduktion der gravimetrisch bestimmten posttraumatischen hemisphäralen Schwellung um 27%. Hierbei korrelierte die im MRT ermittelte hemisphärale Schwellung signifkant mit den gravimetrisch gemessenen Werten. / Posttraumatic brain edema contributes to a higher morbidity and mortality in severe head-injured patients. Vasodilatating bradykinin, part of the kallikrein-kinin-system, mediates over bradykinin 2 (B2) receptors an blood-brain-barrier (BBB) disfunction and causes the formation and maintenance of vasogenic and cytotoxic brain edema. A selective blocking of the B2 receptors has been shown to successfully reduce brain edema formation. One objective of this study was to analize the development of vasogenic brain edema, lesion-size, hemispheric swelling and BBB-integrity after controlled cortical impact injury (CCII) in rats over a period of 7 days using magnetic resonance imaging (MRI) techniques (T2- and T1-weighted MRI, Gadolinium-DTPA (Gd-DTPA)). The other purpose was to investigate the protective effect of the novel nonpeptide B2 receptor antagonist LF 16-0687 Ms on posttraumatic edema and BBB-opening using MRI- and gravimetric methods. T2-weighted imaging showed the highest percentual increase of hemispheric swelling during the first 90 minutes after CCII, a maximum between 24 and 48 hours after CCII and and a decrease after 7 days. T1-weighted imaging revealed a maximum of contrast enhancement caused by extravasation of Gd-DTPA in the lesion-center 6 hours after CCII, while contrast enhancement in the lesion periphery reached its maximum at 48 hours.After an early administration of Gd-DTPA (90 minutes after CCII) contrast enhancement in the traumatized hemisphere was significantly higher compared to the non-traumatized hemisphere. This could be explained by a retention of Gd-DTPA caused by an early closure of the BBB in the lesion-center, while BBB-integrity in the lesion-periphery re-establishes later. The novel nonpeptide B2 receptor antagonist LF 16-0687Ms significantly reduced brain swelling by 27% after single administration measured by gravimetric wet-dry-weighting. Gravimetric and T2-weighted MRI-measurements of hemispheric swelling correlated significantly.

Le syndrome d’embolie de liquide amniotique (SELA) est une complication rare et souvent catastrophique de l’accouchement chez la femme caractérisée classiquement par une hypotension sévère, un arrêt cardiorespiratoire et une coagulation intra-vasculaire disséminée. Malheureusement, sa physiopathologie est encore mal connue. Le rôle des kinines n’a notamment pas été étudié. L’objectif de notre projet était de développer un modèle animal de SELA et d’étudier le rôle éventuel des kinines dans ce syndrome. Douze lapines en fin de gestation ont été incluses dans l’étude. Pour chacune d’entre-elles, le liquide amniotique était aspiré de chaque sac amniotique après une laparotomie. Six lapines recevaient un bolus de liquide amniotique injecté via la veine auriculaire alors que les six autres recevaient un bolus de saline. Parallèlement, les effets in vitro de liquide amniotique sur la coagulation étaient évalués par thrombelastographie (TEG) et comparés aux effets de la saline. L’injection de liquide amniotique n’a pas permis de reproduire les signes cliniques de SELA, n’a pas entrainé la génération de bradykinine, et n’a pas eu d’effet sur le temps de prothrombine, le temps de thromboplastine partielle activée, et l’activité du facteur VIII de. Une thrombocytopénie sévère et transitoire a cependant été notée 5 minutes après l’injection de liquide amniotique. De plus, en additionnant in vitro de liquide amniotique au sang on a observé un tracé de TEG hypercoagulable comparé à celui obtenu avec la saline. Le modèle n’ayant pas pu reproduire le SELA, le rôle des kinines dans ce syndrome reste à déterminer. / Amniotic fluid embolism (AFE) is a rare but catastrophic complication of parturition characterized by severe hypotension, cardiovascular collapse, and massive consumptive coagulopathy. Its pathophysiology remains obscure. In particular, the potential role of bradykinin in hypotension is unknown. The objective of this study was to develop a suitable animal model of AFE and to study the effects of amniotic fluid injection on bradykinin release in this model. Twelve rabbits in late gestation (25 days) were used. For each rabbit, amniotic fluid was collected from foetal amniotic sacs by laparotomy. For six rabbits, the amniotic fluid was then injected as a bolus via the left auricular vein, whereas the six other rabbits received saline (control group). In parallel, the in vitro effects of amniotic fluid on coagulation was assessed by thrombelastography (TEG) and compared to the effects of saline. Injection of amniotic fluid did not reproduce clinical signs of AFE, did not provoke bradykinin generation and had no effect on prothrombin time, the activated partial thromboplastin time, nor Factor VIII activity. However, a significant thrombocytopenia was observed five minutes after amniotic fluid administration. This thrombocytopenia resolved within 60 minutes. In vitro addition of amniotic fluid to blood resulted in accelerated clotting on TEG tracings as compared to the effect of saline. As we were not able to reproduce AFE with our model, the role of kinins in this syndrome remains to be determined.

<p>Parkinson’s disease is a neurodegenerative disorder characterized by a loss of dopaminergic neurons, where mitochondrial dysfunction and neuroinflammation are implicated in this process. However, the exact mechanisms of mitochondrial dysfunction, oxidative stress and neuroinflammation leading to the onset and development of Parkinson’s disease are not well understood. There is a lack of tools necessary to dissect these mechanisms, therefore we engineered genetically encoded fluorescent biosensors to monitor redox status and an inflammatory signal peptide with high spatiotemporal resolution. To measure intracellular redox dynamics, we developed red-shifted redox sensors and demonstrated their application in dual compartment imaging to study cross compartmental redox dynamics in live cells. To monitor extracellular inflammatory events, we developed a family of spectrally diverse genetically encoded fluorescent biosensors for the inflammatory mediator peptide, bradykinin. At the organismal level, we characterized the locomotor effects of mitochondrial toxicant-induced dopaminergic disruption in a zebrafish animal model and evaluated a behavioral assay as a method to screen for dopaminergic dysfunction. Pairing our intracellular redox sensors and our extracellular bradykinin sensors in a Parkinson’s disease animal model, such as a zebrafish toxicant-induced model will prove useful for dissecting the role of mitochondrial dysfunction and inflammation in Parkinson’s disease. </p>