Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / In the last decades the invasive mycoses caused by opportunistic fungi has showed a significant growth. The extensive use of azoles showed that the development of resistance of Candida species to these drugs is an emergent phenomenon. C. glabrata typically presents high degree of primary resistance to fluconazole what determine additional difficulties in the therapies. Here two groups of C. glabrata isolates were evaluated: the first formed by strains primarily fluconazole-susceptible and the second generated by the first, was composed by the same isolates after induction of the fluconazole-resistance. The susceptibility tests detected even in the first group, strains azole-resistant as against itraconazole and voriconazole. The induction of resistance to fluconazole was carried out in order to compare the susceptibilities between the two groups against combined drugs. The fluconazole-resistant strains (Group 2) showed MIC ≥ 64 μg/ml and cross-resistance was either detected with fluconazole, voriconazole and itraconazole as well as to other antifungal agents as amphotericin B and caspofungine. The more frequent interaction observed was indifference, however important synergisms were showed against fluconazole-resistant isolates. The best synergism was registered with amphotericin B+ flucytosine (G1 = 61,77% and G2=76,47%). Other synergistic interactions were amphotericin B+ketoconazole (G2=73,53%), amphotericin B+voriconazole (G2=55,88%), amphotericin B+voricoonazole (G2=55,88%), all of them without antagonisms. The highest percentage of the antagonism were observed with ketoconazole+flucytosine (G1=61,77% and G2= 55,88%). / A freqüência de micoses invasivas devido a fungos oportunistas tem evidenciado significativo aumento nas duas últimas décadas. O uso prolongado e indiscriminado dos azólicos evidenciou o desenvolvimento de resistência a estes fármacos nas espécies de Candida. A espécie C. glabrata caracteriza-se por elevados percentuais de resistência primária ao fluconazol fato que determina dificuldades terapêuticas adicionais. No presente estudo, dois grupos de isolados de C. glabrata foram avaliados: o primeiro formado por isolados clínicos sensíveis ao fluconazol, e o segundo, derivado do primeiro, foi formado pelos mesmos isolados, após terem sido induzidos a resistência ao fluconazol in vitro. Mesmo neste grupo de C. glabrata sensíveis ao fluconazol, os testes de suscetibilidade já evidenciaram resistência frente a outros azólicos como ao itraconazol e voriconazol. Os derivados resistentes ao fluconazol evidenciaram concentrações inibitórias mínimas maiores ou iguais a 64 g/mL. Neste grupo de isolados fluconazol-resistentes, os testes de suscetibilidade detectaram resistência cruzada com cetoconazol, voriconazol e itraconazol bem como com outros agentes de outras classes como a anfotericina B e caspofungina. A indução da resistência foi realizada com o objetivo de se comparar a suscetibilidade entre os dois grupos, frente a fármacos combinados. As associações de antifúngicos entre os grupos sensíveis e resistentes ao fluconazol resultaram, em maior parte, interações indiferentes. No entando as associações mostraram-se mais eficazes nos isolados resistentes ao fluconazol. Em ambos os grupos, a combinação que resultou em maior sinergismo foi anfotericina B com flucitosina (.G1 = 61,77%.% e G2 = 76,47%); outras combinações sinérgicas foram anfotericina B + cetoconazol (G2 = 73,53%), anfotericina B + voriconazol (G2 = 55,88%), todos com ausência de antagonismo. Os maiores percentuais de antagonismo foram observados na combinação cetoconazol + flucitosina (G1 = 61,77% e G2 = 55,88%).

Submitted by Maike Costa (maiksebas@gmail.com) on 2017-03-06T11:28:28Z No. of bitstreams: 1 arquivo total.pdf: 1129026 bytes, checksum: a6cdcef49ae9b3ce93a416e318d65f00 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-06T11:28:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivo total.pdf: 1129026 bytes, checksum: a6cdcef49ae9b3ce93a416e318d65f00 (MD5) Previous issue date: 2016-12-13 / Given the need to implement new therapeutic agents for the treatment of infections caused by Candida spp., the search for natural products grows worldwide. Against this background extracts obtained from Schinopsis brasiliensis Engl. represent potential sources of chemical agents with antifungal effect, considering their recognized bacterial activity. Objective: To evaluate the antifungal, anti-biofilm and cytotoxic potential of the rotavaporated extract of S. brasilienses leaf on Candida spp. Methods: Minimal Inhibitory Concentration - MIC and Minimum Fungicide - CFM were determined on 6 Candida strains by the microdilution technique in 96-well plates. The growth inhibition kinetics of C. albicans ATCC 60193 at different times in the MIC, MIC x 2 and MIC X 4 concentrations were evaluated. The anti-biofilm evaluation was determined in microdilution plates with evaluation of inhibition of formation and reduction of Biofilms ripe uniespecies or multispecies of 24 and 48 hours. The synergism was evaluated by the checkerboard method. Cytotoxicity was performed on human blood cells. The data were analyzed by Tukey, Mann-Wihitney, Kruskall Wallis, ANOVA and post-hoc paired T-test with p <0.05. Results: For the Minimum Inhibitory Concentration the leaf extract of S. brasiliensis presented antifungal activity against all The Candida species evaluated. There was a reduction in formation and in the mature biofilms uni and multispecies for the periods of 24 and 48h. In the kinetics only the MIC concentration x 4 presented results, being the best result of the extract from six hours (p <0.01). At all concentrations used in the study up to 1250 μg / mL the extract did not show cytotoxicity in human cells. Conclusion: The extract of the leaf of S. brasiliensis has antifungal activity on strains of the genus Candida, showing, in general, fungicidal action, especially after six hours of contact with the microbial cells and antibiofilm effect constituted by Candida spp. (Uni and multispecies), with ability to inhibit the formation and reduction of mature biofilm without cytotoxicity on peripheral blood mononuclear cells. / Diante da necessidade de implementação de novos agentes terapêuticos para tratamento de infecções ocasionadas por Candida spp., a busca por produtos naturais cresce mundialmente. Frente a este cenário extratos obtidos a partir de Schinopsis brasiliensis Engl. representam potenciais fontes de agentes químicos com efeito antifúngico, considerando sua reconhecida atividade bacteriana. Objetivo: Avaliar o potencial antifúngico, anti-biofilme e citotóxico do extrato rotaevaporado da folha da S. brasilienses sobre Candida spp. Métodos: Foi determinada a Concentração Inibitória Mínima - CIM e Fungicida Mínima- CFM sobre 6 cepas de Candida, através da técnica da microdiluição em placas de 96 poços. Foi avaliada a cinética de inibição de crescimento da C. albicans ATCC 60193 em diferentes tempos nas concentrações de CIM, CIM x 2 e CIM X 4. A avaliação anti-biofilme foi determinada em placas de microdiluição com avaliação da inibição de formação e redução dos biofilmes maduros uniespécie ou multiespécie de 24 e 48 horas. Foi avaliado o sinergismo pelo método checkerboard. A citotoxidade foi realizada em células sanguíneas humanas. Os dados foram analisados através do teste T pareado, ANOVA e post hoc de Tukey, Mann- Wihitney, Kruskall Wallis com p<0,05 Resultados: Para a Concentração Inibitória Mínima o extrato da folha da S. brasiliensis apresentou atividade antifúngica frente a todas as espécies de Candida avaliadas. Houve redução na formação e nos biofilmes maduros uni e multiespécie para os períodos de 24 e 48h. Na cinética apenas a concentração CIM x 4 apresentou resultados, sendo o melhor resultado do extrato a partir de seis horas (p<0,01). Em todas as concentrações utilizadas no estudo até 1250 μg/ mL o extrato não apresentou citotoxidade em células humanas. Conclusão: O extrato da folha da S. brasiliensis possui atividade antifúngica sobre cepas do gênero Candida, apresentando, de modo geral, ação fungicida, especialmente após seis horas de contato com as células microbianas e efeito antibiofilme constituído por Candida spp. (uni e multiespécie), com habilidade para inibir a formação e reduzir o biofilme maduro, sem apresentar citotoxidade sobre células humanas de sangue periférico.

Submitted by Maike Costa (maiksebas@gmail.com) on 2017-09-12T12:28:26Z No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 1665261 bytes, checksum: dbe5fa1dfafb0bc226838e2bdf4e396e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-12T12:28:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 1665261 bytes, checksum: dbe5fa1dfafb0bc226838e2bdf4e396e (MD5) Previous issue date: 2017-01-18 / Currently, throughout the globe, there has been an increase in the frequency of cases of candidiasis, an opportunistic infection commonly treated with fluconazole. With the indiscriminate use of this and other antifungals cases of candidiasis by multiresistant strains have emerged, making it necessary to search for new drugs. Several natural products such as monoterpene geraniol have demonstrated antimicrobial activity to various microorganisms. The present study aimed to evaluate the antifungal activity of geraniol against strains of Candida albicans, C. glabrata and C. krusei resistant to fluconazole by means of microdilution techniques, evaluating the minimum inhibitory concentration - CIM, minimum fungicidal concentration - CFM, cell wall effect (sorbitol assay), binding to membrane ergosterol, effect of association of this monoterpene with fluconazole and amphotericin B antifungal agents by the checkeboard technique and modulation assay. Pharmacological, toxicological and possible spectra of geraniol activity were also verified by in silico assays using the Osiris, Molinspiration and Pass online software. The analysis showed that geraniol showed excellent antifungal activity against all multiresistant strains with a 512μg/mL CIM90, and a fungicidal effect dependent concentration after 8 hours of exposure with the CFM90 of 512μg/mL. Fungal wall and did not interact with the ergosterol of the cell membrane, nor did it show a synergistic, antagonistic or modulating effect of this phytoconstituent on fluconazole and amphotericin B. The in silico tests showed that geraniol has a good theoretical oral bioavailability, as well as numerous Although it presents the risk of an irritant effect, it does not present mutagenic, tumorigenic or reproductive effects, which leads to the conclusion that geraniol is a good candidate in the fight against multidrug resistant strains of Candida. / Atualmente, em todo globo terrestre tem ocorrido o aumento da frequência dos casos de candidíase, infecção oportunista comumente tratada com fluconazol. Com o uso indiscriminado deste e outros antifúngicos tem se emergido casos de candidíase por cepas multirresistentes tornando-se necessário a busca por novos fármacos. Vários produtos naturais a exemplo do monoterpeno geraniol têm demonstrado atividade antimicrobiana frente a diversos micro-organismos. Buscando alternativas para o tratamento da candidíase o presente estudo objetivou-se avaliar a atividade antifúngica do geraniol frente a cepas de Candida albicans, C. glabrata e C. krusei resistentes ao fluconazol por meio de técnicas de microdiluição, avaliando-se a concentração inibitória mínima – CIM, concentração fungicida mínima – CFM, efeito na parede celular (ensaio de sorbitol), ligação ao ergosterol da membrana, efeito de associação deste monoterpeno com antifúngicos fluconazol e anfotericina B pelo técnica de checkeboard e ensaio de modulação. Verificou-se também a os parâmetros farmacológicos, toxicológicos e possíveis espectros de atividade do geraniol por meio de ensaios in silico utilizando-se os softwares Osiris, Molinspiration e Pass online. As análises realizadas revelaram que o geraniol apresentou uma excelente atividade antifúngica frente a todas as cepas multirresistentes com uma CIM90 512μg/mL, além de um efeito fungicida concentração dependente após 8 horas de exposição com a CFM90 de 512μg/mL, este não apresentou atividade na parede fúngica e nem interagiu com o ergosterol da membrana celular, também não se evidenciou efeito sinérgico, antagônico ou modulador deste fitoconstituinte sobre o fluconazol e a anfotericina B. Os ensaios in silico mostraram que o geraniol tem uma boa biodisponibilidade oral teórica, além de inúmeras atividades farmacológicas e que embora apresente o risco de efeito irritante, não apresenta efeitos mutagênicos, tumorigênicos e nem danos ao aparelho reprodutor, o que permite sugerir que o geraniol é um bom candidato no combate a cepas de Candida multirresistentes.

Submitted by LUNA MARES LOPES DE OLIVEIRA (DINTER) null (lunamares@saolucas.edu.br) on 2017-01-27T02:26:31Z No. of bitstreams: 1 CAPITULO TESE - LUNA MARES LOPES DE OLIVEIRA.pdf: 792305 bytes, checksum: 7e19ae8eb4ac1ad2447d7290d4746ef9 (MD5) / Approved for entry into archive by LUIZA DE MENEZES ROMANETTO (luizamenezes@reitoria.unesp.br) on 2017-01-31T13:11:06Z (GMT) No. of bitstreams: 1 oliveira_lml_dr_araca.pdf: 792305 bytes, checksum: 7e19ae8eb4ac1ad2447d7290d4746ef9 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-01-31T13:11:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 oliveira_lml_dr_araca.pdf: 792305 bytes, checksum: 7e19ae8eb4ac1ad2447d7290d4746ef9 (MD5) Previous issue date: 2016-01-19 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / As propriedades antimicrobianas da romã são atribuídas aos compostos fenólicos, mais especificamente aos taninos hidrolisáveis (THs) galotaninos (ácido gálico) e elagitaninos (ácido elágico), substâncias naturais de defesa da planta. Os objetivos deste estudo foram avaliar os níveis de ácido elágico e fenóis totais, rendimento dos métodos de extração e o potencial inibitório sobre Candida albicans de extratos de partes da Punica granatum. Amostras em triplicata de cascas, sementes e folhas desidratadas, trituradas, pulverizadas, foram submetidas a dois métodos de extração: soxhlet tendo como solventes etanol e metanol e percolação tendo como solvente o etanol. Após a obtenção dos extratos, foram determinados os teores de ácido elágico por cromatografia liquida de alta eficiência e fenóis totais expressos em ácido gálico pelo método espectrofotométrico. A atividade antifúngica dos extratos foi avaliada pelo método de difusão em disco, seguindo-se as normas do National Committee for Clinical and Laboratory Standards (NCCLS document M2-A8, 2003a.). As maiores concentrações de fenóis totais e de ácido elágico foram encontradas nas folhas e na casca da romã. Verificou-se maior eficiência de rendimento por meio da percolação. Os resultados de difusão em disco revelaram maior sensibilidade da cepa de C. albicans aos extratos etanólicos da casca por ambos os métodos de extração. O método percolação alcoólica a 70% e 25ºC e a casca da romã apresentaram a maior eficiência de extração e de atividade anti-fúngica contra uma cepa clínica de C. albicans. / The antimicrobial properties of pomegranate are attributed to the phenolic compounds, more specifically the hydrolyzable tannins (THs) galotaninos (gallic acid) and elagitaninos (ellagic acid), natural plant defense substances. The objectives of this study were to evaluate the levels of ellagic acid and total phenols, yield of the extraction methods and the inhibitory potential against Candida albicans of extracts from parts of Punica granatum. Samples of dried, peels, seeds and leaves were used in triplicates and the extracts were obtained by Soxhlet system and percolation using respectively ethanol, methanol and ethanol solvents. After obtaining the extracts, the ellagic acid contents were determined by high performance liquid chromatography (HPLC) and total phenols expressed in gallic acid by the spectrophotometric method. The antimicrobial activity was evaluated by the disc diffusion method, following the standards of the National Committee for Clinical and Laboratory Standards (NCCLS document M2-A8, 2003a.). The highest concentrations of THs were found in leaves and pomegranate peel. Greater yield efficiency was verified by percolation. The results of diffusion on disc revealed higher sensitivity of the C. albicans strain to the ethanolic extracts of peels by both methods of extraction, presenting inhibition halos of approximately 10 mm. The alcoholic percolation method at 70% and 25ºC and the pomegranate peel showed the highest extraction efficiency and antifungal activity against a clinical strain of C. albicans. / FAPESP: 2014/08643-2 / CAPES: 88881.030445/2013-1

Orientador: Ana Luicia Machado / Banca: Carlos Eduardo Vergani / Banca: Valtencir Zucolotto / Resumo: Apesar do uso de drogas antifúngicas no tratamento da estomatite protética, freqüentemente a infecção é persistente e a resistência microbiana tem sido observada nos biofilmes de Candida albicans. Dessa forma, existe a necessidade de se desenvolver outros agentes antimicrobianos tais como as nanopartículas de prata (AgNPs). Assim, o objetivo deste estudo foi avaliar o efeito de uma solução preparada de AgNPs sobre C. albicans em suspensão. Além disso, os efeitos da incorporação de diferentes concentrações da solução de AgNPs em uma resina acrílica para base de prótese e o armazenamento por períodos de até 180 dias no ângulo de contato, adesão e formação de biofilme foram avaliados. A solução de AgNPs foi sintetizada por meio de redução química utilizando borohidreto de sódio (NaBH4) como agente redutor e polivinil álcool (PVA) como estabilizante, e foi caracterizada utilizando espectroscopia UV-visível (UV-vis), espectrometria de infravermelho por transformada de Fourier (FTIR) e espalhamento de luz dinâmico (DLS). A susceptibilidade antimicrobiana da solução de AgNPs de diferentes concentrações (de 1000 a 20 ppm) foi avaliada em C. albicans suspensão (ATCC 90028). A solução de AgNPs foi também misturada com o pó da resina para produzir resinas acrílicas com AgNPs incorporadas nas concentrações finais de 1000, 750, 500, 250 e 30 ppm. Resina sem AgNPs foi utilizada como controle. Amostras em forma de discos (13 × 2 mm) de cada concentração (n=72) foram preparadas e armazenadas em PBS estéril por 0, 7, 90 e 180 dias (n=18). Após esses períodos, os ângulos de contato foram mensurados em um goniômetro. A seguir, 9 amostras de cada concentração foram utilizadas para o teste de aderência de C. albicans (90 minutos de incubação), e 9 para o teste de formação de... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Despite the use of antifungal drugs to treat denture stomatitis, infection is often persistent and antifungal resistance has been observed in C. albicans biofilms. Therefore, there is a need to develop alternative antimicrobial agents such as silver nanoparticles (AgNPs). Thus, the objective of this study was to evaluate the effect of a prepared AgNPs aqueous solution against C. albicans suspension. Additionally, the effects of incorporation of different concentrations of the AgNPs solution into a denture base acrylic resin and storage for up to 180 days on the contact angle, C. albicans adhesion and biofilm formation were evaluated. The AgNPs solution was synthesized by chemical reduction using sodium borohydride as reducing agent and polyvinyl alcohol as stabilizer, and was characterized by UV-visible spectroscopy, Fourier transform infrared spectroscopy and Dynamic Light Scattering. The antimicrobial susceptibility of AgNPs solution of different concentrations (from 1000 to 20 ppm) was performed against C. albicans suspension (ATCC 90028). The AgNPs solution was also mixed with the acrylic powder to produce silver-incorporated acrylic resins at the final concentrations of 1000, 750, 500, 250 and 30 ppm. Resin without AgNPs was used as control. Disk-shaped samples (13 × 2 mm) of each concentration (n=72) were prepared and stored in sterile PBS for 0, 7, 90 and 180 days (n=18). After the storage periods, the contact angles were measured in a goniometer. Then, 9 samples of each concentration... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:30:22Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-02-17Bitstream added on 2014-06-13T19:00:20Z : No. of bitstreams: 1 wady_af_me_arafo.pdf: 531289 bytes, checksum: f03e54a3a96691d52c47dbbf0cd1479d (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Apesar do uso de drogas antifúngicas no tratamento da estomatite protética, freqüentemente a infecção é persistente e a resistência microbiana tem sido observada nos biofilmes de Candida albicans. Dessa forma, existe a necessidade de se desenvolver outros agentes antimicrobianos tais como as nanopartículas de prata (AgNPs). Assim, o objetivo deste estudo foi avaliar o efeito de uma solução preparada de AgNPs sobre C. albicans em suspensão. Além disso, os efeitos da incorporação de diferentes concentrações da solução de AgNPs em uma resina acrílica para base de prótese e o armazenamento por períodos de até 180 dias no ângulo de contato, adesão e formação de biofilme foram avaliados. A solução de AgNPs foi sintetizada por meio de redução química utilizando borohidreto de sódio (NaBH4) como agente redutor e polivinil álcool (PVA) como estabilizante, e foi caracterizada utilizando espectroscopia UV-visível (UV-vis), espectrometria de infravermelho por transformada de Fourier (FTIR) e espalhamento de luz dinâmico (DLS). A susceptibilidade antimicrobiana da solução de AgNPs de diferentes concentrações (de 1000 a 20 ppm) foi avaliada em C. albicans suspensão (ATCC 90028). A solução de AgNPs foi também misturada com o pó da resina para produzir resinas acrílicas com AgNPs incorporadas nas concentrações finais de 1000, 750, 500, 250 e 30 ppm. Resina sem AgNPs foi utilizada como controle. Amostras em forma de discos (13 × 2 mm) de cada concentração (n=72) foram preparadas e armazenadas em PBS estéril por 0, 7, 90 e 180 dias (n=18). Após esses períodos, os ângulos de contato foram mensurados em um goniômetro. A seguir, 9 amostras de cada concentração foram utilizadas para o teste de aderência de C. albicans (90 minutos de incubação), e 9 para o teste de formação de... / Despite the use of antifungal drugs to treat denture stomatitis, infection is often persistent and antifungal resistance has been observed in C. albicans biofilms. Therefore, there is a need to develop alternative antimicrobial agents such as silver nanoparticles (AgNPs). Thus, the objective of this study was to evaluate the effect of a prepared AgNPs aqueous solution against C. albicans suspension. Additionally, the effects of incorporation of different concentrations of the AgNPs solution into a denture base acrylic resin and storage for up to 180 days on the contact angle, C. albicans adhesion and biofilm formation were evaluated. The AgNPs solution was synthesized by chemical reduction using sodium borohydride as reducing agent and polyvinyl alcohol as stabilizer, and was characterized by UV-visible spectroscopy, Fourier transform infrared spectroscopy and Dynamic Light Scattering. The antimicrobial susceptibility of AgNPs solution of different concentrations (from 1000 to 20 ppm) was performed against C. albicans suspension (ATCC 90028). The AgNPs solution was also mixed with the acrylic powder to produce silver-incorporated acrylic resins at the final concentrations of 1000, 750, 500, 250 and 30 ppm. Resin without AgNPs was used as control. Disk-shaped samples (13 × 2 mm) of each concentration (n=72) were prepared and stored in sterile PBS for 0, 7, 90 and 180 days (n=18). After the storage periods, the contact angles were measured in a goniometer. Then, 9 samples of each concentration... (Complete abstract click electronic access below)

Os microrganismos associados à cárie são, em sua maioria, microrganismos acidogênicos e acidúricos, anaeróbios estritos e facultativos. A presença de fungos é associada à microbiota de cárie radicular, sendo a espécie fúngica mais relacionada a Candida albicans. Embora estudos de cultivo e de análise de DNA comprovem a presença de fungos na microbiota associada a lesões de cárie radicular, demonstrando um gradiente crescente de colonização com a progressão da doença, pouco se sabe sobre o papel que estes microrganismos desempenham no processo de doença. O objetivo deste trabalho foi estudar o papel de Candida albicans na cárie radicular, através da análise de transcriptoma de biofilmes naturais de superfícies radiculares hígidas (n=10, SRS) e de lesão de cárie radicular ativa (n=9, RC). Foi avaliada a expressão diferencial de genes de Candida albicans, as funções específicas e vias metabólicas associadas a este microrganismo. O RNA total microbiano foi extraído e o mRNA isolado e sequenciado na plataforma Illumina Hi-Seq2500. Foram formados pool (grupamentos) das amostras com valores inferiores a 30ng/RNA para a construção de bibliotecas genômicas. Os dados gerados pelo sequenciamento de RNA-Seq foram compilados em uma tabela de contagem (reads) e mapeados com o genoma de referência (C. albicans SC5314) utilizando o software CLC Genomics Workbench 7.5.1. Para o cálculo do nível de expressão gênica os dados foram normalizados com o algoritmo DESeq. A expressão diferencial foi calculada com binomial negativa e False Discovery Rate (FDR<0,05). Os genes com maior expressão em RC e em SRS foram analisados pela mediana relativa de expressão (RME; Relative Median Expression) e expressão diferencial, assim como as vias metabólicas associadas a genes de virulência e metabolismo de açúcares. Dois genes (CaO19.610, FDR=0.009; CaO19.2506, FDR=0.018) apresentaram expressão diferencial significativa em superfície radicular hígida (SRS) e tem suas funções relacionadas a formação de biofilme. Enquanto que em superfície radicular cariada (RC) sete genes (UTP20, FDR=0.018; ITR1, FDR=0.036; DHN6, FDR=0.046; CaO19.7197, FDR=0.046; CaO19.7838, FDR=0.046; STT4, FDR=0.046; GUT1, FDR=0.046) apresentaram expressão diferencial significativa e tem suas funções relacionadas a atividade metabólica, transporte de açúcares, tolerância ao estresse, invasão e regulação de pH. Candida albicans é um microrganismo importante no desenvolvimento da doença cárie radicular. / The microbiota associated with root caries must be acidogenic and aciduric. S. mutans, Lactobacillus, Actinomyces, Veilonella, Bifidobacterium, and other bacteria play important roles in root caries biofilm. Yeasts are also present on carious and non-carious root biofilms, being the specie Candida albicans the most prevalent yeast found in root biofilms. Although the presence of Candida albicans is stablished in the literature, and there are an increasing gradient of Candida species. colonization with caries progression, the role of this microorganism in root caries has not being totally elucidated. The aim of this study is to analyse the role of Candida albicans in root caries thought a transcriptomic analysis of biofilms of sound root surfaces (n=10, SRS) and root caries lesions (n=9, RC) using a high-throughput sequencing of cDNA (RNA-Seq). The differential expression of genes of Candida albicans SC5314, the specific functions and pathways associated with the gene expression of the present study were investigated. The total bacterial RNA was extracted and the mRNA was isolated (Illumina Hi-Seq2500). Samples with low RNA concentration (less than 30ng/RNA) were pooled, yielding a final sample size of SRS=10 and RC=9. Sequence reads were compiled in a count table and mapped to C. albicans SC5314 genome of reference, using the software CLC Genomics Workbench 7.5.1. Gene expression was calculated in the algorithm DESeq, and the differential expression was calculated with binomial negative (Log2FoldChange) and False Discovery Rate (FDR<0,05). The genes with higher expression in RC and SRS were analysed by the Relative Median Expression (RME), and the virulence factors and pathways and sugar metabolization related with Candida albicans pathogenicity in root caries were analysed. Two genes (CaO19.610, FDR=0.009; CaO19.2506, FDR=0.018) are up-regulated in Sound Root Surface (SRS) have their functions related to biofilm formation and seven (UTP20, FDR=0.018; ITR1, FDR=0.036; DHN6, FDR=0.046; CaO19.7197, FDR=0.046; CaO19.7838, FDR=0.046; STT4, FDR=0.046; GUT1, FDR=0.046) are up-regulated in biofilm of carious dentin (RC) have functions related to metabolic activity, sugar transport, stress tolerance, invasion and pH regulation.

Objetivos: avaliar o papel da Candida albicans (ATCC 90028) no potencial cariogênico e acidogênico de biofilmes in vitro de Streptococcus mutans (UA159). Métodos: biofilmes de dupla-espécie (C. albicans + S. mutans) e de espécie única (S. mutans ou C. albicans) foram cultivados sobre a superfície hígida de blocos de esmalte bovino com dureza inicial conhecida na presença de meio de cultura suplementado com glicose 20 mM e sacarose 3 mM por 24, 48 e 72 horas. O meio foi substituído diariamente e seu pH foi registrado. Blocos de esmalte foram então coletados ao final de cada período experimental e contagens de células viáveis foram realizadas. A desmineralização foi avaliada através da porcentagem de alteração de microdureza superficial (% SMC) e análise de microradiografia transversal (perda mineral integrada e profundidade de lesão). Resultados: o pH do meio de cultura permaneceu constante nos biofilmes de espécie única de C. albicans causando quase nenhuma desmineralização no esmalte. Não houve diferença no potencial acidogênico dos biofilmes de espécie única de S. mutans ao longo dos períodos experimentais sendo estes valores de pH sempre menores quando comparados ao pH relacionado aos demais biofilmes (p < 0.01) A % SMC dos biofilmes de espécie única de S. mutans aumentou significativamente com o tempo. Além disso, lesões de cárie após 72 horas de crescimento de biofilme bacteriano apresentaram maior perda mineral integrada e foram mais profundas do que lesões de cárie relacionadas a biofilmes de dupla-espécie (p < 0.01). O pH do meio de cultura relacionado a biofilmes de dupla-espécie foi baixo no primeiro dia, mas aumentou no decorrer do tempo para valores acima do pH crítico para desmineralização do esmalte. Em consequência, a % SMC permaneceu a mesma depois de 48 horas de crescimento de biofilmes de dupla-espécie e foi significantemente menor do que os valores relacionados a S. mutans em espécie única (p < 0.01). Conclusões: os presentes dados sugerem que a C. albicans apresenta um baixo potencial de desmineralização de esmalte e esse micro-organismo parece reduzir tanto o potencial cariogênico quanto acidogênico de biofilmes de S. mutans pela modulação do pH extracelular durante o crescimento in vitro de biofilmes de dupla-espécie. / Aim: evaluate the role of Candida albicans (ATCC 90028) on the cariogenic and acidogenic potentials of Streptococcus mutans (UA159) in vitro biofilms. Methods: dual-species (C. albicans + S. mutans) and single-species (S. mutans or C. albicans) biofilms were grown on the surface of sound bovine enamel slabs with known baseline hardness in the presence of culture medium supplemented with 20 mM glucose and 3 mM sucrose for 24, 48 and 72 hours. The medium was replaced daily and its pH was recorded. Enamel slabs were collected at the end of each experimental period and counts of viable cells were performed. Demineralization was evaluated through percentage of surface microhardness change (% SMC) and transversal microradiography analysis (integrated mineral loss and lesion depth). Results: spent medium pH remained neutral in C. albicans single-species biofilms causing almost no enamel demineralization. No difference in acidogenic potential of S. mutans single-species biofilms was found among experimental periods and its pH was always lower than pH related to other biofilms (p < 0.01). The % SMC in S. mutans single-species biofilms significantly increased with time. In addition, caries lesions after 72 hours of S. mutans biofilm growth had higher integrated mineral loss and were deeper than caries lesions related to dual-species biofilms (p < 0.01). Spent medium pH related to dual-species biofilms was low in the first day, but increased with time to values above critical pH for enamel demineralization. As a consequence, the % SMC remained the same after 48 hours of dual-species biofilm growth and was significantly lower than S. mutans single-species related values (p < 0.01). Conclusions: the present data suggest that C. albicans has low enamel demineralization potential and may decrease both the cariogenic and acidogenic potentials of S. mutans by modulating extracellular pH during in vitro dual-species biofilm growth.

A participação das espécies reativas de oxigênio (ERO) no mecanismo de ação dos antifúngicos azólicos, bem como a relação entre resistência aos antifúngicos e resposta ao estresse oxidativo, têm sido sugeridos. Entretanto, os dados ainda são inconclusivos e diferem entre os micro-organismos. Neste estudo estão apresentados os resultados da geração de ERO pelo fluconazol em isolados de C. glabrata sensíveis e resistentes a esse antifúngico e a resposta antioxidante da levedura. Nesses isolados, tratados e não tratados com fluconazol em concentração subinibitória, de acordo com sua concentração inibitória mínima (CIM), até fase de crescimento estacionário, foi avaliado se o fluconazol geraria ERO. Subsequentemente, foram analisadas as defesas antioxidantes glutationa peroxidase (GPx), superóxido dismutase (SOD), glutationa-S-transferase (GST), consumo de peróxido de hidrogênio e glutationa total, bem como possível dano oxidativo causado pelo fluconazol em lipídeos, proteínas e ácidos nucleicos e os níveis de nitritos e nitratos. Os resultados mostram que nos isolados de C. glabrata sensíveis e resistentes ao fluconazol, na presença do antifúngico, houve um aumento da geração ERO e maior atividade enzimática da GPx e SOD comparada a dos isolados não tratados com fluconazol, não havendo diferença estatística entre isolados sensíveis e resistentes nesses três parâmetros citados. Em relação à enzima GST, os isolados sensíveis mostraram maior atividade enzimática comparada aos resistentes, e quando as células sensíveis foram tratadas com fluconazol, a atividade da GST diminuiu. O fluconazol não induziu dano oxidativo em proteínas e em lipídeos, entretanto foi observado dano oxidativo ao DNA. Diante disso, sugere-se que o fluconazol gera ERO como parte do seu mecanismo antifúngico em C. glabrata em fase de crescimento estacionário, induzindo dano oxidativo no DNA. Como resposta, observa-se aumento na atividade enzimática da SOD e da GPx na levedura. O entendimento da resposta antioxidante de leveduras patogênicas tem importante interesse clínico, uma vez que o desenvolvimento racional de novas drogas antifúngicas requer conhecimento do metabolismo fúngico. / The participation of reactive oxygen species (ROS) in azoles antifungal mechanism of action has been suggested, as well as the relation between antifungal resistance and oxidative stress response. However, data are still inconclusive and differ between microorganisms. This study presents the results of ROS generation by fluconazole in fluconazole-susceptible and resistant C. glabrata strains and their antioxidant response. It was evaluated whether fluconazole generates ROS in those isolates treated and untreated with fluconazole at sub-inhibitory concentration according to their minimal inhibitory concentration (MIC). This treatment was conducted until stationary growth phase was reached. Subsequently, the antioxidant defenses glutathione peroxidase (GPx), superoxide dismutase (SOD), glutathione-S-transferase (GST), consumption of hydrogen peroxide and total glutathione, the possible oxidative damage in lipids, proteins and nucleic acids and the levels of nitrites and nitrates were analyzed. Results showed increased ROS generation in fluconazole-susceptible and resistant C. glabrata strains treated with fluconazole, and also higher GPx and SOD enzymatic activity, compared to untreated cells. No statistical difference of those three parameters was observed between susceptible and resistant strains. In relation to GST, susceptible strains demonstrated higher activity compared to the resistant ones, and when susceptible cells were treated with fluconazole the GST activity decreased compared to untreated. Fluconazole did not induce oxidative damage in proteins and in lipids, however oxidative DNA damage was observed. Therefore, it is suggested that fluconazole generates ROS as part of its antifungal mechanism in C. glabrata at stationary growth phase, inducing oxidative DNA damage. In response, there was increase in the enzymatic activity of SOD and GPx in yeast. The understanding of the pathogenic yeast antioxidant response has important clinical interest, since the rational development of new antifungal drugs requires knowledge about the fungal metabolism.

A própolis é um material resinoso coletado pelas abelhas de diversas partes das plantas como brotos, folhas jovens e exsudatos. É utilizado para embalsamar animais que tenham morrido dentro da colmeia, vedar as paredes e conferir proteção frente a doenças. O emprego desse produto natural com finalidade medicinal remonta a antiguidade, tendo iniciado junto com antigas civilizações como a Egípcia, Grega e Romana e perduram até os dias atuais com ampla utilização em múltiplas finalidades terapêuticas médicas e veterinárias. O objetivo desse trabalho foi avaliar o potencial antifúngico, a capacidade de remover e inibir biofilmes de espécies de Candida não-albicans de diferentes tipos de própolis e analisar a composição química da própolis obtida do Rio Grande do Sul (RS). Foram realizadas macerações e extrações sequenciais com solventes em ordem crescente de polaridade a fim de purificar os extratos. Em seguida foi feita a determinação da atividade antifúngica pelo método da microdiluição em caldo e o ensaio de remoção e inibição de biofilmes através de teste em corpo de prova (utilizando cateter como material teste). Após, foi realizada a análise química da fração diclorometano de própolis obtida do RS. De modo geral, os extratos e frações de própolis vermelha e própolis nativa do RS demonstraram forte atividade anti-Candida frente às leveduras testadas e significativa capacidade de remoção de seu biofilme aderido em cateteres, como corpo de prova. A própolis verde apresentou baixo espectro de ação antifúngica. A análise química da fração diclorometano de própolis obtida do RS levou ao isolamento dos flavonoides pinocembrina, pinostrobina e pinostrobina chalcona. Os resultados evidenciam o potencial da própolis nativa do RS e da própolis vermelha para o desenvolvimento de novos agentes antifúngicos e desinfetantes contra Candida não-albicans. / Propolis is a resinous material collected by bees from various plant parts such as buds, young leaves and exudates. It is used to embalm animals that have died inside the hive, seal the walls and confer protection against the disease. The use of this natural product with medicinal purposes dates back to antiquity, having started with ancient civilizations as the Egyptian, Greek and Roman, and lasted to the present day with extensive use in multiple medical and veterinary therapeutic purposes. The aim of this study was to evaluate the antifungal potential, the ability to remove and inhibit biofilms of Candida non-albicans of different types of propolis and analyze the chemical composition of propolis obtained from Rio Grande do Sul (RS). Maceration and sequential extractions with solvents in order of increasing polarity were performed to purify the extracts. Then the antifungal activity was determined by the method of broth microdilution testing and removal and inhibition of biofilms through test of body of proof (catheter using as test material). After, the chemical analysis of the dichloromethane fraction of propolis obtained in RS was performed. In general, the extracts and fractions of propolis of RS demonstrated strong anti-Candida activity across the tested yeasts and significant capacity removal of biofilm attached in catheter, as test body. The green propolis had low action spectrum antifungal. Chemical analysis of the dichloromethane fraction of propolis native to RS led to the isolation of the flavonoids pinocembrin, chalcone pinostrobin and pinostrobin. The results show the potential of the RS native propolis and red propolis for the development of new antifungal agents and disinfectants against non-albicans Candida.