Ureases, enzimas que catalisam a hidrólise da ureia formando amônia e dióxido de carbono, são sintetizadas por plantas, fungos e bactérias. A espécie leguminosa Canavalia ensiformis, conhecida em inglês como Jack Bean, produz diferentes isoformas de ureases, sendo a chamada Jack Bean Urease (JBU) a isoforma majoritária. Ureases possuem atividade inseticida já comprovada para diferentes espécies de insetos e um dos seus efeitos no animal é o bloqueio neuromuscular. O objetivo deste trabalho foi compreender o mecanismo de ação responsável pela atividade neurotóxica da JBU e pelo bloqueio neuromuscular em insetos. A injeção de JBU em baratas (Nauphoeta cinerea), apesar de não letal, induziu uma inibição da enzima acetilcolinesterase no SNC. A urease, assim como a acetilcolina ou o anticolinérgico neostigmina, também induziu um aumento no ritmo cardíaco das baratas. Insetos tratados com JBU tiveram um aumento no tempo de grooming, efeito comportamental este mimetizado com o tratamento por octopamina. Os resultados acima citados indicam um efeito da JBU no SNC do animal, interferindo com a neurotransmissão colinérgica e octopaminérgica e, possivelmente, também GABAérgica. A atividade de JBU sobre o sistema neuromuscular de insetos também foi estudada através de registros eletrofisiológicos do potencial de ação neural, muscular e de placa motora. Em preparação de músculo tarsal de gafanhoto (Locusta migratoria), a urease reduziu a amplitude do potencial de ação evocado; entretanto quando aplicada diretamente no músculo oviductal isolado, a JBU não alterou a resposta contrátil. Em preparações de placa motora de larvas da mosca-da-fruta Drosophila melanogaster, a urease aumentou a amplitude dos potenciais excitatórios pós-sinápticos (EJPs) e a frequência dos eventos miniaturas (mEJPs). O efeito da JBU sobre a junção neuromuscular de insetos foi reduzido conforme a concentração de cálcio no meio extracelular também foi reduzida e completamente revertido quando o cálcio foi removido do meio (presença de EGTA e cloreto de Co2+), indicando que a mobilidade de íons de cálcio possui um papel importante na toxicidade induzida por JBU no inseto. Experimentos de imagem de cálcio em gânglios de N. cinerea confirmaram um maior influxo de cálcio no neurônio na presença de JBU, indicando que mobilidade do cálcio através da membrana foi alterada. Os resultados obtidos confirmam que a urease induz neurotoxicidade em insetos tanto a nível central como periférico, atuando sobre os gânglios do cordão nervoso, sobre neurônios aferentes e sobre o terminal pré-sináptico de neurônios motores. A neurotoxicidade induzida por JBU aparenta ser dependente do influxo de íons de cálcio no neurônio. / Ureases, enzymes that catalyse the hydrolysis of urea into ammonia and carbon dioxide, are synthesized by plants, fungi and bacteria. The legume Canavalia ensiformis, known as jack bean, produces different isoforms of ureases, being the jack bean urease (JBU) its major isoform. Ureases have insecticidal activity against different insect species and one of effects induced by JBU is a neuromuscular blockage. The aim of this work is to further understand the mechanism of action behind this blockage. The injection of JBU into cockroaches (Nauphoeta cinerea), despite not lethal, caused inhibition of brain acetylcholinesterase enzyme. Urease, as well as acetylcholine or the anticholinesterase drug neostigmine, induced a positive cardiac chronotropism in cockroaches. Similar to octopamine, JBU induced an increase in the time spent on grooming behaviour. These results indicate that JBU may act on the central nervous system of the animal by interfering with neurotransmission, more specifically on the cholinergic, octopaminergic and, possibly, GABAergic pathways. The activity of JBU on the neuromuscular junction of insects was studied through electrophysiological recordings. On the tarsus muscle of locust (Locusta migratoria), JBU reduced the amplitude of evoked muscle potentials, but did not alter the contractile response when applied to the oviduct muscle isolated. When applied on the end-plate of flies (Drosophila melanogaster) JBU led to an increase in the amplitude of Excitatory Junctional Potentials (EJPs), as well as to higher frequency of miniature Excitatory Junctional Potentials (mEJPs). JBU’s effect on the neuromuscular junction was reduced when the extracellular calcium concentrations decreased, and it was completely reversed when in calcium free preparations (in the presence of EGTA and Cobalt chloride), indicating that calcium mobility may play an important role in JBU-induced toxicity. Calcium imaging of cockroach ganglions revealed increased calcium influx upon exposition to JBU. These results indicate that JBU induces a central and peripheral neurotoxicity in insects, by interfering on neurotransmitters release or signalling in the ventral nerve cord, in the afferent neurons and in the motor neurons. Moreover, JBU-induced neurotoxicity depends on the influx of calcium ions into the neurons.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Lectins are proteins that bind carbohydrates specifically and reversibly. The legume lectins represent the best studied and established group, from the point of view of physical-chemical and biological and structural, where a well-studied group of these proteins involves lectin obtained from members of the subtribe Diocleinae. Lectins Diocleinae have a high degree of structural similarity, but the same was not true regarding biological activities. This variability, as a rule, is in the detail that can be analyzed in structures based studies. In this context, multiple cardiovascular disease and inflammatory processes, particularly chronic and recurrent nature, arouse the interest of the scientific community because they require a wider range of drugs for therapeutic alternatives. In this sense, they become important research seeking new compounds with vasorelaxant and anti-inflammatory action. The present paper describes the partial structural and biological characterization of two lectins present in Canavalia virosa and Canavalia oxyphylla seeds, belonging to the family Leguminosae, subfamily Papilionoideae, Phaseoleae tribe, subtribe Diocleinae. The lectin from Canavalia virosa seeds (ConV) was purified in a single step by affinity chromatography on mannose-Sepharose 4B column. ConV strongly agglutinated rabbit erythrocytes and was inhibited by monosaccharide (D-mannose, D-glucose and α-methyl-D-manosÃdeo) and glycoproteins (fetuin and ovalbumin). SDS-PAGE revealed three bands, corresponding to three chains (α, β, γ and) confirmed by ESI mass spectrometry with masses of 25.480  2 Da, 12.864  1 Da and 12,633  1 Da, respectively. The hemagglutination activity of ConV is great in pH 7.0 to 9.0, stable at a temperature of 80 C, and is not affected by EDTA. ConV showed no toxicity against Artemia sp. and relaxed the endothelized rat aorta, with the participation of the lectin domain. In our tests, the lectin immobilized on CNBr-Sepharose was able to bind 0.8 mg of ovalbumin by chromatography, allowing the use of ConV as a tool to capture and purification of glycoproteins. Moreover, the lectin from Canavalia oxyphylla (CoxyL) was purified in a single step by affinity chromatography on Sephadex G-50 column. SDS-PAGE showed that pure lectin consists of a major band of 30 kDa (α chain) and two minor components (β and γ chains) of 16 and 13 kDa, respectively. These data were further confirmed by mass spectrometry via electrospray ionization. Compared to the average molecular weight of the α chains, the partial amino acid sequence obtained corresponds to about 45% of the total sequence CoxyL. CoxyL showed hemagglutinating activity was specifically inhibited by monosaccharide (D-glucose, D-mannose and methyl-α-D-manosÃdeo) and glycoproteins (fetuin and ovalbumin). Furthermore, CoxyL proved to be heat stable at 60 C, and its activity is optimal at pH 7.0. CoxyL caused toxicity in Artemia sp. and induced paw edema in rats. / Lectinas sÃo proteÃnas que se ligam a carboidratos de forma especÃfica e reversÃvel. As lectinas de leguminosas representam o grupo mais bem estudado e estabelecido, tanto do ponto de vista de caracterizaÃÃo fÃsico-quÃmica e biolÃgica como estrutural, onde um grupo bem estudado destas proteÃnas envolve lectinas obtidas de membros da subtribo Diocleinae. As lectinas de Diocleinae apresentam um alto grau de similaridade estrutural, porÃm o mesmo nÃo se observa quanto Ãs atividades biolÃgicas. Esta variabilidade, via de regra, està em detalhes que podem ser analisados em estudos baseados em estruturas. Neste contexto, mÃltiplos processos patolÃgicos cardiovasculares e inflamatÃrios, principalmente de natureza crÃnica e recorrente, despertam o interesse da comunidade cientÃfica por requererem uma maior variedade de fÃrmacos para alternativas terapÃuticas. Neste sentido, tornam-se importantes pesquisas que busquem novos compostos, com aÃÃo vasorrelaxante e anti-inflamatÃria. Assim, o presente trabalho descreve a caracterizaÃÃo estrutural parcial e biolÃgica de duas lectinas presentes em sementes de Canavalia virosa e Canavalia oxyphylla, pertencentes à famÃlia Leguminosae, subfamÃlia Papilionoideae, tribo Phaseoleae, subtribo Diocleinae. A lectina de sementes de Canavalia virosa (ConV) foi purificada em uma Ãnica etapa atravÃs de cromatografia de afinidade em coluna Sepharose-mannose 4B. ConV aglutinou fortemente eritrÃcitos de coelho e foi inibida por monossacarÃdeos (D-manose, D-glicose e α-metil-D-manosÃdeo) e glicoproteÃnas (ovalbumina e fetuÃna). SDS-PAGE revelou trÃs bandas, correspondentes a trÃs cadeias (α, β, e γ) confirmadas por espectrometria de massas ESI com massas de 25,480Â2 Da, 12,864Â1 Da e 12,633Â1 Da, respectivamente. A atividade hemaglutinante da ConV à Ãtima nos pH 7.0 a 9.0, estÃvel a uma temperatura de 80 ÂC, e nÃo à afetada pelo EDTA. ConV nÃo demonstrou toxicidade contra nÃuplios de Artemia sp. e relaxou a aorta endotelizada de ratos, com a participaÃÃo do domÃnio da lectina. Em nossos testes, a lectina imobilizada em CNBr-Sepharose foi capaz de se ligar a 0,8 mg de ovalbumina por cromatografia, permitindo o uso de ConV como uma ferramenta para a captura e purificaÃÃo de glicoproteÃnas. Por outro lado, a lectina de Canavalia oxyphylla (CoxyL) foi purificada em um Ãnico passo atravÃs de cromatografia de afinidade em coluna Sephadex G-50.SDS-PAGE mostrou que a lectina pura consiste de uma principal banda de 30 kDa (cadeia α) e dois componentes menores (cadeias β e γ) de 16 e 13 kDa, respectivamente. Estes dados foram adicionalmente confirmados por espectrometria de massas por ionizaÃÃo por eletropulverizaÃÃo. Em comparaÃÃo com a massa molecular mÃdia das cadeias α, a sequÃncia parcial de aminoÃcidos obtida corresponde a aproximadamente 45% da sequÃncia total de CoxyL. CoxyL apresentou atividade hemaglutinante que foi especificamente inibida por monossacarÃdeos (D-glicose, D-manose, e α-metil-D-manosÃdeo) e glicoproteÃnas (ovalbumina e fetuÃna). AlÃm disso, CoxyL mostrou ser termoestÃvel a 60 C, e sua atividade à Ãtima no pH 7,0. CoxyL causou toxicidade em nÃuplios de Artemia sp. e induziu edema de pata em ratos.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2010 / Made available in DSpace on 2012-10-25T14:43:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 287231.pdf: 1031379 bytes, checksum: f35f0f76d7dd3b0962a5549c477d485b (MD5) / Lectinas são proteínas com capacidade de ligação reversível a carboidratos ou glicoconjugados. No sistema nervoso central de mamíferos, lectinas com afinidade para manose/glicose ou galactose podem modular diversos aspectos da comunicação celular. ConBr, uma lectina isolada das sementes de Canavalia brasiliensis apresentou efeito antidepressivo no teste do nado forçado (TNF) em camundongos, envolvendo, pelo menos em parte, o sistema monoaminérgico. O presente estudo buscou investigar os efeitos neuroprotetores da lectina ConBr em modelos animais de toxicidade glutamatérgica. Os resultados demonstraram que ConBr (10µg/sítio, i.c.v) reduziu as crises tônico-clônicas induzidas pelo agonista de receptores NMDA, ácido quinolínico, produzindo um percentual de proteção de 58%. Adicionalmente, ConBr foi capaz de diminuir significativamente a severidade das convulsões, sem no entanto alterar a latência para a primeira convulsão nem o tempo de duração da crise convulsiva. O AQ produziu um aumento significativo na fosforilação dos sítios Ser-831 e Ser-845 da subunidade GluR1 de receptores AMPA, sendo essa ação bloqueada pelo pré-tratamento com ConBr. O efeito neuroprotetor de ConBr foi dependente de sua integridade estrutural bem como da sua capacidade de ligação à resíduos de oligossacarídeos. Os efeitos observados são aparentemente específicos desde que ConA, uma lectina que tem alta homologia com ConBr, não foi capaz de produzir atividade neuroprotetora. O AQ além de induzir convulões também causa intensa morte celular no hipocampo 24 h após sua administração, medida pela incorporação de iodeto de propídio e o pré-tratamento com ConBr também bloqueou essa ação do AQ. A viabilidade celular também foi avaliada em um modelo in vitro de fatias hipocampais expostas a concentrações tóxicas de glutamato (1 e 10 mM) e medida através da redução do MTT. Neste modelo o glutamato reduz em cerca de 30% a viabilidade celular. O pré-tratamento com ConBr foi capaz de prevenir a queda de viabilidade, sendo a atividade neuroprotetora máxima observada na concentração de 10µg/ml e o IC50 de 7,2 µM. Em conjunto os dados sugerem que a lectina ConBr é capaz de exercer uma ação modulatória sobre receptores NMDA, inibindo sua atividade e dessa forma produzindo neuroproteção. Adicionalmente os dados corroboram com estudos anteriores que demonstram ação antidepressiva de ConBr no TNF via inibição de receptores NMDA.

A cultura algodoeira tem significativa participação na economia mundial. O algodão (Gossypium hirsutum) é predado por uma grande variedade de insetos, entre eles o percevejo manchador Dysdercus peruvianus (Hemiptera: Pyrrhocoridae). O hábito alimentar deste inseto provoca danos nas sementes e fibras depreciando-as para a utilização comercial. Como alternativa para o aumento da resistência das plantas ao ataque de insetos predadores, estratégias biotecnológicas vêm sendo consideradas. A Canavalia ensiformis é fonte de proteínas com atividade inseticida como a urease, a canatoxina e a concanavalina-A. Tanto a canatoxina como a urease exercem efeitos tóxicos em ninfas deste percevejo, causando mortalidade e atraso no desenvolvimento dos insetos sobreviventes. De maneira análoga a outros modelos de insetos já estudados, a toxicidade em D. peruvianus dependeria da ativação proteolítica das proteínas por enzimas digestivas (catepsinas) do inseto e formação de um peptídeo tóxico. Neste trabalho, estudos de hidrólise in vitro na presença de inibidores seguidos por SDS-page e Western-blot confirmaram a ativação proteolítica da urease por enzimas do tipo catepsina-B. O homogeneizado de intestinos de ninfas hidrolisa também substratos típicos para catepsinas, como hemoglobina e Abz-AIAFFSRQ-EDDnp, e a atividade proteolítica é bloqueada por pepstatina-A e E-64, inibidores específicos para aspártico e cisteíno proteinases, respectivamente. Duas cisteíno proteinases (DpQ-NR e DpQ-E) de intestinos de ninfas de D. peruvianus foram parcialmente purificadas e caracterizadas. Ambas apresentaram pH ótimo de atividade proteolítica entre 4,5 e 6,5, na presença de DTT e foram totalmente inibidas por E-64. No entanto o perfil de inibição evidencia a presença de outras enzimas nas frações. Ensaios de especificidade da fração DpQ-NR revelaram a preferência da enzima por substratos contendo resíduo hidrofóbico em P2, enquanto a enzima DpQ-E tem preferência por substratos contendo aminoácidos básicos em P1. Assim, o trabalho desenvolvido sugere a presença de proteinases múltiplas no sistema digestivo de D. peruvianus e o possível envolvimento destas peptidases na ativação proteolítica da urease. / Cotton (Gossypium hirsutum), an important agricultural commodity, is attacked by a number of pests, such as the cotton stainer bug Dysdercus peruvianus (Hemiptera: Pyrrhocoridae) which may cause severe losses in cotton plantations. Bug feeding on the cotton seeds and stains the cotton fibers resulting in damage to the seed, besides being a vector for phytopathogenic bacteria and fungi. Biotechnology strategies focusing on plant defensive molecules are being considered as an alternative to increase host plant resistance against this pest. The jack bean Canavalia ensiformis is the source of proteins displaying insecticidal activity such as urease, canatoxin and concanavalin-A. Canatoxin and urease were shown to cause lethality and severe detrimental effects in surviving insects, delaying the development stages of D. peruvianus. As in other insect models studied previously, this would depend on the proteolytic activation of the protein by insect cathepsin-like digestive enzymes to produced toxic peptides. The in vitro hydrolysis of urease in the presence of inhibitors, followed by SDS-page and Wester-blot confirm the proteolytic activation by insect cathepsin B-like enzymes. A nymphal gut extract hydrolysed typical cathepsin substrates, such as hemoglobin and Abz-AIAFFSRQ-EDDnp, and hydrolysis was blocked by pepstatin-A and E-64, specific inhibitors of aspartic and cysteine proteinases. Two cysteine peptidases (DpQ-NR and DpQ-E) of D. peruvianus nymphs were partially purified and characterized. Both enzymes showed maximum activities at pH 4.5-5.0 and 5.5-6.5 in the presence of dithiotreitol and were totally inhibited by E-64. However, the inhibition profile points out to the presence of other types of proteinases in both fractions. DpQ-NR preferentially hydrolysed substrate with hydrophobic amino acids in P2, while DpQ-E had preference for substrate with basic residues in P1. Therefore, our work suggests the presence of multiple proteinases with distinct biochemical properties in the digestive system of D. peruvianus and the potencial involvement of these peptidases on the proteolytic activation of urease.

A urease de Canavalia ensiformis é de relevância histórica tendo sido a primeira proteína a ser cristalizada, feito realizado por Sumner em 1926 comprovando assim a natureza protéica das enzimas. Essa proteína também foi a primeira enzima contendo níquel a ser identificada. As ureases são amplamente encontradas em vegetais, bactérias e fungos, apresentando um alto grau de homologia entre si. Esta similaridade de seqüência primária indica um processo conservativo durante a Evolução e um papel fisiológico importante destas enzimas. As ureases microbianas estão envolvidas em processos patogênicos como formação de cálculos urinários, incrustação de catéter, pielonefrites, úlceras pépticas e possivelmente, na formação de tumores de estômago. Em vegetais, pouco se sabe a respeito da função biológica das ureases, embora sua presença em tecidos vegetais seja freqüente. Postula-se seu envolvimento na biodisponibilidade de nitrogênio; ou mesmo como mecanismo de defesa dos vegetais. A canatoxina, uma isoforma de urease isolada da C. ensiformis, é tóxica para insetos e possui outras atividades biológicas de interesse, dentre as quais destacam-se: 1) atividade secretagoga e pró-agregante em plaquetas de coelho; 2) atividade hemaglutinante indireta para hemácias de coelho; 3) propriedade próinflamatória, evidenciada nos modelos de edema de pata e pleuresia em ratos. Este estudo propõe-se a investigar se ureases bacterianas apresentariam propriedades biológicas como as da canatoxina; e se essas propriedades são dependentes ou não da atividade enzimática dessas ureases.

A Canavalia ensiformis é uma leguminosa altamente resistente ao ataque de insetos, e contribuindo para essa resistência, a planta possui isoformas de urease, que são proteínas que apresentam atividade entomotóxica. Essa toxicidade é dependente de uma ativação proteolítica da molécula por enzimas digestivas do inseto, do tipo catepsinas, e subseqüente liberação de peptídeos internos, os quais possuem a ação inseticida. A partir dessa informação foi construído um peptídeo recombinante com base na seqüência da urease, chamado Jaburetox-2Ec, o qual é tóxico para insetos resistentes e suscetíveis a urease intacta. O hemíptero Oncopeltus fasciatus é um dos nossos modelos de estudo. O objetivo deste trabalho foi identificar as principais peptidases digestivas de ninfas de O. fasciatus, auxiliando na elucidação do mecanismo de ação inseticida dessas toxinas, além de estudar os efeitos da urease intacta e do peptídeo derivado sobre órgãos isolados. Quando alimentadas com diferentes concentrações da urease majoritária de C. ensiformis (JBU), ninfas de O. fasciatus apresentam uma taxa de mortalidade superior a 80% após duas semanas, assim como quando injetadas com Jaburetox-2Ec apresentam uma taxa de mortalidade de 100% após 48 horas. Ninfas de quarto instar foram dissecadas para retirada dos intestinos e obtenção de um extrato protéico bruto, o qual foi utilizado para a realização dos ensaios enzimáticos. O extrato bruto foi capaz de hidrolisar in vitro a JBU e liberar peptídeos com massa semelhante a peptídeos entomotóxicos já conhecidos, reconhecíveis pelo anticorpo anti-Jaburetox-2Ec. A atividade proteolítica majoritária sobre substratos protéicos, em pH 4.0, foi bloqueada por inibidores específicos de aspártico e cisteíno peptidases, não sendo afetada EDTA, inibidor de metalopeptidases. Ao utilizar-se um substrato específico para cisteíno peptidases, o pico majoritário observado foi em pH 5.0, sendo a atividade completamente inibida por E-64 (inibidor de cisteíno peptidases) em todos os valores de pH testados. Ao utilizarse um substrato desenhado para aspártico peptidases, a atividade majoritária foi novamente em pH 5.0, sendo parcialmente inibida por Pepstatina A (inibidor de aspártico peptidases) é parcial em todos os valores de pH testados. Substratos sintéticos correspondentes às regiões N e C-terminal que flanqueiam o peptídeo inseticida na molécula de urease também foram testados. O primeiro não foi hidrolisado pelo extrato bruto, enquanto que o segundo apresentou um pico de atividade majoritário em pH 4.0-5.0, com inibição total por E-64. O extrato bruto foi submetido a um processo de purificação de duas etapas, uma troca iônica e uma cromatografia de gel filtração. A purificação foi monitorada utilizando-se um substrato específico para cisteíno peptidases, e a fração da gel filtração com maior atividade apresentou massa molecular de 22 kDa. A fração ativa foi submetida a um gel de poliacrilamida, a banda foi excisada e digerida com tripsina, e os peptídeos resultantes foram então analisados por espectrometria de massas. Uma catepsina L foi identificada, com massa molecular semelhante ao previsto pela gel filtração. Os resultados sugerem que a susceptibilidade de ninfas de O. fasciatus a JBU é, como em outros modelos de insetos, relacionada à proteólise limitada da proteína ingerida e posterior liberação de peptídeos inseticidas por enzimas do tipo catepsinas. Diferentes tipos de catepsinas podem estar liberando os peptídeos inseticidas a partir da urease, sendo que um cisteíno peptidase, tipo Catepsina L, pode ter um papel importante na ativação da proteína em O. fasciatus. Adicionalmente fizemos localização in situ de Jaburetox-2Ec após injeção na hemolinfa e observamos imunoreatividade no sistema nervoso central de ninfas de O. fasciatus, indicando que o peptídeo pode estar agindo neste local. Além dos efeitos tóxicos causados pelos peptídeos derivados da urease, já foram relatados em outros modelos, efeitos causados pela molécula intacta. Testamos, então, o efeito da JBU sobre contrações de intestinos ex vivo de O. fasciatus. Observamos que a urease tem a capacidade de inibir, em algumas concentrações, o efeito excitatório da serotonina sobre as contrações musculares, atividade que não é compartilhada com Jaburetox- 2Ec. Concluímos com os dados gerados nesse estudo, e em estudos prévios, que a toxicidade das ureases não só é devida à ativação proteolítica e liberação de peptídeos, mas também à proteína intacta, que parece estar causando distúrbios em processos de sinalização celular. / Jackbean (Canavalia ensiformis) is a legume highly resistant to insects. Contributing to this resistance, the plant contains urease isoforms that are entomotoxic upon the release of internal peptides by insect’s digestive cathepsin-like enzymes. A recombinant peptide, called Jaburetox-2Ec, was built based on urease’s sequence and this peptide is poisonous to all insects tested. The hemipteran bug Oncopeltus fasciatus is one of our models of study. In this work we aimed to identify the main digestive peptidases of O. fasciatus, helping to elucidate the insecticidal mechanism of action of these toxins, and to test the effects of urease and derived peptides upon isolated organs. When fed with different Jackbean major urease (JBU) concentrations, O. fasciatus nymphs showed a mortality rate higher than 80% after two weeks. When injected with Jaburetox-2Ec the mortality rate was 100% after 48 hours. Homogenates of midguts dissected from fourth instars were used to perform proteolytic activity assays. The homogenates hydrolyzed JBU in vitro, yielding a fragment similar in size to known entomotoxic peptides. The major proteolytic activity at pH 4.0 upon protein substrates was blocked by specific aspartic and cysteine peptidases inhibitors, but was not affected by a metalopeptidase inhibitor (EDTA). The optimal activity upon a fluorogenic substrate specific for cysteine peptidases was at pH 5.0, being completely inhibited by E-64 at all pH values tested. The optimal activity upon a fluorogenic substrate designed for aspartic peptidases was again at pH 5.0, being partially blocked by Pepstatin A in the pH range 2 to 10. Fluorogenic substrates corresponding to the Nand C-terminal regions flanking the entomotoxic peptide within urease sequence were also tested. While the N-terminal peptide was not hydrolyzed by the midguts homogenate, the C-terminal peptide was cleaved maximally at pH 4.0-5.0, with complete inhibition by E-64. The midguts homogenate was submitted to ion exchange chromatography followed by gel filtration yielding a 22 kDa protein peak. After SDSPAGE this band was excised from the gel, digested with trypsin and the peptides were analyzed by mass spectrometry. A Cathepsin L was identified. The results suggest that susceptibility of O. fasciatus nymphs to JBU is, like in other insect models, due to limited proteolysis of ingested protein and subsequent release of entomotoxic peptides by Cathepsin-like digestive enzymes. Moreover, we performed in situ localization of Jaburetox-2Ec after injection in the hemolymph, and we observed immunoreactive processes in O. fasciatus nymphs’ central nervous system, indicating that the peptide could be acting there. Besides the poisonous effects caused by urease derived peptides, effects caused by the intact molecule were already described. Hence we tested urease’s effect upon O. fasciatus isolated midguts contractions. We observed that urease is capable of inhibiting, at some concentrations, serotonin excitatory effect on muscular contractions, activity that was not shared with Jaburetox-2Ec. We concluded from the data of this study and previous studies, that urease’s toxicity is not only due to proteolytic activation and release of toxic peptides, but also to the intact molecule, which seems to be causing disturbances in cell signalling.

Ureases, apesar de sua importância histórica para a Bioquímica, ainda são enigmáticas. Pouco se sabe a respeito de suas propriedades não-catalíticas, por exemplo. Nesse contexto, o presente trabalho submeteu uma urease de Canavalia ensiformis (JBURE-IIB) a simulações de dinâmica molecular, nos níveis de detalhamento atomístico e coarse-grained, buscando obter uma caracterização conformacional dessa urease, tanto como monômero quanto como trímero. Os dados assim obtidos sugerem que os domínios da proteína apresentam diferentes mobilidades, sendo o domínio γ o mais flexível. Esse domínio é também o principal responsável pela compactação do monômero da urease isolado, quando comparado à sua conformação cristalográfica. A mobilidade do domínio γ foi também associada ao processo de oligomerização da enzima. A forma trimérica da urease de C. ensiformis também se tornou mais compacta após a simulação, apontando as ureases como moléculas altamente flexíveis, principalmente devido às regiões de alças que conectam domínios estruturais, no caso de ureases vegetais. Sendo uma propriedade não necessariamente associada à catálise, a análise de tal flexibilidade pode auxiliar tentativas futuras de explicar a participação não-catalítica da urease em suas propriedades multifuncionais. / Ureases, despite their historical importance in biochemistry, are still enigmatic. For instance, little is known about their non-catalytic properties. In this context, the current work submitted a Canavalia ensiformis urease (JBURE-IIB) to molecular dynamics simulations at both atomistic and coarse-grained levels in order to obtain a conformational characterization of such urease in both monomeric and trimeric forms. The data suggest that the domains of the protein present different mobilities, with the γ domain being the most flexible one. This domain is also the main responsible for the compactness of the isolated urease monomer when compared to its crystallographic conformation. The γ domain mobility was also associated with the oligomerization process of the enzyme. The trimeric form of C. ensiformis urease also became more compact after simulation, pointing to ureases as highly flexible molecules, mainly due to coiled regions connecting the structural domains, in the case of plant ureases. As a property not necessarily related to catalysis, the analysis of this flexibility may enlighten further efforts to solve the non-catalytic aspects of urease in its moonlighting properties.

Resumo não disponível.

TEIXEIRA, Claudener Souza. Determinação da estrutura tridimensional de uma lectina de sementes de Canavalia maritima (Aublet) complexada com o polifenol antioxidante resveratrol. 2015. 94 f. Tese (Doutorado em Bioquímica)-Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2015. / Submitted by Vitor Campos (vitband@gmail.com) on 2016-09-01T23:33:14Z No. of bitstreams: 1 2015_tese_csteixeira.pdf: 4836976 bytes, checksum: abec6d8f925cfce27622f137363ea5f1 (MD5) / Approved for entry into archive by Jairo Viana (jairo@ufc.br) on 2016-09-02T23:06:47Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_tese_csteixeira.pdf: 4836976 bytes, checksum: abec6d8f925cfce27622f137363ea5f1 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-02T23:06:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_tese_csteixeira.pdf: 4836976 bytes, checksum: abec6d8f925cfce27622f137363ea5f1 (MD5) Previous issue date: 2015 / Resveratrol is a natural antioxidant polyphenol found especially in grape epicarp, walnuts, and pomegranates, which can inhibit the activation of proinflammatory mediators and cytokines at the early gene expression stage. It is well known that lectins are sugar-binding proteins that act as both pro- and anti-inflammatory molecules. Thus, the objective of this work was to verify the binding of a polyphenol compound with a lectin of Canavalia maritima (ConM) based on their ability to inhibit pro-inflammatory processes. To accomplish this, ConM was purified and crystallized, and resveratrol was soaked at 5 mM for 2 hours of incubation. The crystal belongs to the monoclinic space group C2, the final refinement resulted in an Rfactor of 16.0% and an Rfree of 25.5%. Resveratrol binds in the rigid β-sheet through H-bonds and hydrophobic interaction with amino acids that compose the fifth and sixth β-strands of the rigid β-sheet of ConM. The ConM and resveratrol inhibited DPPH oxidation, showing synergic activity with the most effective ratio of 2:3 and carbohydrate binding site is not directly related to antioxidant activity. It is the interaction between ConM and resveratrol that indicates the synergism of these two molecules in acting as free radicals scavengers and in reducing the inflammatory process through the inhibition of many pro-inflammatory events. / O resveratrol é um polifenol antioxidante natural encontrado especialmente na epicarpo da uva, em nozes e na romã o qual pode inibir a ativação de mediadores pró-inflamatório e citocinas na fase precoce de expressão do gene. Já é bem conhecido que as lectinas são proteínas de ligação de açúcares que atuam tanto como moléculas pró- e anti-inflamatórias. Assim, o objetivo do presente trabalho foi o de verificar a ligação de um composto de polifenol com uma lectina de Canavalia maritima (ConM) com base na sua capacidade para inibir processos pró-inflamatórios. Para alcançar este objetivo, a ConM foi purificada e cristalizada, uma solução de 5 mM de resveratrol 5 mM foi utilizada para soaking durante 2 horas de incubação. Os cristais obtidos pertencem ao grupo espacial monoclínico C2, o refinamento final resultou em um Rfactor de 16,0% e uma Rfree de 25,5%. Resveratrol se liga na rígida através de pontes de hidrogênio e interação hidrofóbica com aminoácidos que compõem a quinta e sexta fita-β da folha-β rígida da ConM. A ConM complexada com o resveratrol inibiu a oxidação do DPPH, mostrando atividade sinérgica entre a proteína e o ligante com a relação mais eficaz de 2:3. Foi verificado ainda que o sítio de ligação a carboidratos não está diretamente relacionado à atividade antioxidante. É a interação entre ConM e resveratrol, que indica o sinergismo destas duas moléculas em agir como agentes sequestrantes de radicais livres que podem estarem relacionados a capacidade de redução do processo inflamatório através da inibição de muitos mediadores pró-inflamatórios por lecitinas.

SILVA, Mayara Torquato Lima da. Determinação da estrutura primária e avaliação preliminar dos efeitos inflamatórios de uma lectina de Canavalia bonariensis lindl. 2015. 62 f. Dissertação (Mestrado em Biotecnologia de Recursos Naturais)-Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2015. / Submitted by Anderson Silva Pereira (anderson.pereiraaa@gmail.com) on 2017-01-18T20:42:11Z No. of bitstreams: 1 2015_dis_mtlsilva.pdf: 1563752 bytes, checksum: 70a9c71404759638546970ac47d4c2f7 (MD5) / Approved for entry into archive by Jairo Viana (jairo@ufc.br) on 2017-01-19T11:57:54Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_dis_mtlsilva.pdf: 1563752 bytes, checksum: 70a9c71404759638546970ac47d4c2f7 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-01-19T11:57:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_dis_mtlsilva.pdf: 1563752 bytes, checksum: 70a9c71404759638546970ac47d4c2f7 (MD5) Previous issue date: 2015 / Lectins are (glycol) proteins that bind specifically and reversibly to carbohydrates. These proteins, in particular those from plant, are important tools in glicobiochemistry and glycobiology. Canavalia bonariensis Lindl is a species of Leguminosae family, Papilionoideae subfamily, tribe Phaseoleae, subtribe Diocleinae, native of the southern region of the country. In this work was realized the analysis of the primary sequence of CaBo (Canavalia bonariensis lectin) and preliminary evaluation of the pro-inflammatory effects of the lectin. The purification of CaBo was realized through affinity chromatographic and the process was monitored by SDS-PAGE and hemagglutinating activity. It was observed that the purified lectin is characterized by an electrophoretic profile that consists of a higher band with approximately 29 kDa, and two bottom bands with apparent molecular mass of 14 and 12 kDa. CaBo was tested for the thermostability of their hemagglutinating activity after incubation for one hour at different temperatures, losing activity only at 80° C after one hour. Regarding its stability at different pH, CaBo was stable in a pH range between 7.0 and 9.0. The CaBo activity was also affected after serial dilution in the presence of the chelating agent EDTA and it was recovered significantly after addition of CaCl2 and MnCl2, proving to be dependent of divalent metal cations. The analysis by mass spectrometry indicated that CaBo has an α chain with molecular mass of 25512 kDa and and two subunits (β and γ chains) with molecular mass of 12999 Da and 12537 Da, respectively. The primary sequence of the lectin was determined by a combination of tandem mass spectrometry and molecular biology, by the translation of cDNA isolated from the lectin’s gene. CaBo presented high sequencial similarity with lectins from the same subtribe and the phylogenetic evaluation indicated that the protein must be the most primitive among lectins from the same gender. CaBo showed inflammatory activity in the rat paw edema model, and it is necessary to realize others test in order to elucidate the biological effect of the lectin. / Lectinas são (glico) proteínas que se ligam de maneira específica e reversível a carboidratos. Essas proteínas, em particular as de origem vegetal, são consideradas importantes ferramentas nos estudos de glicobiologia. Canavalia bonariensis Lindl é uma espécie pertencente à família Leguminosae, subfamília Papilionoideae, tribo Phaseoleae, sub-tribo Diocleinae e nativa da região sul do país. Neste trabalho foi realizado a elucidação e análise da sequência primária da CaBo (Lectina de Canavalia bonariensis), bem como uma avaliação preliminar dos efeitos inflamatórios da lectina. A purificação da CaBo foi realizada por meio de cromatografia líquida e o processo foi monitorado por SDS-PAGE e atividade hemaglutinante. Se observou que a lectina purificada é caracterizada por um perfil eletroforético composto por uma banda superior de aproximadamente 25 kDa e duas bandas inferiores de massa molecular aparente de aproximadamente 14 e 12 kDa. CaBo foi testada quanto à termoestabilidade da sua atividade hemaglutinante após incubação por 1 hora em diferentes temperaturas perdendo atividade somente a 80°C após 1 hora. Quanto à estabilidade em diferentes pH, ela manteve-se estável em uma faixa de pH entre 7,0 e 9,0. A atividade da CaBo também foi afetada após diluição seriada na presença do agente quelante EDTA e foi recuperada significativamente após adição de CaCl2 e MnCl2, mostrando-se dependente de cátions metálicos bivalentes. A análise por espectrometria de massas indicou que a CaBo possui uma cadeia α de massa 25512 Da e duas subunidades (cadeias β e γ) de massa 12999 Da e 12537 Da, respectivamente. A sequência primaria da lectina foi determinada por associação das técnicas de espectrometria de massas sequencial e biologia molecular, pela tradução do cDNA do gene isolado da lectina. A CaBo apresentou alta similariedade sequencial com lectinas da mesma subtribo e a avaliação filogenética indicou que a proteína deva ser a mais primitiva dentre as lectinas do mesmo gênero. A CaBo apresentou atividade inflamatória no modelo de pata de rato, sendo necesssário realização de demais testes a fim de elucidar o efeito biológico da lectina.