Orientador: Humberto Santo Neto / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-16T20:39:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Boni_RobsonAparecidodosSantos_M.pdf: 2053465 bytes, checksum: ae91ac2421ee67ae72964df4c510de03 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: A distrofina é uma proteína de membrana ligada ao citoesqueleto da matriz extracelular das fibras musculares (esqueléticas e cardíacas) e nervosas. Enquanto que o papel da distrofina e os efeitos de sua ausência são bem conhecidos nos camundongos mdx (modelo animal da distrofia muscular de Duchenne), sabe-se pouco sobre sua função em nervos periféricos. A distrofina parece ser importante para o crescimento axonal, no sistema trigeminal a sua falta leva a defasciculação do sistema olfatório de camundongos. Em casos de ausência de distrofina a eliminação sináptica ocorre precocemente à expressão de moléculas pré-sinapticas é reduzida e a habilidade das células de Schwann terminais de guiarem as fibras para reinervação muscular fica comprometida. Estes achados sugerem que a distrofina possui papel essencial na regeneração nervosa periférica. Para testar esta hipótese nós examinamos a regeneração nervosa em camundongos mdx. Foram utilizados camundongos adultos machos da linhagem mdx e camundongos da linhagem C57BL/10 como controle, eles foram anestesiados com mistura de cloridrato de cetamina e cloridrato de xilazina. O nervo isquiático direito foi exposto e esmagado com uso de uma pinça fina sem ranhuras. Após o evento cirúrgico e cessado o efeito do anestésico os animais foram acondicionados em gaiolas e submetidos a regime hídrico e alimentar "ad libitum" com ciclo fotoperiódico claro/escuro de 12 horas. Destes, um grupo foi tratado com injeções intraperitoneais de L-arginina (6mg/kg) diluído em água bidestilada. Seis e 21 dias após o esmagamento os animais foram anestesiados e perfundidos por via intracardíaca com solução de Karnovsky. O nervo isquiático foi removido e imerso em fixador por 24 horas e pós-fixado em tetróxido de ósmio 1% por 2 horas. Posteriormente foram inclusos em blocos e feitos cortes semifinos que foram corados com azul de toluidina 0,5%. As secções foram analisadas em fotomicroscópio NIKON ECLIPSE E-400 (NIKON, Inc.). A densidade dos axônios com mielina (6dias) e axônios em regeneração (21 dias) foram contados. Nossos resultados demonstraram que a densidade de axônios com mielina foi significantemente maior no mdx em comparação ao C57BL/10 (312±10,2/mm2 versus 213,8±4,6/mm2). A densidade de macrófagos e células de Schwann com restos de mielina foram respectivamente 77,6±5,6/mm2 e 148±2,4/mm2. Após 21 dias, todos os parâmetros (diâmetro do axônio, espessura da bainha de mielina e número de axônios regenerados) foram significantemente menores nos camundongos mdx. Nos camundongos tratados com L-arginina os parâmetros foram semelhantes ao controle não havendo diferença estatística. Os resultados mostraram que o papel da distrofina e do óxido nítrico são de fundamental importância na regeneração nervosa periférica. / Abstract: Dystrophin is a membrane protein that links the cytoskeleton to the extracellular matrix in skeletal and cardiac muscle fibers and in the nervous system. While the role of dystrophin is well established and the effects of dystrophin loss, as it occurs in the mdx mice model of Duchenne muscular dystrophy, have been widely examined in muscle fibers, less is known about dystrophin function in peripheral nerves. It seems to be important for axonal outgrowth in the trigeminal system and the lack of dystrophin leads to nerve defasciculation in the mouse olfactory system. In the absence of dystrophin, synapse elimination occurs earlier, expression of presynaptic molecules is reduced and the ability of terminal Schwann cells to guide reinnervation of muscle fibers is impaired. These findings suggest a potential role of dystrophin in the regeneration of peripheral nerves. To test this hypothesis we examined nerve regeneration in mdx mice. Adult male mdx and control C57Bl/10 mice were anesthetized with a mixture of ketamine hydrochloride and thyazine hydrochloride. Right sciatic nerve was exposed at mid thigh and crushed with a fine forceps. The wound was closed and mice were kept with food and water ad libitum in a light-dark cycle of 12hs. One group was treated with L-arginine (6mg/kg) in drinking water. Six and 21 days after nerve crush mice were anesthetized and perfused intracardiacally with Karnovsky solution. Sciatic nerves were excised and fragments were immersed in the same fixative for 24 hours and post-fixed in 1% osmium tetroxide for 2 hours. They were conventionally processed for electron microscopy. Transverse semithin sections were stained with 0.5% toluidine blue. Sections were viewed under a Nikon Eclipse E-400 (Nikon, Inc.) microscope. The density of axons with myelin breakdown, of Schwann cells/macrophages filled with myelin debris (6 days) and of myelinated regenerating axons (3 weeks) were directly counted. Our results demonstrated that the density of axons displaying myelin breakdown was significantly higher in mdx than in crushed C57Bl/10 (312±10,2/mm2 versus 213,8±4,6/mm2) the density of macrophages and Schwann cells with myelin debris were respectively 77,6±5,6/mm2 and 148±2,4/mm2. After 21 days, all parameters (axonal diameter, myelin sheath thickness, number of regenerating axons) were significantly lower in mdx mice. When mdx was treated with L-arginine such parameters were not significantly different from control. These results demonstrated that dystrophin plays a role on nerve regeneration and that nitric oxide may be an important factor in that. / Mestrado / Anatomia / Mestre em Biologia Celular e Estrutural

Orientador: Elaine Minatel / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-13T07:56:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tonon_Erika_M.pdf: 1677236 bytes, checksum: e065259ff1028e91f63695538acbe0e8 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: A peroxidação lípidica causada pelo aumento de espécies reativas de oxigênio (EROs) no período que antecede o início da degeneração muscular no camundongo mdx, sugere que o estresse oxidativo pode ser um dos mecanismos primários da degeneração muscular distrófica, ao invés de ser um efeito secundário deste processo. No presente trabalho verificamos se o tratamento com ácido ascórbico antes que se iniciem os ciclos de degeneração/regeneração diminui a degeneração muscular em camundongos mdx. Camundongos mdx com 14 dias de vida pós-natal receberam por gavagem doses diárias de 0,1mg/kg de Ácido Ascórbico diluído em água por 7 (grupo mdx T7) e 14 dias (grupo mdx T14) e/ou dose de 200mg/kg por 14 dias (grupo mdx T14AA). Animais mdx controle receberam solução salina. Após este período, os músculos tibial anterior (TA), esternomastóide (STN) e diafragma (DIA) foram retirados. Na análise histológica, o ácido ascórbico diminuiu a degeneração muscular nos músculos TA do grupo mdx T7 e no DIA do grupo mdx T14AA (P<0,05, Student's t Test) quando comparados ao controle. Não houve diferença significativa nos níveis séricos de creatina quinase entre os grupos analisados (P>0,05, Student's t Test). Aumento significativo no conteúdo de TNF-", pela técnica de Western Blotting, foi observado nos músculos dos camundongos mdx tratados com ácido ascórbico. Os resultados indicam que o tratamento precoce de camundongos mdx com o ácido ascórbico diminuiu significativamente a mionecrose nos músculos tibial anterior e diafragma. O presente trabalho também sugere que o aumento do TNF-" não está necessariamente correlacionado ao aumento da mionecrose. / Abstract: Increased production of reactive oxygen species (ROS) can cause lipid peroxidation in the period preceding muscle necrosis in the mdx mice. This suggests that ROS may be involved as a primary, rather than secondary, cause of degeneration. In the present study, we verified whether ascorbic acid treatment before the cycles of muscle degeneration-regeneration decreases muscular degeneration in mdx mice. Mdx mice at 14 days of age received 0.1mg/kg of acid ascorbic daily in the water for 7 (group mdx T7) or 14 days (group mdx T14) and/or 200mg/kg for 14 days (group mdx T14AA). Control mdx mice received saline. After this period the tibialis anterior (TA), sternomastoid (STN) and diaphragm (DIA) muscles were removed. Hislogical analysis showed that ascorbic acid significantly decreased muscle degeneration in the TA of mdx T7 group and in the DIA of mdx T14AA group (P<0,05, Student's t Test) compared to control. There were no changes in serum CK activity in the ascorbic acid-treated mice compared to control (P>0,05, Student's t Test). Immunoblots showed a significant increase in the content of TNF-" in the muscles of the treated mdx mice. The present results indicate that ascorbic acid treatment before the cycles of muscle fiber degeneration-regeneration significantly decreases myonecrosis in TA and DIA dystrophic muscles. The present findings also sugest that increase TNF-" not necessarily correlates with increased myonecrosis. / Mestrado / Anatomia / Mestre em Biologia Celular e Estrutural

Orientador: Ricardo de Lima Zollner / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-08T15:14:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Vilella_ConceicaoAparecida_D.pdf: 48895468 bytes, checksum: c4753d07008661a967f99ba5800aaf87 (MD5) Previous issue date: 2005 / Resumo: No modelo experimental referenteà linhagem de camundongos NOD (non obese diabetic) a manifestação do diabetes autoimune é espontâneo semelhante ao observado em humanos, o qual se desenvolve entre a 12a e 24a semana de vida com prevalência variável nas diversas colônias, entre 60-90% em fêmeas e 0-20% nos machos. Os estudos dos mecanismos autoimunes do diabetes sugerem o desequilíbrio entre as populações de linfócitos Th1 e Th2 com predomínio do fenótipo Th1 com mecanismos efetores que levam a apoptose da célula 'beta' produtora de insulina. Inúmeros trabalhos sugerem que a apoptose das células 'beta' esteja associada à manifestação do diabetes tanto em modelos experimentais como em humanos. Componentes apoptóticos como Fas/Fas-L, IL-1f3, IFN-y e. TNF-a tem sido associados aos mecanismos efetores da apoptosedas ilhotas. Gangliosídeos podem bloquear de forma seletiva a produção de citocinas próinflamatórias como IFN-ye TNF-a (Th1) inibindo desta forma, a proliferação de linfócitos T. Por outro lado, citocinas antiinflamatóriascomo IL-4 e TGF-f3 podem ter sua síntese estimulada por estes compostos. No presente trabalho, investigamos o efeito do tratamento de gangliosídeos (GM1, GD1a, GD1b, GT1b) sobre a incidência do diabetes mellitus e da insulite em camundongos NOD. Foram monitorados os níveis glicêmicos, os aspectos morfológicos (índice de infiltrado, imunoistoquímica para detecção de subpopulações de linfócitosTCD4+,CD8+e macrófagos-CD11), a expressão gênica de citocinas, moléculas apoptóticas e antiapoptóticas e níveis séricos de citocinas IL-12,IL-4,TGF-f3,TNF-a,IFN-V. Os resultados sugerem que a administração de gangliosídeos a partir da 4a semana de vida do animal impede a manifestação do diabetes, modula o infiltrado inflamatório preservando células f3,diminui a resposta Th1 em ilhotas e eleva os níveis séricos de citocinas antiinflamatóriascomo IL4 e TGFf3,além de induzir a morte celular em linfócitos. Assim, o desenvolvimento de estudos adicionais dirigidos aos mecanismos de ação de gangliosídeos na manifestação do diabetes autoimune, é relevante,e fundamental para estratégiasde tratamentos mais efetivos / Abstract: The 'beta' cells destruction on diabetes type 1 autoimmune knowledge was derivative from NOD (diabetic non obese) mouse as experimental model, which have demonstrated great potential for drugs or immunotherapy's study. In this model, the diabetes manifestation occurs spontaneously like the observed in human, among 128-248 week of life. The prevalence could be varied from 60-90% in females and 0-20% in males. The autoimmune mechanism study suggests the imbalance between Th1 and Th2 response with predominance Th1 phenotype (IL-1(3,TNF-a, IFN-y). Thus, it was necessary the study of the Th1 and Th2 cytokines related to autoimmunity of the diabetes in NOD mouse. Moreover, it believed that apoptosis of the 'beta' cells it was associated with the diabetes manifestation in both human and experimental models. In such studies FaslFas-L were related with IL-1(3,IFN-y and TNF-a as effectors molecules of the cell death pancreatic islets. Gangliosides can block, in a selective manner, the pro-inflammatory (Th1) cytokines preduction like IFN-y and TNF-a and inhibit the T cells proliferation. However, these compounds can stimulate the synthesis of anti-inflammatory cytokines, like IL-4 and TGF-'beta'. In the present wOrk,we analyze the effect of the gangliosides (GM1,GD1a,GD1b, GT1b) treatment on diabetes mellitus manifestation in NOD mice. The glucose levels, injury index, CD4, CDa and CD11 immunohistochemical labeling, cytokines and apoptotic related molecules gene expression analyses and IL-12, IL-4, TGF-'beta' - TNF-'alfa' and IFN-y detection by immunoassay, were monitored. Our results showed that the ganglioside treatment frem 4th week of life prevents the on set of autoimmune diabetes, the inflammatory infiltrate installation. Th1 response can be suppresses by these compounds by the increase anti-inflammatory cytokines and the T cell apoptosis induction, besides the 'beta' cells preservation. Therefore take together these results reinforce the immunomodulatory action of gangliosides treatment on the diabetes mellitus manifestation / Doutorado / Ciencias Basicas / Doutor em Clínica Médica

Orientador: Maria Julia Marques / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-11T07:52:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Matsumura_CintiaYuri_M.pdf: 2365512 bytes, checksum: f477a4a5cc24566572273d6e630a85c9 (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: A ausência da distrofina em fibras musculares de camundongos mdx e na Distrofia Muscular de Duchenne (DMD) provoca ruptura no sarcolema, aumento no influxo de cálcio e conseqüente degeneração muscular. Neste trabalho verificamos os efeitos dos bloqueadores de canais de cálcio diltiazem e verapamil na degeneração/regeneração do músculo distrófico de camundongos mdx. Camundongos mdx (n=32; 18 dias de vida pós-natal) receberam diariamente injeção intraperitoneal de diltiazem (n=16; 72 mg/kg) ou verapamil (n=16; 25 mg/kg) por 18 dias. Após este período os músculos esternomastóide, diafragma, tibial anterior e coração foram retirados. Animais mdx controle (n=16) foram injetados com solução salina. Ambas drogas diminuíram significativamente os níveis séricos de creatina quinase (mdx tratado com salina: 573±245 U/l, animais tratado com diltiazem: 161±53*U/l e animais tratados com verapamil: 217±57*U/l; média±desvio padrão, *p<0,05 comparados a animais tratados com salina, teste t de Student). A quantificação de cálcio total, por espectrômetro de emissão óptica em plasma, foi 173-475% maior em músculos do mdx comparado a músculos de animais controles não-distróficos C57Bl/10. Verapamil e diltiazem reduziram a concentração de cálcio total apenas no diafragma (diltiazem: 229 mg de cálcio/kg versus salina: 295mg de cálcio/kg; p=0,06, teste t de Student) e no músculo cardíaco (diltiazem/verapamil: 10 mg de cálcio/kg versus salina: 16 mg de cálcio/kg; p<0,05, teste t de Student). Na análise histológica, o diltiazem diminui significativamente a degeneração muscular no diafragma (salina: 28% fibras com núcleo central e 7% fibras positivas ao Azul de Evans versus 12% fibras com núcleo central e 1% fibras positivas ao Azul de Evans; p<0,05, teste t de Student). Encontramos um aumento significativo de calsequestrina e ß-distroglicana, pela técnica de Western blotting, em alguns músculos dos animais tratados com diltiazem e verapamil. O diltiazem aparenta ser o mais efetivo agente na proteção contra degeneração muscular, especialmente nos músculos mais afetados. Nossos resultados indicam que bloqueadores de canais de cálcio protegem contra a degeneração muscular na ausência de distrofina e podem ser úteis para o melhor entendimento dos mecanismos envolvidos nas distrofinopatias / Abstract: The lack of dystrophin in dystrophin-deficient fibers of mdx mice and in Duchenne muscular dystrophy leads to sarcolemmal breakdown and enhanced calcium influx followed by muscle degeneration.In this work, we examined whether the calcium channel blockers diltiazem and verapamil could protect dystrophic muscles from degeneration/regeneration. Mdx mice (n=32; 18 days old) received daily intraperitoneal injections of diltiazem (n=16; 72 mg/kg body weight) or verapamil (n=16; 25 mg/kg body weight) for 18 days, after which the sternomastoid, diaphragm, tibialis anterior and cardiac muscles were removed. Control mdx mice (n=16) were injected with saline. Both drugs significantly decreased the blood levels of creatine kinase (saline-treated mdx mice: 573±245 U/l, diltiazem-treated mice: 161±53* U/l and verapamil-treated mice: 217±57* U/l; mean+S.E.M., *p<0.05 vs. saline controls, Student's t-test). The total calcium content, measured by plasma emission spectrometry, was 173-475% greater in mdx muscles compared to control C57Bl/10 muscles. Verapamil and diltiazem reduced the total calcium content only in diaphragm (diltiazem-treated mice: 229 mg calcium/kg vs. saline-treated mice: 295 mg calcium/kg; p=0.06, Student¿s t-test) and cardiac muscle (diltiazem/verapamil-treated mice: 10 mg calcium/kg vs. saline-treated mice: 16 mg calcium/kg; p<0.05, Student¿s t-test). Histological analysis showed that diltiazem significantly attenuated muscle degeneration only in diaphragm muscle (28% central nucleated fibers and 7% Evans blue-positive fibers in saline-treated mice vs. 12% central nucleated fibers and 1% Evans blue-positive fibers in diltiazem-treated mice; p<0.05, Student¿s t-test). Immunoblots showed a significant increase in the levels of calsequestrin and ß-dystroglycan in some diltiazem- and verapamil-treated muscles. Diltiazem was more effective than verapamil in protecting against muscle degeneration in mdx mice, especially in the more affected muscles. These results indicate that calcium channel blockers protect against muscle degeneration in the absence of dystrophin. They also suggest that these drugs could be useful therapeutic alternatives in the treatment of Duchenne muscular dystrophy. ABSTRACT The lack of dystrophin in dystrophin-deficient fibers of mdx mice and in Duchenne muscular dystrophy leads to sarcolemmal breakdown and enhanced calcium influx followed by muscle degeneration.In this work, we examined whether the calcium channel blockers diltiazem and verapamil could protect dystrophic muscles from degeneration/regeneration. Mdx mice (n=32; 18 days old) received daily intraperitoneal injections of diltiazem (n=16; 72 mg/kg body weight) or verapamil (n=16; 25 mg/kg body weight) for 18 days, after which the sternomastoid, diaphragm, tibialis anterior and cardiac muscles were removed. Control mdx mice (n=16) were injected with saline. Both drugs significantly decreased the blood levels of creatine kinase (saline-treated mdx mice: 573±245 U/l, diltiazem-treated mice: 161±53* U/l and verapamil-treated mice: 217±57* U/l; mean+S.E.M., *p<0.05 vs. saline controls, Student's t-test). The total calcium content, measured by plasma emission spectrometry, was 173-475% greater in mdx muscles compared to control C57Bl/10 muscles. Verapamil and diltiazem reduced the total calcium content only in diaphragm (diltiazem-treated mice: 229 mg calcium/kg vs. saline-treated mice: 295 mg calcium/kg; p=0.06, Student¿s t-test) and cardiac muscle (diltiazem/verapamil-treated mice: 10 mg calcium/kg vs. saline-treated mice: 16 mg calcium/kg; p<0.05, Student¿s t-test). Histological analysis showed that diltiazem significantly attenuated muscle degeneration only in diaphragm muscle (28% central nucleated fibers and 7% Evans blue-positive fibers in saline-treated mice vs. 12% central nucleated fibers and 1% Evans blue-positive fibers in diltiazem-treated mice; p<0.05, Student¿s t-test). Immunoblots showed a significant increase in the levels of calsequestrin and ß-dystroglycan in some diltiazem- and verapamil-treated muscles. Diltiazem was more effective than verapamil in protecting against muscle degeneration in mdx mice, especially in the more affected muscles. These results indicate that calcium channel blockers protect against muscle degeneration in the absence of dystrophin. They also suggest that these drugs could be useful therapeutic alternatives in the treatment of Duchenne muscular dystrophy / Mestrado / Biologia Celular / Mestre em Biologia Celular e Estrutural

Orientador: Elaine Minatel / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-23T10:31:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Burgos_RafaelRamosde_M.pdf: 2000317 bytes, checksum: 3ec9bdb6204407b72a6bd5378a5656ae (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: Tratamentos com antioxidantes e bloqueadores de canais de cálcio têm apresentado resultados positivos na diminuição da mionecrose nas fibras musculares distróficas. O objetivo do presente projeto foi verificar se o tratamento com o bloqueador de cálcio Nifedipina (Ni) e o antioxidante Coenzima Q10 (CoQ10), administrados isoladamente ou em associação antes que se iniciem os ciclos de degeneração/regeneração muscular, pode apresentar efeito benéfico sobre as fibras musculares distróficas de camundongos mdx, modelo experimental da distrofia muscular de Duchenne. Camundongos mdx com 14 dias de vida pós-natal foram divididos em 4 grupos experimentais: (1) tratados com álcool 20% e solução aquosa 1% de Tween 80; (2) tratados com a associação de Ni e CoQ10; (3) tratados com Ni isoladamente; (4) e tratados com somente CoQ10. Camundongos da linhagem C57BL/10 foram usados como controle. Os músculos tibial anterior (TA), diafragma (DIA) e esternomastóideo (STN) foram retirados e utilizados para quantificar: (1) o número de fibras em degeneração, regeneradas e normais; (2) o nível de TNF-?, NF-?B e 4-HNE; (3) o conteúdo de cálcio total; e (4) a área de inflamação muscular. Amostras de sangue foram utilizadas para determinação dos níveis creatina quinase (CK). Os animais tratados com Ni apresentaram: redução significativa de fibras em degeneração no músculo TA, redução nos níveis de TNF-? em todos os músculos analisados e no conteúdo de NF-?B e cálcio no músculo DIA. Animais mdx tratados com Coenzima Q10 mostrou redução: CK, TNF-? no músculo TA, no conteúdo de NF-?B nos músculos DIA e STN, na área de inflamação no músculo DIA e determinação do cálcio nos músculos DIA e STN. A associação dos tratamentos demonstrou redução significativa na análise de CK, no TNF-? do músculo TA, na área de inflamação, conteúdo do NF-?B e cálcio no músculo DIA. O conjunto dos resultados sugere que a Ni e a CoQ10 possam ser potencialmente úteis para o tratamento farmacológico da distrofinopatias. Entretanto, estudos futuros da dosagem e do tempo de tratamento serão necessários para obtenção de efeitos benéficos mais significativos sobre os músculos distróficos / Abstract: Treatment using antioxidant and calcium channel blockers have shown positive results for myonecrosis decrease in dystrophic muscle fibers. The aim of this study is to verify if treatment with Nifedipine (Ni) calcium channel blocker and Coenzyme Q10 (CoQ10) antioxidant, administered alone or in association before degeneration/regeneration cycles take place, may have a beneficial effect on dystrophic muscle fibers in mdx mice, which are the experimental model for Duchenne's dystrophy. Mdx mice at 14 days old were divided into 4 experimental groups: (1) treated with 20% alcohol and 1% Tween 80 water solution; (2) treated with an association of Ni and CoQ10; (3) treated with Ni alone; and (4) treated with CoQ10 alone. C57BL/10 mice were used as a control. The tibialis anterior (TA), diaphragm (DIA) and sternomastoid (STN) muscles were removed and used for quantification of: (1) number of degenerated, regenerated and wild-type fibers; (2) TNF-?, NF-?B and 4-HNE levels; (3) total amount of calcium; and (4) muscle inflammation area. Creatine kinase (CK) was analyzed from a blood sample. The animals treated with Ni showed: a significant decrease of degenerated muscle fibers in the TA muscle, a reduced TNF-? level in all muscles analyzed and lower levels of NF-?B and calcium in the DIA muscle. Mdx mice treated with Coenzyme Q10 presented a decrease of the following: CK expression, TNF-? level in the TA muscle, NF-?B level in the DIA and STN muscles, inflammation area in the DIA muscle and calcium content in the DIA and STN muscles. The association of both drugs showed a significant reduction of CK in the blood, TNF-? in the TA muscle, and also a reduction of the inflammation area, the NF-?B expression and the calcium content of the DIA muscle. Overall results suggest that Ni and CoQ10 may play a potential role as a pharmacological treatment for dystrophynopathies. However, further studies must be carried out for both dosage and treatment period to obtain more significant beneficial effects on dystrophic muscles / Mestrado / Anatomia / Mestre em Biologia Celular e Estrutural

Orientador: Humberto Santo Neto / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-19T16:25:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Pereira_JulianoAlves_M.pdf: 2037942 bytes, checksum: c24d96b2cb0285fc7a0e33b79cfd404a (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: A Distrofia Muscular de Duchenne (DMD) é o tipo mais comum de miopatia caracterizado pela perda da deambulação aproximadamente aos 10 anos de idade, levando a óbito por volta da segunda década de vida devido à insuficiência cardiorrespiratória. A degeneração muscular e a fibrose estão associadas com a inflamação nos músculos distróficos em pacientes DMD e no camundongo mdx, modelo experimental para a DMD. Sendo assim, a identificação de fármacos que possam amenizar a severidade e retardar a progressão da doença é necessária. Neste trabalho foi examinado o efeito da doxiciclina (DOX), um membro da família das tetraciclinas, na mionecrose e na fibrose intersticial nos músculos esquelético e cardíaco, além da função muscular de camundongos mdx jovens e idosos. No grupo mdx jovem, o tratamento com a DOX (Sandoz) foi administrado na água de beber 6mg/ml, para a mãe e seus recém-nascidos. Iniciou-se o tratamento no dia do nascimento e a mãe foi mantida na gaiola com os filhotes durante os 36 dias de tratamento (n=9). O grupo mdx controle recebeu apenas água (n=9). No grupo mdx idoso, o tratamento com a DOX (Sandoz) foi administrado na água de beber 6mg/ml, para os camundongos durante 9 meses. Este tratamento foi iniciado aos 8 meses e finalizado aos 17 meses de idade (n=8). O grupo mdx controle recebeu apenas água, durante o mesmo período (n=8). Através da avaliação histopatológica no músculo esquelético (bíceps braquial, diafragma e tibial anterior) e cardíaco foram identificadas e quantificadas, fibras em degeneração, fibras com núcleo central e com núcleo periférico, área de regeneração, área de inflamação e área de fibrose. Foi realizada análise bioquímica, através da determinação dos níveis séricos da Creatina Cinase (CK) no plasma sanguíneo e análise funcional da força de tração do membro torácico. Os resultados quantitativos foram comparados entre os camundongos mdx-DOX e os mdx controles. Nossos resultados mostram que a DOX amenizou o fenótipo distrófico na musculatura esquelética e cardíaca e melhorou a força muscular do membro torácico nos camundongos mdx. A DOX protegeu as fibras musculares contra a mionecrose acompanhada por uma diminuição dos níveis de CK e reduziu a área de inflamação. Além disso, a DOX retardou a progressão da fibrose miocárdica e a fibrose no músculo esquelético. Dado que a DOX apresenta compostos bem tolerados e aprovada pela FDA (Food and Drug Administration) esta droga surge como um potencial agente para o tratamento da DMD / Abstract: Duchenne muscular dystrophy (DMD) is the most common myopathy characterized by loss of ambulation at about 10 years of age with death by twenties due to respiratory and cardiac insufficiency. Muscle degeneration and fibrosis are associated with inflammation in dystrophic muscles of Duchenne muscular dystrophy and in the mdx mice. The identification of promptto- use drugs that can reduce the severity and slow down the progression of the disease is required. We examined whether doxycycline (DOX), a member of tetracycline family, can improve histopathology and muscle function of the mdx mice, an experimental model for DMD. For the short term study, DOX was administered to mothers and newborns in drinking water at 6mg/ml beginning at 1 days of birth, for 5 weeks (n=9). Control mdx mice received water only (n=9). For the long term study, DOX was given in drinking water at 6mg/ml (n=8) during 9 months (starting at 8 months age). Control mdx mice received water only (n=8). Skeletal (biceps brachii, diaphragm and tibialis anterior) and cardiac muscles were submitted to histopathological (degenerating fibers, fibers with central nucleus and nucleus with peripheral areas of inflammation and fibrosis area), biochemical (serum creatine kinase - CK) and functional studies. Quantitative results were compared between treated and untreated mdx mice. We found that DOX significantly minimized dystrophic phenotype in skeletal and cardiac muscles and improved forelimb muscle strength. The drug protected muscle fibers against myonecrosis and decreased inflammation accompanied by a decrease serum CK. Furthermore, DOX slowed down the progression of myocardial fibrosis and skeletal muscle. Given that DOX is well tolerated and approved by the Food and Drug Administration this drug emerges as a potential agent for DMD therapy / Mestrado / Anatomia / Mestre em Biologia Celular e Estrutural

Orientador: Elaine Minatel / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-27T05:53:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Hermes_TuliodeAlmeida_M.pdf: 2416913 bytes, checksum: 6780cc171b5db72eb9dd72aa61ad89b1 (MD5) Previous issue date: 2015 / Resumo: Estresse oxidativo e resposta inflamatória exacerbada são fatores que contribuem com a fisiopatogênese da distrofia muscular de Duchenne (DMD). No presente trabalho, avaliamos se a administração de Cilostazol, antes que se iniciem os ciclos degeneração/regeneração, diminui a degeneração muscular em camundongos mdx, modelo experimental da DMD. Nossa hipótese é que o Cilostazol possa apresentar efeito benéfico sobre as fibras musculares distróficas, uma vez que, este apresenta efeitos anti-inflamatório (reduzindo a expressão de citocinas pró-inflamatórias como o TNF-?, IL-1? e IL-6) e antioxidante (diminuindo a atividade de superóxido e eliminando radicais hidroxilas). Para verificar o efeito do cilostazol sobre as fibras musculares distróficas, camundongos mdx, com 14 dias de vida, receberam por gavagem 100 mg/kg de Cilostazol, por 14 dias consecutivos (grupo mdxC). Camundongos mdx não tratados (grupo mdx) e da linhagem C57BL/10 (grupo Ctrl) foram utilizados como controle. A análise de medida de força realizada em todos os animais (antes e após o período de tratamento) demonstrou que os animais do grupo mdxC apresentaram maior força muscular (cerca de 32%) em relação ao grupo mdx. Na análise bioquímica da degeneração muscular (análise de creatina quinase- CK em amostras de sangue), observou-se aumento significativo nos níveis séricos de CK nos camundongos mdx em relação aos animais controle e redução significativa de 63,2% deste aumento nos mdx tratados com Cilostazol. Na análise histológica dos músculos bíceps braquial (BB), diafragma (DIA) e tibial anterior (TA), verificou-se redução de 93,6% de fibras em degeneração (indicadas pela marcação com azul de Evans) no músculo BB, redução de 66,6% e 36,7% de fibras regeneradas (indicadas pela presença de núcleo centralizado) nos músculos TA e DIA, respectivamente e redução de 39,1% na área de inflamação no músculo BB dos animais do grupo mdxC em relação ao grupo mdx. Através da técnica de western blotting, moléculas envolvidas no processo inflamatório como o TNF-? e NF-?B e um dos produtos da peroxidação lipídica, o 4-HNE, foram analisados nos músculos BB, DIA e TA. Nos animais do grupo mdxC, observou-se diminuição significativa no conteúdo de TNF-? nos músculos DIA (48,5%), TA (35,4%) e BB (45,9%) em relação ao controle. O conteúdo de NF-?B apresentou-se reduzido 25,9% no músculo DIA. O conteúdo de 4-HNE reduziu nos músculos analisados do grupos mdxC, porém esta redução não foi significativa. Na reação Dihydroetidio (DHE) para detecção de espécies reativas de oxigênio, o tratamento com Cilostazol demonstrou ser potencialmente eficaz contra o estresse oxidativo, reduzindo a marcação de DHE em 36,8%, 40,4%, e 75,4% nos músculos BB, TA e DIA, respectivamente. Na análise de vascularização, observamos que os animais tratados com Cilostazol apresentaram aumento da densidade de microvasos no tecido muscular (cerca de 42,7% para o músculo BB e 15,3% para o músculo DIA). Em relação à análise da atividade antioxidante no músculo quadríceps (QUA), identificamos aumento na quantidade de GSH (33,1%) e na atividade da GR (89,1%), no grupo mdx em relação ao Ctrl. Em relação ao tratamento, este não apresentou efeito sobre a atividade antioxidante. O conjunto dos resultados nos permite sugerir que o Cilostazol apresenta potencial efeito benéfico sobre as fibras musculares distróficas / Abstract: Oxidative stress and exacerbated inflammatory response are factors that contribute to Duchenne muscular dystrophy (DMD) pathogenesis. In this work, we evaluated whether administration of Cilostazol, before beginning the degeneration/regeneration cycles, reduces muscle degeneration in mdx mice, an experimental model of DMD. Our hypothesis is that the Cilostazol may provide beneficial effects on dystrophic muscle fibers, since this has anti-inflammatory effects (reducing the expression of proinflammatory cytokines such as TNF-?, IL-1? and IL-6) and antioxidant (decreasing the activity of superoxide and eliminating hydroxyl radicals). To evaluate the Cilostazol effects on dystrophic muscle fibers, mdx mice, 14 days old, received by gavage 100 mg/kg of Cilostazol for 14 consecutive days (mdxC group). Mdx mice untreated (mdx group) and C57BL/10 mice (group Ctrl) were used as controls. Analysis strength measurement performed in all animals (before and after the treatment period) demonstrated that the animals of the mdxC group higher muscle strength (by 32%) compared to mdx group. In biochemical analysis of muscle degeneration (creatina kinase ¿ CK analysis in blood samples), there was significant increase in CK levels in mdx mice compared to control animals and a significant reduction by 63.2% of this increase in Cilostazol treated mdx. Histological analysis of the biceps brachial (BB), diaphragm (DIA) and tibial anterior (TA), showed a reduction of 93.6% of degenerating fibers (indicated by labeling with Evans blue) in the BB muscle, reduction of 66.6% and 36.7% of regenerated fibers (defined by central nuclei presence) in TA and DIA muscles respectively, and a reduction by 39.1% in inflammation area in BB muscle of mdxC group compared to mdx group. By the western blotting technique, molecules involved in inflammation such as TNF-? and NF-?B and one of the lipid peroxidation product, 4-HNE, were analyzed in the BB, DIA and TA muscles. In animals of mdxC group, we observed a significant decrease in TNF-? content in DIA (48.5%), TA (35.4%) and BB (45.9%) compared to control muscles. The NF-?B content had been reduced by 25.9% in the DIA muscle. The 4-HNE content reduced in the muscles analyzed in mdxC groups, but this reduction was not significant. In Dihydroethidium (DHE) reaction for detecting reactive oxygen species, treatment with Cilostazol shown to be potentially effective against oxidative stress, reducing DHE marking by 36.8%, 40.4% and 75.4% in BB, TA and DIA muscles, respectively. In the vasculature analysis, we observed that cilostazol treated animals showed increased microvessel density in muscle tissue (approximately by 42.7% for the BB muscle and 15.3% for DIA muscle). On the analysis of antioxidant activity in the quadriceps (QUA), we identified an increase in the GSH content (33.1%) and GR activity (89.15) in the mdx group compared to Ctrl group. Regarding treatment, this had no effect on antioxidant activity. The results together suggest that cilostazol has a potential beneficial effect on the dystrophic muscle fibers / Mestrado / Anatomia / Mestre em Biologia Celular e Estrutural

Orientador: Humberto Santo Neto / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-27T14:32:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Pereira_JulianoAlves_D.pdf: 20174519 bytes, checksum: cb29b0264ecac77cff508a6dbc1ec270 (MD5) Previous issue date: 2015 / Resumo: Na distrofia muscular de Duchenne (DMD) e no camundongo mdx, a ausência da distrofina no músculo esquelético e cardíaco, desestabiliza o sarcolema e leva a um aumento do influxo de cálcio e consequente mionecrose. A reação inflamatória induzida para remover a fibra muscular necrótica, ativa a produção de citocinas pró-inflamatórias, que por sua vez aumenta o estresse oxidativo e ultimamente levando a formação de fibrose intersticial. A terapia padrão ouro usada no tratamento da DMD é o corticosteroide, tal como a prednisona e o deflazacorte (DFZ). No entanto, eles apresentam valor terapêutico limitado, e sua combinação com drogas já aprovada para o tratamento de outras doenças humanas, como a doxiciclina (DOX) poderia ser uma alternativa no tratamento clínico em pacientes DMD. No presente estudo, investigamos os benefícios da terapia do DFZ associado a DOX em relação ao tratamento padrão ouro DFZ, na atenuação da evolução da distrofinopatia em músculo esquelético e cardíaco de camundongos mdx. As terapias com cada droga isoladamente (DOX 6 mg/mL), (DFZ 1,2 mg/Kg) e com a combinação DOX (6 mg/mL) / DFZ (1,2 mg/Kg) foram administradas na água de beber para mãe e seus recém nascidos, com início no dia do nascimento no grupo tratado de curta duração por 36 dias. No tratamento de longa duração (9 meses), as mesmas terapias e as mesmas doses foram administradas na água de beber, com início aos 8 meses até os 17 meses de idade. Os parâmetros histopatológicos, funcionais e bioquímicos foram avaliados no músculo esquelético (bíceps braquial e diafragma) e coração. A DOX/DFZ apresentou-se vantajosa em relação a monoterapia com DFZ tanto na proteção inicial contra a mionecrose, quanto em retardar a progressão da distrofinopatia nos músculos esqueléticos. Mostrou-se também vantajosa em relação ao DFZ na proteção cardíaca. A combinação da DOX com o DFZ, já utilizada no tratamento de algumas doenças emerge como um tratamento potencialmente útil para DMD / Abstract: In Duchenne Muscular Dystrophy (DMD) and in mdx mice, absence of dystrophin in skeletal and cardiac muscle disrupts the sarcolemma and leads to increased calcium influx and consequent myonecrosis. The inflammatory reaction elicited to remove muscle fiber debris results in production of pro-inflammatory cytokines which, in turn, increases oxidative stress, and ultimately causes interstitial fibrosis. The gold standard therapy used in the treatment of DMD consists in the use of corticosteroids such as prednisone and deflazacort (DFZ). However, these drugs have limited therapeutic value and their combination with drugs already approved for the treatment of other human diseases such as doxycycline (DOX) could be beneficial in the clinical management of DMD patients. In this study, we investigated the benefits of the association between DFZ and DOX over therapy with DFZ (gold standard), in mitigating the evolution of dystrophinopathy in skeletal and heart muscle in mdx mice. The treatments with the single drug (DOX 6 mg/mL), (DFZ 1,2 mg/Kg) or DOX (6 mg/mL) / DFZ (1,2 mg/Kg) combination were administered in drinking water to mothers and newborns, starting on the day of birth in the short-term treatment group for a period of 36 days. In the long-term treatment group, which was composed of mice 17 months of age, the same treatments were administered in drinking water to mdx mice for 9 months, starting on their 8 month of birth. Histopathological, functional and biochemical parameters were evaluated in skeletal (biceps brachii and diaphragm) and cardiac muscle. DOX/DFZ combination was found to be advantageous over monotherapy with DFZ either by promoting an initial protection against myonecrosis or by slowing the progression of dystrophinopathy of skeletal muscles. It was also advantageous for cardiac protection. The combination of DOX with DFZ, which has already been used in the treatment of some diseases, has emerged as a potential useful therapy for DMD / Doutorado / Anatomia / Doutor em Biologia Celular e Estrutural

Muitos estudos de câncer têm sido desenvolvidos, mas os mecanismos moleculares da tumorigênese e a resposta imune contra tumores não foi completamente elucidada. RMAS é uma linhagem celular mutante derivada de RMA. Ao contrário da última, RMAS é deficiente de MHC I e, portanto, é avlvo de células NK. O objetivo deste trabalho foi o uso deste par de células para estabelecer modelos murinos que possam ser usados para entender a resposta imune entre células CD8 e NK contra tumor e investigar o efeito da expressão de moléculas antiapoptóticas no comportamento tumoral in vivo. Essa abordagem pode prover informações relevantes para o desenvolvimento de novas terapias. Para desenvolver células EGFP, foi usado um vetor retroviral bicistrônico contendo o gene Egfp. Para desenvolver os modelos experimentais, camundongos C57BL6 WT foram injetados iv com diferentes números de células e curvas de sobrevivência foram geradas. Os padrões de doença e infiltração tumoral foram observadas por análises macroscópica, microscópica e por detecção de EGFP em tecidos. In vivo, células RMA. induziram paralisia enquanto RMA-S.Egfp, ascite. RMA.Egfp infiltrou a medula óssea enquanto RMA-S.Egfp, tecidos diferentes como fígado, rins e peritôneo, mas não a medula óssea. Os sinais clínicos apareceram após 15 dias da inoculação de >104 células e a morte, em 30 dias. Números <103 células não induziram doença nem morte, mas protegeram de ambas quando re-inoculadas 106 células RMA.Egfp. Camundongos CD4KO e CD8KO paralisaram e morreram antes do que os WT. Células RMA.BclW.Egfp foram mais resistentes a apoptose do que células RMA.Egfp in vitro e provocaram características clínicas piores: paralisia e morte anteriores, inchaço de membros e hemorragia de fígado e rins. / Many cancer studies have been developed, however the molecular mechanisms of tumorigenesis and immune responses to tumor is not completely elucidated. RMAS cells are a mutant lymphoma line derived from RMA cells. In contrast to the latter, RMAS are deficient in MHCI and, therefore, are targets for NK cells. Our aims were use these pair of cells to establish mouse models that can be used to understand CD8T vs NK cell immune responses to tumors and investigate the effect of expression of antiapoptotic molecules in tumor behavior in vivo. The combination of these approaches should provide relevant information for the development of novel immunotherapy. To develop EGFP cells we used a bicistronic retroviral vector containing Egfp gene. To develop the experimental models, WT C57BL/6 mice were iv injected with different cell numbers and survival curves were produced. In addition, clinical features and tumor spread was observed by macroscopy, microscopy and EGFP detection of tumor cell analysis in tissues. When injected in vivo, RMA.Egfp cells induced progressive paralysis while RMA-S.Egfp promoted ascites. RMA.Egfp cells infiltrated the bone marrow, while RMA-S.Egfp were found in different tissues such as liver, kidney and the peritoneum cavity, but were not found in bone marrow. The symptoms appeared 15 days post injection of >104 cells and the death was 30 days. Numbers of <103 cells do not induced pathology or death, but protected to paralysis and death when re-injected 106 RMA.Egfp cells. CD4KO and CD8KO mice showed paralysis and death earlier than WT mice. RMA.BclW.Egfp cells were more resistant to apoptosis than RMA.Egfp in vitro and induced worse clinical features in vivo: earlier paralysis and death, swelling of members, haemorragia of liver and kidneys.

Orientador: José Angelo Camilli / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-17T23:25:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Nakagaki_WilsonRomero_D.pdf: 4233267 bytes, checksum: 97a4bebd0547a5885f015f496b45e99f (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: A distrofia muscular de Duchenne (DMD) é uma doença neuromuscular resultante da ausência de distrofina. Em virtude do enfraquecimento muscular e do uso de glicocorticóides, pacientes com DMD têm ossos frágeis. O camundongo mdx é o modelo experimental largamente utilizado para o estudo da DMD e apresenta falta da distrofina, processo inflamatório intenso e degeneração da fibra muscular. Além disso, apresenta ciclos de degeneração/regeneração muscular que se iniciam de forma mais marcante após o vigésimo primeiro dia de vida. Estudos demonstraram que camundongos mdx têm níveis elevados de fatores de crescimento de fibroblasto e proteína quimiotática de monócito-1, bem como aceleração da cicatrização em lesões da pele. Com base nessas evidências, elaboramos duas hipóteses. A primeira hipótese é que podem existir alterações nos ossos de camundongos mdx por influência da ausência de distrofina ou por algum outro mecanismo inerente à doença mesmo antes da sua manifestação clínica. A segunda hipótese é que o processo de reparo ósseo espontâneo também possa estar acelerado, de modo semelhante à cicatrização da pele. Para testar a primeira hipótese o fêmur e o músculo quadríceps do camundongo mdx foram analisados aos 21 dias de vida. Para verificar a segunda hipótese foi produzido um defeito no osso parietal direito e a regeneração foi analisada após 15, 30 e 60 dias pós-cirúrgicos. Na análise morfológica do quadríceps as fibras musculares apresentavam núcleos periféricos e não foram observadas fibras positivas para o corante azul de Evans em ambos os grupos, indicando que não houve degeneração das fibras no grupo mdx. O fêmur do grupo mdx demonstrou osteopenia, menor quantidade de osteoblastos, menor conteúdo mineral e menor resistência mecânica na ausência de sinais de degeneração muscular em relação ao grupo controle. No estudo do osso parietal, os dados mostraram que não há diferença significante no volume de osso neoformado entre os grupos controle e mdx nos três tempos pós-operatórios e também entre os três tempos, independentemente do grupo estudado. Diante destes resultados, concluímos que o fêmur dos camundongos mdx com 21 dias de vida pode conter um distúrbio interligado a algum fator genético, diretamente ou não relacionado com a ausência de distrofina. Isto demonstrou que a perda da qualidade óssea em camundongos mdx não ocorre somente em função do enfraquecimento muscular. Considerando a qualidade óssea inferior do fêmur e a similaridade estatística da taxa de regeneração óssea, entendemos que a capacidade osteogênica da calvária mdx foi mais expressiva do que a dos camundongos controle, igualando a taxa de reparo ósseo de um tecido com menor qualidade à de ossos normais / Abstract: Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a neuromuscular disease caused by lack of dystrophin. DMD patients have brittle bones because of muscle weakness and use of glucocorticoids. The mdx mouse is widely used as experimental model for the study of DMD and it presents lack of dystrophin, intense inflammatory process and muscle fiber degeneration. Moreover, it presents cycles of muscle degeneration/regeneration that becomes more marked after the twenty-first day of life. Studies have shown that mdx mice have elevated levels of fibroblast growth factor and monocyte chemoattractant protein-1, as well as accelerate wound healing in skin lesions. Based on this evidence, we formulate two hypotheses. The first hypothesis is that there may be changes in the bones of mdx mice by the influence of the absence of dystrophin or by some other mechanism inherent to the disease even before clinical manifestation. The second hypothesis is that the process of spontaneous bone repair can also be accelerated, similar to skin healing. To test the first hypothesis, the femur and the quadriceps muscle of mdx mice were analyzed at 21 days of life. To verify the second hypothesis a defect was produced in the right parietal bone and the regeneration was evaluated after 15, 30 and 60 days after surgery. In the morphological analysis of quadriceps were observed muscle fibers with peripheral nuclei and were not seen Evans blue dye positive fibers in both groups, indicating that there was no fiber degeneration in mdx group. The femur of the mdx group demonstrated osteopenia, lower number of osteoblasts, lower mineral content and lower mechanical strength in the absence of signs of muscular degeneration compared to the control group. In the study of the parietal bone, the data showed no significant difference in newly formed bone volume between control and mdx groups in the three moments after the operation and also between the three moments, regardless of the studied group. Given these results, we conclude that the femur of mdx mice at 21 days of life can contain a disorder linked to some genetic factor, directly or not related to the absence of dystrophin. This demonstrated that loss of bone quality in mdx mice occurs not only because of muscle weakening. Considering the lower femur bone quality and statistical similarity in the rate of bone regeneration, we believed that the osteogenic capacity of mdx calvaria was more expressive than that of control mice, equaling the rate of bone repair of a tissue with lesser quality to that of normal bones / Doutorado / Anatomia / Doutor em Biologia Celular e Estrutural