Made available in DSpace on 2015-05-14T12:56:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 1892653 bytes, checksum: a545874efed4589c08f494b70565cd51 (MD5) Previous issue date: 2009-11-27 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / For a long time, the drugs used in the treatment and prevention of diseases and injuries were from plants becoming, often, the only resource that doctors had to treat their patients. In dentistry, the use of herbal medicines is still small and takes place mainly in the informal market. It is extremely important there be legislation to that end, in addition, research has been done in order to scientifically validate the use of some of these natural products as antimicrobial agents, which would open up space for clinical application in different diseases affecting the oral cavity especially those caused by Candida spp. In this context, this study aimed to evaluate the antifungal activity of essential oil of Citrus limon Linn. about 22 strains of Candida spp. by determining the CIM and CFM of the time evaluation of microbial death and morphological changes of the strains tested under the action of natural product tested. The CIM was obtained by the microdilution technique and CFM was obtained from the subculture of the concentration corresponding to the inhibitory and the two concentrations more concentrated. The evaluation of the interference of CIM product tested over time of microbial death was performed by counting viable cells. The study of morphological changes due to the action of the natural product was made from the microculture technique, with further observation under optical microscope. It was established the value of CIM of essential oil of C. limon between 0.078 and 0.156 mg/mL and CFM had a variation between 0.078 to 1.250 mg/mL. The kinetics of microbial death, there was fungicidal effect at concentrations of CIMx8 and CIMx4, with initial action after 2-4 hours of exposure of yeast. Microscopic observation of morphogenesis of the yeast under the action of the product tested showed inhibition in the formation of chlamydospores and pseudo-hyphae in most strains tested, this result was comparable to that of synthetic antimicrobial used as a control, the miconazole. We conclude therefore that the essential oil of C. limon has a important fungicide action and can be effective in the inhibition of Candida spp. / Durante muito tempo, os remédios empregados no tratamento e prevenção de doenças e lesões eram originários das plantas, constituindo-se, não raro, no único recurso de que dispunham os médicos para tratar seus doentes. Na Odontologia, a utilização destes medicamentos chamados de fitoterápicos ainda é pequena e dá-se principalmente no mercado informal. Uma regulamentação nesse sentido mostra-se de extrema importância, e pesquisas têm sido feitas com o objetivo de validar cientificamente o uso de alguns destes produtos naturais como agentes antimicrobianos, o que abriria espaço para sua aplicação clínica em diversas afecções que acometem a cavidade bucal, em especial aquelas causadas por leveduras do gênero Candida. Nesse contexto, o presente estudo visou avaliar a atividade antifúngica do óleo essencial de Citrus limon Linn. sobre 22 cepas de Candida spp., através da determinação da CIM e da CFM, da avaliação do tempo de morte microbiana e das alterações morfológicas das cepas ensaiadas decorrentes da ação do produto natural testado. A CIM foi obtida através da técnica da microdiluição, e a CFM a partir do subcultivo da concentração correspondente à inibitória e as duas concentrações imediatamente mais concentradas. A avaliação da interferência da CIM do produto testado sobre o tempo de morte microbiana foi realizada através da contagem de células viáveis e o estudo das alterações morfológicas devido à ação do produto natural deu-se a partir da técnica do microcultivo, com posterior observação em microscópio óptico. O valor da CIM do óleo essencial de C. limon ficou estabelecida entre 0,078 e 0,156 μg/mL, e a CFM variou de 0,078 a 1,250 μg/mL. Quanto à cinética de morte microbiana, observou-se efeito fungicida nas concentrações de CIMx8 e CIMx4, com ação inicial após 2-4 horas de exposição das leveduras. A observação microscópica da morfogênese das leveduras sob ação do produto testado mostrou inibição na formação de clamidoconídios e pseudo-hifas na maior parte das cepas ensaiadas, resultado comparável ao do antimicrobiano sintético utilizado como controle, o miconazol. Concluiu-se, assim, que o O.E. de C. limon possui destacada ação fungicida, podendo ser eficaz na inibição do crescimento de leveduras do gênero Candida.

Made available in DSpace on 2015-05-14T12:56:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 910904 bytes, checksum: c726c0e05bf38f910085210325321242 (MD5) Previous issue date: 2010-08-19 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Candida species are part of the commensal microbiota of the oral cavity of most healthy individuals. The emergence of new species of Candida and the selection of lines tolerant to conventional antifungal agents stimulates the development of new therapies for the treatment of infections caused by species of Candida. In this context stands the photodynamic therapy (PDT) which is capable of killing fungal cells by administration of a photosensitizing substance followed by the application of light in the visible wavelength. This study evaluated, in vitro, the efficacy of PDT in photoinactivation of Candida species (C. albicans, C. krusei, C. tropicalis and C. guilhermondii) using the photosensitizing agent methylene blue (150&#956;g/ml) and irradiation with a diode laser operating in the visible red (&#654;660nm, 40mW). Initially, the tested microorganisms were inoculated in test tubes containing liquid culture medium and incubated overnight at 37°C. Then cell s uspensions were obtained containing 106 cfu / ml. These suspensions were transferred to 96-holes plates and exposed to 03 doses of laser light (Group 1- 60J/cm2 (2,4J), Group 2- 120J/cm2 (4,8J), Group 3-180J/cm2 (7,2J)). Additional suspensions were treated with only the photosensitizer, with only the laser light or with 0.85% saline (control group). Each experimental condition was performed twice. After the treatments, 1&#956;l aliquots of the suspensions were plated on Sabouraud Dextrose Agar. The plates were incubated at 37°C for 24-48h and after this period there was the counting of colonies (cfu / ml). The three doses evaluated determined significant inactivation of Candida spp. (P <0.05). The 180J/cm2 dose was the most effective, inactivating 78% of cfu/ml followed by doses of 120J/ cm2 and 60J/cm2 with inactivation average of 62% and 42% respectively. A statistically significant difference between the rates of inactivation of C. albicans, C.krusei, C. tropicalis and C. guilhermomdii at doses of 60 J/cm2 and 120 J/cm2 (p> 0.05) was not verified. However, at a dose of 180 J/cm2 C. albicans was the most susceptible species to the effects of PDT. We conclude that photodynamic therapy (PDT) has demonstrated effectiveness in the inactivation of Candida spp. / As espécies de Candida fazem parte da microbiota comensal da cavidade bucal da maioria dos indivíduos saudáveis.. A emergência de novas espécies de Candida e a seleção de linhagens tolerantes aos antifúngicos convencionais estimula o desenvolvimento de novas modalidades terapêuticas para o tratamento das infecções causadas por espécies de Candida.Nesse contexto destaca-se a terapia fotodinâmica (TFD) que é capaz de eliminar células fúngicas através da administração de uma substância fotosensibilizadora seguido da aplicação de luz em comprimento de onda visível e compatível. Este estudo avaliou, in vitro, a eficácia da TFD na fotoinativação de espécies do gênero Candida (C. albicans, C. krusei, C. tropicalis e C. guilhermondii) por meio do agente fotossensibilizador azul de metileno (150&#956;g/ml) e da irradiação com um Diodo Laser (660nm, 40mW)). Inicialmente os microrganismos avaliados foram inoculados em tubos de ensaio contendo meio de cultura líquido e incubados overnight a 37°C. Em seguida foram obtidas suspensões celulares contendo 106 ufc/ml, as quais foram transferidas para placas de 96 orifícios e expostas a 03 doses de luz Laser (Grupo1- 60J/cm2 (2,4J), Grupo2- 120J/cm2 (4,8J), Grupo 3-180J/cm2 (7,2J). Suspensões adicionais foram tratadas apenas com o fotossensibilizador, apenas com a luz Laser ou com solução salina 0,85% (grupos controle). Cada condição experimental foi realizada 2 vezes. Após a aplicação dos tratamentos, alíquotas de 1&#956;l das suspensões foram plaqueadas em Agar Sabouraud Dextrose. As placas foram incubadas a 37°C por 24-48h e após esse período foi realizada a contagem das colônias (ufc/ml). As três doses avaliadas determinaram inativação significativa de Candida spp. (p<0,05). A dose de 180J/cm2 foi a mais eficaz, inativando 78% das ufc seguida pelas doses de 120J/ cm2 e 60J/cm2 com inativação média de 62% e 42% respectivamente. Não foi verificada diferença estatística significativa entre as taxas de inativação de C.albicans, C.krusei, C. tropicalis e C. guilhermomdii nas doses de 60 J/cm2 e 120 J/cm2 (p> 0,05). No entanto, na dose de 180 J/cm2 C. albicans foi a espécie mais susceptível aos efeitos da TFD. Conclui-se que a terapia fotodinâmica (PDT) demonstrou efetividade na inativação de Candida spp.

Orientador: Ana Claudia Pavarina / Banca: Eunice Teresinha Giampaolo / Banca: Cristina Kurachi / Resumo: Este trabalho teve por objetivo avaliar a efetividade da terapia fotodinâmica (PDT) mediada pelo fotossensibilizador (FS) Photodithazine® (PDZ), associado à luz do tipo LED (660nm). Para tanto, foram utilizados 55 camundongos com aproximadamente 6 semanas de vida, os quais foram submetidos a indução de candidose no dorso da língua. Inicialmente os animais foram imunossuprimidos e no dia seguinte se realizou a inoculação de C. albicans na língua dos mesmos por meio de swabs embebidos na suspensão (107 Ufc/mL). Para a realização da terapia fotodinâmica o FS foi avaliado nas concentrações de 75, 100, 125 e 150mg/L. Tais grupos experimentais foram denominados de (P+L+ 75mg/L, P+L+ 100mg/L, P+L+ 125mg/L, P+L+ 150mg/L) associados a uma dose de luz de 37,5 J/cm2. Para a verificação apenas do efeito da PDZ, a mesma foi aplicada na língua dos animais, sem iluminação (grupos denominados de P+L- 75mg/L, P+L- 100mg/L, P+L- 125mg/L, P+L- 150mg/L). O efeito da luz foi avaliado por meio da iluminação das línguas com dose de luz de 37,5J/cm2, (grupo denominado de P-L+ 37,5J/cm2). Um grupo recebeu apenas inoculação por Candida (grupo P-L-, controle positivo), outro grupo não recebeu nenhum tratamento e nem inoculação fúngica (grupo CN - controle negativo). Após os experimentos realizou-se a recuperação de C. albicans das línguas dos animais por meio de swabs que foram esfregados sobre as mesmas durante 1 minuto. Esses swabs foram embebidos em tubos de ensaio com 1mL de solução salina, e diluições seriadas foram realizadas e colocadas em placas de petri com SDA. Após 48 horas de incubação a 37º C as células fúngicas foram quantificadas e o número de Ufc/mL foi determinado e analisado pelo teste ANOVA (P<.05). Os camundongos foram sacrificados e tiveram as línguas removidas cirurgicamente para realização da análise histológica. Os resultados demonstraram... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The aim of this investigation was to evaluate the effectiveness of photodynamic therapy (PDT) mediated by photossensitizer Photodithazine® (PDZ) associated with LED light (660nm) for the photoinactivation of C. albicans in a murine model of oral candidosis. Fifty-five 6-week-old female Swiss mice were immunossuppressed and in the next day small cotton pads were soaked in a C. albicans cell suspension (107CFU/mL) and swabbed in the oral cavity of mice. PDT was performed and the PS was applicated topically on the dorsum of the tongue of mice at concentrations 75, 100, 125 and 150mg/L (P+L+75, P+L+100, P+L+125 and P+L+150mg/L) associated with LED at a fluence of 37,5J/cm2. The effect of PS only was tested by application of PDZ for the same period of pre-irradiation time and irradiation at the same concentration as that for the P+L+ group, without the LED illumination (P+L-75, P+L-100, P+L-125 and P+L-150mg/L). To verify the effect of the light only, the group was exposed to the same LED dose mentioned previously (P-L+ 37,5J/cm2), 1 group). The positive control did not receive any PS or light (P-L-). The negative control group (CN) of animals was evaluated and mice did not receive any treatment. After treatment the dorsum of the tongue was swabbed for 1 minute with a cotton pad to recover C. albicans cells and the microbiological evaluation was performed. The yeast colony counts were quantified and the number of CFU/mL was determined and analyzed by ANOVA test (P<.05). Animals were killed 24 hours after treatment and the tongue of all mice were surgically removed for histological analysis. The results of this investigation demonstrated that PDT was effective in reducing C. albicans recovered from the tongue of mice at concentrations 100, 125 and 150mg/L of PS when compared with the animals from the positive control group (P-L-) (P<0.05). There was no difference between these concentrations... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Ana Claudia Pavarina / Banca: Eunice Teresinha Giampaolo / Banca: Claudia Helena Lovato da Silva / Resumo: O surgimento da resistência antifúngica aos tratamentos convencionais tem exigido o desenvolvimento de novas modalidades terapêuticas para o tratamento da candidíase bucal. Nesse contexto, a Terapia Fotodinâmica (Photodynamic Therapy - PDT) tem sido sugerida como método alternativo para a inativação de microorganismos patogênicos. O sucesso da PDT depende, dentre outros fatores do tempo de pré-irradiação (TPI), que é o tempo em que o fotossensibilizador (FS) permanece em contato com os micro-organismos previamente à iluminação. O objetivo deste estudo foi avaliar a efetividade da PDT mediada pela curcumina (Cur), associando diferentes TPIs, concentrações e doses de luz, na redução da viabilidade celular de três espécies de Candida ATCC (C. albicans ATCC 90028; C. glabrata ATCC 2001; C. dubliniensis ATCC 7987), em culturas planctônicas e biofilmes. A Cur foi ativada por um aparelho de LED (luz emitida por diodo) que emite luz no espectro azul, com comprimento de onda predominante de 455 nm. Inicialmente, suspensões celulares padronizadas dos micro-organismos foram transferidas para placas de 96 orifícios, e tratadas com três diferentes concentrações de Cur (5, 10 e 20 YM), ou mantidas nos poços por 48 horas para formação dos biofilmes, seguida de tratamento com outras três concentrações de Cur (20, 30 e 40 YM). As culturas celulares foram deixadas em contato com a Cur por 1, 5, 10 ou 20 minutos, anteriormente à iluminação. Em seguida, as culturas planctônicas foram expostas à dose de luz de 5,28 J/cm2. Os biofilmes, por sua vez, foram tratados com duas doses de luz (5,28 e 10,56 J/cm2). Suspensões/biofilmes adicionais foram tratados somente com as três concentrações de Cur (pelo maior tempo usado em cada estudo) ou apenas com a maior dose de luz. Amostras controle não foram tratadas com Cur e não receberam luz. Após a PDT, as suspensões celulares... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The emergence of antifungal-resistant yeasts to conventional therapy has demanded the development of new therapy modalities against oral candidiasis. On this context, Photodynamic Therapy (PDT) has been suggested as a possible alternative treatment for inactivation of pathogenic microorganisms. PDT success depends, among other factors, on the pre-irradiation time (PIT). The aim of this study was to evaluate the effectiveness of curcumin (Cur)-mediated PDT associating different PITs, Cur concentrations and light doses, against planktonic and biofilm cultures of three different Candida species (C. albicans ATCC 90028; C. glabrata ATCC 2001; C. dubliniensis ATCC 7987). Cur was activated by a LED (light emitting diode) device, which emits light on the blue spectrum, with predominant wavelength at 455 nm. Standardized cell suspensions were treated with three different concentrations of Cur (5, 10 e 20 YM), or kept into the wells for 48 hours to allow adhesion and biofilm formation. The biofilms were treated with other three different concentrations of Cur (20, 30 e 40 YM). The cultivated fungus (planktonic and biofilms) were maintained in the dark in contact with the PS for either 1, 5, 10 or 20 minutes before irradiation. The suspensions were exposed to LED light dose of 5.28 J/cm2, while the biofilms were exposed to either 5.28, or 10.56 J/cm2. Additional samples of suspensions/biofilms were treated only with the three Cur concentrations (for the highest incubation period used in the study), without illumination, or only with the highest light dose, without Cur. Control samples had neither light nor Cur. After PDT, suspensions were plated on Sabouraud Dextrose Agar (SDA) in duplicate, while biofilm results were read using the XTT-salt reduction method. The results for the planktonic cultures were statistically analyzed by Kruskal-Wallis and Dunn, while for the biofilms, analysis of variance... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Les levures du genre Candida provoquent 70 à 90% des infections fongiques invasives chez l’Homme. Candida albicans est l’espèce de levure la plus souvent isolée et la plus pathogène au niveau de la cavité orale. Cette levure présente des facteurs de virulence multiples, notamment une capacité à modifier sa morphologie (dimorphisme), des adhésines servant à la reconnaissance de l’hôte, la sécrétion de phospholipases et d’aspartyl protéases et une capacité à former des biofilms. L’augmentation constante des infections fongiques et des résistances aux antifongiques, des effets secondaires et du coût des traitements, justifie la recherche de nouvelles molécules actives contre les biofilms impliquant des levures. Après une revue de la littérature sur les modèles de biofilms oraux, nous avons étudié l’effet d’un extrait végétal de Solidago virgaurea sur C. albicans. Une première étude a montré que l’extrait, par ailleurs dépourvu d’effet antibactérien, pouvait agir sur le champignon en : 1) empêchant la conversion de levures en hyphes, 2) inhibant la formation de biofilm, et 3) en dissociant le biofilm déjà formé. La deuxième étude visait à comprendre le mode d’action de cet extrait. Elle a montré que l’extrait de S. virgaurea inhibait l’expression de protéines impliquées dans l’adhésion et la filamentation. Par ailleurs, il exerce un effet synergique sur l’élimination du biofilm lorsqu’il est combiné à des antifongiques. L’ensemble de ces résultats positionne l’extrait de S. virgaurea en candidat prometteur pour une approche innovante du traitement topique des candidoses cutanéomuqueuses. / Candida yeast cause 70 to 90 % of human invasive fungal infections. In the oral cavity, Candida albicans is the most frequently isolated the most pathogenic species. This yeast has multiple virulence factors, including the capacity to alter its morphology (dimorphism), adhesins for host-recognition, the secretion of phospholipases and aspartyl proteases, and the ability to form biofilms. The search for new anti-biofilms drugs and, in particular, those targeting biofilm involving yeast is justified by the constantly increasing incidence of fungal infections and antifungal resistance, treatments side effects and costs. We first reviewed the literature regarding oral biofilm models. Then, we studied the effect of a Solidago virgaurea extract against C. albicans. A first study showed that this extract, which has no antibacterial effect, could act on the fungus in several ways, including: 1) inhibiting yeast-to-hypha transition, 2) inhibiting biofilm formation, and 3) disrupting existing biofilm. The second study aimed to understand the mode of action of this extract. It showed that it might act via the down-regulation of proteins involved in yeast adhesion and filamentation. Furthermore, it acted in synergy with antifungals to eliminate biofilm. Overall, these findings indicate that this S. virgaurea extract is a promising candidate for an innovative approach of superficial candidiasis topical therapy.

Orientador: Luciane Dias de Oliveira / Coorientadora: Graziella Nuernberg Back Brito / Banca: Luana Marotta Reis de Vasconcellos / Banca: Mariella Vieira Pereira Leão / Resumo: Cepas isoladas de infecções graves por Candida albicans expressam inúmeros fatores de virulência e a compreensão destes fatores permite esclarecer os mecanismos inerentes ao patógeno no processo infeccioso, assim como ferramentas terapêuticas que modulem a expressão destes fatores e permitam o controle de infecções persistentes. O objetivo deste estudo foi analisar a influência de 4 extratos vegetais no crescimento deste fungo quando em bifilme, assim como na expressão dos fatores de virulência (proteinase, fosfolipase e hemolisina) de C. albicans. Para isso, biofilmes de 48 horas de C. albicans (ATCC 18804) foram expostos a diferentes concentrações dos extratos glicólicos de Hamamelis virginiana, Persea. americana, Cynara scolymus L e Stryphnodendro barbatiman M, por 5 minutos e 24 h, para verificar a atividade antifúngica (redução em relação ao controle), e a secreção de proteinase, fosfolipase e hemolisina, utilizando meios especificos. Todos os extratos testados foram efetivos na redução do biofilme de C. albicans. Quando em contato por 5 min os extratos foram capazes de reduzir o biofilme em 50% em média, reduções mais expressivas foram encontradas depois de 24 h de exposição. O extrato de P. americana (25 mg/mL) reduziu o biofilme em 90%, em relação ao controle, seguido de C. scolymus (100 mg/mL), que reduziu em 85%. A secreção de proteinase foi alterada, tanto em 5 min como em 24 h, sendo a Pz (atividade enzimática) média de 0,69, em relação ao controle Pz= 0,49. Cynar... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Strains isolated from severe Candida. albicans infections express numerous virulence factors, which suggest the understanding of these factors allows to clarify the mechanisms inherent to the pathogen in the infectious process, as well as therapeutic tools that modulate the expression of these factors and allow the control of persistent infections. Biofilms of 48 hours of C. albicans (ATCC 18804) were exposed to different concentrations of the glycolic extracts of Hamamelis virginiana and Persea. americana, Cynara. scolymus L and Stryphnodendron. barbatiman M, for 5 minutes and 24 h, to verify the antifungal activity, and secretion of proteinase, phospholipase and hemolysin. All extracts tested were effective in reducing the biofilm of C. albicans. When in contact for 5 min the extracts were able to reduce the mean of 50% of the biofilm. More significant reductions were found after 24 h of exposure. The extract of P. americana (25 mg/ml) reduced biofilm by 90% compared to control, followed by C. scolymus (100 mg/ml), which reduced by 85%. The enzymatic activiti (Pz) of proteinase was altered, both in 5 min and 24 h, the mean Pz being 0.69, in relation to the control Pz = 0.49. C. scolymus was the extract with the highest mean Pz at the concentration of 100 mg/ml, 0.73 and 0.78, when treated for 5 min and 24 h, respectively, in relation to the control (Pz = 0.48) (p <0,0001). Phospholipase secretion was altered after treatment, with S. barbatiman (100 mg/ml) being the most eff... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Este estudo clínico-laboratorial identificou as espécies de Candida do palato e prótese de indivíduos desdentados totais com estomatite relacionada à prótese (ERP) e avaliou o efeito de soluções desinfetantes para higiene de próteses totais sobre Candida spp.. Sessenta participantes foram distribuídos aleatoriamente em 04 grupos paralelos (n=15); orientados a escovar as próteses e o palato 3 vezes ao dia e imergi-las nas soluções salina (C controle), Hipoclorito de sódio a 0,25% (HS0,25%), Ricinus communis a 10% (RC10%) ou Cloramina T a 0,5% (CT0,5%) por 20 minutos. Amostras de biofilme foram coletadas da prótese e palato no Baseline, após 7 e 37 dias do uso das soluções e semeadas em meio CHROMagar Candida. Após período de incubação foi realizada a identificação presuntiva, verificação da incidência e quantificação de crescimento das espécies de Candida (contagem de UFC). Cepas ATCC das espécies mais incidentes clinicamente foram avaliadas no estudo laboratorial. Biofilmes de C. albicans, C. tropicalis e C. glabrata foram formados sobre espécimes em resina acrílica termopolimerizável e imersos nas soluções por 20 minutos. Água destilada foi utilizada como controle. As variáveis de resposta foram crescimento de colônias (contagem de UFC), metabolismo celular (método de XTT), produção de enzimas hidrolíticas (kits específicos), formação de hifas (contagem de células em câmara de Newbauer) e quantificação de células vivas (microscopia de epifluorescência). A capacidade de remoção de biofilme pelas soluções também foi avaliada por meio de microscopia de epifluorescência. Para o estudo clínico, análises descritivas foram utilizadas para interpretação dos dados quanto às características sociodemográficas da amostra, identificação e incidência das Candida spp. Os resultados de crescimento celular (UFC) foram analisados pelos Testes Kruskal-Wallis e Friedman. Para o estudo laboratorial, os resultados foram analisados por teste Anova (One-way) e Tukey (capacidade de crescimento e metabolismo celular de C. albicans e C. tropicalis), teste de Kruskal-Wallis (metabolismo celular de C. glabrata; produção de enzimas hidrolíticas; formação de hifas; capacidade de remoção de biofilme) e teste de Wilcoxon (comparação entre quantidade de biofilme vivo e biofilme total). Empregou-se um nível de confiança de 95% (&alpha;= 0,05). As espécies mais incidentes foram C. albicans, seguida de C. tropicalis, C. glabrata e C. krusei. O HS 0,25% reduziu a incidência das três espécies na prótese e palato nos períodos de 7 e 37 dias; o CT 0,5% promoveu redução de Candida spp. somente nas próteses totais. O R. communis diminuiu a incidência de C. tropicalis em ambos os sítios de coleta. Para contagem de UFC, o HS 0,25% e CT 0,5% causaram redução significativa para cepas clínicas e ATCC. O R. communis, in vitro, reduziu a quantidade de UFC de C. glabrata. O HS 0,25% obteve os melhores valores contra atividade metabólica, formação de hifas, manutenção de células vivas e remoção do biofilme das espécies de Candida. As soluções de RC 10% e CT 0,5% causaram diminuição da atividade metabólica. Não houve diferença significante na produção de proteinase por C. albicans e C. tropicalis após exposição às diferentes soluções desinfetantes, com exceção da C. glabrata, em que todas as soluções causaram aumento significativo da produção desta enzima. As soluções não influenciaram a produção de fosfolipase. A CT 0,5% e RC 10% apresentaram resultados intermediários para manutenção de células vivas. A Cloramina T foi mais eficiente que o R. communis para remoção do biofilme de C. albicans e C. tropicalis e menos eficiente para remoção de biofilme de C. glabrata. As soluções de Hipoclorito de sódio a 0,25% e Cloramina T a 0,5% apresentaram os melhores resultados como solução de imersão frente às variáveis estudadas, podendo ser indicadas para uso clínico como desinfetantes para próteses totais. / This clinical-laboratory study identified the Candida species from the palate and complete dentures of edentulous individuals with prosthesis-related stomatitis (PRS) and evaluated the effect of disinfectant solutions for denture hygiene on Candida spp. Sixty participants were randomly assigned in 04 parallel groups (n = 15); They were oriented to brush their prostheses and the palate 3 times a day and immerse them in saline solution (C-control), 0.25% Sodium hypochlorite (HS0.25%), 10% Ricinus communis (RC10%) or 0.5% Chloramine T (CT 0.5%) for 20 minutes. Biofilm samples were collected from the prosthesis and palate in the baseline, after 7 and 37 days of use of the solutions and seeded in CHROMagar Candida medium. After incubation period, the presumptive identification, incidence verification and quantification of Candida species growth (CFU count) were performed. ATCC strains of the most clinically incident species were evaluated in the laboratory study. C. albicans, C. tropicalis and C. glabrata biofilms were formed on heatpolymerised acrylic resin specimens and immersed in the solutions for 20 minutes. Distilled water was used as control. The response variables were colony growth (UFC count), cell metabolism (XTT method), production of hidrolytic enzymes (specific kits), formation of hyphae (counting cells in Newbauer\'s chamber) and quantification of live cells (epifluorescence microscopy). The ability of biofilm removal by the solutions was also evaluated by means of epifluorescence microscopy. For the clinical study, descriptive analyzes were used to interpret the data regarding the sociodemographic characteristics of the sample, identification and incidence of Candida spp. The cell growth results (CFU) were analyzed by the Kruskal-Wallis and Friedman tests. For the laboratorial study, the results were analyzed by the Anova (One-way) and Tukey test (growth capacity and cellular metabolism of C. albicans and C. tropicalis), Kruskal-Wallis test (cellular metabolism of C. glabrata; hidrolytic enzymes production; formation of hyphae; ability to remove biofilm) and Wilcoxon\'s test (comparison of the amount of live biofilm and total biofilm). A confidence level of 95% (&alpha; = 0.05) was used. The most incident species were C. albicans, followed by C. tropicalis, C. glabrata and C. krusei. HS 0.25% reduced the incidence of the three species on the prosthesis and palate in the periods of 7 and 37 days; CT 0.5% promoted reduction of Candida spp. only in dentures. R. communis decreased the incidence of C. tropicalis in both collection sites. For CFU counts, HS 0.25% and CT 0.5% caused significant reduction for clinical strains and ATCC. R. communis, in vitro, reduced the amount of CFU of C. glabrata. The HS 0.25% obtained the best values compared to the metabolic activity, hyphae formation, maintenance of living cells and removal of the biofilm of Candida species. The solutions of RC 10% and CT 0.5% caused the decrease in the metabolic activity. There was no significant difference in proteinase production by C. albicans and C. tropicalis after exposure to different disinfectant solutions, except C. glabrata, in which all solutions caused a significant increase in the production of this enzyme. The solutions did not influence phospholipase production. A CT 0.5% and RC 10% presented intermediate results for the maintenance of living cells. Chloramine T was more efficient than R. communis for biofilm removal from C. albicans and C. tropicalis; and less efficient for biofilm removal from C. glabrata. The solutions of 0.25% Sodium Hypochlorite and 0.5% Chloramine T presented the best results as immersion solution compared to the studied variables and can be prescribed for clinical use as disinfectants for total dentures.

Cryptococcus neoformans et les levures du genre Candida sont fréquemment impliqués dans les infections fongiques opportunistes chez les personnes vivant avec le VIH (PVVIH). Les données sur l'épidémiologie moléculaire et la sensibilité de ces levures aux antifongiques sont rares au Cameroun. Les objectifs de ce travail ont été (i) d'obtenir et caractériser génétiquement les isolats de Cryptococcus et de Candida issus des PVVIH à Yaoundé, (ii) d'étudier leur profil de sensibilité à divers antifongiques, (iii) d'étudier l'activité antifongique des extraits de 3 plantes médicinales (Terminalia mantaly, Terminalia catappa et Monodora tenuifolia). Vingt-cinq souches de C. neoformans et 317 isolats Candida dont 113 C. albicans ont été isolés respectivement de 171 et 402 PVVIH à l'Hôpital Central de Yaoundé. Ces isolats ont été identifiés sur la base de leurs caractères phénotypiques, biochimiques, par spectrométrie de masse et par PCR quantitative. La diversité génétique de 150 isolats (25 prélèvement initiaux et 125 colonies) de C. neoformans a été réalisée par séro-génotypage, PCR-RFLP et polymorphisme de séquences microsatellites. La diversité génétique des 113 isolats de C. albicans a été réalisée par génotypage et par analyse du polymorphisme de séquences microsatellites. La recherche des espèces du complexe C. albicans s'est effectuée par amplification du gène Hwp1. La sensibilité des isolats de C. neoformans aux antifongiques (posaconazole, voriconazole, ketoconazole, itraconazole, fluconazole, amphotéricine B et 5-fluorocytosine) a été évaluée par microdilution en milieu liquide grâce au kit « Sensititre YeastOne® ». Le protocole CLSI M27-A3 été utilisé pour l'étude de la sensibilité des isolats de C. albicans à l'amphotéricine B, au fluconazole, au ketoconazole et à l'itraconazole. L'étude de l'activité antifongique des extraits de plantes s'est déroulée en 3 étapes : (i) screening préliminaire avec détermination de la concentration minimale inhibitrice (CMI) des extraits bruts, (ii) fractionnement bio-guidé, (iii) étude des interactions synergiques dans les combinaisons de ces subfractions. C. neoformans var grubii est la seule espèce de cryptocoque isolée des liquides céphalorachidiens. Quinze espèces de Candida ont été isolées et C. albicans reste l'espèce majoritaire. C. africana a été isolée et identifiée pour la première fois au Cameroun. La diversité génétique des isolats de C. neoformans a montré 14 types moléculaires, et 24% de patients étaient infectés par deux types moléculaires différents. Le génotype A est majoritaire dans les isolats de C. albicans et 65 types moléculaires différents ont été observés. L'analyse du polymorphisme du gène Hwp1 a permis de définir de nouveaux génotypes (H1-H6). Les souches de C. neoformans sont sensibles aux antifongiques testés. Une souche présente une sensibilité réduite à la 5-fluorocytosine et une autre au fluconazole. Des isolats issus du même patient peuvent présenter des sensibilités différentes aux antifongiques testés. Les isolats de C. albicans présentent une sensibilité aux antifongiques similaire à celle décrite dans la littérature. Il a été montré qu'il existe une relation entre la sensibilité à l'itraconazole et le génotype H chez les isolats de C. albicans (p-value <0,05). Les extraits de plantes présentent des activités inhibitrices contre les levures testées. Les fractions obtenues par fractionnement bio-guidé ont permis l'amélioration de l'activité de 7 extraits. La combinaison de ces subfractions a donné une combinaison synergique et fongicide dérivée de T. mantaly et de M. tenuifolia. En conclusion, ce travail apporte de nouvelles données sur la compréhension de l'épidémiologie moléculaire et de la sensibilité des isolats de C. neoformans et de Candida aux antifongiques à Yaoundé. L'étude des extraits de plantes semble être une voie prometteuse dans le développement de thérapies antifongiques alternatives. / Cryptococcus neoformans and Candida species are the main causative agents of yeast opportunistic infections among HIV infected persons. However, information on molecular their epidemiology and antifungal susceptibility are scarce in Cameroon. The main objective of this work was to study the genetic diversity and the antifungal susceptibility against antifungal drugs and plant extracts of C. neoformans and Candida isolates from Yaoundé HIV patients. C. neoformans (25) and Candida (317 among which 113 C. albicans) Isolates were obtained, from 171 and 402 HIV patients at the Yaoundé Central Hospital respectively. They were identified by phenotypic and biochemical characters, by mass spectrometry and quantitative PCR. The genetic diversity of 150 C. neoformans isolates (25 initial isolates and 125 colonies) was carried out by serotyping, microsatellite length polymorphism and PCR-RFLP. The genetic diversity of the 113 C. albicans isolates was performed by genotyping and microsatellite length polymorphism. The identification of C. albicans complex species was achieved by PCR amplification of the Hwp1 gene. The antifungal susceptibility testing of C. neoformans against posaconazole, voriconazole, ketoconazole, itraconazole, fluconazole, amphotericin B and 5-fluorocytosine was carried out by the broth microdilution test using the « Sensititre YeastOne® » kit. The CLSI M27-A3 protocol was used for the determination of the C. albicans isolate's susceptibility against amphotericin B, ketoconazole, fluconazole and itraconazole which are frequently used in Cameroon. The antifungal activity of extracts from Terminalia mantaly, Terminalia catappa and Monodora tenuifolia was performed by a preliminary screening with the determination of minimal inhibitory concentrations (MIC) of crude extracts. Selected extracts were therefore submitted to the bio-guided fractionation. Selected subfractions were submitted to combination assays. C. neoformans var grubii was the lonely Cryptococcus species isolated in cerebrospinal fluids. Fifteen Candida species were isolates from mucosae with C. albicans remaining the most frequent. C. africana has been isolated for the first time in Cameroon. C. neoformans and C. albicans provided 14 and 65 major molecular types respectively. It was also found that a patient can be infected by 2 different molecular types of C. neoformans. C. albicans genotype A was the most frequent. The PCR amplification of the Hwp1 gene allowed the identification of a novel molecular profile among the C. albicans complex and named H (H1-H6). C. neoformans isolates were susceptible to the tested drugs. However, one isolate exhibited reduced susceptibility to fluconazole and one another to 5-fluorocytosine. C. albicans isolates expressed various susceptibility profiles similar to what described in the literature. Furthermore, there was a relationship between the H-typing and the antifungal susceptibility of C. albicans isolates against itraconazole (p-value<0.05). T. mantaly, T. catappa and M. tenuifolia extracts exhibited antifungal activity against tested yeasts. Bioguided fractionation allowed improves of the antifungal activity from crude extracts to subfractions. Synergism was observed, and the most active combination from T. mantaly and M. tenuifolia was also fungicidal on tested yeasts. Conclusively, the present work brings new tools for the comprehension and the better management of C. neoformans and Candida infections among Yaoundé HIV positive patients. The antifungal resistance emergence of yeasts isolates could be compensated by the development of a new antifungal medicine from subfractions combinations of T. mantaly and M. tenuifolia.

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A toxicidade dos fármacos antifúngicos utilizados juntamente com o desenvolvimento da resistência tem se tornado um sério problema clínico. Com isso, atualmente existe a urgência na descoberta de novos compostos com atividades antifúngicas. Objetivos: avaliar a atividade antifúngica do fármaco Cloridrato de Verapamil, determinar a Concentração Inibitória Mínima (CIM) e a Concentração Fungicida Mínima (CFM), frente à Candida albicans ATCC 18804, Candida krusei ATCC 6258, Candida parapsilosis ATCC 90018 e Candida glabrata ATCC 9030. Além de avaliar a citotoxicidade do fármaco em queratinócitos humanos (HaCaT). Metodologia: a determinação da CIM foi realizada pela técnica de microdiluição de acordo com The European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST). A CFM foi determinada por plaqueamento em ágar Sabouraud de alíquotas provenientes das diluições do ensaio de microdiluição. A avaliação da citotoxicidade foi realizada pela técnica de redução da resazurina, sendo possível avaliar a atividade mitocondrial das células HaCaT. Resultados: o fármaco Cloridrato de Verapamil demonstrou atividade antifúngica contra as quatro espécies patogênicas de Candida, com o valor de CIM de 1250 µM; valor de CFM maior que 1250 µM, sendo assim este fármaco foi considerado fungistático. Além disso, o Cloridrato de Verapamil não apresentou citotoxicidade nas concentrações avaliadas no estudo, pois, a redução de células viáveis nas concentrações mais elevadas não ultrapassa 30%. Com relação à redução de biomassa em biofilme de Candida, após tratamento com Cloridrato de Verapamil, houve redução (de 10 a 20%) para as quatro espécies de Candida em estudo, quando utilizadas concentrações de fármaco correspondentes a CIM; quando utilizadas concentrações de fármaco correspondentes a cinco vezes o valor de CIM, houve um aumento significativo na redução de biomassa (de 25% a 60%) em biofilme formado pelas quatro espécies de Candida. Conclusão: o fármaco Cloridrato de Verapamil apresentou atividade antifúngica para Candida albicans e Candida não-albicans, sendo considerado um fármaco fungistático, além de não apresentar citotoxicidade em queratinócitos humanos, e demonstrar atividade na redução de biomassa em biofilme formado pelas quatro espécies de Candida. Demais estudos são necessários para verificar a ação desse fármaco em diferentes mecanismos de virulência frente a células de Candida spp. / Abstract: The epidemiology of Candida infections has changed in recent years. Although Candida albicans is still the main pathogen causing candidiasis, recent reports have reported an increase in the incidence of infections caused by nonalbicans Candida species. The toxicity of the antifungal drugs used together with the development of resistance has become a serious clinical problem. With this, there is now an urgency in the discovery of new compounds with antifungal activities. Objectives: To evaluate the antifungal activity of the drug Verapamil Hydrochloride, to determine the Minimum Inhibitory Concentration (MIC) and the Minimum Fungicidal Concentration (CFM) against Candida albicans ATCC 18804, Candida krusei ATCC 6258, Candida parapsilosis ATCC 90018 and Candida glabrata ATCC 9030 In addition to evaluating the cytotoxicity of the drug in human keratinocytes (HaCaT). Methodology: MIC determination was performed by the microdilution technique according to The European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST). The CFM was determined by plating on Sabouraud agar from aliquots from the dilutions of the microdilution assay. The evaluation of cytotoxicity was performed using the resazurin reduction technique, and it was possible to evaluate the mitochondrial activity of HaCaT cells. Results: The drug Verapamil Hydrochloride demonstrated antifungal activity against the four pathogenic species of Candida, with MIC value of 1250 μM; CFM value greater than 1250 μM, so this drug was considered fungistatic. In addition, Verapamil Hydrochloride did not present cytotoxicity in the units evaluated in the study, because the reduction of viable cells in the most cells is not exceeded by 30%. Regarding the biomass reduction in Candida biofilm, after treatment with Verapamil Hydrochloride, there was a reduction (from 10 to 20%) for the four Candida species in study, when the use of drug corresponding to MIC; when the use of drug corresponding to 5 times of MIC, there was a significant increase in the biomass reduction (from 25% to 60%) in the biofilm molded by the four Candida species. Conclusion: Thus, the drug Verapamil Hydrochloride led to the antifungal activity of Candida albicans and non-albicans Candida species, being considered a fungicidal drug, besides not presenting cytotoxicity in human serotonizers, and were submitted to biomass reduction in biofilm molded by four Candida species. More studies are needed to verify the action of the drug on different mechanisms of virulence against Candida spp cells.

Espécies de Candida com relevância clínica diferem entre si com relação a aspectos como prevalência clínica, virulência e perfil de resistência a antifúngicos. Formulamos a hipótese de que estas diferenças podem ocorrer devidas em parte à capacidade relativa distinta destas espécies de resistirem ao estresse oxidativo que é imposto por fagócitos durante a patogênese da candidíase. Nesse contexto, poucos são os estudos de resposta ao estresse oxidativo (REO) em espécies que não Candida albicans. Assim, esse trabalho teve por objetivo investigar a REO in vitro em isolados de referência e clínicos de 8 espécies de Candida – C. albicans, C. dubliniensis, C. famata, C. glabrata, C. guilliermondii, C. krusei, C. parapsilosis e C. tropicalis. Para tal, foi avaliado o grau de resistência a oxidantes, a capacidade de adaptação, a indução de enzimas antioxidantes, os níveis de glutationa total, a capacidade antioxidante total e a indução de dano oxidativo a proteínas e lipídios através de metodologias atuais. C. albicans, C. glabrata e C. krusei apresentaram maior resistência ao estresse oxidativo nas condições testadas, C. parapsilosis e C. tropicalis resistência média e C. dubliniensis, C. famata e C. guilliermondii foram mais sensíveis. Todas as espécies demonstraram capacidade adaptativa e indução de enzimas antioxidantes. Os níveis de glutationa total mostraram redução intracelular frente ao estresse oxidativo. A capacidade antioxidante total foi variável entre espécies. Outros testes (efeito de meio condicionado e de moléculas quorum-sensing – tirosol e farnesol - no crescimento, capacidade de proteção cruzada e oxidante total) foram empregados sem sucesso. Ainda, verificamos em isolados de C. albicans a relação entre capacidade de resistirem a oxidantes e produção de fosfolipase e protease. Os resultados indicaram ausência de correlação entre estes fatores. Espécies com sistema antioxidante mais frágil são também as que ocorrem com menor frequência em infecções sistêmicas ou resistem menos ao efeito dos antifúngicos. É interessante investigar se C. albicans, C. glabrata e C. krusei tiram vantagem efetiva de um sistema antioxidante mais potente para causarem candidíase disseminada ou resistirem a drogas. A caracterização detalhada da REO pode proporcionar a descoberta de novos alvos para a ação de antifúngicos no futuro. / Candida species with clinical relevance differ in therms of clinical prevalence, virulence and profile of resistance to antifungal agents. We hypothesized that these differences may be due in part to the relative ability of these species to resist oxidative stress that is imposed by phagocytes in the pathogenesis of candidiasis. In this context, there are few studies of the oxidative stress response (OSR) in different species than C. albicans. Thus, this study aimed to investigate the in vitro OSR considering isolates of eight Candida species – C. albicans, C. dubliniensis, C. famata, C. glabrata, C. guilliermondii, C. krusei, C. parapsilosis and C. tropicalis. To this purpose, we evaluated the resistance degree to oxidants, the adaptability, the induction of antioxidant enzymes, levels of total glutathione, total antioxidant status and induction of oxidative damage to proteins and lipids by current methodologies. C. albicans, C. glabrata and C. krusei showed greater resistance to oxidative stress in the conditions tested; C. parapsilosis and C. tropicalis showed an intermediate resistance and C. dubliniensis, C. famata and C. guilliermondii were more sensitive to oxidative stress. All species showed adaptive capacity and induction of antioxidant enzymes. The levels of total glutathione showed intracellular reduction against oxidative stress. The total antioxidant capacity was variable between species. Other tests (effect of conditioned medium and quorum-sensing molecules - farnesol and tirosol – on growth, ability of cross-protection and total oxidant status) were tested without success. Still, we found in isolates of C. albicans the relationship between ability to resist oxidation and production of phospholipase and protease. The results indicated no correlation between these factors. Species with weaker antioxidant system are also those that occur less frequently in systemic infections or are less resistant to the effect of antifungal agents. It is interesting to investigate if C. albicans, C. glabrata and C. krusei take effective advantage of a more powerful antioxidant system to cause disseminated candidiasis or resist drugs. The detailed characterization of the OSR can provide the discovery of new targets for the action of antifungals in the future.