Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais / The development of the work plan proposed for this dissertation refers to the production of xanthan gum from sugarcane juice using the bacterium Xanthomonas campestris pv. campestris NRRL B-1459. Tests were conducted in 500 mL erlenmeyers flasks and in a 2.0-L reactor, in sucrose concentration range from 15 to 40 g/L, judiciously following the pre-established experimental designs, when the process variables and its levels were defined. Firstly, two varieties of sugarcane, RB 835486 and SP 791011 were tested in different production media, aiming at selecting the variety and the fermentative media whose K values (rate of consistence) and n (behavior rate) for the fermented must represented in a better way the condition of pseudoplastic fluid. In the sequence, two factorial designs in two levels and three variables defined the appropriate composition of the medium for later investigations related to the gum biosynthesis. However, the third design appears with two variables and three levels, rendering favorable an evaluation of the optimum point through surfaces generated for each response analyzed. Above all, an increase in the scale researched until then guided the execution of tests in reactor for checking, under controlled conditions, the growth of microorganisms, decrease of sucrose concentration and the product formation, the viscosity of fermented must, and the 1% solution of gum after recovery and purification. Tests in erlenmeyer flasks were carried out in stirring table at 120 rpm and 28ºC while in the reactor, the agitation, aeration, and pH maintained their values in 800 rpm, 0.5 vvm and 7.3, respectively. In that way, results found in this study indicate that the variety of sugarcane SP 791011 has remarkable potential for the production of xanthan gum and after execution of two designs was defined too the medium of production constituted by dilute sugarcane, fortified with four components for effecting the 3rd and 4th designs. Then, the feasibility of the production process of xanthan gum was attested in reactor, reaching 15.1 g/L of gum concentration, 0.629 g/Lh of productivity, 0.579 g.g-1 of conversion from substrate to product, 21509.9 cP of viscosity at 0.75 s-1 for 1% solution of xanthan gum. Gums produced were compared to a commercial sample and presented a similar spectroscopy near infrared region. / O desenvolvimento do plano de trabalho proposto para esta dissertação refere-se à produção de goma xantana a partir de caldo de cana utilizando a bactéria Xanthomonas campestris pv. campestris NRRL B-1459. Os ensaios foram conduzidos em erlenmeyers de 500 mL e em reator de 2,0 L, numa faixa de concentração de sacarose de 15 a 40 g/L, seguindo criteriosamente planejamentos experimentais pré-estabelecidos, uma vez definidas as variáveis de processo e seus níveis. Primeiramente, duas variedades de cana-de-açúcar, RB 835486 e SP 791011, foram testadas em diferentes meios de produção visando selecionar a variedade e os meios fermentativos cujos valores de K (índice de consistência) e n (índice de comportamento) para o mosto fermentado representaram melhor a condição de fluido pseudoplástico. Na seqüência, dois planejamentos fatoriais a dois níveis e três variáveis definiram a composição adequada do meio para posteriores investigações relacionadas à biossíntese da goma. Contudo, surge o 3o planejamento com duas variáveis a três níveis, propiciando uma avaliação do ponto ótimo através das superfícies geradas para cada resposta analisada. Sobretudo, um aumento na escala pesquisada até então direcionou a execução dos ensaios em reator para verificar, sob condições controladas, o crescimento de microrganismos, o decréscimo da concentração de sacarose, a formação de produto, a viscosidade do mosto fermentado e a da solução 1% da goma após recuperação e purificação. Os testes em erlenmeyers foram realizados em mesa agitadora a 120 rpm e a 28o C enquanto no reator a agitação, a aeração e o pH mantiveram seus valores em 800 rpm, 0,5 vvm e 7,3 respectivamente. Dessa forma, os resultados encontrados nesse estudo apontam a variedade de cana SP 791011 com potencialidade notável para a produção de goma xantana e definiu-se também após execução de dois planejamentos o meio de produção constituído por caldo de cana diluído fortificado com quatro componentes para efetuar o 3o e 4o planejamentos. Logo, a viabilidade do processo de produção da goma xantana foi atestada em reator, atingindo 15,1 g/L de concentração de goma, 0,629 g/Lh de produtividade, 0,579 g.g-1 de conversão de substrato a produto, 21509,9 cP de viscosidade a 0,75 s-1 para solução 1% de goma. As gomas produzidas foram comparadas a uma amostra comercial e apresentaram espectroscopia na região do infravermelho similares. / Mestre em Engenharia Química

Submitted by Leonardo Freitas (leonardo.hfreitas@ufpe.br) on 2015-04-10T18:09:17Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) DISSERTAÇÃO Aline de Souza Carvalho.pdf: 3258262 bytes, checksum: 3f81c4413b8ed7201362818528439d61 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-10T18:09:17Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) DISSERTAÇÃO Aline de Souza Carvalho.pdf: 3258262 bytes, checksum: 3f81c4413b8ed7201362818528439d61 (MD5) Previous issue date: 2013-02-28 / CNPq; FACEPE; CAPES / Apuleia leiocarpa (Voguel) J. F.Macbride, uma árvore com grande valor na indústria madeireira, é uma leguminosa (Fabaceae) encontrada na Caatinga. Lectinas são proteínas capazes de reconhecer e se ligar a carboidratos e glicoconjugados de acordo com sua especificidade e, por isso, têm diversas aplicações bioquímicas e biotecnológicas. Sementes de leguminosas são reconhecidas por serem boas fontes de lectinas. Este trabalho descreve a purificação, caracterização e a atividade antimicrobiana deApulSL (Apuleia leiocarpa seeds lectin). ApulSL foi extraída misturando a farinha das sementes em solução salina (NaCl 150 mM), gerando o extrato bruto (EB) que foi aplicado em cromatografia emcoluna de quitina eluida com ácido acético 1M, obtendo-se um único pico ativo. A ApulSL é termorresistente (100°C/2h) e íon dependente (Mn2+), tem caráter ácido e afinidade por N-acetilglicosamina, D(-)-arabinose e azocaseína. Trata-se de uma proteína com estrutura conformacional desordenada, com resíduos de tirosina no cerne hidrofóbicoe um peso molecular nativo de 55,8 kDa, mas que em condições desnaturantes e redutorasse desdobra emtrês a quatro oligopeptídeos, sendo portanto, uma proteína oligomérica. A análise emMALDI TOF/TOF detectou vários peptídeos, mas não houve homologia suficiente (< 30%) entre os peptídeos detectados e o banco de dados de proteínas para a elucidação da sequência primária. A ApulSLapresentouatividade inibitória e bactericida contra três variedades de Xanthomonas campestris, como também inibiu outras cepas gram-negativas e gram-positivas. Em conclusão, a ApulSL é uma lectina sem registros anteriores na literatura e que apresentou potencial antimicrobiano contra a espécie Xanthomonas campestris

Orientador : Yoko B. Rosato / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-14T03:58:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Pimenta_AndreadeLima_M.pdf: 6770754 bytes, checksum: 136b47f574714032f48a26747148f5bc (MD5) Previous issue date: 1990 / Resumo: Xanthomonas campestris é uma bactéria fitopatogênica responsável pela podridão negra de várias espécies vegetais e produtora de um mucopolissacarídeo extracelular de ampla utilização industrial conhecido como goma xantana. Com o intuito de se obter linhagens desta bactéria com alta capacidade de expressão do gene da alfa-amilase e potencialmente capazes de produzir a goma, xantana a partir de substratos amiláceos, foram clonadas e caracterizadas seqüências promotoras específicas de x.campestris e, de posse destas foram construídos e introduzidos em duas de suas linhagens (REF Cmr e 280 Nalr) quatro vetores distintos portadores do gene da alfa-amilase de Bacillus subtilis; (1) pAP2X, contendo o gene amy sob o controle do promotor de B. subtilis; (2) pAP2X, contendo o gene amy sob controle do promotor de X. campestris em adição ao promotor original; (3) pAP23, construção semelhante à do pAP2 contendo a inserção do locus de estabilização parB; e (4) pAP23X, obtido a partir da introdução do promotor de Xanthomonas no pAP23. Análises do nível de estabilização obtido após a introdução do locus parB no plasmidio pAP2 mostraram que linhagens portadoras do plasmidio contendo este locus estabilizador apresentaram índice de perda plasmidial até 27 vezes menor do que aquelas cujo plasmidio não fora dotado desse locus. A quantificação da produção de alfa-amilase pelas oito linhagens obtidas após a introdução dos plasmidios em X.campestris mostrou que linhagens originalmente amilolíticas (Cm r), portadoras de vetores nos quais o gene sob o controle do promotor específico dessa bactéria, apresentaram atividade específica de alfa-amilase 100% superior a da linhagem controle, chegando esta diferença à 300% no caso das linhagens originalmente não amilolíticas (Na I r). Apesar de nenhuma das linhagens obtidas ter se mostrado capaz de produzir goma xantana tendo o amido como único substrato, o caráter amilolítico introduzido conferiu a estas bactérias, de um modo geral, melhor capacidade de aproveitamento de todos os substratos estudados (sacarose, amido e amido+sacarose) para produção de xantana, tendo o mais alto nível de produção correspondido ao da linhagem N2X (portadora do plasmidio amilolítico onde foi introduzido o promotor de X. campestris) crescida em amido+sacarose. Estes resultados permitem considerar promissoras as possibilidades de produção de goma xantana a partir de amido, sendo para tanto necessários alguns estudos adicionais envolvendo a caracterização dos produtos de hidrólise do amido por esta alfa amilase de B. subtilis e seu aproveitamento por linhagens de X. campestris / Abstract: Xanthomonas campestris is a phytopathogenic bacteria responsible for the black rot of crucifers and a variety of other economically important plant diseases, and which produces an exopolisacharide with large industrial applications known as xanthan gum. Promoter sequences isolated from X. campestris were cloned and four plasmids harboring the amy gene of B. subtilis were constructed in order to obtain strains showing high expression of the alpha-amylase gene and thus potentially capable to use starch in fermentation processes, The new plasmids constructed were: (i) pAP2, which contains the amy gene under the control of its original promoter of Bacillus; (ii) pAP2X, which contains an aditional promoter of X. campestris placed upstream of the amy gene; (iii) pAP23, obtained upon introduction of the stabilizer locus parB in pAP2; and (iv) pAP23X, obtained upon introduction of the Xanthomonas promoter sequence in pAP23. Analysis of the stabilization levels obtained after the introduction of parB in pAP2 showed a reduction of up to 27 times in the loss rate of plasmid containing this locus. Quantification of the alpha-amylase production by the 8 strains obtained after the introduction of the new plasmids in X campestris showed that, strains containing both Bacillus and Xanthomonas promoters were able to produce up to 300% more alpha-amylase than strains lacking those plasmids. Although none of the strains tested has been able to produce xanthan gum from starch, the amylolitic character introduced improved their capacity to utilize starch containing media (starch and starch plus sucrose) for the production of this biopolymer. The highest level of xantan production was achieved by strain N2X, wich harbours the amylolitic plasmid with the insertion of the X. campestris promoter (pAP2X). These show that there are promising possibilities for the production of xanthan gum utilizing starch as the unique carbon source, although aditional studies involving characterization of the hydrolysis products of the alpha-amylase gene cloned from B. subtilis and their utilization by strains of X. campestris should still be carried aut / Mestrado / Genetica / Mestre em Ciências Biológicas

Orientadores : Yoko Bomura Rosato , Spartaco Astolfi Filho / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-14T22:27:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Stripecke_Renata_M.pdf: 3003802 bytes, checksum: 8c424cedc5aad86a1d83c9a594fd7733 (MD5) Previous issue date: 1988 / Resumo: A bactéria Xanthomonas campestris é um fitopatógeno que produz a goma xantana, de grande importância econômica, devido ao seu variado potencial de utilização na Indústria e na agricultura. Com o objetivo de se verificar a expressão de um gene de amilase exógeno em X.campestris, estabeleceu-se um sistema de clonagem para esta bactéria. Este sistema constituiu-se no plasmídio promíscuo pMFY40 ao qual se inseriu o gene da alfa-emllese de Bacillus subtilis, resultando no plesmídio pAP1. Este plesmídio possui aproximadamente 14.0 Kb, á mobilizável por plasmídios ¿helper¿ e razoavelmente estável, em condições de fermentação, em X. campestris. O pAP1 foi introduzido por transformação e por conjugação em duas linhagens de campestris, uma delas originalmente amilolítica (REF) e outra não-amilolítica (280), mas que é uma boa produtora de goma. Após se verificar a secreção da enzima em meio sólido pelos recombinantes, analisou-se o consumo de amido e a produção de açúcar redutor em meto líquido. Verificou-se que a linhagem 280/pAPl foi capaz de degradar o amido do meio e que a linhagem REF/pAPl teve seu caráter amiolítico amplificado. A produção de xantana em meios contendo diferentes com posições de substratos foi verificada através da viscosidade da goma, para se analisar as potencialidades da substituição do substrato tradicional, que é a sacarose, pelo amido. Foi observado um acréscimo de produção nas linhagens contendo o pAPl em meio com 2X de amido e em meto com 1X de amido e IX de sacarose. Apesar da substituição total da sacarose pelo amido ser Inviável para a fermentação pela linhagem 280/pAP1, verificou-se que a composição de IX de sacarose e de 1X de amido Já fornece bons resultados / Abstract: Xanthomonas campestris Is a phytopathogenlc bacteria. Which produces the xanthan-gum a biopolimer of economical Importance due to lts great poss1b111tles of ut111zat1on ln the Industry and In the agriculture. A cloning system for the analysis of expression of the extracellular amylase was established. The alfa-amylase gene from Bacillus subtilis was introduced in the promiscuous plasmid pMFY40, giving rise to the hybrid plasmid pAP1. This plasmid contains approximately 14.0 Kb, is mobilizable by helper plasmid and is reasonably stable, in fermenting conditions, in X.campetris. The plasmid pAP1 has been introduced by transformation and by conjugation into two strains of X. campestris one of them originally amylolytlc (REF), and the other not amylolytic (280) but a very good gum producer. Besides the observation of the enzyme production by the recombinants in solid media, the starch consumption and the reducing-sugar production in liquid media were also analysed. It was verified that the strain 280/pAP1 was able to degradate the starch of the media and that the strain REF/pAP1 had its amylolytic character amplified. The xanthan production in media containing different substrates compositions was analysed to evaluate the potentialities of the substitution of the traditional substrate, sucrose, by starch. The strains bearing the plasmid pAP1 showed viscosity enhancement of the media containing 2% starch and also 1% starch plus 1% sucrose. Although the total substitution of sucrose by starch was not successful for the fermentation of 280/pAP1, good results were observed in the media containing 1% starch plus 1% sucrose / Mestrado / Genetica / Mestre em Ciências

The pouched mouse, Saccostomus campestris Peters, 1846 from southern Africa shows a high degree of karyotypic variation where up to 16 variants (2n = 30–50) have been reported. This has led to a systematic uncertainty that the present study attempts to assess using: 1) cytochrome b (cyt b; 1077 bp) and 16S rRNA (528 bp) partial sequences; 2) G-banding cytogenetic data; and 3)geometric morphometric data of various views of the cranium and mandible. The results from these multidisciplinary analyses are broadly similar with phylogenetic analyses of the molecular data revealing the presence of two major lineages. The first lineage comprises the high diploid numbered 2n = 46 cytotype from KwaZulu-Natal Province, South Africa that is considered to be ancestral. The second lineage consists of multiple inland populations that are subdivided into: 1) a sub-lineage comprising samples from a large semi-arid area in the west; and b) a sub-lineage of small distinct populations of low migrations from the east. The cytogenetic data suggest that karyotypic variation within S. campestris from southern Africa is due to autosomal Robertsonian fusions, with evidence of geographic structuring where cytotypes with high diploid numbers originate from the mesic east, while those with low diploid numbers originate from the arid west. The reduction in chromosome number appears to be due to adaptation to cold and dry conditions in the arid west. The X-chromosome revealed three variants that arose from a single pericentric inversion followed by the addition of genetic material, possibly heterochromatin. Variant 1 is only present in the ancestral cytotype and is found in all cytotypes throughout southern Africa, variant 2 is found in cytotypes from areas with < 600 mm of annual rainfall, while variant 3, although only found in females, is sympatric with variant 2. Geometric morphometric analysis of karyotyped specimens showed no discernible patterns of variation among karyotypic variants except for some subtle but equivocal indication of the morphological distinctiveness of the 2n = 46 cytotype from KwaZulu-Natal. Collation of the molecular, cytogenetic, and geometric morphometric data in the present study suggest that S. campestris from southern Africa is monotypic. / Dissertation (MSc)--University of Pretoria, 2011. / Zoology and Entomology / unrestricted

A demanda global por energia tem acompanhado o desenvolvimento de novas indústrias, o que exige um constante aprimoramento e busca por novas fontes de energia. Com a conscientização da população a respeito da necessidade de fontes de energia renovável se abriu uma expectativa otimista para o uso da biomassa como fonte de energia. Uma variedade de microrganismos, como bactérias e fungos produzem enzimas que podem ser usadas para a despolimerização de biomassa celulósica em monômeros de glicose. Dentro deste contexto, estudamos uma celulase (XCC3535) de Xanthomonas campestris. Esta proteína é um híbrido natural com dois domínios (um domínio glicosilhidrolase e um domínio semelhante à expansina) que podem possuir funções complementares. Acredita-se que expansinas e proteínas semelhantes a expansinas possam ajudar na degradação da celulose cristalina, participando na ligação ao substrato, seguida pela formação de complexos enzimáticos ou, possivelmente, associadas à superfície para degradação. Este trabalho foi iniciado com análises de bioinformática da sequência para a proteína Glicosilhidrolase permitindo três construções para clonagem : uma completa contendo ambos os domínios (catalítico e semelhante a Expansina), outro com apenas o domínio catalítico GH5, e uma terceiro com apenas o domínio semelhante a Expansina. Obtemos por expressão recombinante em Escherichia coli Rosetta proteína das três construções. A amostra protéica pura foi utilizada para estudos por espalhamento dinâmico de luz (DLS), espalhamento de raios-X a baixo ângulo (SAXS), dicroísmo circular (CD) e cristalização para uso aplicando difração de raios-X. Assim, nosso principal objetivo neste estudo foi a descrição da Glicosilhidrolase XCC3535, permitindo assim a geração de conhecimento para o entendimento da função desta proteína e de seus domínios. / Global demand for energy has grown with the development of new industries that requires constant improvement and search for new sources of energy. Nowadays, the growing awareness of the population about the need for renewable energy have opened an optimistic expectation for the use of biomass as energy source. A variety of microorganisms like bacteria and fungi produce enzymes that can be used for the depolymerization of cellulosic biomass into glucose monomers. Within this context, we study one cellulase (XCC3535) from Xanthomonas campestris organism. This protein is a natural hybrid with two domains (a glicosyl hidrolase domain and an expansin-like domain) which seem to have complementary functions. It is believed that expansins help in the degradation of crystalline cellulose by participating in substrate binding, followed by formation of enzyme complexes or possibly attaching to cell surface. This work was initiated using bioinformatics analysis of the protein sequence and three constructs were made: a full length containing both domains (catalytic and expansin), another with only the catalytic domain, and a third one with only the expansin-like domain. We were able to overexpress these recombinant proteins in Escherichia coli Rosetta strain. The pure protein sample was used for studied by Dynamic Light Scattering (DLS), Small angle X-ray scattering, Circular Dichroism (CD) and Crystallization for X-ray diffraction. Thus, our main objective in this study was structurally describe these proteins, thereby allowing the generation of knowledge for understanding function of these proteins.

Submitted by (lucia.rodrigues@ufrpe.br) on 2017-03-20T15:01:07Z No. of bitstreams: 1 Luiz Augusto Martins Peruch.pdf: 694087 bytes, checksum: 27f67eb702a71e64c5b03780e75fe68e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-20T15:01:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Luiz Augusto Martins Peruch.pdf: 694087 bytes, checksum: 27f67eb702a71e64c5b03780e75fe68e (MD5) Previous issue date: 2004-02-18 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / The brassica cultivation has been of high importance in Brazil. However, the profitable crop production can be limited by occurrence of diseases such as Alternaria black spot, caused by Alternaria brassicicola and/or Alternaria brassicae, and black rot, caused by Xanthomonas campestris pv. campestris. In that context, the present study had as objectives to evaluate the intensity of Alternaria black spot and of black rot diseases on brassica under organic cultivation in the states of Pernambuco and Santa Catarina, and the spore production longevity of A. brassicicola in leaf debris of broccolis. The intensity of the diseases was evaluated from November 2001 to February 2002, in 103 fields under organic farming systems, including broccoli, Chinese cabbage, cauliflower, kale and cabbage. High prevalence of the diseases was registered in both states, except on Chinese cabbage in Santa Catarina. Prevalence of Alternaria black spot was 100% on broccoli fields in Pernambuco, as well as on cauliflower in the two states, while the black rot reached that level on broccoli and cauliflower fields in Santa Catarina. In the average of the different brassica species, the diseases were more prevalent in Pernambuco than in Santa Catarina. However, when considered severity averages of each disease, no significant differences were verified between the two states, although the climatic conditions have been sharply different. The levels ofdisease severity were low, considering that 98% of the fields presented severity lower than 5%. The Alternaria black spot severity varied among the brassica species in Pernambuco, being higher on Chinese cabbage and lower on kale. In Santa Catarina no significant differences were verified among the brássicas species. In relation to the black rot, only in Santa Catarina there was difference in the disease severity among the brassicas, being registered the lowest level on Chinese cabbage. No significant correlations were verified between severity levels of Alternaria black spot and black rot, neither between disease severity and total number of plants or plant age. The spore production longevity of A. brassicicola was investigated in leaves debris of broccoli, considering different depths of debris incorporation, periods of the year, and systems of soil handling, in two experiments carried out in Urussanga city, State of Santa Catarina, Brazil. Infected leaves debris of broccoli were conditioned in bags of polyethylene and distributed in portions in the field, on the soil surface and at depths of 5 and 10 cm. Periodically, the debris in the bags were collected and conidia concentrations were quantified for longevity of spore production andextinction rate. In both experiments there was higher spore production longevity in leaves debris in the period I, characterized by lighter temperatures, higher air relative humidity and lower pluvial precipitation than in the period II. Depth of debris incorporation influenced directly on A. brassicicola spores production, being lower when incorporation was made at 10 cm depth. In relation to soil handling systems, when the inoculum source was deposited on the soil surface there was not difference in the rate of spore production extinction between the soils under conventional and organic handling. However, at depths of 5 and 10 cm, the rate was significantly higher in the soil under conventional handling. The management of Alternaria black spot on broccoli at the area under study can be accomplished by integrated control, including the incorporation of infected leaves debris in the soil, at least 10 cm depth, along with crop rotation, for no less than a 60-day interval in subsequent brassica plantings. / O cultivo de brássicas tem destacada importância na olericultura brasileira. No entanto, a produção dessas olerícolas pode ser limitada pela ocorrência de doenças, dentre as quais se destacam a alternariose, causada por Alternaria brassicicola e/ou Alternaria brassicae, e a podridão negra, causada por Xanthomonas campestris pv. campestris. Nesse contexto, o presente estudo teve como objetivos realizar o levantamento da intensidade da alternariose e da podridão negra em cultivos orgânicos de brássicas nos Estados de Pernambuco e Santa Catarina, bem como avaliar a longevidade da esporulação de A. brassicicola em restos foliares de brócolis. Os levantamentos foram realizados no período de novembro de 2001 a fevereiro de 2002, num total de 103 cultivos orgânicos, incluindo brócolis, couve-chinesa, couve-flor, couve-manteiga e repolho. Foram registradas elevadas prevalências das doenças nos dois Estados, com exceção em couve-chinesa em Santa Catarina. A prevalência da alternariose foi de 100% nos cultivos de brócolis em Pernambuco, bem como em couve-flor nos dois Estados, enquanto a podridão negra atingiu esse nível nos cultivos de brócolis e couve-flor em Santa Catarina. Na média das diferentes espécies de brássicas, as doenças foram mais prevalentes em Pernambuco que Santa Catarina. Entretanto,quando consideradas as médias de severidade de cada doença no conjunto das brássicas, não foram constatadas diferenças significativas entre os dois Estados, embora as condições climáticas tenham sido nitidamente distintas. Os níveis de severidade das doenças foram baixos, tendo em vista que 98% dos cultivos apresentaram severidade inferior a 5%. A severidade da alternariose variou entre as espécies de brássicas em Pernambuco, com maior severidade registrada em couve-chinesa e menor em couve-manteiga, enquanto em Santa Catarina não foram constatadas diferenças significativas entre as brássicas. Em relação à podridão negra, somente em Santa Catarina houve diferença na severidade entre as brássicas, sendo registrados os menores níveis em couve-chinesa. Não foram constatadas correlações significativas entre os níveis de severidade da alternariose e da podridão negra, bem como da severidade destas com o número total de plantas e a idade das plantas nos cultivos. Foi também investigada a longevidade da esporulação de A. brassicicola em restos foliares de brócolis, considerando diferentes profundidades de incorporação dos restos, períodos do ano e sistemas de manejo do solo, em dois experimentos realizados em Urussanga - SC. Restosfoliares de brócolis infectados pelo patógeno foram acondicionadas em sacolas de polietilenoperfuradas e distribuídos em parcelas no campo, na superfície do solo e nas profundidades de 5 e 10 cm. Nos dois experimentos foi verificada uma maior longevidade da esporulação nos restos foliares no período I, caracterizado por temperaturas mais amenas, maior umidade relativa do ar e menor precipitação pluvial que no período II. A profundidade de incorporação dos restos influiu diretamente na esporulação de A. brassicicola, que foi inferior quando a incorporação foi efetuada a 10 cm de profundidade. Em relação aos sistemas de manejo, quando a fonte de inóculo foi depositada na superfície do solo não houve diferença na taxa de extinção da esporulação entre os solos sob manejo convencional e orgânico. No entanto, nas profundidades de 5 e 10 cm, essa taxa foi significativamente superior no solo sob manejo convencional. O manejo da alternariose em brócolis na região do estudo pode ser realizado pela combinação de vários métodos de controle, inclusive pela incorporação dos restos foliares infectados no solo, à profundidade mínima de 10 cm, combinado com rotação de culturas, visando um intervalo mínimo de 60 dias entre cultivos de brássicas.

La maladie de la pourriture noire des Brassicacées est causée par la colonisation du système vasculaire des plantes par Xanthomonas campestris pv. campestris (Xcc). Cette bactérie, largement retrouvée sur les cinq continents, peut infecter de nombreuses espèces d'intérêts agronomiques et la plante modèle Arabidopsis. Malgré l'importance de cette maladie, la génétique et les bases moléculaires de la résistance à Xcc et de la résistance vasculaire en général restent méconnues et ont été le sujet de mes travaux de thèse. Des approches génétiques chez Arabidopsis ont permis d'identifier trois gènes (ZAR1, PBL2, RKS1) requis pour la résistance à Xcc et la reconnaissance de l'effecteur de type III XopAC de Xcc. Ces trois gènes codent respectivement une protéine de résistance canonique (famille des NLR) et deux kinases de la famille des RLCK. En collaboration avec l'équipe de J-M Zhou (Pékin), nous avons élucidé le mécanisme moléculaire de reconnaissance de XopAC: Un complexe de résistance préformé ZAR1-RKS1 reconnaît spécifiquement l'uridylylation de la kinase PBL2 par XopAC et induit la résistance à Xcc. Contrairement aux données existantes, la spécificité de reconnaissance du complexe de résistance n'est pas portée par la NLR mais par la kinase adaptateur RKS1. Ces résultats constituent la première description des mécanismes moléculaires sous tendant la résistance des brassicacées à Xcc et pourront servir de bases pour la mise en place de programmes rationnels d'amélioration variétale chez les Brassicacées cultivés. / Black rot disease of Brassicaceae is caused by the colonization of plant vasculature by Xanthomonas campestris pv. campestris (Xcc). This worldwide-distributed bacterium causes serious losses in brassica crops and also infects Arabidopsis. Despite of the economic importance of this disease, genetics and molecular bases of resistance to Xcc and vascular resistance in general is poorly understood. This topic was thus selected as my thesis project. Genetic approaches in Arabidopsis identified three genes (ZAR1, PBL2, RKS1) required for resistance to Xcc and the recognition of the Xcc type III effector XopAC. These three genes code for a canonical resistance protein of the NLR family and two kinases of the RLCK family, respectively. In collaboration with the group of J-M Zhou (Beijing), we uncovered the molecular mechanism of XopAC recognition: a preformed ZAR1-RKS1 resistance complex specifically recognizes PBL2 uridylylated by XopAC and triggers resistance to Xcc. In contrast to existing knowledge, the recognition specificity of the resistance complex is not conferred by the NLR but by the adaptor kinase RKS1. These results are the first description of the molecular mechanisms underlying Brassicaceae resistance to Xcc and pave the avenue for the rationale breeding of resistance in Brassica crops.

A demanda global por energia tem acompanhado o desenvolvimento de novas indústrias, o que exige um constante aprimoramento e busca por novas fontes de energia. Com a conscientização da população a respeito da necessidade de fontes de energia renovável se abriu uma expectativa otimista para o uso da biomassa como fonte de energia. Uma variedade de microrganismos, como bactérias e fungos produzem enzimas que podem ser usadas para a despolimerização de biomassa celulósica em monômeros de glicose. Dentro deste contexto, estudamos uma celulase (XCC3535) de Xanthomonas campestris. Esta proteína é um híbrido natural com dois domínios (um domínio glicosilhidrolase e um domínio semelhante à expansina) que podem possuir funções complementares. Acredita-se que expansinas e proteínas semelhantes a expansinas possam ajudar na degradação da celulose cristalina, participando na ligação ao substrato, seguida pela formação de complexos enzimáticos ou, possivelmente, associadas à superfície para degradação. Este trabalho foi iniciado com análises de bioinformática da sequência para a proteína Glicosilhidrolase permitindo três construções para clonagem : uma completa contendo ambos os domínios (catalítico e semelhante a Expansina), outro com apenas o domínio catalítico GH5, e uma terceiro com apenas o domínio semelhante a Expansina. Obtemos por expressão recombinante em Escherichia coli Rosetta proteína das três construções. A amostra protéica pura foi utilizada para estudos por espalhamento dinâmico de luz (DLS), espalhamento de raios-X a baixo ângulo (SAXS), dicroísmo circular (CD) e cristalização para uso aplicando difração de raios-X. Assim, nosso principal objetivo neste estudo foi a descrição da Glicosilhidrolase XCC3535, permitindo assim a geração de conhecimento para o entendimento da função desta proteína e de seus domínios. / Global demand for energy has grown with the development of new industries that requires constant improvement and search for new sources of energy. Nowadays, the growing awareness of the population about the need for renewable energy have opened an optimistic expectation for the use of biomass as energy source. A variety of microorganisms like bacteria and fungi produce enzymes that can be used for the depolymerization of cellulosic biomass into glucose monomers. Within this context, we study one cellulase (XCC3535) from Xanthomonas campestris organism. This protein is a natural hybrid with two domains (a glicosyl hidrolase domain and an expansin-like domain) which seem to have complementary functions. It is believed that expansins help in the degradation of crystalline cellulose by participating in substrate binding, followed by formation of enzyme complexes or possibly attaching to cell surface. This work was initiated using bioinformatics analysis of the protein sequence and three constructs were made: a full length containing both domains (catalytic and expansin), another with only the catalytic domain, and a third one with only the expansin-like domain. We were able to overexpress these recombinant proteins in Escherichia coli Rosetta strain. The pure protein sample was used for studied by Dynamic Light Scattering (DLS), Small angle X-ray scattering, Circular Dichroism (CD) and Crystallization for X-ray diffraction. Thus, our main objective in this study was structurally describe these proteins, thereby allowing the generation of knowledge for understanding function of these proteins.

Submitted by Nathália Faria da Silva (nathaliafsilva.ufv@gmail.com) on 2017-07-11T14:11:33Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 484351 bytes, checksum: 312994cb64033039a832571f86cbf2a3 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-07-11T14:11:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 484351 bytes, checksum: 312994cb64033039a832571f86cbf2a3 (MD5) Previous issue date: 2001-07-06 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais / Trinta e três isolados de Xanthomonas campestris pv. campestris, obtidos de oito diferentes brássicas, provenientes de diferentes regiões do Brasil e do exterior, foram analisados com base em caracterizações bioquímica, patogênica, sorológica e genética, objetivando verificar a existência ou não de relacionamentos quanto à origem geográfica e ao hospedeiro. No estudo bioquímico, foram realizados 22 testes, além da avaliação da atividade de esterase, em que com base no tamanho do halo e utilizando o teste de Scott Knott no nível de 5% de probabilidade, obtiveram-se cinco grupos de similaridade. Avaliando a capacidade de produção de bacteriocina, verificou-se que três isolados apresentaram antibiose contra sete outros. Avaliou-se, também, a sensibilidade dos isolados a alguns antibióticos e, com base na análise de agrupamento, foi possível a observação de três grupos distintos: o primeiro constituído por quatro isolados resistentes a 11 ou mais antibióticos; o segundo grupo composto por um isolado resistente somente a três antibióticos; e o terceiro grupo composto pelos demais isolados. Na caracterização patogênica, foi realizada a inoculação cruzada, de forma que os 33 isolados foram inoculados artificialmente em sete diferentes brássicas. Desses, 14 não mostraram especificidade quanto aos hospedeiros, enquanto os 19 isolados restantes apresentaram relativo grau de especificidade, uma vez que não causaram doença em uma ou mais das brássicas inoculadas. Para a análise sorológica, foram obtidos sete antissoros, pelos quais se reconheceram, no teste de imunodifusão dupla, 32 dos 33 isolados estudados, além de mostrarem especificidade quanto ao reconhecimento dos isolados de X. campestris pv. campestris. Na caracterização molecular, realizou-se a extração do DNA total de todos os isolados, seguida de amplificação pela técnica do RAPD. Procedeu-se, também, à extração do DNA plasmidial. Para avaliação do comportamento dos 33 isolados de X. campestris pv. campestris de diferentes origens e hospedeiros, com relação às diferentes análises realizadas, foram efetuadas análises estatísticas univariadas, para a avaliação da atividade de esterase, e multivariadas, para as demais, bem como a análise conjunta de todos os resultados. Com base nos resultados das caracterizações bioquímica, patogênica e sorológica, não se observou correlação da variabilidade dos isolados estudados com a origem geográfica e o hospedeiro do qual foram obtidos. Isso pode ter sido devido à constante introdução de novos isolados de X. campestris pv. campestris nas áreas de plantio, por meio de sementes contaminadas. / Thirty-three isolates of Xanthomonas campestris pv. campestris, obtained from eight different Brassica species and originated from distinct geographic regions in Brazil and other countries, were analyzed in terms of their biochemical, pathogenic, serological and molecular properties, in order to determine whether there is a relationship between isolate variability and host or geographic origin. Twenty-two biochemical tests, besides the determination of sterase activity, were carried out for the biochemical characterization. Five similarity groups were identified using Scott- Knot s test at 5% probability. The analysis of bacteriocin production indicated that three isolates displayed antibiosis against seven other isolates. Sensitivity to several antibiotics was also evaluated. Using cluster analysis, three distinct groups were identified: the first group consisted of four isolates which were resistant to 11 or more antibiotics; the second group consisted of one isolate which was resistant to only one antibiotic; the third group consisted of all the other remaining isolates. For the pathogenic characterization, all 33 isolates were cross-inoculated onto seven different Brassica species. Fourteen isolates did not display host specificity. The remaining 19 isolates displayed a relative degree of host specificity, since they did not induce disease in one or more of the inoculated species. Seven polyclonal antisera were raised for the serological analysis. In immunodiffusion tests, 32 out of the 33 isolates tested were recognized by these antisera. The antisera specifically recognized isolates of X. campestris pv. campestris. For the molecular characterization, total DNA was extracted from each isolate and used as a template for RAPD reactions. Plasmid DNA was also extracted. Together, the data from the biochemical, pathogenic, serological and molecular analyses failed to indicate a relationship among the isolates, hosts and geographic origin. This could be due to the repeated introduction of new isolates of X. campestris pv. campestris into different geographic regions, via contaminated seeds.