O diabetes mellitus do tipo 1 (DM1) é uma doença causada pela destruição autoimune das células-β produtoras de insulina do pâncreas. O transplante de ilhotas pancreáticas é um procedimento tecnicamente simples sendo uma alternativa terapêutica interessante para o DM1. Entretanto, a oferta limitada de pâncreas de doadores falecidos e a necessidade de imunossupressão crônica são fatores que limitam a aplicabilidade dessa modalidade de transplante. Neste trabalho foram estudadas duas estratégias que visam oferecer soluções aos fatores limitantes do transplante de ilhotas pancreáticas. Na primeira parte do trabalho, o mecanismo molecular que dirige o processo de diferenciação de células-tronco embrionárias murinas (murine embryonic stem cells, mESCs) em células produtoras de insulina (insulin producing cells, IPCs) foi analisado visando otimizar o processo de diferenciação. Nós selecionamos o gene Thioredoxin interacting protein (Txnip), diferencialmente expresso ao longo da diferenciação β-pancreática, para realizar um estudo funcional através da modificação genética de mESCs. Os resultados obtidos permitiram verificar que a inibição de Txnip na diferenciação β-pancreática pode induzir a diferenciação de IPCs com maior expressão de marcadores de células- e mais responsivas ao estímulo de glicose. Além disso, o modelo de zebrafish permitiu elucidar in vivo o papel de Txnip durante a organogênese pancreática, revelando que a inibição desse gene é capaz de aumentar a massa de células-β através do estimulo de células presentes no ducto extra-pancreático. Dessa forma, a inibição de Txnip pode aprimorar os protocolos para obtenção de IPCs a partir de células-tronco pluripotentes. A exposição crônica a agentes imunossupressores diabetogênicos e a perda de componentes de matriz extracelular durante o isolamento de ilhotas pancreáticas são causas para a perda de funcionalidade do enxerto. Dessa forma, na segunda parte do trabalho, um biomaterial inovador foi desenvolvido, contendo um polímero de laminina (polilaminina, PLn) para o encapsulamento e a imunoproteção de ilhotas pancreáticas. As cápsulas produzidas com o biomaterial desenvolvido, Bioprotect-Pln, são térmica- e mecanicamente estáveis, além de serem biocompatíveis e capazes de imunoproteger ilhotas pancreáticas humanas in vitro. O encapsulamento com Bioprotect-Pln preserva a funcionalidade de ilhotas pancreáticas. Além disso, quando cápsulas vazias de Bioprotect-Pln foram implantadas em camundongos imunocompetentes, houve atenuação da resposta inflamatória ao implante, uma das principais causas para perda de funcionalidade de enxertos encapsulados. Os resultados obtidos indicam que a presença de polilaminina na malha capsular induz uma resposta anti-inflamatória que pode beneficiar a preservação do enxerto de ilhotas pancreáticas encapsuladas. Atualmente, o transplante de ilhotas pancreáticas é visto como a terapia celular mais promissora para atingir a independência de insulina em pacientes de DM1, porém, a aplicabilidade desse transplante ainda é limitada. Este trabalho contribuiu para a elucidação dos mecanismos moleculares que podem aprimorar o processo de diferenciação de célulastronco pluripotentes em IPCs, estabelecendo uma fonte alternativa de células para a terapiade reposição, e, também, estabeleceu um biomaterial inovador, capaz de diminuir a resposta inflamatória ao implante de microcápsulas e de imunoproteger células microencapsuladas. Desta forma, este trabalho contribui para o estabelecimento da terapia de reposição celular para pacientes de DM1. / Type 1 diabetes mellitus (DM1) is a disease caused by the autoimmune destruction of insulin-producing pancreatic β-cells. Pancreatic islet transplantation is a technically simple procedure and an interesting alternative therapy for DM1, however, the limited supply of cadaveric donated pancreas and the need of life-long immunosuppression are factors which limit its applicability. In the present work, two strategies were employed aiming at establishing viable solutions for the factors limiting pancreatic islet transplantation. In the first part of this study, the molecular mechanism which drives differentiation of murine embryonic stem cells (mESCs) into insulin producing cells (IPCs) was analyzed in order to optimize the differentiation process. The Thioredoxin interacting protein (Txnip) gene, which is differentially expressed along -pancreatic differentiation, was selected to undergo a functional analysis by genetically modifying mESCs. The results allowed us to verify that Txnip inhibition during the β-pancreatic differentiation process can induce differentiation of IPCs displaying higher expression of β-cell markers and being more responsive to glucose stimuli. In addition, the zebrafish model allowed us to elucidate in vivo the role of Txnip during pancreatic organogenesis, revealing that its inhibition is able to increase the mass of β-cells through stimulation of extra-pancreatic ductal cells. Therefore, Txnip inhibition may turbinate IPCs differentiation from pluripotent stem cells. The chronic exposure to diabetogenic immunosuppressive agents and the loss of extracellular matrix components during isolation of pancreatic islets are probable causes for the loss of pancreatic islet graft functionality. Therefore, in the second part of this study, an innovative biomaterial was developed by incorporating a laminin polymer (polylaminin, PLn) for the encapsulation and immunoprotection of pancreatic islets. The capsules produced with the novel biomaterial, Bioprotect-Pln, are biocompatible, thermally and mechanically stable and are able to immunoprotect human pancreatic islets in vitro. Encapsulation with Bioprotect-Pln preserves the functionality of pancreatic islets. In addition, when empty Bioprotect-Pln capsules were implanted into immunocompetent mice, an attenuation of the inflammatory response to the implant occurred, this being one of the main causes of encapsulated graft loss. The results indicate that polylaminin addition to the capsular mesh induces an anti-inflammatory response which may favor preservation of the engrafted encapsulated pancreatic islets. Pancreatic islet transplantation is currently seen as the most promising cell therapy to achieve insulin independence in DM1 patients, however, the applicability of this transplant is still limited. This work contributed to the elucidation of the molecular mechanisms which can turbinate the differentiation of pluripotent stem cells into IPCs, establishing an alternative source of cells for the replacement therapy, and, also, established an innovative biomaterial which is able to decrease the inflammatory response to the graft, thereby immunoprotecting the microencapsulated cells. Therefore, this work contributes to the establishment of the cell replacement therapy for DM1 patients.

O diabetes mellitus do tipo 1 (DM1) é uma doença causada pela destruição autoimune das células-β produtoras de insulina do pâncreas. O transplante de ilhotas pancreáticas é um procedimento tecnicamente simples sendo uma alternativa terapêutica interessante para o DM1. Entretanto, a oferta limitada de pâncreas de doadores falecidos e a necessidade de imunossupressão crônica são fatores que limitam a aplicabilidade dessa modalidade de transplante. Neste trabalho foram estudadas duas estratégias que visam oferecer soluções aos fatores limitantes do transplante de ilhotas pancreáticas. Na primeira parte do trabalho, o mecanismo molecular que dirige o processo de diferenciação de células-tronco embrionárias murinas (murine embryonic stem cells, mESCs) em células produtoras de insulina (insulin producing cells, IPCs) foi analisado visando otimizar o processo de diferenciação. Nós selecionamos o gene Thioredoxin interacting protein (Txnip), diferencialmente expresso ao longo da diferenciação β-pancreática, para realizar um estudo funcional através da modificação genética de mESCs. Os resultados obtidos permitiram verificar que a inibição de Txnip na diferenciação β-pancreática pode induzir a diferenciação de IPCs com maior expressão de marcadores de células- e mais responsivas ao estímulo de glicose. Além disso, o modelo de zebrafish permitiu elucidar in vivo o papel de Txnip durante a organogênese pancreática, revelando que a inibição desse gene é capaz de aumentar a massa de células-β através do estimulo de células presentes no ducto extra-pancreático. Dessa forma, a inibição de Txnip pode aprimorar os protocolos para obtenção de IPCs a partir de células-tronco pluripotentes. A exposição crônica a agentes imunossupressores diabetogênicos e a perda de componentes de matriz extracelular durante o isolamento de ilhotas pancreáticas são causas para a perda de funcionalidade do enxerto. Dessa forma, na segunda parte do trabalho, um biomaterial inovador foi desenvolvido, contendo um polímero de laminina (polilaminina, PLn) para o encapsulamento e a imunoproteção de ilhotas pancreáticas. As cápsulas produzidas com o biomaterial desenvolvido, Bioprotect-Pln, são térmica- e mecanicamente estáveis, além de serem biocompatíveis e capazes de imunoproteger ilhotas pancreáticas humanas in vitro. O encapsulamento com Bioprotect-Pln preserva a funcionalidade de ilhotas pancreáticas. Além disso, quando cápsulas vazias de Bioprotect-Pln foram implantadas em camundongos imunocompetentes, houve atenuação da resposta inflamatória ao implante, uma das principais causas para perda de funcionalidade de enxertos encapsulados. Os resultados obtidos indicam que a presença de polilaminina na malha capsular induz uma resposta anti-inflamatória que pode beneficiar a preservação do enxerto de ilhotas pancreáticas encapsuladas. Atualmente, o transplante de ilhotas pancreáticas é visto como a terapia celular mais promissora para atingir a independência de insulina em pacientes de DM1, porém, a aplicabilidade desse transplante ainda é limitada. Este trabalho contribuiu para a elucidação dos mecanismos moleculares que podem aprimorar o processo de diferenciação de célulastronco pluripotentes em IPCs, estabelecendo uma fonte alternativa de células para a terapiade reposição, e, também, estabeleceu um biomaterial inovador, capaz de diminuir a resposta inflamatória ao implante de microcápsulas e de imunoproteger células microencapsuladas. Desta forma, este trabalho contribui para o estabelecimento da terapia de reposição celular para pacientes de DM1. / Type 1 diabetes mellitus (DM1) is a disease caused by the autoimmune destruction of insulin-producing pancreatic β-cells. Pancreatic islet transplantation is a technically simple procedure and an interesting alternative therapy for DM1, however, the limited supply of cadaveric donated pancreas and the need of life-long immunosuppression are factors which limit its applicability. In the present work, two strategies were employed aiming at establishing viable solutions for the factors limiting pancreatic islet transplantation. In the first part of this study, the molecular mechanism which drives differentiation of murine embryonic stem cells (mESCs) into insulin producing cells (IPCs) was analyzed in order to optimize the differentiation process. The Thioredoxin interacting protein (Txnip) gene, which is differentially expressed along -pancreatic differentiation, was selected to undergo a functional analysis by genetically modifying mESCs. The results allowed us to verify that Txnip inhibition during the β-pancreatic differentiation process can induce differentiation of IPCs displaying higher expression of β-cell markers and being more responsive to glucose stimuli. In addition, the zebrafish model allowed us to elucidate in vivo the role of Txnip during pancreatic organogenesis, revealing that its inhibition is able to increase the mass of β-cells through stimulation of extra-pancreatic ductal cells. Therefore, Txnip inhibition may turbinate IPCs differentiation from pluripotent stem cells. The chronic exposure to diabetogenic immunosuppressive agents and the loss of extracellular matrix components during isolation of pancreatic islets are probable causes for the loss of pancreatic islet graft functionality. Therefore, in the second part of this study, an innovative biomaterial was developed by incorporating a laminin polymer (polylaminin, PLn) for the encapsulation and immunoprotection of pancreatic islets. The capsules produced with the novel biomaterial, Bioprotect-Pln, are biocompatible, thermally and mechanically stable and are able to immunoprotect human pancreatic islets in vitro. Encapsulation with Bioprotect-Pln preserves the functionality of pancreatic islets. In addition, when empty Bioprotect-Pln capsules were implanted into immunocompetent mice, an attenuation of the inflammatory response to the implant occurred, this being one of the main causes of encapsulated graft loss. The results indicate that polylaminin addition to the capsular mesh induces an anti-inflammatory response which may favor preservation of the engrafted encapsulated pancreatic islets. Pancreatic islet transplantation is currently seen as the most promising cell therapy to achieve insulin independence in DM1 patients, however, the applicability of this transplant is still limited. This work contributed to the elucidation of the molecular mechanisms which can turbinate the differentiation of pluripotent stem cells into IPCs, establishing an alternative source of cells for the replacement therapy, and, also, established an innovative biomaterial which is able to decrease the inflammatory response to the graft, thereby immunoprotecting the microencapsulated cells. Therefore, this work contributes to the establishment of the cell replacement therapy for DM1 patients.

O Diabetes mellitus (DM) do tipo 1 é uma doença causada pela destruição, por mecanismo auto-imune, das células beta das ilhotas pancreáticas, produtoras de insulina. O tratamento convencional da doença é realizado por meio de injeções diárias de insulina exógena. O transplante de ilhotas pancreáticas inclui-se, atualmente, como uma das alternativas terapêuticas à insulinoterapia. Entretanto, para atingir a insulino-independência, é necessário transplantar um grande número de ilhotas por paciente. O conhecimento do mecanismo de proliferação das células beta pode possibilitar a realização do transplante a partir da expansão celular ex vivo. A glicose é um dos principais indutores da proliferação de células beta. Neste trabalho, foi estabelecida e executada a tecnologia de isolamento e purificação de ilhotas pancreáticas humanas, visando sua estimulação com glicose. Para identificar genes regulados por glicose nestas ilhotas, foi utilizada a técnica de hibridização subtrativa SSH, associada ao rastreamento da biblioteca através de macroarranjos de DNA. Num primeiro rastreamento, foram identificados dois fragmentos gênicos induzidos pela glicose. Um destes apresentou homologia com uma proteína hipotética humana de função desconhecida e o segundo com o receptor de polipetídeo pancreático. Este trabalho permitiu a identificação de novos genes regulados pela glicose em ilhotas pancreáticas humanas, os quais podem estar relacionados à proliferação celular deste tecido. / Type 1 Diabetes mellitus (T1DM) is caused by autoimmune destruction of the insulin-producing pancreatic islet b-cells. Treatment is generally approached by daily subcutaneous injections of exogenous insulin. Nowadays, pancreatic islet transplantation is considered as an effective alternative treatment to insulin therapy. However, in order to reach insulin-independence, a large number of islets is required for each patient. Knowledge of the mechanisms regulating islet b-cell proliferation may allow ex-vivo b-cell expansion prior to transplant. Glucose is considered one of the main inducers of islet b-cells proliferation. We established and executed the technology of human islet isolation and purification. The islets were then stimulated in culture with glucose. In order to identify glucose-regulated genes in cultured human islets, we utilized the suppression subtractive hybridization (SSH) method, followed by cDNA library screening by DNA macroarrays. Preliminary screening allowed us to isolate two cDNAs displaying glucose regulation, one of which is similar to a human hypothetical protein of unknown function and the other shows similarity to the pancreatic polypeptide receptor. This work allowed identification of glucose-regulated genes in human pancreatic islets, which may be related to cell proliferation in this tissue.

O Diabetes mellitus (DM) do tipo 1 é uma doença causada pela destruição, por mecanismo auto-imune, das células beta das ilhotas pancreáticas, produtoras de insulina. O tratamento convencional da doença é realizado por meio de injeções diárias de insulina exógena. O transplante de ilhotas pancreáticas inclui-se, atualmente, como uma das alternativas terapêuticas à insulinoterapia. Entretanto, para atingir a insulino-independência, é necessário transplantar um grande número de ilhotas por paciente. O conhecimento do mecanismo de proliferação das células beta pode possibilitar a realização do transplante a partir da expansão celular ex vivo. A glicose é um dos principais indutores da proliferação de células beta. Neste trabalho, foi estabelecida e executada a tecnologia de isolamento e purificação de ilhotas pancreáticas humanas, visando sua estimulação com glicose. Para identificar genes regulados por glicose nestas ilhotas, foi utilizada a técnica de hibridização subtrativa SSH, associada ao rastreamento da biblioteca através de macroarranjos de DNA. Num primeiro rastreamento, foram identificados dois fragmentos gênicos induzidos pela glicose. Um destes apresentou homologia com uma proteína hipotética humana de função desconhecida e o segundo com o receptor de polipetídeo pancreático. Este trabalho permitiu a identificação de novos genes regulados pela glicose em ilhotas pancreáticas humanas, os quais podem estar relacionados à proliferação celular deste tecido. / Type 1 Diabetes mellitus (T1DM) is caused by autoimmune destruction of the insulin-producing pancreatic islet b-cells. Treatment is generally approached by daily subcutaneous injections of exogenous insulin. Nowadays, pancreatic islet transplantation is considered as an effective alternative treatment to insulin therapy. However, in order to reach insulin-independence, a large number of islets is required for each patient. Knowledge of the mechanisms regulating islet b-cell proliferation may allow ex-vivo b-cell expansion prior to transplant. Glucose is considered one of the main inducers of islet b-cells proliferation. We established and executed the technology of human islet isolation and purification. The islets were then stimulated in culture with glucose. In order to identify glucose-regulated genes in cultured human islets, we utilized the suppression subtractive hybridization (SSH) method, followed by cDNA library screening by DNA macroarrays. Preliminary screening allowed us to isolate two cDNAs displaying glucose regulation, one of which is similar to a human hypothetical protein of unknown function and the other shows similarity to the pancreatic polypeptide receptor. This work allowed identification of glucose-regulated genes in human pancreatic islets, which may be related to cell proliferation in this tissue.

O transplante de ilhotas pancreáticas humanas representa uma estratégia promissora para a cura do diabetes mellitus tipo 1 (DM1), mas a aplicação a todos os pacientes diabéticos ainda é impraticável devido à limitada disponibilidade de ilhotas ou células β e à necessidade de utilização de drogas imunossupressoras pelo paciente transplantado. O tratamento com imunossupressores após o transplante de ilhotas pode ser abolido quando se realiza o microencapsulamento das ilhotas pancreáticas. Neste trabalho investigou-se um novo biomaterial, Biodritina® (alginato/sulfato de condroitina) adequado ao microencapsulamento que gelifica na presença de íons de cálcio ou bário. A biocompatibilidade das microcápsulas tem sido avaliada segundo o grau de pureza do alginato utilizado na sua confecção. Amostras de alginato comercial purificado foram analisadas, comprovando-se a presença de impurezas (polifenóis, endotoxinas, proteínas) em níveis elevados, que impedem sua aplicação clínica. Optou-se, portanto pela utilização do alginato comercial ultrapurificado nos experimentos descritos neste trabalho. Das formulações de biomateriais avaliadas, as microcápsulas de bário-Biodritina apresentaram o melhor desempenho em testes de estabilidade físico-química. Estas microcápsulas mantiveram sua morfologia e estabilidade estrutural após permanecerem 30 dias na cavidade peritoneal de camundongos, conforme demonstrado por microscopia eletrônica de varredura (MEV). Análises histológicas mostraram que microcápsulas de bário-Biodritina explantadas, não possuíam adesão celular em sua superfície. Estudos de permeabilidade demonstraram que o tamanho médio dos poros das microcápsulas de bário-Biodritina permite passagem de proteínas de até 70 kDa, enquanto os poros daquelas de cálcio-Biodritina comportam proteínas de até 100 kDa. Experimentos de coResumo | x cultivo de macrófagos peritoneais com ilhotas de rato microencapsuladas demonstraram uma capacidade imunoprotetora maior das microcápsulas de bário-Biodritina em relação às de cálcio- Biodritina, sendo que as primeiras não ativaram os macrófagos. A manutenção da viabilidade e função de ilhotas humanas microencapsuladas com bário-Biodritina foi confirmada através de ensaio funcional in vitro, no qual ilhotas microencapsuladas apresentaram níveis de secreção de insulina idênticos aos de ilhotas nuas. A prova de conceito do biomaterial foi realizada através do implante de ilhotas humanas microencapsuladas em bário-Biodritina em camundongos com DM1 induzido por estreptozotocina. A hiperglicemia desses animais foi corrigida pelo implante por um período superior a 60 dias, durante os quais o teste oral de tolerância à glicose mostrou-se normal, demonstrando completa funcionalidade e eficiência das ilhotas microencapsuladas com bário-Biodritina. Partindo de observações de que animais inoculados com a peçonha do escorpião Tityus serrulatus apresentam nesidioblastose, foi realizado o fracionamento do veneno por HPLC de fase reversa e 24 frações obtidas foram submetidas a ensaios de proliferação celular através da incorporação de 3H-timidina em células de insulinoma de rato RINm5F. Uma dessas frações foi capaz de induzir a proliferação das células RINm5F e quando aplicada a ilhotas humanas isoladas, elevou o índice de secreção de insulina e induziu um aumento da expressão dos mRNAs de insulina e PCNA. Portanto, demonstrou-se que o biomaterial bário-Biodritina possui as características necessárias para microencapsular células/ilhotas com eficiência e que a \"fração ativa\" do veneno do escorpião T. serrulatus induz proliferação de células RINm5F e melhora a secreção de insulina de ilhotas humanas. / Islet transplantation has been proposed as a promising therapeutic strategy for the cure of type 1 diabetes mellitus (DM), however, its application to all diabetic patients is still not possible due to the limited source of islets or β cells and to the need of an immunosuppressive treatment of the recipient to avoid graft rejection. The use of immunosupressors may be abolished when pancreatic islets are microencapsulated prior to transplantation. Here, we investigated the use of a new biomaterial suitable for cell microencapsulation, namely, Biodritin®, composed of alginate and chondroitin sulphate, which is capable of gelation in the presence of barium or calcium ions. Microcapsules biocompatibility has been evaluated according to the purity of the alginate used in its production. Samples of purified commercial alginate were analyzed, but the high levels of contaminants (proteins, endotoxins and polyphenols) detected prevented its use in clinical applications. On the other hand, also commercially available ultrapure alginate fulfills the requirements for this application, therefore, this biomaterial was chosen for our experiments. Among the different biomaterial formulations evaluated, barium-Biodritin microcapsules displayed the best performance in the physico-chemical tests. Scanning electronic microscopy revealed that barium-Biodritin microcapsules maintained their morphology and structural stability after being implanted for 30 days in the peritoneal cavity of mice. No cellular adhesion was detected on the surface of explanted barium-Biodritin microcapsules by histological analysis. Permeability studies determined the medium pore size of barium-Biodritin microcapsules, which allows proteins of up to 70 kDa to pass through the biomaterial, while calcium-Biodritin pores accomodate proteins of up to 100 kDa. Co-culture of peritoneal macrophages with microencapsulated rat islets, revealed a superior immunoprotective capacity of barium-Biodritin microcapsules, which were capable of protecting the islets with no macrophage activation. Microencapsulated and naked human islets presented identical insulin secretion levels upon stimulation with glucose in vitro, confirming that barium-Biodritin microencapsulation maintains the function and viability of human islets. Proof-of-concept experiments in which barium-Biodritin microencapsulated human islets were implanted into chemically-induced diabetic mice, showed that these animals maintained normal blood glucose levels for more than 60 days, during which oral glucose tolerance tests were normal, demonstrating the complete functionality and efficiency of barium-Biodritin microencapsulated human islets. From the observation that animals inoculated with the venom of the scorpion Tityus serrulatus presented nesidioblastosis, we decided to fractionate the venom to isolate the active principle. The venom was fractionated by reversed phase HPLC and 24 fractions were obtained and submitted to cellular proliferation assays, in which rat insulinoma RINm5F cells evaluated for 3H-timidina incorporation. One of these fractions was capable of inducing cell proliferation and was also applied to isolated human islets. Treated islets presented a higher insulin secretion index and an increase in insulin and PCNA mRNA expression. In conclusion, we demonstrated that the barium-Biodritin biomaterial possesses all characteristics required for efficient cell/islet microencapsulation and that the active fraction of Tityus serrulatus venom induces the proliferation of RINm5F cells and improves insulin secretion in human islets.

Cette thèse présente un système bioélectronique prometteur, l’Hynet. Ce Réseau Hybride (vivant-artificiel) est conçu pour l’étude du comportement à long terme des cellules électrogénératrices, comme les neurones et les cellules betas, en deux aspects : l’individuel et en réseau. Il est basé sur une boucle fermée et sur la communication en temps réel entre la culture cellulaire et une unité artificielle (Matériel, Logiciel). Le premier Hynet utilise des Matrices d’électrodes (MEA) commerciales qui limitent les performances spatiotemporelles du Hynet. Une nouvelle Matrice d’électrodes intelligente (iMEA) est développée. Ce nouveau circuit intégré, analogique et mixte, fournit une interface à forte densité, à forte échelle et adaptative avec la culture. Le nouveau système améliore le traitement des données en temps réel et une acquisition faible bruit du signal extracellulaire. / This thesis presents a promising new bioelectronics system, the Hynet. The Hynet is a Hybrid (living-artificial) Network, developed to study the long-term behavior of electrogenic cells (such as Neurons or Beta-cells), both individually and in a network. It is based on real-time closed-loop communication between a cell culture (bioware) and an artificial processing unit (hardware and software). In the first version of our Hynet, we use commercial Multielectrode Arrays (MEA) that limits its spatiotemporal performances. A new Intelligent Multielectrode Array (iMEA) is therefore developed. This new analog/mixed integrated circuit provides a large-scale, high-density, and adaptive interface with the Bioware, which improves the real-time data processing and the low-noise acquisition of the extracellular signal. / Esta dissertação de doutorado apresenta um sistema bioeletrônico auspicioso, o Hynet. Esta Rede Híbrida (viva e artificial), é concebida para o estudo do comportamento à longo prazo de células eletrogeneradoras (como neurônios ou células beta), em dois aspectos : individual e em redes. Ele é baseado na comunicação bidirecional, em laço fechado e em tempo real entre uma cultura celular (Bioware) e uma unidade artificial (Hardware ou Software). Um primeiro Hynet é apresentado, mas o uso de Matrizes de Eletrodos (MEA) comerciais limita a performance do sistema. Finalmente, uma nova Matriz de Eletrodos Inteligente (iMEA) é desenvolvida. Este novo circuito integrado fornece uma interface adaptativa, em alta densidade e grande escala, com o Bioware. O novo sistema melhora o processamento de dados em tempo real e a aquisição baixo ruído do sinal extracelular.

O transplante de ilhotas pancreáticas humanas representa uma estratégia promissora para a cura do diabetes mellitus tipo 1 (DM1), mas a aplicação a todos os pacientes diabéticos ainda é impraticável devido à limitada disponibilidade de ilhotas ou células β e à necessidade de utilização de drogas imunossupressoras pelo paciente transplantado. O tratamento com imunossupressores após o transplante de ilhotas pode ser abolido quando se realiza o microencapsulamento das ilhotas pancreáticas. Neste trabalho investigou-se um novo biomaterial, Biodritina® (alginato/sulfato de condroitina) adequado ao microencapsulamento que gelifica na presença de íons de cálcio ou bário. A biocompatibilidade das microcápsulas tem sido avaliada segundo o grau de pureza do alginato utilizado na sua confecção. Amostras de alginato comercial purificado foram analisadas, comprovando-se a presença de impurezas (polifenóis, endotoxinas, proteínas) em níveis elevados, que impedem sua aplicação clínica. Optou-se, portanto pela utilização do alginato comercial ultrapurificado nos experimentos descritos neste trabalho. Das formulações de biomateriais avaliadas, as microcápsulas de bário-Biodritina apresentaram o melhor desempenho em testes de estabilidade físico-química. Estas microcápsulas mantiveram sua morfologia e estabilidade estrutural após permanecerem 30 dias na cavidade peritoneal de camundongos, conforme demonstrado por microscopia eletrônica de varredura (MEV). Análises histológicas mostraram que microcápsulas de bário-Biodritina explantadas, não possuíam adesão celular em sua superfície. Estudos de permeabilidade demonstraram que o tamanho médio dos poros das microcápsulas de bário-Biodritina permite passagem de proteínas de até 70 kDa, enquanto os poros daquelas de cálcio-Biodritina comportam proteínas de até 100 kDa. Experimentos de coResumo | x cultivo de macrófagos peritoneais com ilhotas de rato microencapsuladas demonstraram uma capacidade imunoprotetora maior das microcápsulas de bário-Biodritina em relação às de cálcio- Biodritina, sendo que as primeiras não ativaram os macrófagos. A manutenção da viabilidade e função de ilhotas humanas microencapsuladas com bário-Biodritina foi confirmada através de ensaio funcional in vitro, no qual ilhotas microencapsuladas apresentaram níveis de secreção de insulina idênticos aos de ilhotas nuas. A prova de conceito do biomaterial foi realizada através do implante de ilhotas humanas microencapsuladas em bário-Biodritina em camundongos com DM1 induzido por estreptozotocina. A hiperglicemia desses animais foi corrigida pelo implante por um período superior a 60 dias, durante os quais o teste oral de tolerância à glicose mostrou-se normal, demonstrando completa funcionalidade e eficiência das ilhotas microencapsuladas com bário-Biodritina. Partindo de observações de que animais inoculados com a peçonha do escorpião Tityus serrulatus apresentam nesidioblastose, foi realizado o fracionamento do veneno por HPLC de fase reversa e 24 frações obtidas foram submetidas a ensaios de proliferação celular através da incorporação de 3H-timidina em células de insulinoma de rato RINm5F. Uma dessas frações foi capaz de induzir a proliferação das células RINm5F e quando aplicada a ilhotas humanas isoladas, elevou o índice de secreção de insulina e induziu um aumento da expressão dos mRNAs de insulina e PCNA. Portanto, demonstrou-se que o biomaterial bário-Biodritina possui as características necessárias para microencapsular células/ilhotas com eficiência e que a \"fração ativa\" do veneno do escorpião T. serrulatus induz proliferação de células RINm5F e melhora a secreção de insulina de ilhotas humanas. / Islet transplantation has been proposed as a promising therapeutic strategy for the cure of type 1 diabetes mellitus (DM), however, its application to all diabetic patients is still not possible due to the limited source of islets or β cells and to the need of an immunosuppressive treatment of the recipient to avoid graft rejection. The use of immunosupressors may be abolished when pancreatic islets are microencapsulated prior to transplantation. Here, we investigated the use of a new biomaterial suitable for cell microencapsulation, namely, Biodritin®, composed of alginate and chondroitin sulphate, which is capable of gelation in the presence of barium or calcium ions. Microcapsules biocompatibility has been evaluated according to the purity of the alginate used in its production. Samples of purified commercial alginate were analyzed, but the high levels of contaminants (proteins, endotoxins and polyphenols) detected prevented its use in clinical applications. On the other hand, also commercially available ultrapure alginate fulfills the requirements for this application, therefore, this biomaterial was chosen for our experiments. Among the different biomaterial formulations evaluated, barium-Biodritin microcapsules displayed the best performance in the physico-chemical tests. Scanning electronic microscopy revealed that barium-Biodritin microcapsules maintained their morphology and structural stability after being implanted for 30 days in the peritoneal cavity of mice. No cellular adhesion was detected on the surface of explanted barium-Biodritin microcapsules by histological analysis. Permeability studies determined the medium pore size of barium-Biodritin microcapsules, which allows proteins of up to 70 kDa to pass through the biomaterial, while calcium-Biodritin pores accomodate proteins of up to 100 kDa. Co-culture of peritoneal macrophages with microencapsulated rat islets, revealed a superior immunoprotective capacity of barium-Biodritin microcapsules, which were capable of protecting the islets with no macrophage activation. Microencapsulated and naked human islets presented identical insulin secretion levels upon stimulation with glucose in vitro, confirming that barium-Biodritin microencapsulation maintains the function and viability of human islets. Proof-of-concept experiments in which barium-Biodritin microencapsulated human islets were implanted into chemically-induced diabetic mice, showed that these animals maintained normal blood glucose levels for more than 60 days, during which oral glucose tolerance tests were normal, demonstrating the complete functionality and efficiency of barium-Biodritin microencapsulated human islets. From the observation that animals inoculated with the venom of the scorpion Tityus serrulatus presented nesidioblastosis, we decided to fractionate the venom to isolate the active principle. The venom was fractionated by reversed phase HPLC and 24 fractions were obtained and submitted to cellular proliferation assays, in which rat insulinoma RINm5F cells evaluated for 3H-timidina incorporation. One of these fractions was capable of inducing cell proliferation and was also applied to isolated human islets. Treated islets presented a higher insulin secretion index and an increase in insulin and PCNA mRNA expression. In conclusion, we demonstrated that the barium-Biodritin biomaterial possesses all characteristics required for efficient cell/islet microencapsulation and that the active fraction of Tityus serrulatus venom induces the proliferation of RINm5F cells and improves insulin secretion in human islets.