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Autotransplante da fração mononuclear da medula ossea em úlcera corneana por hidróxido de sódio experimental em cães / Bone marrow mononuclear fraction autotransplant on experimental sodium hydroxide corneal ulcer in dogsTognoli, Guilherme Kanciukaitis 26 February 2008 (has links)
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The bone marrow (BM)adult stem cell, mainly the mononuclear cell (MC) fraction, calls great interest in tissue regeneration researches in veterinary medicine, among those, works with experimental corneal ulcers. It is believed that the limbus represents the main stem cell source to replace damaged corneal cells, however, the number of animals showing limbal deficiency with subsequent conjunctivalization increases every day. This condition can be developed for several reasons, where the alkali burn is the most common. Aiming to conduct a study about transplanted BM MC presence confirmation, the homing process and to histopathologically compare the treated and sham groups, an experimental alkali corneal ulcer model, associated with the autologous MC transplant was used. Sixteen male or female, stray dogs, weithing around 10kg were submitted to experimental corneal ulcer, where the sodium hydroxide soaked filter discs alkali burn model was used. After the lesions, the animal were then submitted to subonjunctival autologous BM MC transplantation. The mononuclear fraction was isolated by density gradient centrifugation at 678G for 30 minutes and marked with nanocrystals to engrafment and homing follow-up. The pos-operatory evaluation was made with imunofluorescence exams in the sixth day after the transplant and for histopathology after 15 days of the same procedure where it could be noticed that the MC fixed in the damaged area, there was no homing phenomenom and despite they reduce the local inflamation, the MC did not help the corneal epithelium cicatrization process in this short term evaluation. Thus BM MC transplant studies in corneal wounds are indicated. / As células-tronco adulta da medula óssea (MO), em particular a fração de células mononucleares (CM), despertam grande interesse nas pesquisas que visam regeneração tecidual na medicina veterinária, dentre elas, estudos com úlceras de córnea experimentais. Atualmente, acredita-se que o limbo representa a fonte de células-tronco para a reposição
de células corneanas lesadas, no entanto, o número de animais que apresentam deficiência límbica com conjuntivalização subseqüente aumenta a cada dia. Essa condição pode ser desenvolvida por diversas afecções, em que a queimadura por base é a mais comum. Visando realizar um estudo sobre a confirmação da presença das CM da MO
transplantadas, da ocorrência de quimiotaxia (homing) das mesmas e comparar histopatologicamente os grupos tratados e controles, utilizou-se um modelo experimental de
úlcera de córnea associado ao autotransplante de CM. Dezesseis cães machos ou fêmeas, sem raça definida, com peso ao redor de 10kg foram submetidos à ulceração experimental de córnea, em que o modelo de queimadura ocular por álcali com papel filtro embebido em hidróxido de sódio foi utilizado. Após a realização das lesões, os animais foram submetidos ao transplante subconjuntival de CM da MO, previamente isoladas. A fração mononuclear foi separada por centrifugação da MO com gradiente de densidade a 678G por 30 minutos e marcada com nanocristais para posterior acompanhamento dos processos de pega e quimiotaxia. A avaliação pós-operatória foi realizada por exames de imunofluorescência no sexto dia após o transplante e por histopatologia passados 15 dias do mesmo procedimento,
quando pode se notar que as CM fixaram-se na região lesionada, não sofreram quimiotaxia e, apesar de diminuírem a inflamação do local, não auxiliaram no processo de cicatrização
do epitélio corneano em curto prazo. Assim, sugere-se estudos adicionais no transplante de CM da MO na cicatrização da córnea .
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Efeito das células-tronco mesenquimais na modulação autonômica cardíaca e na sensibilidade do barorreflexo em ratos com insuficiência cardíaca / Effect of mesenchymal stem cells on cardiac autonomic modulation and baroreflex sensitivity in rats with heart failure.Sharon Del Bem Velloso de Morais 20 October 2015 (has links)
As doenças cardiovasculares estão entre as principais causas de morte, principalmente aquelas decorrentes do infarto do miocárdio (IM). A terapia com células-tronco tem mostrado resultados promissores após o IM em estudos clínicos e experimentais, especialmente as células-tronco mesenquimais (MSC), por apresentarem notável potencial pró-angiogênico, anti-fibrosante e imunomodulador. Entretanto, nenhum estudo foi realizado quanto à variabilidade da frequência cardíaca (VFC), tono autonômico e sensibilidade do barorreflexo, que são considerados fatores de risco apreciáveis, e se encontram atenuados na insuficiência cardíaca (IC) induzida pelo IM. Desta forma, o objetivo do presente trabalho foi examinar o efeito do transplante de MSC de medula óssea sobre a modulação autonômica e a sensibilidade do barorreflexo em ratos com IC, induzida pelo IM. Para isso, foi realizada a ligadura da artéria coronária esquerda em ratos Wistar machos (220-360g), e após dois a três dias foi feita a avaliação da área infartada pelo SPECT. As MSCs foram injetadas, intravenosamente, sete dias pós-IM. A função cardíaca foi analisada pela ventriculografia, antes e um mês após o transplante. Após a reavaliação da ventriculografia, os animais foram submetidos a registros eletrocardiográficos, após receberem eletrodos implantados subcutaneamente no dorso, e cânula na veia jugular esquerda para determinação farmacológica do tono autonômico. Também, foi implantada cânula na artéria femoral para registro da pressão arterial, e análise da sensibilidade do barorreflexo. Logo após os registros, os animais foram sacrificados para coleta do coração e análise histopatológica. Para a infusão, as MSCs foram caracterizadas, segundo critérios da Sociedade Internacional de Terapia Celular. A área de lesão induzida logo após a ligadura da artéria foi semelhante entre os animais. Um mês após o tratamento, o tamanho do infarto foi reduzido no grupo tratado com MSC. Verificou-se redução da fração de ejeção do ventrículo esquerdo (FEVE) após a ligadura coronariana, e previamente ao tratamento nos animais com IC. Um mês após a terapia com MSC, ou injeção de salina, não houve melhora da FEVE em ambos os grupos com IC. Os intervalos QT e QTc foram alongados pelo IM, enquanto as MSCs não tiveram efeito nestes parâmetros. A VFC mostrou redução do desvio padrão de valores sucessivos (SDNN) do intervalo RR (iRR) e a raiz quadrada da média da soma dos quadrados das diferenças de valores sucessivos (RMSSD) do iRR pós-IM, enquanto as MSCs preveniram essa redução. Na análise espectral, os espectros do iRR, após o infarto, mostraram potências menores, em unidades absolutas, das bandas de baixa frequência, LF, e alta frequência, HF, enquanto que as MSCs promoveram um aumento destes parâmetros. Os métodos não-lineares da VFC mostraram redução na entropia, e aumento da análise de flutuação depurada de tendência (DFA) do iRR pós-IM. A terapia com MSC preveniu a alteração da entropia e, também, protegeu o DFA. A frequência cardíaca foi semelhante entre os grupos; entretanto, a frequência intrínseca de marca-passo apresentou-se reduzida no grupo IC, enquanto o tratamento com MSC preservou esta atenuação. Foi observado menor tono vagal no grupo IC não tratado, enquanto o tratamento com MSC aumentou o tono vagal. O tono simpático não apresentou diferença entre os grupos. A sensibilidade do barorreflexo à bradicardia foi reduzida na IC, enquanto que as MSC preveniram essa redução. O colágeno intersticial apresentou-se aumentado na IC, mas não no grupo tratado com MSC. A pressão arterial (PA) sistólica, a PA média e os parâmetros da variabilidade da PA: SDNN e LF encontraram-se reduzidas nos grupos com IC, tratados ou não com MSC. Em conjunto, esses dados demonstram que a terapia com MSC reduziu a extensão do infarto e a fibrose intersticial no miocárdio remanescente do ventrículo esquerdo. Além disso, melhorou a modulação autonômica colinérgica do coração, a VFC e a sensibilidade barorreflexa. / Cardiovascular diseases are among the leading causes of death, especially those resulting from myocardial infarction (MI). Stem cell therapy has shown promising results after MI in both patients and experimental animals, especially those using mesenchymal stem cells (MSC), which present potential pro-angiogenic, anti-fibrotic and immunomodulatory. However, no studies have been conducted on the heart rate variability (HRV), autonomic tone and baroreflex sensitivity, which are considered risk factors and are attenuated in heart failure (HF) induced by MI. Thus, the main of this study was to examine the effect of bone marrow MSC transplantation on autonomic modulation and baroreflex sensitivity in rats with HF, induced by MI. Therefore, it was performed ligation of the left coronary artery of male Wistar rats (220-360g) and after two to three days, assessment was made of the area infarcted by SPECT. MSC were injected intravenously seven days post-MI. Cardiac function was assessed by ventriculography before and one month after transplantation. After reassessing the ventriculography, the animals underwent electrocardiographic recordings after receiving electrodes implanted subcutaneously on the back, and cannula in the left jugular vein for drug determination of autonomic tone. Also, cannula was implanted in the femoral artery for blood pressure recording and analysis of baroreflex sensitivity. Soon after the records, the animals were sacrificed for collection of the heart and histopathological analysis. For infusion, the MSC were characterized according to the criteria of the International Society for Cellular Therapy. The lesion area induced soon after artery ligation was similar among animals. One month after treatment, infarct size was reduced in the group treated with MSC. A reduction was observed in left ventricular ejection fraction (LVEF) after coronary ligation, and prior to treatment in HF animals. One month after the MSC therapy, or saline injection, there was no improvement in LVEF in both groups with HF. The QT and corrected QT intervals were lengthened by IM, while the MSC had no effect on these parameters. HRV showed a reduction in the standard deviation of successive values (SDNN) of the RR interval (RRi), and the root mean square of the successive (RMSSD) RRi after MI, while the MSC prevented this reduction. In spectral analysis, the RRi spectra, after infarction, showed lower power, in absolute units, of the low frequency, LF, and high frequency band, HF, while MSCs promoted an increase in these parameters. Nonlinear methods of HRV showed a reduction in entropy, and increased detrended fluctuation analysis (DFA) of RRi, post-MI. The MSC therapy prevented the change of entropy and also protected DFA. Heart rate was similar in both groups; however, the intrinsic heart rate was reduced in HF group, while treatment with MSC preserved this attenuation. A lower vagal tone was observed in HF untreated group, while treatment with MSC increased vagal tone. The sympathetic tone did not differ between groups. The baroreflex sensitivity to bradycardia was reduced in HF, while the MSC prevented this reduction. The interstitial collagen was increased in HF, but not in the group treated with MSC. Systolic blood pressure (BP), the mean BP and parameters of BP variability: SDNN and LF were reduced in the groups with HF, treated or not with MSC. Together, these data demonstrate that MSC therapy reduced the infarct size and interstitial fibrosis in the remaining myocardium of the left ventricle. In addition, the cells improved cholinergic autonomic modulation of the heart, heart rate variability and baroreflex sensitivity.
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Hemopoese em desnutrição proteica: caracterização do estroma medular e avaliação da participação do cálcio / Hematopoiesis in protein malnutrition: characterization of bone marrow stroma and evaluation of calcium participation.Ed Wilson Cavalcante Oliveira Santos 11 April 2018 (has links)
A desnutrição proteica continua sendo um dos principais problemas nutricionais do mundo. Trabalhos de nosso laboratório e de outros autores evidenciam que entre as alterações presentes na desnutrição proteica, está a alteração do tecido hemopoético, com modificações em componentes da matriz extracelular, alterações no ciclo celular da célula tronco/progenitora hemopoética, redução da produção de precursores hemopoéticos, tanto na série eritrocitária como na série leucocitária, levando a anemia e leucopenia. Os mecanismos de participação do Ca2+ nas células da medula óssea são pouco conhecidos, porém, sabe-se que ele atua no processo de hemopoese. Têm sido descrito que elevações da concentração de Ca2+ citoplasmático induzem a proliferação e diferenciação de células mielóides. A ação dessa via em indivíduos desnutridos também é pouco conhecida. Este estudo tem como objetivo avaliar o estabelecimento da celularidade medular in vitro, bem como investigar mecanismos moleculares envolvidos na proliferação e diferenciação dessa celularidade, além de avaliar a ação do cálcio na presença da interleucina-3 em células-tronco hemopoéticas murinas e sua modulação para avaliar alterações na via das MAPKs. Camundongos C57BL/6, machos e adultos foram submetidos à desnutrição proteica e, após a perda de aproximadamente 20% de seu peso corporal, as células da medula óssea foram colhidas. Essas células foram imunofenotipadas, além de reagirem com anticorpos específicos para caracterização da célula-tronco hemopoética e proteínas da via de sinalização de cálcio intracelular. Observamos que a celularidade do estroma medular em cultura de longa duração de animais desnutridos é alterada, principalmente em células de origem mesenquimal, que aparecem em maior número em desnutridos ao longo dos dias de cultura. Além disso, as ondas de cálcio intracelular estavam diminuídas em animais desnutridos, bem como as proteínas p-PKC, p-PLCy, CAMKII, p-AKT e p-STAT5 não respondem ao estímulo de IL-3, levando a uma deficiência da expressão das MAPK: ERK 1/2, JNK e p38. A desnutrição proteica pode causar alterações na celularidade estromal da medula óssea e na diferenciação das células tronco hemopoéticas pela via das MAPKs estimulada por IL-3. / Protein malnutrition remains one of the world\'s major nutritional problems. Studies from our laboratory and others shown that alterations in protein malnutrition include hemopoietic tissue alterations, changes in extracellular matrix components, changes in the hemopoietic stem/progenitor cell tissue, reduction in the production of hemopoietic precursors, in the erythroid series as in the mieloyd series, leading to anemia and leukopenia. Mechanisms of Ca2+ participation in bone marrow cells are poorly understood, but no hemopoiesis has been developed. Elevations of cytoplasmic Ca2+ concentration in proliferation and differentiation of myeloid cells were included. Such an action through malnourished animals is also a little known. This study aims to evaluate the establishment of cellularity in vitro as well as investigate the molecular involvement in cell proliferation and differentiation, as well as to evaluate the action of calcium in the presence of IL-3 in hemopoietic stem cells and its modulation by analytical evaluations in the MAPKs pathway. C57BL/6, male adult mices were subjected to protein restriction and, after loss of approximately 20% of their body weight, bone marrow cells were harvested. These were immunophenotyped in addition to specific activation terms for the hemopoietic stem cell and intracellular signaling pathway proteins. We observed that the bone marrow cells in long-term culture of malnourished animals is altered, mainly in cells of mesenchymal origin, which appears in greater numbers in undernourished throughout the days of culture. In addition, as intracellular calcium waves decreased in malnourished animals, as well as the p-PKC, p-PLC, CAMKII, p-AKT and p-STAT5 proteins did not respond to IL-3, sugesting expression of the expression of MAPK: ERK 1/2, JNK and p38. Protein malnutrition may have changes in bone marrow capacity and differentiation of hemopoietic stem cells through IL-3-stimulated MAPKs.
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Avaliação de aspectos regulatórios da hematopoese em desnutrição proteico-energética experimental: papel das células endoteliais derivadas das células tronco mesenquimais medulares / Evaluation of hematopoietic regulatory aspects in experimental protein-energy malnutrition: the role of endothelial cells derived from bone marrow mesenchymal stem cells.Araceli Aparecida Hastreiter 22 September 2014 (has links)
A desnutrição proteico-energética (DPE) provoca anemia e leucopenia decorrente da redução de precursores hematopoéticos e comprometimento da produção de mediadores indutores da hematopoese, bem como alterações estruturais e ultra-estruturais na matriz extracelular medular. A hematopoese ocorre em nichos medulares distintos - endosteal e perivascular - que modulam os processos de diferenciação, proliferação e auto-renovação da célula tronco hematopoética (CTH). As células tronco mesenquimais (CTM) tem um papel importante na formação destes nichos, através da sua diferenciação nos diversos tipos celulares que os compõe. Adicionalmente, a CTM pode modular a função de outras células, como a CTH e a célula endotelial (CE) medular, através da liberação de diversos fatores de crescimento e citocinas. As CE expressam proteínas que regulam a diferenciação e movimentação das CTH na MO. Há sinais que a CTM pode ser a precursora da CE medulares, pois in vitro a CTM pode se diferenciar em CE-like. Desta forma, a CTM é um ponto chave no estudo das alterações causadas pela DPE no nicho perivascular e sobre a regulação da hematopoese. Neste trabalho, investigamos se a DPE afeta a diferenciação in vitro da CTM medular em CE-like e avaliamos se essas células apresentam diferentes capacidades em produzir alguns mediadores regulatórios da hematopoese (CXCL-12, SCF, Ang-1, IL-11, GM-CSF e TFG-β), bem como possíveis alterações no perfil de expressão gênica de marcadores de função das CTM e CE-like. Utilizamos camundongos C57BL/6 machos, divididos em grupos Controle e Desnutrido, sendo que o grupo Controle recebeu ração normoprotéica (12% caseína) e o grupo Desnutrido recebeu ração hipoprotéica (2% caseína), ambos durante 5 semanas. Após este período, os animais foram eutanasiados, foi realizada a avaliação nutricional e hematológica, caracterizando a DPE. As CTM foram isoladas, caracterizadas e diferenciadas in vitro em CE-like, o que foi evidenciado pela maior expressão gênica de NT5E, FLT1, KDR, PECAM1 e VCAM1. Avaliamos a expressão dos genes CDH5, CSPG4, LEPR, NES, CSF1, CSF2, CSF3, MCAM, PROM1, ANGPT1, CXCL12, ENG, IGF1, IL3, IL11, KITL, TGFB1, WNT3A, WNT5A, ICAM1, PDGFB1 e VWF. Encontramos alterações causadas pela DPE na expressão gênica e quantificação de CXCL-12, SCF e Ang-1, os quais mostraram que as células avaliadas do grupo Desnutrido encontram-se em um estado \"pró-proliferativo\", em um esforço para restabelecer a hematopoese na DPE. Entretanto, foi observado neste trabalho e nos demais trabalhos do grupo que há hipoplasia medular na DPE e, portanto, pode-se inferir que as alterações hematopoéticas observadas na DPE não são ocasionadas por alterações na síntese de SCF, CXCL-12 ou Ang-1. / Protein-energy malnutrition (PEM) causes anemia and leukopenia as it reduces hematopoietic precursors, impairs the production of mediators that induce hematopoiesis and alters structural and ultrastructural changes in bone marrow (BM) extracellular matrix. Hematopoiesis occurs in distinct BM niches - endosteal and perivascular - which modulate the processes of differentiation, proliferation and self-renewal of hematopoietic stem cell (HSC). Mesenchymal stem cells (MSC) play an important role in the formation of these niches through their differentiation in several cell types that compose them. Additionally, MSC can modulate the function of other cells, such as HSC and endothelial cells (EC), through the release of several growth factors and cytokines. The EC express proteins that regulate the differentiation and migration of HSC in the BM. MSC seem to be the precursor of medullary EC because in vitro MSC can differentiate into EC-like cells. Thus, MSC are a key point in the study of changes caused by DPE on the perivascular niche and on the regulation of hematopoiesis. In this study, we investigated whether PEM would affect BM-MSC in vitro differentiation into EC-like cells and evaluated whether these cells would have distinct capacities of producing some regulatory mediators of hematopoiesis (CXCL- 12, SCF, Ang-1, IL-11, GM -CSF and TFG-β), as well as analyzed possible changes in the gene expression profile of MSC function and EC-like cells related markers. C57BL/6 mice were divided into Control and Malnourished groups, which received for 5 weeks, respectively, a normal protein diet (12% casein) and a low protein diet (2% casein). After this period, animals were euthanized, nutritional and hematological evaluations were performed, featuring the PEM. MSC were isolated, characterized and differentiated in vitro into EC-like cells, which were evidenced by increased gene expression of NT5E, FLT1, KDR, PECAM1 and VCAM1. The expression of CDH5, CSPG4, LEPR, NES, CSF1, CSF2, CSF3, MCAM, PROM1, ANGPT1, CXCL12, ENG, IGF1, IL3, IL11, KITL, TGFB1, Wnt3a, WNT5A, ICAM1, PDGFB1 and VWF genes was also evaluated. Changes caused by PEM on gene expression and quantification of CXCL-12, SCF and Ang-1 were found, indicating that tested cells from the Malnourished group were in a \"pro-proliferative\" state in an effort to restore hematopoiesis. However, our results are in accordance to the literature regarding bone marrow hypoplasia as a consequence of PEM. Therefore, we infer hematopoietic changes observed in this work are not related to changes in the synthesis of SCF, 12 CXCL-12 or Ang-1.
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Cultura e caracterização de células do trofoblasto extraviloso (TEV) derivado da placenta humana a termo / Culture and characterization of extravillous trophoblast cells (EVT) derived from human term placentaIsabella Rodrigues Fernandes 14 December 2010 (has links)
A placenta é um anexo embrionário que tem atraído grande interesse como fonte de células-tronco para medicina regenerativa, devido à plasticidade fenotípica de alguns dentre os vários tipos celulares isolados a partir deste tecido. Apesar de terem a mesma origem, não fazem parte do embrião, portanto o uso da placenta como fonte de células embrionárias não provoca debates éticos. Uma característica que vale a pena mencionar, é que a placenta está envolvida na manutenção da tolerância do feto pelo organismo materno, pois contém células que apresentam propriedades imunomoduladoras. Por fim, o tecido placentário é disponibilizado após o parto e é geralmente descartado. Estas características tornam esse tecido de grande interesse para protocolos de terapia celular, tanto que tem surgido bancos de célulatronco de placenta humana. Alguns trabalhos demonstraram plasticidade de células extraídas da placenta, porém existe ainda a necessidade de se definir melhor a região de coleta e os métodos de extração e isolamento dessas células. Nosso grupo estabeleceu a cultura de células derivadas da região do trofoblasto extraviloso (TEV) de placenta humana a termo, que são as células responsáveis pelos mecanismos de imunotolerância materno-fetal. As células TEV apresentam os marcadores de pluripotencia Oct-4 e Nanog, e, portanto, podem reter mesmo extraídas da placenta a termo, alguma plasticidade celular, caracterizando-as como células-tronco. Entretanto, nossa experiência no cultivo destas células mostrou que existem limitações relacionadas ao tempo de cultivo celular e capacidade de proliferação das TEV, que certamente fornece argumentos sólidos para limitar o seu uso em protocolos de terapia celular em medicina regenerativa. / The placenta is attached embryo that has attracted great interest as a source of stem cells for regenerative medicine due to phenotypic plasticity of some of the various cell types isolated from this tissue. Despite having the same origin, they are not part of the embryo, so the use of placenta as a source of embryonic cells does not provoke ethical debates. A feature worth mentioning is that the placenta is involved in maintaining tolerance of the fetus by the mother, because it contains cells that have immunomodulatory properties. Finally, the placental tissue is present after birth and is usually discarded. These characteristics make this fabric of great interest for cell therapy protocols, which has emerged both banks of stem cells from human placenta. Some studies have demonstrated plasticity of cells extracted from the placenta, but there is still a need to better define the catchment area and the methods of extraction and isolation of these cells. Our group has established a culture of cells derived from the extravillous trophoblast region (TEV) from human placenta at term, which are the cells responsible for the mechanisms of maternalfetal immunotolerance. TEV cells have the pluripotency markers Oct-4 and Nanog, and therefore can retain, even extracted from the placenta at term, some cellular plasticity, characterizing them as stem cells. However, our experience in growing these cells showed that there are limitations related to the time of cell culture and proliferation capacity, which certainly provides strong arguments for limiting their use in cell therapy protocols in regenerative medicine.
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Identificação e validação funcional de novos alvos das PKCs em célula tronco embrionária / Identification and functional validation of new targets of PKC in embryonic stem cellMariana Lemos Duarte 02 August 2013 (has links)
Algumas das estratégias utilizadas para entender a biologia de células tronco embrionária (CTE) são baseadas na identificação de cascatas de sinalização que induzem a diferenciação e auto-renovação das CTE através da interferência seletiva de processos específicos. A família das proteínas quinase C (PKC) é conhecida por participar dos processos de auto-renovação e diferenciação celular em CTE, entretanto, o papel específico das diferentes isoenzimas das PKCs ainda precisa ser elucidado. Desta forma investigamos. o papel das PKCs atípicas (aPKCs) em CTE indiferenciadas utilizando um inibidor específico para estas serina/ treonina quinases, o peptídeo pseudossubstrato das aPKCs, e fosfoproteômica. A maioria das proteinas identificadas cuja fosforilação reduziu após o tratamento com o inibidor das aPKC, são proteínas envolvidas com o metabolismo principalmente com a via glicolítica. Além disso, a inibição das aPKCs levou a redução do consumo de glicose, secreção de lactato, acompanhada da redução da atividade da lactato desidrogenase, e aumento da fosforilação oxidativa, sendo analisada através do consumo de oxigênio após o tratamento com oligomicina e FCCP. Verificamos também que as aPKCs são capazes de fosforilar diretamente a piruvato quinase. A glicólise aeróbica parece ser fundamental para a manutenção da indiferenciação das CTE, e demonstramos que as aPKCs participam deste processo auxiliando na auto-renovação das CTE indiferenciadas. Também observamos que as aPKCs assim como a PKCβI modulam a fosforilação da α-tubulina, porém ao passo que as aPKCs interagem com a α-tubulina durante a interfase, a PKCβI interage com a mesma apenas durate a mitose. Estes resultados motivaram a segunda parte da tese, na qual o papel da fosforilação da α-tubulina pela PKCβI foi investigado. O resíduo de treonina 253, conservado em diversas espécies de vertebrados e localizado na interface de polimerização entre a α- e a β-tubulina foi identificado, como um novo sítio de fosforilação da α-tubulina pela PKCβI. Este sítio não está em um consenso linear para a PKC, entretanto é um consenso formado estruturalmente, onde aminoácidos básicos distantes na sequência linear se tornam justapostos na estrutura terciária da proteína. Estudos de simulação por dinâmica molecular demonstraram que a interação entre a α e β-tubulina aumenta após esta fosforilação, uma vez que T253 fosforilada passa a interagir com K105, um residuo conservado na β-tubulina. A fosforilação in vitro de α-tubulina aumenta a taxa de polimerização da tubulina e a inibição da PKCβI em células reduziu a taxa de repolimerização do microtubulo após o tratamento com nocodazol. Além disso, a importância da fosforilação deste sítio foi demonstrada pelo fato de que um mutante fosfomimético GFP-α-tubulina, T253E ser mais incorporado no fuso mitótico ao passo que T253A foi menos incorporado do que a proteína selvagem. Nossos dados suportam a hipótese que os consensos estruturais formados podem ser importantes sítios de reconhecimento pelas quinases e que a fosforilação de T253 da α-tubulina afeta a estabilidade do polímero. Em conclusão, utilizando métodos de fosfoproteômica e interferência seletiva de vias de sinalização, combinados a validações experimentais dos alvos identificados podemos propor a importância funcional das aPKCs e PKCβI em CTE indiferenciadas. / Some of the strategies used to understand stem cell biology are based on the identification of signalling cascades that lead to differentiation and self-renewal of embryonic stem cells (ESC) by selective interference of specific signalling processes. The protein kinase C (PKC) family is known to participate in ESC self-renewal and differentiation, however, the specific role of the different PKC isoenzymes in these cells remains to be determined. Therefore, we investigated the role of atypical PKCs (aPKC) in undifferntiated ESC using a specific inhibitor for these serine/ threonine kinases, pseudo-substrate peptide of aPKCs, and phosphoproteomics. The majority of proteins whose phosphorylation decreased upon aPKC inhibition, are proteins involved in metabolism in particular with the glycolytic pathway. Besides that, inhibiton of aPKCs led to a decrease in glucose uptake and lactate secretion, followed by a decrease in lactate dehydrogenase activity, and an increase in mitochondrial activity as measured by oxygen consumption after treatment with olygomycin and a chemical uncoupler. We also verified that aPKCs are able to directly phosphorylated pyruvate kinase. Aerobic glicolysis seems to be fundamental for the maintainance of undifferentiated ESC, and we demonstrated that aPKCs participte in these processes helping to maintain self-renewal of undifferentiated ESC. We also observed that aPKCs as PKCβI modulate the phosphorylation of α-tubulin, however, while aPKCs interact with α-tubulin during interfase PKCβI interacts with α-tubulin only during mitosis. These results lead to the second part of this thesis. We investigated the role of α-tubulina phosphorylation by PKCβI. Indentifying threonine 253, a conserved residue in several vertebrate species, of localized at the polymerization interface between α- and β-tubulin, as a phosphorylation site of α-tubulin by PKCβI. This site is not in a linear consensus for PKC, however, it is in a structuraly formed consensus, where basic aminoacids distant in the linear sequence are juxtaposed in the three dimentional protein structure. Simulation studies by molecular dynamics show that the interaction between α and β-tubulin increases upon this phosphorylation, once, phosphorylated T253 interacts with com K105, a conserved residue in β-tubulin. The in vitro phosphorylation of α-tubulin increased tubulin polymerization rate and inhibiton of PKCβI in cells reduced repolimeration rate of microtubles upon treatment with nocodazole. Besides that, the importance of this phosphorylation site were demonstrated by the fact that a phosphomimetic mutant GFP-α-tubulina, T253E is more incorporated in mitotic fuses while T253A is less than wild type. Our data support the hypothesis that structural consensus may be important sites recognized and that T253 phosphorylation of α-tubulin afects the polymer stability. In conclusion, using phosphoproteomics methods and selective interference of signal transduction pathways combined with experimental validation studies of the identified targets we can propose roles for aPKCs and PKCβI in undifferentiated ESC.
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Associação entre os valores do coeficiente de difusão aparente nas imagens de ressonância magnética ponderadas em difusão e marcadores prognósticos e de células tronco tumorais no câncer de mama em pacientes que realizaram quimioterapia neoadjuvante / Correlation among the values of apparent diffusion coefficient provided by diffusion-weighted magnetic resonance imaging, the cancer stem cells markers and the major prognostic factors in patients with invasive breast cancer treated with neoadjuvant chemotherapyOliveira, Tatiane Mendes Gonçalves de 08 April 2016 (has links)
As imagens de ressonância magnética (RM) ponderadas em Difusão são conhecidas como uma técnica funcional capaz de refletir alterações estruturais e celulares de neoplasias. No câncer de mama, a difusão e sua quantificação através dos valores do coeficiente de difusão aparente (CDA) têm sido utilizados para avaliar resposta tumoral após quimioterapia neoadjuvante (QTN). Os variados desfechos clínicos do câncer de mama, incluindo as diferentes respostas ao tratamento quimioterápico podem estar relacionados à heterogeneidade da doença. A presença das células tronco tumorais (CTT) é uma das hipóteses aceitas para explicar os diferentes comportamentos biológicos dos tumores. Este estudo buscou avaliar uma possível associação entre os valores de CDA nas neoplasias invasivas da mama e a presença de marcadores de CTT e os principais marcadores prognósticos da doença em pacientes tratadas com QTN. Foram avaliadas prospectiva e consecutivamente as imagens de RM pré-tratamento de 27 pacientes com câncer da mama que realizaram QTN seguida de cirurgia. Os valores de CDA média, p10, p25 e p50 foram obtidos através de duas mensurações, uma com único ROI e outra com múltiplos ROIs envolvendo toda extensão tumoral. Esses valores de CDA foram correlacionados: à quantificação por citometria de fluxo de CTT com fenótipos ESA+/CD44+/CD24-, células ESA+ com alta atividade ALDH1 e células ESA+/ABCG2+, à capacidade de formação de mamoesferas, e aos principais fatores prognósticos do câncer de mama, incluindo estágio clínico, doença axilar linfonodal, grau tumoral, receptores de estrógeno (RE), receptores de progesterona (RP) e superexpressão do HER2. Também foi realizada correlação dos valores de CDA com a resposta patológica completa após QTN. A presença de CTT, a capacidade de formação de mamoesferas e a resposta patológica completa não se correlacionaram aos valores de CDA. Para ambas as medidas e todos os parâmetros avaliados de CDA (x10-3mm2/s), os valores foram significantemente menores nos tumores com estágio clínico III e IV vs II (0,90±0,16; 1,02±0,18); com doença linfonodal após QTN vs axila livre (0,89±0,16; 1,01±0,17); RE+ vs RE- (0,90±0,16; 1,00±0,18); RP+ vs RP- (0,91±0,16; 0,98±0,18) e HER2+ vs HER2- (0,92±0,17;0,97±0,18). Tumores grau 1 apresentaram CDA com valores significativamente maiores em relação aos tumores grau 2 (diferença 0,18; CI: 0,03-0,33, p=0,02). Os valores de CDA dos tumores de mama pré-QTN não predizem a presença de CTT, a capacidade de formação de mamoesferas ou a resposta patológica completa, porém se correlacionam com o estágio clínico da doença, doença linfonodal axilar após QTN, grau tumoral e expressão das proteínas RE, RP e HER2, sendo um promissor marcador de agressividade tumoral / The diffusion-weighted magnetic resonance imaging (DWMRI) is a functional technique able to reflect structural and cellular changes in the tumors. In the breast cancer, the diffusion-weighted images and its numeric value known as the apparent diffusion coefficient (ADC) has been applied to evaluate pathologic response in patients treated with neoadjuvant chemotherapy (NC). The difference in the clinical results after breast cancer treatment, including different rates of responses to the NC has been associated to the heterogeneity of the disease. The presence of the breast cancer stem cells (BCSC) is an accepted hypothesis to explain the different biologic breast cancers behaviors. The aim of this study was to correlate the ADC value of invasive breast cancer with the presence of cancer stem cells markers and the major prognostic factors in patients treated with neoadjuvant chemotherapy. Prospectively, the MRI pre-treatment of twenty-seven consecutive patients with invasive breast cancer posteriorly treated with NC followed by surgery were evaluated. The ADC values mean, 10th percentile, 25th percentile, 50th percentile were obtained from two measurements, one of them with a unique ROI and the other with multiple ROIs encompassing the entire lesion. The ADC values were correlated to: presence of BCSCs (cell surface markers CD44+/CD24-, ABCG2 and ALDH1) identified by flow cytometric analysis, tumor grade, breast cancer staging, lymph nodal involvement, expression of estrogen receptors (ER), expression of progesterone receptors (PR) and expression of HER2. The assay mammospheres (Mammocult ®) were analyzed in 18 samples. Additionally, the ADC values were correlated to the pathologic complete response after QN treatment. There were no correlations between ADC values and breast cancer stem cells markers or mammospheres formation efficiency. For all parameters calculated, the ADC values (x10- 3 mm 2 /s) were lower in: breast cancer stage III and IV than stage II (0,90±0,16; 1,02±0,18), tumors with lymph node metastasis than without lymph node metastasis (0,89±0,16; 1,01±0,17), ER expression than ER negative (0,90±0,16; 1,00±0,18), PR expression than PR 10 negative (0,91±0,16; 0,98±0,18) and HER2 expression than HER2 negative (0,92±0,17; 0,97±0,18). The ADC values were significantly higher in grade-1 tumors (difference 0,18; CI: 0,03-0,33) compared to grade-2 tumors (p=0,02). The tumors values of ADC pretreatment were not correlated to the pathologic complete response after NC. The ADC values in pre-treatment invasive breast cancers are not a predictor of BCSC presence, mammospheres formation efficiency or pathologic complete response to QN. However it is correlated to the tumor grade, breast cancer staging, lymph nodal involvement, expression of ER, PR and HER2 and may represent a promising marker of tumor aggressiveness
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Expressão gênica de moléculas da matriz extracelular e da membrana celular durante a diferenciação de células-tronco adultas da polpa dentária humana / Gene expression of extracellular matrix and cell membrane molecules during cellular differentiation from human dental pulp stem cellsSilva, Luiz Henrique Santos 17 March 2014 (has links)
As células-tronco mesenquimais (MSCs) são células multipotentes que tem o potencial de se diferenciarem em várias linhagens celulares in vitro e in vivo. Estas são encontradas em nichos específicos em muitos órgãos e tecidos adultos, tais como medula óssea, tecido adiposo, músculo, dente, cordão umbilical, pele, cartilagem articular, sendo facilmente isoladas, expandidas e com alta capacidade proliferativa in vitro. Assim, estas características têm despertado grande interesse na sua utilização como uma potencial fonte de células para o reparo e regeneração tecidual de diversos órgãos e tecidos. Pouco se conhece sobre as moléculas que são secretadas pelas MSCs para a matriz extracelular (MEC) e que estão na interface célula-matriz e estão presentes em vias de transdução de sinais intracelulares. Desta forma, o objetivo deste trabalho foi avaliar o perfil de expressão gênica de enzimas que remodelam a MEC (metaloproteinases de matriz MMPs: 15 membros) e seus inibidores (inibidores teciduais das metaloproteinases de matriz TIMPs: 4 membros e RECK) e proteína da membrana plasmática (Caveolina-1) durante a diferenciação osteogenica in vitro a partir de células-tronco mesenquimais da polpa dentária humana (DPSCs). Para tanto, utilizamos polpas dentárias humanas provenientes de terceiros molares de indivíduos adultos (18-32 anos n=3) e as DPSCs isoladas foram imunofenotipadas por citometria de fluxo, avaliada a taxa de proliferação, induzidas as diferenciações osteogênica (1, 7, 14, 21 e 28 dias) e adipogênica (28 dias) e os transcritos avaliados por PCR em tempo real. Estas células foram positivas para o marcadores CD29, CD105, STRO-1, CD44, CD90 negativas os marcadores para CD31, CD45, CD34 e CD14 e são capazes de se diferenciarem em osteoblastos e adipócitos. Verificamos que as MMP-2, MMP-3, MMP-13, MMP-14, MMP-25, TIMP-3, TIMP-4 e Caveolina-1 foram diferencialmente expressas durante a diferenciação osteogênica, sendo reguladas positivamente apenas no período de 28 dias pós indução e a TIMP-1 regulada positivamente desde o primeiro dia de indução. A MMP-11 e MMP-16 não foram detectadas nas DPSCs e nem durante a diferenciação osteogênica. Desta forma, concluímos que MMPs encontradas bem como a Caveolina-1 e as TIMP-3 e TIMP-4 podem estar participando dos dos eventos de diferenciação óssea em DPSCs, a TIMP-1 pode estar participando de eventos biológicos relacionados as propriedades do estado indiferenciado das DPSCs e da diferenciação óssea e que as MMP-11 e MMP-16 não são expressas pelas DPSCs e também não estão envolvidas na diferenciação osteogênica. / Mesenchymal stem cells (MSCs) are multipotent cells that have the potential to differentiate into various cell lineages in vitro and in vivo. These are found in specific niches in many adult organs and tissues, such as bone marrow, adipose tissue, muscle, tooth, umbilical cord, skin, cartilage, being easily isolated, expanded and high proliferative capacity in vitro. Thereby, these features have attracted great interest in its use as a potential source of cells for tissue repair and regeneration of various organs and tissues. Little is known about the molecules secreted by MSCs into the extracellular matrix (ECM), present at cell-matrix interface and present on intracellular signal transduction. Thus, the aim of this study was to evaluate gene expression profile of ECM remodeling enzymes (matrix metalloproteinases MMPs: 15 members) and their inhibitors (tissue inhibitors of matrix metalloproteinases TIMPs: 4 members and RECK) and plasma membrane proteins (Caveolin-1) that participate in signaling pathways during osteogenic differentiation in vitro from human dental pulp stem cells (DPSCs). Normal human impacted third molars were collected from adults (18-32 years-old n=3) and DPSCs isolated were immunophenotyping by flow cytometry, evaluated the proliferation ratio, induced to osteogenic (1, 7, 14, 21 and 28-days) and adipogenic differentiation (28-days) and the transcript levels evaluated by Real Time PCR. These cells are positive for CD29, CD105, STRO -1, CD44, and CD90 markers and negative for CD31, CD45, CD34, and CD14 markers and are capable of differentiating into osteoblasts and adipocytes. We found that MMP- 2, MMP -3, MMP -13, MMP -14, MMP -25, TIMP-3, TIMP-4 and Caveolin-1 were differentially expressed during osteogenic differentiation, being upregulated only at 28 days post-induction and TIMP-1 upregulated from the first day of induction. MMP-11 and MMP-16 were not detected in DPSCs neither during differentiation. Thus, we conclude that MMPs, Caveolin-1 found as well as TIMP-3 and TIMP-4 may be participating in the event of bone differentiation in DPSCs, TIMP-1 may participate in biological events related to the properties of the undifferentiated state DPSCs and osteogenic differentiation, MMP-11 and MMP-16 are not also expressed by DPSCs and are not involved in osteogenic differentiation.
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Estudo da biodistribuição de células tronco de polpa de dente decíduo humana (CTPDDh) após o transplante intra-uterino no modelo canino (Canis lupus familiares) / Biodistribution of human immature dental pulp stem cells following in utero transplantation in canine model (Canis lupus familiaris)Reginato, Ana Luísa 19 June 2012 (has links)
O transplante intrauterino de células-tronco (TIUCT) é um método de tratamento de doenças genéticas, congênitas, hematológicas e imunológicas em um feto durante a gestação. Em pesquisa básica este modelo permite o estudo da dinâmica de migração, enxertia e estado funcional de diferentes tipos de células-tronco (CT). Estas células podem ser transplantadas em diferentes momentos do período gestacional, que pode ser dividido em três momentos do desenvolvimento fetal, sendo estes, diferentes funcionalmente. A escolha deste momento para o transplante influenciará tanto no comportamento celular quanto no resultado. Para o TIUCT são utilizadas as CT mesenquimais derivadas da medula óssea ou fetais ou hematopoiéticas. Para esta pesquisa utilizamos células-tronco derivadas da polpa dentária imatura humana (CTIPDh) as quais apresentam potencial pluripotente e propriedades imunomodulatórias. Nosso principal objetivo foi avaliar a capacidade migratória, bem como de proliferação e endereçamento (homing) das CTIPDh durante o terceiro período gestacional do desenvolvimento fetal no modelo canino. Todos os procedimentos experimentais foram elaborados sob protocolo anestésico apropriado e aprovados pelo comitê de ética da FMVZ da USP. Foram transplantadas via intraperitoneal (IP) 1x106 CTIPDh GFP+ em cada feto, durante procedimento cirúrgico de laparotomia exploratória com ultrassonografia guiada intraoperatóriamente em quatro fetos com idade gestacional aproximada de 45 dias, e outros dois fetos os quais não receberam o transplante, utilizados como controle. Avaliamos os fetos pré e pós-transplante através do ultrasson. Após sete dias, realizamos a ovário-salpingo-histerectomia (OSH) para a colheita dos fetos. Em seguida coletamos seus órgãos e tecidos os quais foram fixados em paraformoldeído a 4% e criopreservados a temperatura de -80oC. Analisamos a biodistribuição das CTIPDh dentro dos órgãos e tecidos em criocortes de 5µm sob microscopia Confocal. Constatamos o homing das CTIPDh nos órgãos derivados das linhas germinativas endodermais, ectodermais e mesodermais. No estômago e intestinos as CTIPD/GFP+ foram identificadas tanto no espaço intraglandular, como na camada muscular da mucosa; no fígado no parenquima hepático; no coração especialmente no tecido muscular do miocárdio; no cérebro nos vasos da substância branca, e cerebelo entre células de Purkinje. Na placenta estas células foram encontradas especialmente junto aos vasos. Quantificamos as CTIPD GFP+ utilizando a citometria de fluxo. Comparativamente dentre os órgãos analisados, obtivemos resultados expressivos do homing celular no miocárdio (~50%), no baço e fígado. Nossos resultados foram confirmados através das análises de imunohistoquímica e imunofluorescência utilizando os anticorpos Anti-núcleo (HuNu), Anti-CTIPD e Anti-GFP humanos. Concluímos que as CTIPDh apresentam grande potencial migratório e proliferativo após o TIUCT em fetos caninos. Estas células indiferenciadas demonstraram homing, especialmente nos tecidos: hematopoiéticos fetais (placenta, fígado e baço), tecido epitelial e glandular de órgãos, bem como de nichos perivasculares de CT. Estes dados sugerem que as CTIPD através do TIU, é uma alternativa viável, segura e promissora para o tratamento de doenças genéticas, congênitas, hematológicas e imunológicas. / Intra-uterine stem cells transplantation (IUSCT) is a method for the treatment of genetic, congenital, hematological, and immunological diseases. In basic research it provides a model for studying the dynamics of migration, graft and functional status of different types of stem cells. The cells can be transplanted in different moments of gestational period, which can be divided into quarters that are not functionally equivalent. The choice of the cells and quarter where the stem cells will be applied can influence cells behavior and results of transplantation. Fetal and adult hematopoietic or bone marrow derived mesenchymal stem cells (MSCs) were mainly used for IUSCT. We previously obtained human immature dental pulp stem cell (IDPSCs), which showed pluripotent potential and immune-compatible properties. The goal of our study was to evaluate migration capacity, proliferation and homing of IDPSCs after IUSCT during the third fetal period in dogs. All experimental procedures were approved by the Ethical Committee of the School of Veterinary Medicine and Animal Science of São Paulo University and were performed under appropriate anesthesia. 1x106 of undifferentiated GFP-positive human IDPSCs were transplanted following laparotomy and intraperitoneal injection under intra-operative ultrasound control into 5 fetuses at the 45 days of gestation. Five fetuses, which did not receive IDPSCs, were used as a control. Ultrasound analyses were performed daily before collection of the fetuses. After 7 days ovarian hysterectomy was performed, fetuses were collected; organs and tissues were isolated and fixed in 4% paraformaldehyde or cryopreserved. Biodistribution of IDPSCs within the organs and tissues were analyzed on cryosections (5µm) under Confocal Microscopy. Homing of IDPSCs was observed in organs derived from three germ lines, endoderm, ectoderm and mesoderm. In stomach and in intestine GFP IDPSCs were found in intraglandular space as well as in muscularis mucosae. In liver they appeared in hepatic parenchyma; in heart in myocardium and in brain in bold vessels, in cerebellum within Purkinje cells. Using Flow cytometry assay GFP IDPSCs graft was quantified. Among the different organs an expressive homing was observed in myocardium of heart (~50%), in spleen and liver. The IDPSCs were also found in canine placenta, especially in blood vessels. These data were confirmed using anti-human nucleus (HuNu), anti-GFP and anti-IDPSCs anti-bodies. Human IDPSCs showed high migration and proliferation potential after IUSCT in dog fetuses. Undifferentiated IDPSCs demonstrated homing in fetal hematopoietic (placenta), epithelial (gastric glands) and perivascular stem cells niches. Our data suggest that IDPSCs is a new promising source for genetic, congenital, hematological, and immunological treatment for those diseases through IUSCT.
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Expressão gênica de moléculas da matriz extracelular e da membrana celular durante a diferenciação de células-tronco adultas da polpa dentária humana / Gene expression of extracellular matrix and cell membrane molecules during cellular differentiation from human dental pulp stem cellsLuiz Henrique Santos Silva 17 March 2014 (has links)
As células-tronco mesenquimais (MSCs) são células multipotentes que tem o potencial de se diferenciarem em várias linhagens celulares in vitro e in vivo. Estas são encontradas em nichos específicos em muitos órgãos e tecidos adultos, tais como medula óssea, tecido adiposo, músculo, dente, cordão umbilical, pele, cartilagem articular, sendo facilmente isoladas, expandidas e com alta capacidade proliferativa in vitro. Assim, estas características têm despertado grande interesse na sua utilização como uma potencial fonte de células para o reparo e regeneração tecidual de diversos órgãos e tecidos. Pouco se conhece sobre as moléculas que são secretadas pelas MSCs para a matriz extracelular (MEC) e que estão na interface célula-matriz e estão presentes em vias de transdução de sinais intracelulares. Desta forma, o objetivo deste trabalho foi avaliar o perfil de expressão gênica de enzimas que remodelam a MEC (metaloproteinases de matriz MMPs: 15 membros) e seus inibidores (inibidores teciduais das metaloproteinases de matriz TIMPs: 4 membros e RECK) e proteína da membrana plasmática (Caveolina-1) durante a diferenciação osteogenica in vitro a partir de células-tronco mesenquimais da polpa dentária humana (DPSCs). Para tanto, utilizamos polpas dentárias humanas provenientes de terceiros molares de indivíduos adultos (18-32 anos n=3) e as DPSCs isoladas foram imunofenotipadas por citometria de fluxo, avaliada a taxa de proliferação, induzidas as diferenciações osteogênica (1, 7, 14, 21 e 28 dias) e adipogênica (28 dias) e os transcritos avaliados por PCR em tempo real. Estas células foram positivas para o marcadores CD29, CD105, STRO-1, CD44, CD90 negativas os marcadores para CD31, CD45, CD34 e CD14 e são capazes de se diferenciarem em osteoblastos e adipócitos. Verificamos que as MMP-2, MMP-3, MMP-13, MMP-14, MMP-25, TIMP-3, TIMP-4 e Caveolina-1 foram diferencialmente expressas durante a diferenciação osteogênica, sendo reguladas positivamente apenas no período de 28 dias pós indução e a TIMP-1 regulada positivamente desde o primeiro dia de indução. A MMP-11 e MMP-16 não foram detectadas nas DPSCs e nem durante a diferenciação osteogênica. Desta forma, concluímos que MMPs encontradas bem como a Caveolina-1 e as TIMP-3 e TIMP-4 podem estar participando dos dos eventos de diferenciação óssea em DPSCs, a TIMP-1 pode estar participando de eventos biológicos relacionados as propriedades do estado indiferenciado das DPSCs e da diferenciação óssea e que as MMP-11 e MMP-16 não são expressas pelas DPSCs e também não estão envolvidas na diferenciação osteogênica. / Mesenchymal stem cells (MSCs) are multipotent cells that have the potential to differentiate into various cell lineages in vitro and in vivo. These are found in specific niches in many adult organs and tissues, such as bone marrow, adipose tissue, muscle, tooth, umbilical cord, skin, cartilage, being easily isolated, expanded and high proliferative capacity in vitro. Thereby, these features have attracted great interest in its use as a potential source of cells for tissue repair and regeneration of various organs and tissues. Little is known about the molecules secreted by MSCs into the extracellular matrix (ECM), present at cell-matrix interface and present on intracellular signal transduction. Thus, the aim of this study was to evaluate gene expression profile of ECM remodeling enzymes (matrix metalloproteinases MMPs: 15 members) and their inhibitors (tissue inhibitors of matrix metalloproteinases TIMPs: 4 members and RECK) and plasma membrane proteins (Caveolin-1) that participate in signaling pathways during osteogenic differentiation in vitro from human dental pulp stem cells (DPSCs). Normal human impacted third molars were collected from adults (18-32 years-old n=3) and DPSCs isolated were immunophenotyping by flow cytometry, evaluated the proliferation ratio, induced to osteogenic (1, 7, 14, 21 and 28-days) and adipogenic differentiation (28-days) and the transcript levels evaluated by Real Time PCR. These cells are positive for CD29, CD105, STRO -1, CD44, and CD90 markers and negative for CD31, CD45, CD34, and CD14 markers and are capable of differentiating into osteoblasts and adipocytes. We found that MMP- 2, MMP -3, MMP -13, MMP -14, MMP -25, TIMP-3, TIMP-4 and Caveolin-1 were differentially expressed during osteogenic differentiation, being upregulated only at 28 days post-induction and TIMP-1 upregulated from the first day of induction. MMP-11 and MMP-16 were not detected in DPSCs neither during differentiation. Thus, we conclude that MMPs, Caveolin-1 found as well as TIMP-3 and TIMP-4 may be participating in the event of bone differentiation in DPSCs, TIMP-1 may participate in biological events related to the properties of the undifferentiated state DPSCs and osteogenic differentiation, MMP-11 and MMP-16 are not also expressed by DPSCs and are not involved in osteogenic differentiation.
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