Allergic asthma is characterized by airway hyperresponsiveness, inflammation, and a cellular infiltrate dominated by eosinophils. Numerous epidemiological studies have related the exacerbation of allergic asthma with an increase in ambient inhalable particulate matter from air pollutants. This is because inhalable particles efficiently deliver airborne allergens deep into the airways, where they can aggravate allergic asthma symptoms. However, the cellular mechanisms by which inhalable particulate allergens (pAgs) potentiate asthmatic symptoms remain unknown, in part because most in vivo and in vitro studies exploring the pathogenesis of allergic asthma use soluble allergens (sAgs). Using a mouse model of allergic asthma, we found that, compared with their sAg counterparts, pAgs triggered markedly heightened airway hyperresponsiveness and pulmonary eosinophilia in allergen-sensitized mice. Mast cells (MCs) were implicated in this divergent response, as the differences in airway inflammatory responses provoked by the physical nature of the allergens were attenuated in MC-deficient mice. The pAgs were found to mediate MC-dependent responses by enhancing retention of pAg/IgE/FcεRI complexes within lipid raft–enriched, CD63(+) endocytic compartments, which prolonged IgE/FcεRI-initiated signaling and resulted in heightened cytokine responses. These results reveal how the physical attributes of allergens can co-opt MC endocytic circuitry and signaling responses to aggravate pathological responses of allergic asthma in mice. / Dissertation

Mais de 60% dos pacientes com Doença Pulmonar Obstrutiva Crônica (DPOC) podem apresentar hiper-responsividade brônquica. Entretanto, não se sabe se, além das vias aéreas, o tecido pulmonar periférico também apresenta uma resposta exagerada a um agonista na DPOC. No presente estudo foi investigado o comportamento mecânico in vitro e as alterações estruturais e inflamatórias do tecido pulmonar periférico de 10 pacientes com DPOC comparados com 10 controles não fumantes. Foram realizadas medidas de resistência (R) e elastância (E) de fatias pulmonares em situação basal e após desafio com Acetilcolina. Também foram analisados no tecido alveolar as densidades de neutrófilos, eosinófilos, macrófagos, mastócitos e linfócitos CD8+ e CD4+, além do conteúdo de células positivas para -actina de músculo liso, fibras elásticas e colágenas. Os valores de R após o tratamento com Acetilcolina (RACh) e a porcentagem de aumento de resistência (%R) foram significativamente maiores no grupo DPOC comparado ao grupo controle (p0,03). O grupo DPOC também apresentou densidade de macrófagos (p=0,04) e linfócitos CD8+ (p=0,017) significativamente maior e conteúdo de fibras elásticas significativamente menor (p=0,003) comparado ao grupo controle. Foi observada uma correlação positiva significativa entre a %R e a densidade de eosinófilos e linfócitos CD8+ (r=0,608, p=0,002; e r=0,581, p=0,001, respectivamente), e também uma correlação negativa significativa entre a %R e a relação VEF1/ CVF (r=-0,451, p<0,05). Concluímos que a resposta colinérgica de fatias de parênquima pulmonar está aumentada em pacientes com doença pulmonar obstrutiva crônica e parece estar relacionada tanto à densidade de eosinófilos e de linfócitos CD8+ no tecido alveolar quanto ao grau de obstrução determinado pela prova de função pulmonar. / Up to 60% of COPD patients can present airway hyperresponsiveness. However, it is not known whether the peripheral lung tissue also presents an exaggerated response to agonists in COPD. In this study we investigated the in vitro mechanical behavior and structural and inflammatory changes of peripheral lung tissue of 10 COPD patients and compared to 10 non-smoking controls. We measured resistance (R) and elastance (E) of lung strips at baseline and after acetylcholine (ACh) challenge. We further assessed the alveolar tissue density of neutrophils, eosinophils, macrophages, mast cells and CD8+ and CD4+ cells, and the content of -smooth muscle actin+ cells, elastic fibers and collagen fibers. Values of R after ACh treatment (RACh) and percent increase of tissue resistance (%R) were significantly higher in COPD group compared to controls (p0.03). There was a significantly higher density of macrophages (p=0.04) and CD8+ cells (p=0.017) and a lower elastic fiber content (p=0.003) in COPD group compared to controls. We observed a significant positive correlation between %R and eosinophil and CD8+ cells density (r=0.608, p=0.002; and r=0.581, p=0.001, respectively), and also a negative correlation between %R and FEV1/FVC (r=-0.451, p<0.05). We conclude that the cholinergic responsiveness of parenchymal lung strips is increased in COPD patients and seems to be related to alveolar tissue eosinophilic and CD8 lymphocytic inflammation and also to the degree of airway obstruction at pulmonary function test.

Introdução: A asma é caracterizada por um processo inflamatório crônico que está associado ao desenvolvimento da hiperresponsividade brônquica (HRB). O exercício físico regular proporciona inúmeros benefícios aos pacientes com asma porém, os efeitos do treinamento físico na HRB permanecem pouco compreendidos. Objetivo: Avaliar o efeito do treinamento físico aeróbio na hiperresponsividade brônquica, inflamação pulmonar, controle clínico e fatores relacionados à qualidade de vida de pacientes adultos com asma persistente moderada a grave. Métodos: Cinquenta e oito adultos com asma moderada a grave foram divididos aleatoriamente, em dois grupos: Controle (GC, n=28) e Treinado (GT, n=30). Os pacientes do GC foram submetidos a um programa educacional e a um programa de exercícios respiratórios, enquanto os pacientes do GT foram submetidos a todos os procedimentos do GC e a um programa de condicionamento físico aeróbio. A hiperresponsividade brônquica foi avaliada através do teste de broncoprovocação inespecífica com histamina antes e após a intervenção. Nestas ocasiões, todos os pacientes também realizaram, análise do escarro induzido e da fração exalada de óxido nítrico, espirometria, teste ergoespirométrico e responderam aos questionários de controle clínico, fatores de saúde relacionados à qualidade de vida (FSRQV) e níveis de depressão. Além disso, foi coletada uma amostra do sangue venoso dos pacientes para quantificação do IgE total e de IgE específica. Resultados: Após três meses de intervenção, os pacientes do GT aumentaram 1 dupla dose de concentração (dd) (1 dd; 0,3-1,7 dd, 95% CI) (p < 0,05) enquanto o GC (0,06 dd; -0,6dd a 0,7 dd, 95% CI) não apresentou mudança significativa na hiperresponsividade brônquica. A inflamação pulmonar reduziu apenas nos pacientes do GT que apresentaram níveis elevados de eosinófilos (> 3%) e FeNO (> 26ppb) (p < 0,05). O condicionamento aeróbio melhorou os FSRQV, controle clínico da asma e níveis de depressão (p < 0,05). Conclusão: Nossos resultados demonstram que o treinamento aeróbio tem um efeito anti-inflamatório importante na asma e deve ser considerado como um tratamento complementar para o manejo da doença / Introduction: Asthma is characterized by a chronic inflammatory process that is associated with the development of bronchial hyperresponsiveness (BHR). Regular exercise provides numerous benefits in patients with asthma; however, the effects of exercise training on BHR remain poorly understood. Objective: To evaluate the effect an aerobic training on bronchial hyperresponsiveness, pulmonary inflammation, clinical control and health related quality of life (HRQoL) in adults patients with moderate to severe asthma. Methods: Fifty-eigth patients adults with moderate to severe asthma were randomly assigned into two groups: Control (CG, n = 28) and Trained (TG, n = 30).The GC patients undertake an educational program and performed breathing exercises, while the TG patients underwent the same procedures than CG plus an aerobic training program. Bronchial hyperresponsiveness was assessed by nonspecific bronchial provocation test with histamine before and after the intervention. On these occasions, all patients also performed induced sputum analysis and fractional exhaled nitric oxide (FeNO), spirometry, cardiopulmonary exercise testing and fulfilled questionnaires to evaluate clinical control test, HRQoL and depression levels. In addition, blood samples were collect in order to quantify total serum immunoglobulin (IgE) and specific IgE. Results: After 3 months of intervention, the TG increased 1 double dose of concentration (dd) (0.3 to 1.7 dd, 95% IC) and CG did not change significantly on bronchial hyperresponsiveness 0.06 dd (-0.6 to 0.7 dd, 95% IC) (p < 0.05).The pulmonary inflammation reduced only in the GT patients with high levels of eosinophils (> 3%) and FeNO (> 26ppb) (p < 0.05). Aerobic training also improved HRQoL, clinical control and depression levels (p < 0.05).Conclusion: Our results demonstrate that aerobic training exercise has a significant anti-inflammatory effect on asthma and should be considered as a complementary treatment for disease management

Introdução: A asma é caracterizada por um processo inflamatório crônico que está associado ao desenvolvimento da hiperresponsividade brônquica (HRB). O exercício físico regular proporciona inúmeros benefícios aos pacientes com asma porém, os efeitos do treinamento físico na HRB permanecem pouco compreendidos. Objetivo: Avaliar o efeito do treinamento físico aeróbio na hiperresponsividade brônquica, inflamação pulmonar, controle clínico e fatores relacionados à qualidade de vida de pacientes adultos com asma persistente moderada a grave. Métodos: Cinquenta e oito adultos com asma moderada a grave foram divididos aleatoriamente, em dois grupos: Controle (GC, n=28) e Treinado (GT, n=30). Os pacientes do GC foram submetidos a um programa educacional e a um programa de exercícios respiratórios, enquanto os pacientes do GT foram submetidos a todos os procedimentos do GC e a um programa de condicionamento físico aeróbio. A hiperresponsividade brônquica foi avaliada através do teste de broncoprovocação inespecífica com histamina antes e após a intervenção. Nestas ocasiões, todos os pacientes também realizaram, análise do escarro induzido e da fração exalada de óxido nítrico, espirometria, teste ergoespirométrico e responderam aos questionários de controle clínico, fatores de saúde relacionados à qualidade de vida (FSRQV) e níveis de depressão. Além disso, foi coletada uma amostra do sangue venoso dos pacientes para quantificação do IgE total e de IgE específica. Resultados: Após três meses de intervenção, os pacientes do GT aumentaram 1 dupla dose de concentração (dd) (1 dd; 0,3-1,7 dd, 95% CI) (p < 0,05) enquanto o GC (0,06 dd; -0,6dd a 0,7 dd, 95% CI) não apresentou mudança significativa na hiperresponsividade brônquica. A inflamação pulmonar reduziu apenas nos pacientes do GT que apresentaram níveis elevados de eosinófilos (> 3%) e FeNO (> 26ppb) (p < 0,05). O condicionamento aeróbio melhorou os FSRQV, controle clínico da asma e níveis de depressão (p < 0,05). Conclusão: Nossos resultados demonstram que o treinamento aeróbio tem um efeito anti-inflamatório importante na asma e deve ser considerado como um tratamento complementar para o manejo da doença / Introduction: Asthma is characterized by a chronic inflammatory process that is associated with the development of bronchial hyperresponsiveness (BHR). Regular exercise provides numerous benefits in patients with asthma; however, the effects of exercise training on BHR remain poorly understood. Objective: To evaluate the effect an aerobic training on bronchial hyperresponsiveness, pulmonary inflammation, clinical control and health related quality of life (HRQoL) in adults patients with moderate to severe asthma. Methods: Fifty-eigth patients adults with moderate to severe asthma were randomly assigned into two groups: Control (CG, n = 28) and Trained (TG, n = 30).The GC patients undertake an educational program and performed breathing exercises, while the TG patients underwent the same procedures than CG plus an aerobic training program. Bronchial hyperresponsiveness was assessed by nonspecific bronchial provocation test with histamine before and after the intervention. On these occasions, all patients also performed induced sputum analysis and fractional exhaled nitric oxide (FeNO), spirometry, cardiopulmonary exercise testing and fulfilled questionnaires to evaluate clinical control test, HRQoL and depression levels. In addition, blood samples were collect in order to quantify total serum immunoglobulin (IgE) and specific IgE. Results: After 3 months of intervention, the TG increased 1 double dose of concentration (dd) (0.3 to 1.7 dd, 95% IC) and CG did not change significantly on bronchial hyperresponsiveness 0.06 dd (-0.6 to 0.7 dd, 95% IC) (p < 0.05).The pulmonary inflammation reduced only in the GT patients with high levels of eosinophils (> 3%) and FeNO (> 26ppb) (p < 0.05). Aerobic training also improved HRQoL, clinical control and depression levels (p < 0.05).Conclusion: Our results demonstrate that aerobic training exercise has a significant anti-inflammatory effect on asthma and should be considered as a complementary treatment for disease management

Mais de 60% dos pacientes com Doença Pulmonar Obstrutiva Crônica (DPOC) podem apresentar hiper-responsividade brônquica. Entretanto, não se sabe se, além das vias aéreas, o tecido pulmonar periférico também apresenta uma resposta exagerada a um agonista na DPOC. No presente estudo foi investigado o comportamento mecânico in vitro e as alterações estruturais e inflamatórias do tecido pulmonar periférico de 10 pacientes com DPOC comparados com 10 controles não fumantes. Foram realizadas medidas de resistência (R) e elastância (E) de fatias pulmonares em situação basal e após desafio com Acetilcolina. Também foram analisados no tecido alveolar as densidades de neutrófilos, eosinófilos, macrófagos, mastócitos e linfócitos CD8+ e CD4+, além do conteúdo de células positivas para -actina de músculo liso, fibras elásticas e colágenas. Os valores de R após o tratamento com Acetilcolina (RACh) e a porcentagem de aumento de resistência (%R) foram significativamente maiores no grupo DPOC comparado ao grupo controle (p0,03). O grupo DPOC também apresentou densidade de macrófagos (p=0,04) e linfócitos CD8+ (p=0,017) significativamente maior e conteúdo de fibras elásticas significativamente menor (p=0,003) comparado ao grupo controle. Foi observada uma correlação positiva significativa entre a %R e a densidade de eosinófilos e linfócitos CD8+ (r=0,608, p=0,002; e r=0,581, p=0,001, respectivamente), e também uma correlação negativa significativa entre a %R e a relação VEF1/ CVF (r=-0,451, p<0,05). Concluímos que a resposta colinérgica de fatias de parênquima pulmonar está aumentada em pacientes com doença pulmonar obstrutiva crônica e parece estar relacionada tanto à densidade de eosinófilos e de linfócitos CD8+ no tecido alveolar quanto ao grau de obstrução determinado pela prova de função pulmonar. / Up to 60% of COPD patients can present airway hyperresponsiveness. However, it is not known whether the peripheral lung tissue also presents an exaggerated response to agonists in COPD. In this study we investigated the in vitro mechanical behavior and structural and inflammatory changes of peripheral lung tissue of 10 COPD patients and compared to 10 non-smoking controls. We measured resistance (R) and elastance (E) of lung strips at baseline and after acetylcholine (ACh) challenge. We further assessed the alveolar tissue density of neutrophils, eosinophils, macrophages, mast cells and CD8+ and CD4+ cells, and the content of -smooth muscle actin+ cells, elastic fibers and collagen fibers. Values of R after ACh treatment (RACh) and percent increase of tissue resistance (%R) were significantly higher in COPD group compared to controls (p0.03). There was a significantly higher density of macrophages (p=0.04) and CD8+ cells (p=0.017) and a lower elastic fiber content (p=0.003) in COPD group compared to controls. We observed a significant positive correlation between %R and eosinophil and CD8+ cells density (r=0.608, p=0.002; and r=0.581, p=0.001, respectively), and also a negative correlation between %R and FEV1/FVC (r=-0.451, p<0.05). We conclude that the cholinergic responsiveness of parenchymal lung strips is increased in COPD patients and seems to be related to alveolar tissue eosinophilic and CD8 lymphocytic inflammation and also to the degree of airway obstruction at pulmonary function test.

O aumento da prevalência de doenças alérgicas como a asma, tem sido atribuído à falta de estímulos infecciosos. A atopia, que embasa as manifestações alérgicas, caracteriza-se por uma disfunção imune com predomínio da resposta do tipo Th2. Experimentos em modelos animais com micobactérias e seus produtos têm demonstrado resultados promissores na proteção e reversão de resposta imune do tipo Th2. A imunoterapia para alérgenos inalatórios tem mostrado resultados positivos e o uso do BCG como adjuvante poderia trazer benefícios adicionais. Em estudo randomizado duplo cego foram avaliados 21 indivíduos de ambos os sexos, com idades de 8 a 17 anos sensibilizados ao Dermatophagoides pteronissynus (Dpt) e portadores de asma leve ou moderada persistentes. Os pacientes foram divididos em dois grupos e tratados com imunoterapia específica (ITE) para Dpt. O Grupo A recebeu como adjuvante, no início da ITE, uma aplicação do diluente do BCG e o Grupo B uma dose da vacina BCG. Na avaliação realizada após o período de indução da ITE constatou-se nos dois grupos diminuição significativa dos sintomas, da necessidade de medicação para asma, da hiperreatividade brônquica inespecífica, da reatividade cutânea ao Dpt juntamente com a melhora da função pulmonar. Houve uma redução no índice de estimulação da cultura de células mononucleares do sangue periférico estimuladas com Dpt, acompanhada de uma elevação da IL-10 no sobrenadante e dos níveis da IgG específica para Dpt e da IgE total. Os eosinófilos, a IgE específica para Dpt do sangue e o óxido nítrico no ar exalado não se alteraram. Não houve diferença na comparação dentre os grupos, exceto na proliferação das células mononucleares do sangue periférico estimuladas com PPD, que foi maior no Grupo B. Conclusão: a ITE levou a resultados satisfatórios com melhora clínica e alterações imunológicas já ao final do período de indução. A avaliação do uso do BCG como adjuvante, não mostrou benefícios adicionais. / The increase of allergic diseases, such as asthma, has often been explained by a decline in infectious stimulation. Atopy that is characterized as an immune dysfunction promotes a strong type Th2 immune response and underlines allergic diseases. Experimental animal models researches with mycobacteria and its products had led to promising results in prevention or reversion of type Th2 response. Positive results have been obtained to allergens specific immunotherapy (SIT) and its association with BCG vaccine, as an adjuvant, could promote additional benefits. In a randomized double blind study 21 patients sensitized to mite Dermatophagoides pteronyssinus (Dpt) with mild or moderate persistent asthma, aged 8 to 17 years of both sex were evaluated. Patients were divided in two groups. Group A received at the beginning of SIT one dose of BCG diluent and Group B one dose of BCG vaccine. After the SIT induction period we observed in both groups a significant decrease in asthma symptoms, bronchial hyperreactivity, immediate cutaneous reactivity to Dpt and the necessity of drugs intake. Specific lymphoproliferation against Dpt significantly decreased while IL-10 levels, specific IgG and total IgE increased. Blood eosinophils, specific IgE, others immunoglobulins levels and nitric oxide in exhaled air didn\'t change. There were no differences in all parameters evaluated between the two groups except on specific lymphoproliferation against PPD that was higher in Group B. Conclusions: improvement in symptoms and immunologicals changes where observed at the end of SIT induction period. BCG as adjuvant didn\'t add additional benefits.

O aumento da prevalência de doenças alérgicas como a asma, tem sido atribuído à falta de estímulos infecciosos. A atopia, que embasa as manifestações alérgicas, caracteriza-se por uma disfunção imune com predomínio da resposta do tipo Th2. Experimentos em modelos animais com micobactérias e seus produtos têm demonstrado resultados promissores na proteção e reversão de resposta imune do tipo Th2. A imunoterapia para alérgenos inalatórios tem mostrado resultados positivos e o uso do BCG como adjuvante poderia trazer benefícios adicionais. Em estudo randomizado duplo cego foram avaliados 21 indivíduos de ambos os sexos, com idades de 8 a 17 anos sensibilizados ao Dermatophagoides pteronissynus (Dpt) e portadores de asma leve ou moderada persistentes. Os pacientes foram divididos em dois grupos e tratados com imunoterapia específica (ITE) para Dpt. O Grupo A recebeu como adjuvante, no início da ITE, uma aplicação do diluente do BCG e o Grupo B uma dose da vacina BCG. Na avaliação realizada após o período de indução da ITE constatou-se nos dois grupos diminuição significativa dos sintomas, da necessidade de medicação para asma, da hiperreatividade brônquica inespecífica, da reatividade cutânea ao Dpt juntamente com a melhora da função pulmonar. Houve uma redução no índice de estimulação da cultura de células mononucleares do sangue periférico estimuladas com Dpt, acompanhada de uma elevação da IL-10 no sobrenadante e dos níveis da IgG específica para Dpt e da IgE total. Os eosinófilos, a IgE específica para Dpt do sangue e o óxido nítrico no ar exalado não se alteraram. Não houve diferença na comparação dentre os grupos, exceto na proliferação das células mononucleares do sangue periférico estimuladas com PPD, que foi maior no Grupo B. Conclusão: a ITE levou a resultados satisfatórios com melhora clínica e alterações imunológicas já ao final do período de indução. A avaliação do uso do BCG como adjuvante, não mostrou benefícios adicionais. / The increase of allergic diseases, such as asthma, has often been explained by a decline in infectious stimulation. Atopy that is characterized as an immune dysfunction promotes a strong type Th2 immune response and underlines allergic diseases. Experimental animal models researches with mycobacteria and its products had led to promising results in prevention or reversion of type Th2 response. Positive results have been obtained to allergens specific immunotherapy (SIT) and its association with BCG vaccine, as an adjuvant, could promote additional benefits. In a randomized double blind study 21 patients sensitized to mite Dermatophagoides pteronyssinus (Dpt) with mild or moderate persistent asthma, aged 8 to 17 years of both sex were evaluated. Patients were divided in two groups. Group A received at the beginning of SIT one dose of BCG diluent and Group B one dose of BCG vaccine. After the SIT induction period we observed in both groups a significant decrease in asthma symptoms, bronchial hyperreactivity, immediate cutaneous reactivity to Dpt and the necessity of drugs intake. Specific lymphoproliferation against Dpt significantly decreased while IL-10 levels, specific IgG and total IgE increased. Blood eosinophils, specific IgE, others immunoglobulins levels and nitric oxide in exhaled air didn\'t change. There were no differences in all parameters evaluated between the two groups except on specific lymphoproliferation against PPD that was higher in Group B. Conclusions: improvement in symptoms and immunologicals changes where observed at the end of SIT induction period. BCG as adjuvant didn\'t add additional benefits.

L'asma és una malaltia d'etiologia complexa, formada per factors genètics i ambientals, on la interrelació de ambdós factors mitjançant interaccions gen-ambient juga un paper clau. L'objectiu d'aquesta tesi ha sigut aprofundir en el coneixement del paper dels polimorfismes genètics, i la seva interacció amb factors ambientals, en la ocurrència d'asma, atòpia i hiperreactivitat bronquial. Aquest objectiu ha estat desenvolupat a través de la replicació de variants genètiques prèviament identificades, l'avaluació d'interaccions gen-ambient i la identificació de nous gens de susceptibilitat mitjançant un disseny basat en el genotipatge de variants genètiques all llarg del genoma en pools d'ADN. La tesi ha estat majoritàriament duta a terme dins l'estudi European Community Respiratory Health Survey (ECRHS) que està comprès per 5.000 individus seguits durant 9 anys, pels quals es disposa d'un qüestionari complet sobre símptomes respiratoris, avaluacions clíniques, informació sobre exposicions ambientals i mostres de ADN. Aquesta tesi a replicat l'associació del polimorfismes dels gens TNFA i NPSR1 amb asma. A més s'han establert les interaccions entre TNFA i obesitat, NQO1 i contaminació atmosfèrica, i NPSR1 i edat d'inici d'asma. L'anàlisi de pools d' ADN ha permès associar la regió on es situa el gen SGK493 amb atòpia. Aquesta tesi contribueix al coneixement de l'etiologia d'asma amb la identificació i replicació d'associacions genètiques i interaccions gen-ambient. / Asthma is a disease with a complex etiology, involving multiple genetic and environmental factors, and with an important role of the interplay of these factors through gene-environment interactions. In this thesis I aimed to advance our knowledge on the importance of genetic polymorphisms and their interaction with environmental data for the occurrence of asthma and related phenotypes (atopy and bronchial hyperreactivity). This objective was developed through the replication of genetic associations previously reported, the assessment of gene-environment interactions and the identification of new susceptibility genes using genome-wide analysis based on a pooling DNA strategy. The thesis was, mostly, performed within the European Community Respiratory Health Survey (ECRHS). This cohort has information and DNA samples from approximately 5,000 adult subjects followed-up for 9 years, with extensive questionnaires on respiratory symptoms, clinical evaluations and information on environmental exposures. This thesis replicates previous effects on asthma of polymorphisms in TNFA and NPSR1 genes. In addition, interactions have been established between TNFA and obesity, NQO1 and air-pollution, and NPSR1 and age at onset of asthma. The approach based on genome-wide analysis of DNA pools identified the SGK493 region being associated with atopy. This thesis contributes to the understanding of the etiology of asthma through the identification and replication of genetic associations and gene-environment interactions.