Thesis (Ph. D.)--Medical University of South Carolina, 1998. / Includes bibliographical references.

The fungal infections are becoming an important cause of morbidity and mortality in immunocompromised patients. Here we have studied the activity of new antifungal agents as ravuconazole, albaconazole, micafungin as well as fluconazole tpathogenic yeasts as Candida albicans, Candida dubliniensis, Candida tropicalis, Candida lusitaniae, Candida glabrata and Candida krusei. We have also included clinical and environmental isolates of Cryptococcus neoformans. The susceptibilities tests indicated that the majority of the strains were sensible to the antifungal agents studied but Candida albicans (6.6%) and C.tropicalis (3.3%) were classified as resistant to fluconazole. These results show the importance of monitoring of the susceptibility in yeast like fungi from clinical source and emphasize that new and constant susceptibility studies deserve be applied to Candida and Cryptococcus neoformans to reduce the mortality among immunocompromised patients. / As infecções fúngicas têm-se tornado uma importante causa de morbidade e mortalidade em pacientes, principalmente os imunocomprometidos. Na tentativa de se transpor esta realidade, têm-se buscado estabelecer e avaliar novas drogas antifúngicas eficazes e com melhor tolerabilidade e segurança. O presente estudo foi objetivado a verificar a atividade dos triazólicos fluconazol, ravuconazol e albaconazol e da micafungina, frente a um banco de fungos leveduriformes incluindo as espécies C.albicans, C. dubliniensis, C. tropicalis, C. lusitaniae, C. glabrata e C. krusei, todas de origem clínica e Cryptococcus neoformans de origens clínica e ambiental. De modo geral, as espécies de Candida spp. e Cryptococcus foram sensíveis aos antifúngicos testados, com exceção da Candida albicans e Candida tropicalis frente ao fluconazol, onde 6,6% e 3,3%, respectivamente dos isolados, foram resistentes a este azólico. Estes resultados demonstram a necessidade de uma constante vigilância da suscetibilidade dos fungos e maiores pesquisas em relação às drogas antifúngicas, pois, desta forma, estaremos contribuindo para a menor morbidade e maior sobrevida dos pacientes.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Widespread and prolonged usage of azoles in recent years has led to the rapid development of drug resistance in Candida species. In Candida albicans, resistance to fluconazole causes cross-resistance to other antifungals and an increase in virulence, making treatment still more difficult because of the limited therapeutical options. Nonetheless, other species has emerged as significant pathogens of clinical importance. Fluconazole resistance has been clinically described in Candida dubliniensis isolates and it is easily induced by in vitro exposure to the drug, but little is known about its consequences. In the present study, two groups of C. dubliniensis isolates were evaluated and compared in some points with the closely related species, C. albicans. One group was composed by fluconazole-susceptible clinical isolates and the other was composed by fluconazole-resistant laboratory derivatives from the former, in order to examine the changes on phenotypic characteristics and antifungal susceptibility accompanying the development of resistance to fluconazole. Resistant derivatives showed minimal inhibitory concentrations equal or higher than 64 μg/mL and proved to keep most of phenotypic characteristics that were tested before resistance was induced. However, some strains were not found to produce pseudomycelia and chlamydospores. Against killer toxins, C. dubliniensis did not present biotypes enough to permit its differentiation from C. albicans. On the other hand, when proteinase activity was evaluated, C. albicans activity was significantly higher than C. dubliniensis . Resistant derivatives of C. dubliniensis showed proteinase activity similar to fluconazole-susceptible isolates, suggesting that fluconazole resistance may not necessarily result on an increase of virulence in this species. Partial atmosphere of CO2, fluconazole at subinhibitory concentrations, or combination of both conditions, as well as addition of antiretrovirals on induction culture medium did not influence on proteinase activity of C. albicans and C. dubliniensis isolates. Finally, fluconazole-resistant isolates showed cross-resistance with ketoconazole, itraconazole, ravuconazole and terbinafine. In addition, associations of amphotericin B or terbinafine with azoles resulted mainly on indifferent interactions. On fluconazole-susceptible isolates, the most positive interaction came from association of amphotericin B with voriconazole. When resistance was induced, the best activity was found when terbinafine was combined with itraconazole. / O uso prolongado e indiscriminado dos azólicos nos últimos anos permitiu um rápido desenvolvimento de resistência aos fármacos nas espécies de Candida. Em Candida albicans, a resistência ao fluconazol causa resistência cruzada a outros antifúngicos e aumento na virulência, tornando o tratamento ainda mais complicado por causa das opções terapêuticas limitadas. Ainda assim, outras espécies emergiram como patógenos significantes de importância clínica. A resistência ao fluconazol tem sido clinicamente descrita em isolados de Candida dubliniensis e é facilmente induzida pela exposição in vitro ao azólico, mas pouco se conhece sobre suas conseqüências. No presente estudo, dois grupos de isolados de C. dubliniensis foram avaliados e comparados em alguns aspectos com C. albicans. Um grupo era composto de isolados clínicos sensíveis ao fluconazol, e o outro, derivado do primeiro, era composto de isolados resistentes, com o intuito de analisar as alterações nas características fenotípicas e na suscetibilidade aos antifúngicos que acompanham o desenvolvimento de resistência ao fluconazol. Os derivados resistentes obtidos evidenciaram concentrações inibitórias mínimas maiores ou iguais a 64 μg/mL e mantiveram grande parte das características fenotípicas avaliadas anteriormente à indução da resistência. Entretanto, apenas o Ágar Suco de Tomate permitiu a identificação dessas estruturas em 100% dos isolados resistentes. Diante das toxinas killer , C. albicans e C. dubliniensis exibiram biotipos incapazes de permitir a diferenciação entre as espécies. Por outro lado, quando avaliada a atividade de proteinase, a de Candida albicans foi significativamente maior do que a de C. dubliniensis. Os derivados resistentes de C. dubliniensis evidenciaram atividade de proteinase semelhante a dos isolados sensíveis ao fluconazol, sugerindo que a resistência ao antifúngico pode não necessariamente acarretar aumento de virulência na espécie. Microaerofilia, fluconazol a concentrações subinibitórias, ou a combinação dessas duas condições, bem como a adição de anti-retrovirais ao meio de indução da enzima não exerceram influência sobre a atividade de proteinase em C. albicans e C. dubliniensis. C. dubliniensis resistentes ao fluconazol evidenciaram resistência cruzada com cetoconazol, itraconazol, ravuconazol e terbinafina. Em adição, as associações de anfotericina B ou terbinafina com azólicos resultaram principalmente em interações indiferentes. Em isolados sensíveis, a interação mais positiva resultou da associação de anfotericina B com voriconazol. Quando a resistência foi induzida, a melhor atividade foi encontrada quando a terbinafina foi combinada com itraconazol.

A proteômica é uma técnica muito importante e amplamente utilizada na elucidação de diversos mecanismos biológicos. Essa técnica pode ser usada, por exemplo, na avaliação da resposta celular a estímulos ou na determinação de modificações proteicas resultantes de um tratamento. Neste trabalho, a abordagem proteômica foi utilizada em dois sistemas diferentes: (1) na elucidação da resposta à luz no fungo Metarhizium acridum e (2) na determinação dos danos proteicos causados pelo tratamento fotodinâmico da levedura Candida albicans. (1) O fungo entomopatogênico M. acridum, quando crescido na presença de luz, produz conídios com elevada tolerância à radiação ultravioleta-B (290-315 nm). Essa elevada resistência é altamente desejada para aplicação de M. acridum no controle biológico de pragas na agricultura. É possível que esse fenômeno seja decorrente do acúmulo diferencial de proteínas nos conídios produzidos na presença de luz em comparação com aqueles produzidos no escuro. Assim, foi utilizada uma abordagem proteômica para determinar quais proteínas poderiam estar diferencialmente acumuladas nos conídios. Os resultados mostraram que, de um total de 501 proteínas identificadas, somente quatro estavam diferencialmente acumuladas. Apesar de não ser possível estabelecer uma relação clara entre o acúmulo dessas proteínas e a elevada tolerância à radiação ultravioleta-B, dados de proteínas homólogas em Aspergillus fumigatus obtidos da literatura mostraram que essas proteínas são reguladas em condições de estresse. Adicionalmente, experimentos foram conduzidos para expandir o conhecimento sobre a fotobiologia de M. acridum. Estabeleceu-se que, dentro do espectro da luz visível, a luz azul é responsável por induzir o aumento da tolerância à radiação ultravioleta-B, enquanto a luz vermelha não produz o mesmo resultado. Conclui-se que o estudo da resposta à luz através da proteômica de conídios requer o uso de técnicas que resultem na identificação de uma fração maior do proteoma, já que o acúmulo diferencial de proteínas aparentemente não envolve as proteínas mais abundantes. (2) Candida albicans é um importante patógeno humano responsável por micoses superficiais e sistêmicas, principalmente em indivíduos imunocomprometidos. O uso contínuo dos fungicidas tradicionais vem resultando na seleção de linhagens tolerantes. Nesse cenário, o tratamento fotodinâmico antimicrobiano surgiu como importante alternativa no tratamento das micoses causadas por C. albicans. Apesar da efetividade desse tratamento ter sido observada em diversos trabalhos, um estudo no nível proteico ainda não havia sido realizado. A abordagem proteômica por eletroforese bidimensional revelou que, após o tratamento das células, muitos spots nos géis sofreram um desvio ácido, ou seja, um deslocamento para regiões de menor ponto isoelétrico. Por outro lado, foram observados spots resistentes a essa modificação. Proteínas pertencentes a ambos os grupos foram identificadas por espectrometria de massas. A análise de aminoácidos mostrou que o conteúdo de histidina nas células de C. albicans foi reduzido em aproximadamente 60% após o tratamento, o que é uma possível explicação para o desvio ácido observado. Conclui-se, após extensa revisão e discussão da literatura, que os danos em proteínas dependem da interação entre proteína e fotossensibilizador e também da presença de aminoácidos fotooxidáveis nas proximidades dos sítios de interação. / Proteomics is a very important and largely employed technique for the elucidation of a series of biological mechanisms. This technique can be used, for instance, on the evaluation of cellular responses to stimulus or in determining protein modification resulting from a treatment. In the present work, a proteomic approach was used in two distinct biological systems: (1) to evaluate the light response in the fungus Metarhizium acridum, and (2) to determine the protein damage resulting from photodynamic treatment of the yeast Candida albicans. (1) The entomopathogenic fungus M. acridum, when grown in the presence of light, produces conidia with increased tolerance to ultraviolet-B radiation (290-315 nm). This increased resistance is desired for the application of this fungus on the biological control of agricultural pests. It is possible that this phenomenon results from the differential accumulation of proteins in conidia produced in the presence of light as compared to those produced in the dark. Therefore, a proteomic approach was used to determine which proteins could be differentially accumulated in conidia. The results showed that, out of a total of 501 identified proteins, only four were found to be differentially accumulated. Even though establishing a direct relationship between the observed accumulation and the increased tolerance to ultraviolet-B radiation was not possible, data from the literature on homolog proteins in Aspergillus fumigatus have shown that these proteins are regulated under stress conditions. Additionally, experiments were performed to gain further insight on the photobiology of M. acridum. It was stablished that, within visible light spectrum, blue light is responsible for inducing the increased tolerance to ultraviolet-B, while red light does not produce the same effect. It is concluded that a light-response study employing proteomics should rely on techniques yielding a higher number of identified proteins, as the differential accumulation does not seem to affect high abundance proteins. (2) Candida albicans is an important human pathogen responsible for superficial and systemic mycoses mainly in immunocompromised patients. The continuous use of the traditional fungicides has resulted in the selection of tolerant strains. In this scenario, antimicrobial photodynamic treatment became an important alternative on the treatment of C. albicans infections. Although the effectiveness of this treatment has been observed in multiple studies, an evaluation at the protein level had not been performed. A proteomic approach by two-dimensional electrophoresis revealed that, after cell treatment, many spots underwent an acidic shift, that is, a shift towards lower isoelectric point. On the other hand, protein spots resistant to modification were also observed. Proteins belonging to both groups were identified by mass spectrometry. Amino acid analysis revealed that the histidine content in C. albicans cells decreased by up to 60% after the treatment, which is a possible explanation to the observed acidic shift. It is concluded, after extensive literature review and discussion, that protein damage depends on protein-photosensitizer interaction and also on the presence of photooxidazible amino acids in the proximity of the interaction site.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:28:55Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-03-16Bitstream added on 2014-06-13T20:18:33Z : No. of bitstreams: 1 dovigo_ln_me_arafo.pdf: 987871 bytes, checksum: 23bc47899d421f6557ae321ff6536498 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O surgimento da resistência antifúngica aos tratamentos convencionais tem proporcionado o desenvolvimento de novas modalidades terapêuticas para o tratamento da candidose bucal. Nesse contexto, a utilização da PDT vem sendo sugerida como método alternativo para a inativação de microrganismos patogênicos. Este estudo avaliou a efetividade da PDT na inativação de C. albicans e C. glabrata, ATCC e resistente a fluconazol, por meio da utilização do e da iluminação com LEDs de agente fotossensibilizador Photogem® comprimento de onda azul. Inicialmente, os microrganismos avaliados foram inoculados em tubos de ensaio contendo meio de cultura líquido e incubados overnight a 37ºC. Em seguida, foram obtidas suspensões celulares das espécies de Candida avaliadas. Essas suspensões foram transferidas para placas de 96 orifícios, tratadas com cinco diferentes concentrações de Photogem® (2,5; 5; 10; 25 e 50mg/L) e expostas a quatro doses de luz (10,5; 18; 25,5 e 37,5J/cmø). Suspensões adicionais foram tratadas somente com as cinco concentrações do fotossensibilizador ou apenas com as quatro doses de luz. Cada condição experimental foi realizada três vezes. Após a realização desses experimentos, foram obtidas diluições seriadas de cada amostra (10-1 a 10-3 ), e alíquotas de 25 æL dessas diluições foram plaqueadas, em triplicatas, em Sabouraud Dextrose Agar. Adicionalmente, alíquotas de 25 æL foram removidas das cavidades das placas de orifícios e transferidas diretamente para um quadrante da placa de Petri, sem a realização de diluição. As placas foram incubadas a 37ºC por 48 horas. Após a incubação, foi realizada a contagem das colônias viáveis (ufc/mL), e os valores obtidos foram analisados com o teste t de Student (p < 0,05). / Oral candidosis is an opportunistic infection that affects a significant percentage of the population. The oral infection caused by Candida spp. is usually treated with topical and systemic antifungal drugs. However, the widespread use of these agents has resulted in an alarming increase in the rate of antifungal resistance. Recently, the photodynamic therapy (PDT) has been studied as an alternative modality of killing microorganisms, including viruses, fungi and bacteria. The aim of this study was to determine whether Candida albicans and C. glabrata, ATCC and fluconazole-resistant strains, could be photosensitized by Photogem® in combination with blue Light Emitted Diode (LED). Suspensions of each Candida strain, containing 106 viable cells per milliliter, were treated with five concentrations of Photogem® (2.5, 5, 10, 25 and 50 mg/l), followed by LED irradiation in four light doses (10.5, 18, 25.5 and 37.5 J/cm2). Each experimental condition was carried out in triplicate and repeated tree times. From each sample, serial dilutions were obtained and aliquots of 25 æl of each dilution were plated on Sabouraud Dextrose Agar. All plates were incubated at 37°C for 48 hours. After incubation, colonies were counted (CFU/ml) and the data were statistically analyzed by the Student's t test (p < 0.05). The results demonstrated a concentration/dose-dependent pattern of inactivation, that resulted in complete elimination of all Candida evaluated. The minimal light dose for the complete inactivation of both C. albicans source was 18 J/cmø, in conjunction with 50 mg/l of Photogem®. After 25.5 and 37.5 J/cmø, a lower concentration of Photogem® was required to totally inactivate C. albicans ATCC (5 and 2.5 mg/l) in comparison with C. albicans luconazole-resistant (10 and 5 mg/l). (Complete abstract, clik electronic access below)

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:28:56Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-06-17Bitstream added on 2014-06-13T19:58:19Z : No. of bitstreams: 1 andrade_mc_me_arafo.pdf: 1842420 bytes, checksum: 8ab56a86c157ba82b8e80912d3966136 (MD5) / O surgimento da resistência antifúngica aos tratamentos convencionais tem exigido o desenvolvimento de novas modalidades terapêuticas para o tratamento da candidíase bucal. Nesse contexto, a Terapia Fotodinâmica (Photodynamic Therapy – PDT) tem sido sugerida como método alternativo para a inativação de microorganismos patogênicos. O sucesso da PDT depende, dentre outros fatores do tempo de pré-irradiação (TPI), que é o tempo em que o fotossensibilizador (FS) permanece em contato com os micro-organismos previamente à iluminação. O objetivo deste estudo foi avaliar a efetividade da PDT mediada pela curcumina (Cur), associando diferentes TPIs, concentrações e doses de luz, na redução da viabilidade celular de três espécies de Candida ATCC (C. albicans ATCC 90028; C. glabrata ATCC 2001; C. dubliniensis ATCC 7987), em culturas planctônicas e biofilmes. A Cur foi ativada por um aparelho de LED (luz emitida por diodo) que emite luz no espectro azul, com comprimento de onda predominante de 455 nm. Inicialmente, suspensões celulares padronizadas dos micro-organismos foram transferidas para placas de 96 orifícios, e tratadas com três diferentes concentrações de Cur (5, 10 e 20 YM), ou mantidas nos poços por 48 horas para formação dos biofilmes, seguida de tratamento com outras três concentrações de Cur (20, 30 e 40 YM). As culturas celulares foram deixadas em contato com a Cur por 1, 5, 10 ou 20 minutos, anteriormente à iluminação. Em seguida, as culturas planctônicas foram expostas à dose de luz de 5,28 J/cm2. Os biofilmes, por sua vez, foram tratados com duas doses de luz (5,28 e 10,56 J/cm2). Suspensões/biofilmes adicionais foram tratados somente com as três concentrações de Cur (pelo maior tempo usado em cada estudo) ou apenas com a maior dose de luz. Amostras controle não foram tratadas com Cur e não receberam luz. Após a PDT, as suspensões celulares... / The emergence of antifungal-resistant yeasts to conventional therapy has demanded the development of new therapy modalities against oral candidiasis. On this context, Photodynamic Therapy (PDT) has been suggested as a possible alternative treatment for inactivation of pathogenic microorganisms. PDT success depends, among other factors, on the pre-irradiation time (PIT). The aim of this study was to evaluate the effectiveness of curcumin (Cur)-mediated PDT associating different PITs, Cur concentrations and light doses, against planktonic and biofilm cultures of three different Candida species (C. albicans ATCC 90028; C. glabrata ATCC 2001; C. dubliniensis ATCC 7987). Cur was activated by a LED (light emitting diode) device, which emits light on the blue spectrum, with predominant wavelength at 455 nm. Standardized cell suspensions were treated with three different concentrations of Cur (5, 10 e 20 YM), or kept into the wells for 48 hours to allow adhesion and biofilm formation. The biofilms were treated with other three different concentrations of Cur (20, 30 e 40 YM). The cultivated fungus (planktonic and biofilms) were maintained in the dark in contact with the PS for either 1, 5, 10 or 20 minutes before irradiation. The suspensions were exposed to LED light dose of 5.28 J/cm2, while the biofilms were exposed to either 5.28, or 10.56 J/cm2. Additional samples of suspensions/biofilms were treated only with the three Cur concentrations (for the highest incubation period used in the study), without illumination, or only with the highest light dose, without Cur. Control samples had neither light nor Cur. After PDT, suspensions were plated on Sabouraud Dextrose Agar (SDA) in duplicate, while biofilm results were read using the XTT-salt reduction method. The results for the planktonic cultures were statistically analyzed by Kruskal-Wallis and Dunn, while for the biofilms, analysis of variance... (Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:28:57Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-02-08Bitstream added on 2014-06-13T19:37:36Z : No. of bitstreams: 1 takamiya_as_me_araca.pdf: 2744019 bytes, checksum: 436939ec1fb2e59f419b688a517c064c (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O objetivo do presente estudo foi verificar a atividade antimicrobiana de uma resina acrílica à base de poli (metil metacrilato) (PMMA) contendo nanopartículas de prata frente ao microorganismo Candida albicans. Utilizou-se a resina acrílica termopolimerizável Lucitone 550 e as nanopartículas de prata foram sintetizadas por meio da redução dos íons prata do nitrato de prata pelo citrato de sódio. A forma e o tamanho das partículas foram confirmados por microscopia eletrônica de varredura (MEV) e de transmissão (MET), tendo-se obtido partículas na forma esférica e com tamanhos médios de 5 e 10 nm. A resina acrílica foi proporcionada de acordo com as instruções do fabricante e a solução coloidal de nanopartículas de prata foi adicionada ao componente líquido da resina acrílica nas concentrações de 0,05%, 0,5% e 5% baseadas na massa do polímero. Após o processamento, os espécimes foram esterilizados por radiação de Co-60. Foram analisados a adesão de microorganismos à superfície do poli (metil metacrilato)/prata (PMMA/Ag) e a formação de biofilme por Candida albicans sobre a superfície polimérica através de microscopia de luz e de MEV. Os resultados mostraram redução estatisticamente significante (P < 0,05) da adesão de microorganismos à superfície do nanocompósito para os grupos com 0,05 e 0,5% de nanopartículas de prata com tamanho de 5nm quando comparados ao grupo controle. A microscopia de luz nãomostrou diferença na formação de biofilme entre os grupos dos nanocompósitos e o grupo controle. A MEV sugeriu uma redução na quantidade de células na superfície dos grupos contendo nanopartículas de prata, especialmente até 12 horas de crescimento fúngico. Os resultados sugerem ação inibitória sobre a adesão e formação de biofilme por Candida albicans quando da adição de nanopartículas de prata de tamanho 5 nm à resina acrílica nas concentrações de 0,05% e 0,5% / The aim of this study was to verify the antimicrobial activity of a poly (methyl methacrylate) acrylic resin containing silver nanoparticles against Candida albicans microorganism. The heat-polymerized acrylic resin Lucitone 550 was used and the silver nanoparticles were synthesized through the reduction of silver ions of silver nitrate by sodium citrate. The shape and size of the particles were confirmed by scanning electron microscopy (SEM) and transmission electron microscopy (TEM), and showed spherical particles with medium size of 5 and 10 nm. The acrylic resin was proportioned according to the manufacturer’s instructions and the silver nanoparticles colloid solution was added to the liquid of the acrylic resin in 0.05%, 0.5% and 5% of concentration based on the polymer mass. After being processing, the specimens were sterilized by Co-60 radiation. The adhesion of cells of Candida albicans and the biofilm formation on the surface of the polymer were evaluated by light microscopy and SEM. The results demonstrated significantly reduction (P < .05) of the microorganisms adhesion on the surface of the nanocomposites for the groups containing 0.05 and 0.5% of silver nanoparticles with size of 5nm when compared to the control group. The light microscopy did not show difference in the biofilm formation among the groups evaluated. The SEM images suggested reduction of growth of Candida albicans cells for the nanocomposite groups, mainly up to the period of 12 hours. It was concluded that the addition of silver nanoparticles with size of 5 nm to the PMMA in 0.05% and 0.5% concentrations showed antimicrobial effect against Candida albicans

Made available in DSpace on 2015-05-14T12:56:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 1778703 bytes, checksum: fdc31d949eee563ab3213db7eec3ac95 (MD5) Previous issue date: 2014-02-26 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The Cinnamomum zeylanicum Blume leaf (Cinnamon) essential oil has been reported in the literature by presenting antifungal activity against Candida species. This study aimed to verify the in vitro antifungal activity of a Cinnamomum zeylanicum Blume leaf essential oil based mouthwash, in addition to changes in roughness and hardness caused by it in thermopolymerizable acrylic resin. Further evaluation of the safety and tolerability of the test product was seeked through a phase I clinical trial involving users of removable dentures. For this to happen, the determination of the Minimum Inhibitory Concentration (MIC) and Minimum Fungicidal Concentration (MFC) on twelve strains of Candida, using the technique of Sabouraud Dextrose Broth microdilution (CSD) and subculture on Sabouraud Dextrose Agar (SDA), respectively. For microhardness tests and surface roughness, 30 specimens were made in thermopolymerizable acrylic resin (Vip Flash, Ltda. São Paulo, SP, Brazil), divided into three groups of n = 10. Group I remained in artificial saliva during the test, while groups II and III remained for 1 minute, 3 times a day, in their corresponding solutions (mouthwash and nystatin, respectively), returning to neutral artificial saliva during 15 days. Roughness measurements (SJ-201 Minutayo, Kawasaki, Japan) and microhardness (Shimadzu, Kyoto, Japan) were performed (24 hours before and 24 hours after the start and end of the test) to obtain data on the roughness and microhardness (25g / 30s), which were submitted to ANOVA and followed by Tukey post-test (&#945; = 5%). For the phase I clinical trial, 15 healthy patients using a C. zeylanicum mouthwash in CIM (15 days, 3 times a day) were submitted to clinical and mycological examinations before and after the intervention. The essential oil of C. zeylanicum showed anti-Candida activity on the 12 strains tested, with an MIC = 625.0&#956;g/mL equivalent to CFM. All groups experienced an increase in roughness after the intervention (p <0.0001). The test product group (GII) suffered alteration (&#916;Ra) of 0.40&#956;m, not statistically different from the group that remained immersed in saliva (GI) whose value was &#916;Ra 0.39&#956;m. Nystatin (GIII) showed the largest increase in roughness (&#916;Ra = 0.50&#956;m) compared to GI and GII (p <0.0001). Regarding hardness, nystatin also promoted a greater decrease (&#916;M = -3.62VHN) compared to saliva (&#916;M = -2.57VHN) and mouthwash, which promoted change of -2.12VHN (p <0.0001). Regarding the clinical stage of phase 1, there were no adverse clinical signs after the intervention, or relevant reports indicating that suspension of use. The mouthwash showed antifungal activity against all tested strains and promoted minor variation of roughness and hardness of acrylic resin compared to positive control (nystatin). These factors combined with the absence of adverse effects in humans make it possible to consider, in this study, satisfactory safety and tolerability of the tested substance, supporting new advances involving the clinical use of C. zeylanicum Blume essential oil. / O óleo essencial das folhas de Cinnamomum zeylanicum Blume (Canela) tem sido reportado pela literatura por apresentar atividade antifúngica sobre espécies de Candida. Objetivou-se verificar, in vitro, a atividade antifúngica de um enxaguatório bucal a base do óleo essencial das folhas de Cinnamomum zeylanicum Blume, além de alterações de rugosidade e microdureza provocadas pelo mesmo em resina acrílica termopolimerizável. Buscou-se ainda avaliar a segurança e tolerabilidade do produto-teste através de um ensaio clínico fase I envolvendo usuários de próteses removíveis. Para tal procedeu-se com a determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) e da Concentração Fungicida Mínima (CFM) sobre doze cepas de Candida, utilizando-se a técnica da microdiluição em Caldo Sabouraud Dextrose (CSD) e subcultivo em Ágar Sabouraud Dextrose (ASD), respectivamente. Para os ensaios de microdureza e rugosidade superficial foram confeccionados 30 corpos de prova em resina acrílica termopolimerizável (Vip Flash, Ltda. São Paulo, SP, Brasil), divididos em três grupos de n=10. O grupo I manteve-se em saliva artificial durante o ensaio, enquanto os grupos II e III, permaneceram durante 1 minuto, 3 vezes ao dia, em suas soluções correspondentes (enxaguatório bucal e nistatina, respectivamente), retornando à saliva artificial neutra, durante 15 dias. Medições em rugosímetro (SJ-201 Minutayo, Kawasaky,Japão) e microdurômetro (Shimadzu, Kyoto, Japão) foram realizadas (24h antes e 24h após o início e término do ensaio) para obtenção dos dados relativos à rugosidade e microdureza Vickers (25g/30s), os quais foram submetidos à análise de variância ANOVA e pós-teste de Tukey (&#945;=5%). Para o ensaio clínico fase I, 15 pacientes saudáveis utilizaram um enxaguatório bucal de C. zeylanicum na CIM (15 dias, 3 vezes ao dia) sendo submetidos à exames clínico e micológico antes e após a intervenção. O óleo essencial de C. zeylanicum apresentou atividade anti-Candida sobre as 12 cepas testadas, sendo a CIM = 625,0&#956;g/mL equivalente à CFM. Todos os grupos sofreram aumento da rugosidade após a intervenção (p<0,0001). O grupo referente ao produto-teste (GII) sofreu alteração (&#916;Ra) de 0,40&#956;m, não diferindo estatisticamente do grupo que permaneceu imerso em saliva (GI) cujo valor de &#916;Ra foi de 0,39&#956;m. A nistatina (GIII) promoveu maior aumento da rugosidade (&#916;Ra=0,50&#956;m), quando comparada a GI e GII (p<0,0001). Em relação à microdureza, a nistatina também promoveu uma maior diminuição (&#916;M=-3,62VHN), quando comparada à saliva (&#916;M=-2,57VHN) e ao enxaguatório, que promoveu alteração de - 2,12VHN (p<0,0001). Em relação à etapa clínica de fase I, não houve sinais clínicos adversos após a intervenção, nem relatos relevantes que indicassem suspensão do uso. O enxaguatório apresentou atividade antifúngica sobre todas as cepas testadas e promoveu menor alteração de rugosidade e microdureza em resina acrílica se comparada ao controle positivo (nistatina). Tais fatores aliados à ausência de efeitos adversos em humanos permitem considerar, neste estudo, a segurança e a tolerabilidade da substância testada satisfatórias, subsidiando novos avanços envolvendo a utilização clínica do óleo essencial da C. zeylanicum Blume.

Made available in DSpace on 2015-05-14T12:56:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 2062730 bytes, checksum: f8aa4f1dba574b15daf66619df74d887 (MD5) Previous issue date: 2013-12-12 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Candida albicans is a yeast that lives harmlessly on various parts of the human body, including the oral cavity, however, under certain circumstances, may cause superficial infections of the mucous membranes, such as denture stomatitis, in which a biofilm of Candida is formed on the acrylic surface of dentures. Thymol is a phenolic terpene found in several plant species, which has antimicrobial activity against oral microorganisms such as Candida albicans, since it can significantly interfere with fungal biofilm formation and inhibit the metabolic activity of these microorganisms by direct action on cell membrane. This study evaluated through fluorescence technique the cell viability of Candida albicans biofilms under the antifungal activity of thymol. It was used strains of Candida albicans (ATCC® 11006 ). The minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum fungicidal concentration (MFC) of the antifungal drugs (miconazole and thymol) were determined by microdilution tests in Sabouraud dextrose broth. The drugs were prepared in dimethylsulfoxide (DMSO) and the inoculum was standardized to correspond to 0.5 of McFarland s scale (106 UFC/mL). Biofilms of Candida albicans were grown, from Sabouraud broth supplemented with 10% dextrose, on the surface of acrylic resin disks in parallel flow chambers and, after 12 hours of biofilm formation in a continuous flow system, it was exposure to the antifungal agents, being evaluated periods of 5, 15 and 30 minutes. For counting of colony-forming units, the fungal solution was sequentially diluted and plated on Sabouraud dextrose agar. Cell viability was quantified by fluorescence by mixing SYTO 9 and Propidium Iodide dyes. Data were evaluated by analysis of variance (ANOVA), Tukey's test and t-test at 5% probability. Biofilms treated with thymol showed, on the three incubation times evaluated, low percentage numbers of viable cells detected by fluorescence technique, and the average of the three incubation times between miconazole and thymol were not statistically different (p&#707; 0.05), demonstrating that both drugs possess equivalent efficiency, taking into account their respective minimum fungicidal concentrations. It was possible to prove that both methodologies used to quantify fungal cells showed to be strongly correlated. / Candida albicans trata-se de um fungo comensal que habita inofensivamente nichos de várias partes do corpo humano, incluindo a cavidade oral, no entanto, sob certas circunstâncias, pode causar infecções superficiais das mucosas, como a estomatite protética, na qual um biofilme de Candida é formado sobre a superfície acrílica das próteses dentárias. O timol é um terpeno fenólico encontrado em diversas espécies vegetais e que possui atividade antimicrobiana frente a microrganismos orais, tal como Candida albicans, pois é capaz de interferir de forma significativa com a formação de biofilmes fúngicos, uma vez que inibe a atividade metabólica destes microrganismos por ação direta na membrana celular. Este estudo objetivou avaliar através de técnica de fluorescência a viabilidade celular de biofilmes de Candida albicans frente à ação antifúngica do timol. Foram utilizadas cepas de Candida albicans (ATCC® 11006 ). A concentração inibitória mínima (CIM) e a concentração fungicida mínima (CFM) dos agentes antifúngicos (timol e miconazol) foram determinadas através de testes de microdiluição em caldo Sabouraud dextrose, sendo as drogas preparadas em dimetilsulfóxido (DMSO) e o inóculo padronizado para corresponder a 0,5 da escala de McFarland (106 UFC/mL). Os biofilmes de Candida albicans foram cultivados sobre a superfície de discos de resina acrílica, nas células paralelas de fluxo, a partir de caldo Sabouraud suplementado com 10% de dextrose, e, após 12 horas de formação do biofilme no sistema de fluxo contínuo, foi realizada a exposição aos agentes antifúngicos, sendo avaliados períodos de 5, 15 e 30 minutos. Para contagem das unidades formadoras de colônia, a solução fúngica foi sequencialmente diluída e semeada em ágar Sabouraud dextrose. A viabilidade celular foi quantificada por fluorescência através da mistura dos corantes SYTO 9 e Iodeto de Propídio. Os valores médios foram submetidos à análise de variância (ANOVA) e ao teste T em nível de 5% de probabilidade. Os biofilmes tratados com o timol apresentaram, nos três tempos de exposição avaliados, baixos números percentuais de células viáveis detectadas através da técnica de fluorescência, e os valores médios dos três tempos de exposição entre miconazol e timol não diferiram estatisticamente (p&#707;0,05), demonstrando que ambas as drogas possuem eficiência equivalente, levando-se em consideração suas respectivas concentrações fungicidas mínimas. Foi possível comprovar ainda que ambas as metodologias utilizadas para quantificação das células fúngicas apresentaram-se fortemente correlacionadas.

Made available in DSpace on 2015-05-14T12:56:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 1501652 bytes, checksum: 4c9d4fada2cc41f87661b7f25404ae20 (MD5) Previous issue date: 2014-02-26 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The study aimed to evaluate the biological activity of the essential oil of Cymbopogon nardus and citronellal phytochemical on Candida strains, checking the possible inhibition of adhesion to dental implants and cover screws. Initially, a screening was performed by the disk diffusion technique in Sabouraud Dextrose Agar (SDA) for the essential oils of Cinnamomum camphora (White Camphor), Melissa officinalis (Lemon Balm), Ocimum basilicum (Basil) and Cymbopogon nardus (citronella), as well as phytochemicals alpha pinene, citral, citronellal and carvacrol. After screening, the essential oil of C. nardus and citronellal were selected because they displayed significant antifungal activity. Then, essential oil was analyzed by Gas chromatography mass spectrometry (GC-MS). Subsequently, were determined MIC and MFC of essential oil and citronellal against 12 strains of Candida and tests of inhibition of adhesion to dental implants and cover screws, using the MIC of substances evaluated, followed by analysis on a Scanning Electron Microscope (SEM). Assays were performed in triplicate and chlorhexidine and nystatin were used as positive control. The data were analyzed on the software GraphPad Prism 4. Analysis of variance (ANOVA) with Tukey s post-test was carried out, with a confidence interval of 95%. The GC-MS analysis of the essential oil identified the major substance as citronellal terpenoid. The essential oil, citronellal, chlorhexidine and nystatin able to inhibit 100% of the strains was 64 &#956;g/mL, 512 &#956;g/mL, 64 &#956;g/mL, 32 &#956;g/mL, respectively. The essential oil inhibited the adhesion of C. albicans in the dental implants and cover screws (p <0.001). Citronellal only inhibited the growth of the strain in dental implants (p <0.001) with no significant results in the cover screws (p> 0.05) compared to the growth control. We conclude that the essential oil of C. nardus and citronellal have antifungal activity and are able to inhibit the in vitro adherence of C. abicans. / O estudo teve como objetivo avaliar a atividade biológica do óleo essencial de Cymbopogon nardus e do fitoconstituinte citronelal sobre cepas de Candida, verificando a possível inibição da aderência aos implantes dentários e cover screws. Inicialmente, foi realizado uma triagem por meio da técnica de disco-difusão em Agar Sabouraud Dextrose (ASD), para os óleos essenciais de Cinnamomum camphora (Cânfora Branca), Melissa officinalis (Erva Cidreira), Ocimum basilicum (Manjericão) e Cymbopogon nardus (Citronela), bem como dos fitoconstituintes alfa pineno, citral, citronelal e carvacrol. Após a triagem, o óleo essencial de C. nardus e o citronelal foram selecionados por terem apresentado expressiva atividade antifúngica. Em seguida, o óleo essencial foi analisado por cromatografia gasosa acoplada ao espectro de massa (GC-MS). Posteriormente, foram determinadas a CIM e CFM do óleo essencial e citronelal frente a 12 cepas de Candida e realizados testes de inibição da aderência aos implantes dentários e cover screws, utilizando-se a CIM das substâncias avaliadas, seguida de análise em Microscópio Eletrônico de Varredura (MEV). Os ensaios foram realizados em triplicata e a nistatina e clorexidina foram utilizadas como controle positivo. Os dados foram analisados no software GraphPad Prism 4. Foi realizada uma análise de variância (ANOVA) com pós-teste de Tukey ao nível de confiança de 95%. A análise por GC-MS do óleo essencial permitiu a identificação do terpenoide citronelal como substância majoritária. A CIM do óleo essencial, citronelal, clorexidina e nistatina capaz de inibir 100% das cepas foi 64 &#956;g/mL; 512 &#956;g/mL; 64 &#956;g/mL; 32 &#956;g/mL, respectivamente. O óleo essencial inibiu a aderência de C. albicans nos implantes dentários e cover screws (p<0,001). O citronelal inibiu apenas o crescimento da cepa nos implantes dentários (p<0,001), não apresentando resultados significantes nos cover screws (p>0,05) em relação ao controle de crescimento. Conclui-se que o óleo essencial de C. nardus e citronelal possuem atividade antifúngica e são capazes de inibir a aderência in vitro de C. abicans.