A proteômica é uma técnica muito importante e amplamente utilizada na elucidação de diversos mecanismos biológicos. Essa técnica pode ser usada, por exemplo, na avaliação da resposta celular a estímulos ou na determinação de modificações proteicas resultantes de um tratamento. Neste trabalho, a abordagem proteômica foi utilizada em dois sistemas diferentes: (1) na elucidação da resposta à luz no fungo Metarhizium acridum e (2) na determinação dos danos proteicos causados pelo tratamento fotodinâmico da levedura Candida albicans. (1) O fungo entomopatogênico M. acridum, quando crescido na presença de luz, produz conídios com elevada tolerância à radiação ultravioleta-B (290-315 nm). Essa elevada resistência é altamente desejada para aplicação de M. acridum no controle biológico de pragas na agricultura. É possível que esse fenômeno seja decorrente do acúmulo diferencial de proteínas nos conídios produzidos na presença de luz em comparação com aqueles produzidos no escuro. Assim, foi utilizada uma abordagem proteômica para determinar quais proteínas poderiam estar diferencialmente acumuladas nos conídios. Os resultados mostraram que, de um total de 501 proteínas identificadas, somente quatro estavam diferencialmente acumuladas. Apesar de não ser possível estabelecer uma relação clara entre o acúmulo dessas proteínas e a elevada tolerância à radiação ultravioleta-B, dados de proteínas homólogas em Aspergillus fumigatus obtidos da literatura mostraram que essas proteínas são reguladas em condições de estresse. Adicionalmente, experimentos foram conduzidos para expandir o conhecimento sobre a fotobiologia de M. acridum. Estabeleceu-se que, dentro do espectro da luz visível, a luz azul é responsável por induzir o aumento da tolerância à radiação ultravioleta-B, enquanto a luz vermelha não produz o mesmo resultado. Conclui-se que o estudo da resposta à luz através da proteômica de conídios requer o uso de técnicas que resultem na identificação de uma fração maior do proteoma, já que o acúmulo diferencial de proteínas aparentemente não envolve as proteínas mais abundantes. (2) Candida albicans é um importante patógeno humano responsável por micoses superficiais e sistêmicas, principalmente em indivíduos imunocomprometidos. O uso contínuo dos fungicidas tradicionais vem resultando na seleção de linhagens tolerantes. Nesse cenário, o tratamento fotodinâmico antimicrobiano surgiu como importante alternativa no tratamento das micoses causadas por C. albicans. Apesar da efetividade desse tratamento ter sido observada em diversos trabalhos, um estudo no nível proteico ainda não havia sido realizado. A abordagem proteômica por eletroforese bidimensional revelou que, após o tratamento das células, muitos spots nos géis sofreram um desvio ácido, ou seja, um deslocamento para regiões de menor ponto isoelétrico. Por outro lado, foram observados spots resistentes a essa modificação. Proteínas pertencentes a ambos os grupos foram identificadas por espectrometria de massas. A análise de aminoácidos mostrou que o conteúdo de histidina nas células de C. albicans foi reduzido em aproximadamente 60% após o tratamento, o que é uma possível explicação para o desvio ácido observado. Conclui-se, após extensa revisão e discussão da literatura, que os danos em proteínas dependem da interação entre proteína e fotossensibilizador e também da presença de aminoácidos fotooxidáveis nas proximidades dos sítios de interação. / Proteomics is a very important and largely employed technique for the elucidation of a series of biological mechanisms. This technique can be used, for instance, on the evaluation of cellular responses to stimulus or in determining protein modification resulting from a treatment. In the present work, a proteomic approach was used in two distinct biological systems: (1) to evaluate the light response in the fungus Metarhizium acridum, and (2) to determine the protein damage resulting from photodynamic treatment of the yeast Candida albicans. (1) The entomopathogenic fungus M. acridum, when grown in the presence of light, produces conidia with increased tolerance to ultraviolet-B radiation (290-315 nm). This increased resistance is desired for the application of this fungus on the biological control of agricultural pests. It is possible that this phenomenon results from the differential accumulation of proteins in conidia produced in the presence of light as compared to those produced in the dark. Therefore, a proteomic approach was used to determine which proteins could be differentially accumulated in conidia. The results showed that, out of a total of 501 identified proteins, only four were found to be differentially accumulated. Even though establishing a direct relationship between the observed accumulation and the increased tolerance to ultraviolet-B radiation was not possible, data from the literature on homolog proteins in Aspergillus fumigatus have shown that these proteins are regulated under stress conditions. Additionally, experiments were performed to gain further insight on the photobiology of M. acridum. It was stablished that, within visible light spectrum, blue light is responsible for inducing the increased tolerance to ultraviolet-B, while red light does not produce the same effect. It is concluded that a light-response study employing proteomics should rely on techniques yielding a higher number of identified proteins, as the differential accumulation does not seem to affect high abundance proteins. (2) Candida albicans is an important human pathogen responsible for superficial and systemic mycoses mainly in immunocompromised patients. The continuous use of the traditional fungicides has resulted in the selection of tolerant strains. In this scenario, antimicrobial photodynamic treatment became an important alternative on the treatment of C. albicans infections. Although the effectiveness of this treatment has been observed in multiple studies, an evaluation at the protein level had not been performed. A proteomic approach by two-dimensional electrophoresis revealed that, after cell treatment, many spots underwent an acidic shift, that is, a shift towards lower isoelectric point. On the other hand, protein spots resistant to modification were also observed. Proteins belonging to both groups were identified by mass spectrometry. Amino acid analysis revealed that the histidine content in C. albicans cells decreased by up to 60% after the treatment, which is a possible explanation to the observed acidic shift. It is concluded, after extensive literature review and discussion, that protein damage depends on protein-photosensitizer interaction and also on the presence of photooxidazible amino acids in the proximity of the interaction site.

Probióticos são microrganismos vivos que conferem benefícios à saúde dos indivíduos, quando administrados em quantidades adequadas. Além de promoverem uma melhora no sistema gastrointestinal, os probióticos são conhecidos por sua capacidade de inibirem o crescimento de microrganismos patogênicos. O presente trabalho objetivou avaliar a influência dos probióticos na redução da prevalência de Candida oral de indivíduos usuários de próteses totais. Para realização deste estudo foi elaborado o bioproduto contendo probióticos, Lactobacillus rhamnosus e Lactobacillus acidophilus. O protocolo do estudo foi duplo-cego randomizado, sendo que os sujeitos da pesquisa foram divididos aleatoriamente em dois grupos: experimental (probióticos) e controle (placebo). Os participantes utilizaram o produto durante cinco semanas e o resultado foi avaliado segundo a contagem de leveduras isoladas em unidades formadoras de colônias (UFC/mL), antes e após a intervenção. Paralelamente, a esta fase clínica da pesquisa, foram testadas in vitro a ação de outras cepas de Lactobacillus com a finalidade de verificar a associação entre a cepa de Lactobacillus com a redução das espécies de Candida isoladas do palato e das próteses, bem como, com a sensibilidade aos antifúngicos, miconazol e nistatina. Também foi pesquisado um dos principais mecanismos de ação contra patógenos, por Lactobacillus spp, a produção de bacteriocinas. Os resultados inferem que as cepas de probióticos testadas: foram eficazes na redução da prevalência de Candida oral de usuários de próteses totais; in vitro, inibiram o crescimento de Candida sp, sendo L. rhamnosus Lr-32 a cepa com melhor resultado e não produzem bacteriocinas quando em contato com a levedura. / Probiotics are live microorganisms that confer benefits to the health of an individual when administered in adequate amounts. In addition to promoting an improvement in a gastrointestinal system, the probiotics are known for their ability to inhibit the growth of pathogenic microorganisms. The present study sought to evaluate the capacity of probiotics strains in reducing the prevalence of oral Candida in denture wearers. For this study, the by-product was elaborated containing probiotics, such as Lactobacillus rhamnosus and Lactobacillus acidophilus. The study protocol was randomized, double-blind, being that the subjects of the research were randomly sorted into two groups: experimental (probiotics) and control (placebo). The participants utilized the product daily for five weeks and the result was evaluated according to the amount of yeasts isolated in colony-forming units (CFU), before and after the intervention. In parallel to this clinical phase, the action of other Lactobacillus strains were tested in vitro, with the purpose of verifying the relation between the strain of Lactobacillus and the reduction of Candida species isolated from the palate and the prostheses, as well as, with the sensitivity to antifungal agents, miconazole and nystatin. The production of bacteriocins is one of the main mechanisms of action by Lactobacillus spp. against pathogens, and was analised. The results imply that the strains of tested probiotics: in vivo, were effective in reducing the prevalence of oral Candida for denture wearers; in vitro, inhibited the growth of Candida sp, being that L. rhamnosus Lr-32 was the best resulting strain, and the strains did not produce bacteriocins when in contact with yeast.

As infecções sistêmicas causadas por Candida spp. representam importante causa de morbidade e mortalidade em pacientes pediátricos internados em unidades de cuidados intensivos. A utilização de fármacos imunodepressores em pacientes submetidos a transplantes, antibioticoterapia prolongada, nutrição parenteral, presença de cateter venoso central, entre outros fatores, contribuem para o aumento na freqüência destas infecções oportunísticas. Embora Candida albicans permaneça como a espécie mais freqüentemente isolada de episódios de candidemia, tem ocorrido aumento do número de infecções causadas por espécies não albicans. Os métodos convencionais de cultivo apresentam sensibilidade limitada, além de demandar tempo prolongado para a identificação das espécies infectantes. A Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) requer pequenos volumes de sangue para análise, situação ideal para crianças gravemente enfermas, propiciando diagnóstico rápido e identificação precisa das espécies de Candida. Este estudo teve como objetivos padronizar técnicas de PCR de dupla amplificação, para identificar cinco espécies de Candida em amostras de sangue de pacientes pediátricos com risco de desenvolver candidemias, e comparar os resultados com as hemoculturas. Foram analisadas amostras de sangue de 80 pacientes pediátricos internados na Unidade de Terapia Intensiva do Instituto da Criança do Hospital das Clínicas da FMUSP, alocados em dois grupos: 58 pacientes que apresentavam duas ou mais condições predisponentes que elevam o risco de infecção fúngica (Grupo 1); e 22 pacientes em condições clínicas de menor gravidade e risco mais baixo, que foram estudados para avaliação da freqüência de resultados falso-positivos por PCR (Grupo 2). A primeira amplificação identificou fragmento da região ITS do DNA ribossômico, e a segunda etapa amplificou fragmentos espécie-específicos para C.albicans, C.glabrata, C.parapsilosis, C.tropicalis e C.krusei. Para as amostras com detecção de Candida spp. somente por PCR, foram realizadas restrições enzimáticas e seqüenciamentos, para a confirmação da especificidade dos amplificados. A concordância entre os resultados das hemoculturas e das PCR foi avaliada pelo teste de McNemar, com nível de significância de 5%. As hemoculturas foram positivas em 15,5% dos pacientes do grupo 1, enquanto as amplificações por PCR detectaram DNA de Candida spp. em 25,9% dos casos, incluindo todos os pacientes com culturas positivas. Houve concordância na identificação das espécies em 88,9% dos casos. Em dois pacientes, a PCR identificou mais de uma espécie infectante, o que não ocorreu pelas hemoculturas. Nos seis casos em que somente a PCR detectou Candida spp. nas amostras de sangue, as restrições enzimáticas e os seqüenciamentos confirmaram a especificidade das amplificações. No grupo 2, as hemoculturas foram negativas em todos os 22 casos, e a PCR detectou C.glabrata em um paciente, cujos amplificados, após seqüenciamento, apresentaram 98% de homologia com o protótipo. O teste de McNemar mostrou que a discordância encontrada entre os métodos é estatisticamente significante e favorece a PCR (p = 0,031). Os resultados do presente estudo demonstraram que a técnica de PCR apresentou maior poder de detecção de Candida spp. em amostras de pacientes com risco de desenvolver candidemia, quando comparada às hemoculturas. A PCR foi ainda capaz de detectar mais de uma espécie infectante na mesma amostra de sangue / Disseminated candidiasis is an important cause of morbidity and mortality in immunocompromised and critically ill pediatric patients. Increased use of immunosupressive drugs, indwelling catheters, broad-spectrum antibiotics, parenteral nutrition and other predisposing conditions have contributed to the increment of Candida bloodstream infections. Although Candida albicans remains the leading species, a growing number of nonalbicans isolates has been reported. Laboratory diagnosis of candidemia is troublesome due to the lack of blood cultures sensitivity. Detection of Candida DNA by polymerase chain reaction (PCR) in tiny blood volumes may provide a more rapid and reliable candidemia detection in critically ill children. The present study aimed at standardizing nested-PCR amplifications for identification of five Candida species, comparing results with those obtained by blood cultures. Eighty patients admitted to the pediatric intensive care unit of the Instituto da Criança do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo were divided into two groups: 58 patients presenting with two or more predisposing conditions to develop candidemia (Group 1), and 22 patients with lower risk, enrolled to establish the frequency of PCR false-positive results (Group 2). Nested amplifications were targeted to Candida ITS sequence, the first round yielding a gender specific fragment, and the second round identified five Candida species corresponding to C. albicans, C. tropicalis, C. glabrata, C. parapsilosis and C. krusei. When PCR positive results were not confirmed by blood cultures, enzymatic restriction and DNA sequencing were performed. Agreement between both methods was assessed by the McNemar test, adopting a level of significance of 5%. Blood cultures were positive in 15.5% of group 1 patients, whereas nested-PCR identified Candida species in 25.9%, including all culture positive patients. PCR was 88.9% concordant with blood cultures species identification, but only the molecular technique identified dual candidemia in two patients. Amplification products of six patients with negative blood cultures submitted to enzymatic restriction and sequencing analysis showed high degree of homology with Candida reference strains, confirming the specificity of PCR. Blood cultures were negative in all patients of group 2, but PCR detected C.glabrata in one case whose amplification products resulted in 98% of homology with the reference strain. The McNemar test showed disagreement between both methods, favoring PCR (p=0.031). In the present study, PCR was more sensitive to detect Candida species in comparison to blood cultures, being also able to identify dual candidemia

Made available in DSpace on 2017-07-24T19:22:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Protasio Vargas Neto.pdf: 1264880 bytes, checksum: 14ef9b969de58a4eae16cc5d445c2e8d (MD5) Previous issue date: 2004-07-29 / Candidosis is a current intraoral infection, resulting from temporary parasitism of Candida, mostly C. albicans. The use of phytotherapics for prevention and control of candidosis is not well stablished. The presence of Candida was determined in the oral cavity of 86 patients, 40 males and 46 females, aging from 18 to 82 yars, without clinical signs of candidosis by plating saliva samples on sabouraud dextrose. Candida was found in 38 (44,18%) individuals, 20 (23,25%) male and 18 (20,93%) female. From 38 samples, 18 were C. albicans, 13 C. tropicalis, 3 C. parapsilosis, 2 C. guilliermondii, 1 C. Krusei and 1 C. kerfyr. The sensitivity of these Candida isolates were evaluated throught three phytotherapics, Anacardium occidentale, Arctium lappa, Plantago major and the natural product propolis. The sensitivity of the yeasts was demonstrated in vitro, using a test of diffusion in agar and a test in tube to determine the number of yeasts killed by the phytotherapics and in vivo by the recovery of Candida from the oral cavity of rats treated with them and by the induction of candidosis in the rat´s tongue. As a comparison, tests with two types of commercial antifungal agents were performed. The results showed an effective action of propolis in both in vivo and in vitro tests. The most effetive phytotherapic was the cajueiro (Anacardium occidentale). Bardana (Arctium lappa) and tanchagem (Plantago major) showed less effetiveness without statistical significance. / A Candidose é uma infecção de ocorrência comum na cavidade bucal, conseqüência de parasitismo temporário por leveduras do gênero Candida. Nesta pesquisa, foram coletadas amostras de saliva de 86 pacientes, 40 do sexo masculino e 46 do sexo feminino, com idade entre 18 e 82 anos, sem candidose clinicamente visível. Destes 86 pacientes 38 (44,18%) foram positivos para Candida, sendo 20 (23,25%) homens e 18 (20,93%) mulheres. Foram isoladas 38 amostras de 6 espécies, 18 caracterizadas como C. albicans, 13 C. tropicalis, 3 C. parapsilosis, 2 C. guilliermondii, 1 C. krusei e C. kerfyr. Foi avaliada a sensibilidade destas cepas de Candida frente a três fitoterápicos; Anacardium occidentale, Arctium lappa, Plantago major e o produto natural própolis, através de dois testes in vitro e dois in vivo. Os testes in vitro foram o teste de difusão em agar e o teste em tubo de ensaio para determinar o número de células sensíveis aos extratos. Os testes in vivo foram de recuperação de Candida da boca de ratos e desenvolvimento de candidose na língua de ratos. Como comparação foram também realizados dois testes de sensibilidade aos antifúngicos comerciais, o teste de difusão em ágar com discos impregnados em antifúngicos da Cecon Ltda (antifungigrama) e o teste da ATB Fungus (bioMérieux). Os resultados mostraram uma efetiva ação da própolis tanto nos testes in vivo quanto in vitro. O fitoterápico mais efetivo frente às amostras de Candida foi o cajueiro. A bardana e a tanchagem apresentaram menor ação sobre as leveduras e não mostraram diferenças significativas entre si.

Submitted by Angela Maria de Oliveira (amolivei@uepg.br) on 2018-09-11T12:20:53Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) Lidia Yileng.pdf: 2407431 bytes, checksum: 8e4f36ecd67d4196231ab479788b77c2 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-09-11T12:20:53Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) Lidia Yileng.pdf: 2407431 bytes, checksum: 8e4f36ecd67d4196231ab479788b77c2 (MD5) Previous issue date: 2013-07-30 / Fundação Araucária de Apoio ao Desenvolvimento Científico e Tecnológico do Paraná / A Estomatite protética (EP) é uma doença inflamatória crônica que afeta usuários de prótese removível, sendo a Candida spp. o principal agente etiológico. Uncaria tomentosa, conhecida como unha de gato, é utilizada usualmente na medicina alternativa para o tratamento de diversas doenças. O propósito deste estudo clínico randomizado duplo cego foi determinar a eficácia de um gel de Uncaria tomentosa Willd D.C. contra a EP. Cinquenta pacientes portadores de EP foram distribuídos aleatoriamente em três grupos para receber tratamento contra a doença: grupo M: gel de miconazol 2% como controle positivo; grupo P: gel de hydroxietilcelulose (natrosol) como placebo; e grupo UT: gel de Uncaria tomentosa 2% como o grupo experimental. Os pacientes receberam uma bisnaga contendo o medicamento de acordo com o grupo e foram instruídos para aplicar o gel na base da prótese três vezes ao dia durante uma semana. Além disso, instruções sobre a higiene bucal e das próteses foram prescritas a todos os pacientes. Os pacientes foram avaliados inicialmente (dia 0), após uma semana de tratamento (dia 7) e uma semana após terminado o tratamento (dia 14). A efetividade do tratamento foi avaliada clinicamente pela utilização dos critérios de Newton para grau de EP. Além disso, exame micológico foi realizado contando as unidades formadoras de colônias por mililitro (UFC/mL) de amostras tomadas da mucosa do palato e da superfície interna da prótese. AsCandida spp.foram identificadas com o HiCrome Candida Agar e submetidas ao teste bioquímico Api 20 C AUX. Não houve diferença significativa entre os três grupos (p>0,05) segundo o teste estatístico Kruskal-Wallis e o teste de comparação múltipla de Dunn. Pôde-se observar clinicamente uma diminuição no grau de EP e na análise microbiológica redução significativa da contagem de UFC/mL, após uma semana de tratamento (p<0,05) a qual permaneceu semelhante após 14 dias (p>0,05) nos três grupos avaliados. Foi possível reconhecer C. albicans, C. tropicalis, C. glabrata e C. krusei encontradas nas amostras dos pacientes com EP. Pode-se concluirque o gel de Uncaria tomentosa teve o mesmo efeito que o agente antifúngico miconazol 2%. / Denture stomatitis is a chronic oral disease that affects denture wearers. It presents as an inflammatory reaction in denture-bearing patients, under maxillary prosthesis. Candida spp. has been reported as the principal etiological agent. Despite the existence of a great number of antifungal agents, treatment failure is observed frequently. Uncaria tomentosaWilld D.C., known as cat’s claw, is habitually used in alternative medicine for the treatment of several diseases. The aim of this clinical study was to determine the efficacy of Uncaria tomentosa gel against denture stomatitis (DS). Fifty patients with DS were randomly assigned into three groups to receive either 2% miconazole gel as a positive control (Group M) or 1.5% hydroxyethylcellulose (natrosol) as a placebo group (Group P) or 2% Uncaria tomentosa gel as the experimental group (Group UT). All patients received their treatment on admission and were told to apply the gel on the base of the denture three times a day for a period of 1 week. In addition, instructions for oral and denture hygiene were prescribed to all patients. DS level was registered initial (day 0), after 1 one week of treatment (day 7) and 7 days after treatment (day 14). The effectiveness of treatment was assessed clinically using Newton’s criteria for severity degree of DS; mycological examination was performed counting colony-forming units per milliliter (CFU/mL) from samples of the palatal mucosa and from the tissue surface or the upper denture. Candida spp. were identified with HiCrome Candida and submitted to the biochemical test API 20 C AUX. Results were statistically evaluated using Kruskal-Wallis test and Dunn’s multiple comparsion test. Clinically it was observed decrease in the severity of DS in all groups (p<0.05). At the mycological examination, significant reduction in number of CFU/ml after one week of treatment (p<0.05) which remained after 14 days (p>0.05) were found in the three groups with no significant difference among the three groups (p < 0.05). It was possible to identifyC. albicans, C. tropicalis, C. glabrata and C. krusei found on the samples of DS patients. Furthermore, it was observed that Uncaria tomentosa gel has the same effect as the antifungal agent.

Orientador: Rinaldo Poncio Mendes / Resumo: A candidemia constitui um grande problema em hospitais terciários, por sua elevada incidência – 3,9 casos por 1.000 admissões e letalidade – 50 a 72%. Assim, o objetivo deste estudo foi avaliar a taxa de infecções da corrente sanguínea por Candida spp., em um período de sete anos, determinar o perfil de sensibilidade dos isolados a antifúngicos, caracterizar as espécies do complexo Candida glabrata e avaliar aspectos epidemiológicos, clínicos e terapêuticos dos pacientes-fonte. Methodology. O perfil de sensibilidade antifúngica foi realizado no equipamento Vitek2. A análise molecular de C. glabrata foi realizada por PCR utilizando-se primer senso CGL1 e antisenso CGL2 e de C. nivariensis e C. bracarensis por PCR multiplex com o primer senso NIV-f e BRA-f e antisenso universal UNI-5.8S. Aspectos epidemiológicos, clínicos e terapêuticos foram coletados de prontuário eletrônico e registrados em ficha padronizada para este estudo. Results. Foram avaliados 84 isolados de hemocultura e os dados clínicos de 59 pacientes. A taxa de incidência de candidemia (por 1.000 admissões) foi maior em mulheres que em homens (0,76 vs 0,54; p<0,0001), não se alterou ao longo dos anos e variou em função da unidade de internação, predominando na Clínica Cirúgica, Clínica Médica, Oncologia e Unidade de terapia Intensiva. C. albicans foi a espécie predominante e, dentre as não-C. albicans, a C. glabrata foi a mais frequente. Todos os isolados do complexo C. glabrata foram identificadas como C. glabra... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Background. Candidemia is the major problem in hospitals because of its high incidence - 3.9 cases per 1,000 admissions and lethality - 50 to 72%. Therefore, the objective of this study was to evalue the rate of the bloodstream infecction by Candida spp, to determine the sensitivity profile of the antifungal isolated, characterize the Candida glabrata complex species and to evaluate the epidemiological aspects, clinical and therapeutic patients sources. Methodology. The antifungal sensitivity profile was performed into Vitek2 device. Molecular analysis of C. glabrata was performed by PCR using primers ford CGL1 and reverse CGL2 and C. nivariensis and C. bracarensis by multiplex PCR with primers ford NIV-f and BRA-f universal reverse UNI-5.8S. Epidemiological, clinical and therapeutic aspects were collected from an electronic medical record and registered in a standard form for this study. Results. Were evaluated 84 patients with hemoculture and clinical data from 59 patients. The incidence rate of candidemia (per 1,000 admissions) was higher in women than men (0.76 vs 0.54, p <0.0001), not very different through out the years and varied according to the hospitalization unit, predominating in the Clínica Surgical, Clinical Medicine, Oncology and Intensive Care Unit. C. albicans was a predominant genus and, among non-C. albicans, C. glabrata was more frequent. All compounds of the C. glabrata complex were as C. glabrata stricto sensu. Predisposing factors - gastric surgery, use... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Os microrganismos associados à cárie são, em sua maioria, microrganismos acidogênicos e acidúricos, anaeróbios estritos e facultativos. A presença de fungos é associada à microbiota de cárie radicular, sendo a espécie fúngica mais relacionada a Candida albicans. Embora estudos de cultivo e de análise de DNA comprovem a presença de fungos na microbiota associada a lesões de cárie radicular, demonstrando um gradiente crescente de colonização com a progressão da doença, pouco se sabe sobre o papel que estes microrganismos desempenham no processo de doença. O objetivo deste trabalho foi estudar o papel de Candida albicans na cárie radicular, através da análise de transcriptoma de biofilmes naturais de superfícies radiculares hígidas (n=10, SRS) e de lesão de cárie radicular ativa (n=9, RC). Foi avaliada a expressão diferencial de genes de Candida albicans, as funções específicas e vias metabólicas associadas a este microrganismo. O RNA total microbiano foi extraído e o mRNA isolado e sequenciado na plataforma Illumina Hi-Seq2500. Foram formados pool (grupamentos) das amostras com valores inferiores a 30ng/RNA para a construção de bibliotecas genômicas. Os dados gerados pelo sequenciamento de RNA-Seq foram compilados em uma tabela de contagem (reads) e mapeados com o genoma de referência (C. albicans SC5314) utilizando o software CLC Genomics Workbench 7.5.1. Para o cálculo do nível de expressão gênica os dados foram normalizados com o algoritmo DESeq. A expressão diferencial foi calculada com binomial negativa e False Discovery Rate (FDR<0,05). Os genes com maior expressão em RC e em SRS foram analisados pela mediana relativa de expressão (RME; Relative Median Expression) e expressão diferencial, assim como as vias metabólicas associadas a genes de virulência e metabolismo de açúcares. Dois genes (CaO19.610, FDR=0.009; CaO19.2506, FDR=0.018) apresentaram expressão diferencial significativa em superfície radicular hígida (SRS) e tem suas funções relacionadas a formação de biofilme. Enquanto que em superfície radicular cariada (RC) sete genes (UTP20, FDR=0.018; ITR1, FDR=0.036; DHN6, FDR=0.046; CaO19.7197, FDR=0.046; CaO19.7838, FDR=0.046; STT4, FDR=0.046; GUT1, FDR=0.046) apresentaram expressão diferencial significativa e tem suas funções relacionadas a atividade metabólica, transporte de açúcares, tolerância ao estresse, invasão e regulação de pH. Candida albicans é um microrganismo importante no desenvolvimento da doença cárie radicular. / The microbiota associated with root caries must be acidogenic and aciduric. S. mutans, Lactobacillus, Actinomyces, Veilonella, Bifidobacterium, and other bacteria play important roles in root caries biofilm. Yeasts are also present on carious and non-carious root biofilms, being the specie Candida albicans the most prevalent yeast found in root biofilms. Although the presence of Candida albicans is stablished in the literature, and there are an increasing gradient of Candida species. colonization with caries progression, the role of this microorganism in root caries has not being totally elucidated. The aim of this study is to analyse the role of Candida albicans in root caries thought a transcriptomic analysis of biofilms of sound root surfaces (n=10, SRS) and root caries lesions (n=9, RC) using a high-throughput sequencing of cDNA (RNA-Seq). The differential expression of genes of Candida albicans SC5314, the specific functions and pathways associated with the gene expression of the present study were investigated. The total bacterial RNA was extracted and the mRNA was isolated (Illumina Hi-Seq2500). Samples with low RNA concentration (less than 30ng/RNA) were pooled, yielding a final sample size of SRS=10 and RC=9. Sequence reads were compiled in a count table and mapped to C. albicans SC5314 genome of reference, using the software CLC Genomics Workbench 7.5.1. Gene expression was calculated in the algorithm DESeq, and the differential expression was calculated with binomial negative (Log2FoldChange) and False Discovery Rate (FDR<0,05). The genes with higher expression in RC and SRS were analysed by the Relative Median Expression (RME), and the virulence factors and pathways and sugar metabolization related with Candida albicans pathogenicity in root caries were analysed. Two genes (CaO19.610, FDR=0.009; CaO19.2506, FDR=0.018) are up-regulated in Sound Root Surface (SRS) have their functions related to biofilm formation and seven (UTP20, FDR=0.018; ITR1, FDR=0.036; DHN6, FDR=0.046; CaO19.7197, FDR=0.046; CaO19.7838, FDR=0.046; STT4, FDR=0.046; GUT1, FDR=0.046) are up-regulated in biofilm of carious dentin (RC) have functions related to metabolic activity, sugar transport, stress tolerance, invasion and pH regulation.

L'incidence des candidoses invasives a considérablement augmenté au cours des dernières décennies, parallèlement à l'augmentation du nombre de patients à risque. Ces pathologies sont associées à une morbi-mortalité élevée. Ce pronostic peut toutefois être amélioré par l'instauration d'un traitement antifongique précoce. Quatre classes de molécules antifongiques sont aujourd’hui disponibles pour la prévention et le traitement des candidoses invasives : échinocandines, antifongiques azolés, polyènes et pyrimidines. Du fait d’une efficacité importante et d’une meilleure tolérance, les échinocandines et les antifongiques azolés sont les plus largement utilisés. L'utilisation massive de ces molécules a conduit à une modification de l'épidémiologie des candidoses invasives, avec l'émergence d'espèces non-albicans intrinsèquement moins sensibles à ces antifongiques, à l'exemple de C. glabrata ou C. parapsilosis. De plus, des souches résistantes voire multi-résistantes aux échinocandines et aux antifongiques azolés sont de plus en plus fréquemment isolées, et associées à des échecs thérapeutiques. L'activité de ces antifongiques est également limitée par le phénomène de tolérance, résultant de la capacité d'adaptation des levures aux stress membranaires et pariétaux induits par ces molécules.Pour toutes ces raisons, l'identification et le développement de nouvelles stratégies antifongiques sont nécessaires. Ce travail de thèse s'inscrit dans cette optique, avec pour objectifs l'étude de la tolérance et de la résistance aux antifongiques chez Candida spp. et la caractérisation de nouvelles cibles thérapeutiques impliquées dans ces processus.La première partie de ce travail a permis de démontrer l'intérêt du séquençage nouvelle génération et d'une approche multigénique pour l'étude des mécanismes impliqués dans la résistance aux antifongiques azolés et aux échinocandines chez Candida spp. Par ce biais, il a été possible d'appréhender de nouveaux mécanismes potentiellement impliqués dans la résistance aux antifongiques, qui nécessitent toutefois d'être confirmés.Dans un deuxième temps, ce travail a permis de mettre en évidence que l'ensemble des protéines de la voie de signalisation du pH ou voie Rim chez les levures est impliqué dans la tolérance aux antifongiques chez C. albicans, l'espèce la plus fréquemment isolée en pathologie humaine. De plus, de nouveaux gènes Rim-dépendants ont été identifiés par RNA-sequencing, à l'exemple de HSP90, codant pour une protéine chaperone responsable de la régulation de multiples processus biologiques, et IPT1, responsable de la biosynthèse du principal sphingolipide membranaire. Ces deux gènes ont précédemment été impliqués dans la tolérance aux antifongiques azolés et aux échinocandines chez C. albicans et pourraient participer à la tolérance aux antifongiques médiée par la voie Rim. Ces résultats ouvrent des perspectives intéressantes : en effet, en ciblant la voie Rim, il pourrait être possible de potentialiser l'activité des molécules antifongiques actuellement commercialisées et de cibler indirectement Hsp90 tout en s'affranchissant des problèmes de toxicité car cette voie de signalisation est spécifique du règne fongique.Enfin, une dernière partie de ce travail réalisée dans le cadre du partenariat de l'ANR FungiBET a permis de montrer que la protéine BET (Bromodomain and Extra-Terminal) Bdf1 de C. glabrata, impliquée dans la régulation épigénétique de la transcription, est essentielle à la croissance in vitro. Plus précisément, l'intégrité des deux bromodomaines BD1 et BD2 de Bdf1, responsables de la liaison de cette protéine aux histones, est essentielle chez cette espèce, qui est la deuxième la plus fréquemment isolée dans les candidoses invasives en Europe et aux Etats-Unis. Ce résultat confirme les premières données obtenues chez C. albicans, et l'intérêt de l'inhibition des protéines BET fongiques comme nouvelle stratégie antifongique / The incidence of invasive candidiasis (IC) has dramatically increased over the past decades, partly due to the increasing number of at-risk patients. IC is associated with high mortality rates: however, its prognosis can be improved by early treatment. Four antifungal classes are available today for the prevention and treatment of IC: echinocandins, azoles, polyenes and pyrimidines. Due to their high efficacy and interesting safety profile, echinocandins and azoles are more commonly used. Massive use of these compounds has led to epidemiological changes in IC, with the emergence of non-albicans species which are intrinsically less susceptible to these antifungals, such as C. glabrata or C. parapsilosis. In addition, Candida spp. strains resistant, or even multiresistant, to azoles and echinocandins are increasingly isolated and associated with therapeutic failures. Antifungal activity is also limited by tolerance, a reversible phenomenon resulting from the yeast's adaptation to membrane and cell wall stresses caused by these molecules.For these reasons, identification and development of new antifungal strategies are needed. This work aimed at studying antifungal resistance and tolerance in Candida spp. and characterizing new therapeutic targets involved in these process.First, this work showed the interest of next-generation sequencing and multigene approaches to study mechanisms involved in resistance to echinocandins and azoles antifungals in Candida spp. It notably allowed to identify new mechanisms involved in antifungal resistance, which still need to be confirmed.In a second part, this work allowed to show that all the proteins of the pH-signaling pathway, known as the Rim pathway in yeasts, are involved in antifungal tolerance in C. albicans, the most frequent species responsible for IC in humans. In addition, new Rim-dependent genes were identified through RNA-sequencing, such as HSP90, coding for a major chaperone involved in the regulation of multiple cellular process, as well as IPT1, responsible for the synthesis of the main membrane sphingolipid.Both genes were previously shown to be involved in azoles and echinocandins tolerance in C. albicans, and could therefore play a role in antifungal tolerance mediated by the Rim pathway. These results offer great perspectives. Indeed, targeting the Rim pathway would allow to enhance the activity of commercially available antifungals and to indirectly target Hsp90, with no or limited toxicity as this signaling pathway is fungal-specific.Thirdly, a last part of this work performed in the context of the ANR FungiBET consortium, allowed to show that the BET protein Bdf1 in C. glabrata, which is involved in epigenetic regulation of transcription, is required for in vitro growth. More precisely, the integrity of both BD1 and BD2 Bdf1 bromodomains are essential in this species, which ranks second among causes of IC. This result confirms the first data obtained in C. albicans and the interest of inhibiting fungal BET proteins as a new antifungal strategy

O amplo espectro da candidíase e respectiva importância clínica da infecção impulsionam as pesquisas que visam esclarecer os mecanismos de patogenicidade e identificação dos fatores de virulência de Candida sp. Portanto, o objetivo deste estudo foi verificar através de testes fenotípicos e moleculares a capacidade de adesão, atividade de proteases e variabilidade genética de isolados clínicos de C. albicans e C. tropicalis. A capacidade de adesão às glicoproteínas de matriz extracelular laminina e fibronectina foi avaliada utilizando-se a técnica de ELISA (Enzyme-linked imunosorbent assay). A pesquisa de proteases foi realizada pelos métodos semiquantitativo, em placa de ágar com albumina bovina, e quantitativo, em solução-tampão com hemoglobina. A presença dos genes ALS2, ALS3, SAP1, SAP3 e PLB1 foi verificada pela Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) e os polimorfismos intra e interespécies pela técnica do DNA Polimórfico Amplificado ao Acaso (RAPD). Todos os isolados de C. albicans e C. tropicalis apresentaram ligação a laminina e a fibronectina imobilizadas. Os isolados Ca33 e Ct13 apresentaram índice de adesão relativa significativamente maiores em relação aos demais isolados para as duas glicoproteínas (p < 0,001). A atividade de proteases foi observada em todos os isolados de C. albicans tanto pelo método semiquantitativo quanto pelo método quantitativo. A atividade de proteases dos isolados de C. tropicalis foi melhor evidenciada através do método quantitativo. A amplificação de fragmentos dos genes relacionados à adesão (ALS2 e ALS3), atividade de proteases (SAP1 e SAP3) e fosfolipase (PLB1) foi observada em todos os isolados de C. albicans. Os isolados de C. tropicalis não apresentaram produtos de amplificação para os genes pesquisados. A variabilidade genética avaliada pela técnica do RAPD revelou uma população heterogênea em ambas as espécies. No entanto, C. tropicalis apresentou maior diversidade genética que C. albicans. / The wide spectrum of candidiasis and its clinical importance encourage the research with the purpose of clarifying the mecanisms of pathogenicity and identification of virulence factors of Candida sp. Therefore, the aim of this study was to verify through phenotypic and molecular assays the adhesion, enzymatic activity e genetic variability of clinical C. albicans and C. tropicalis isolates. The adhesion ability to the extracellular matrix glycoproteins laminin and fibronectin was evaluated using the ELISA technique (Enzyme-linked imunosorbent assay). The research of proteases was carried out in agar plate containing bovine albumin and through a quantitative method in buffer solution containing hemoglobin. The presence of ALS2, ALS3, SAP1, SAP3 and PLB1 was verified using polimerase chain reaction (PCR) and intra and interespecies polimorphisms through Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) technique. All C. albicans and C. tropicalis isolates binded to immobilized laminin and fibronectin. Ca33 and Ct13 isolates had relative adhesion index significantly higher than the other isolates for both glycoproteins (p < 0,001). Protease activity was observed in all isolates of C. albicans using either the semi-quantitative or quantitative assay. The protease activity of C. tropicalis was better detected through the quantitative assay. The amplification of genes related to adhesion (ALS2 and ALS3), proteases (SAP1 and SAP3) and phospholipase (PLB1) activity using PCR was observed in all C. albicans strains. PCR amplification products were not observed in C. tropicalis isolates for the researched genes. The genetic variability by RAPD revealed an heterogeneous population in both species. Nevertheless, C. tropicalis presented higher genetic variability than C. albicans strains.

Este estudo clínico-laboratorial identificou as espécies de Candida do palato e prótese de indivíduos desdentados totais com estomatite relacionada à prótese (ERP) e avaliou o efeito de soluções desinfetantes para higiene de próteses totais sobre Candida spp.. Sessenta participantes foram distribuídos aleatoriamente em 04 grupos paralelos (n=15); orientados a escovar as próteses e o palato 3 vezes ao dia e imergi-las nas soluções salina (C controle), Hipoclorito de sódio a 0,25% (HS0,25%), Ricinus communis a 10% (RC10%) ou Cloramina T a 0,5% (CT0,5%) por 20 minutos. Amostras de biofilme foram coletadas da prótese e palato no Baseline, após 7 e 37 dias do uso das soluções e semeadas em meio CHROMagar Candida. Após período de incubação foi realizada a identificação presuntiva, verificação da incidência e quantificação de crescimento das espécies de Candida (contagem de UFC). Cepas ATCC das espécies mais incidentes clinicamente foram avaliadas no estudo laboratorial. Biofilmes de C. albicans, C. tropicalis e C. glabrata foram formados sobre espécimes em resina acrílica termopolimerizável e imersos nas soluções por 20 minutos. Água destilada foi utilizada como controle. As variáveis de resposta foram crescimento de colônias (contagem de UFC), metabolismo celular (método de XTT), produção de enzimas hidrolíticas (kits específicos), formação de hifas (contagem de células em câmara de Newbauer) e quantificação de células vivas (microscopia de epifluorescência). A capacidade de remoção de biofilme pelas soluções também foi avaliada por meio de microscopia de epifluorescência. Para o estudo clínico, análises descritivas foram utilizadas para interpretação dos dados quanto às características sociodemográficas da amostra, identificação e incidência das Candida spp. Os resultados de crescimento celular (UFC) foram analisados pelos Testes Kruskal-Wallis e Friedman. Para o estudo laboratorial, os resultados foram analisados por teste Anova (One-way) e Tukey (capacidade de crescimento e metabolismo celular de C. albicans e C. tropicalis), teste de Kruskal-Wallis (metabolismo celular de C. glabrata; produção de enzimas hidrolíticas; formação de hifas; capacidade de remoção de biofilme) e teste de Wilcoxon (comparação entre quantidade de biofilme vivo e biofilme total). Empregou-se um nível de confiança de 95% (&alpha;= 0,05). As espécies mais incidentes foram C. albicans, seguida de C. tropicalis, C. glabrata e C. krusei. O HS 0,25% reduziu a incidência das três espécies na prótese e palato nos períodos de 7 e 37 dias; o CT 0,5% promoveu redução de Candida spp. somente nas próteses totais. O R. communis diminuiu a incidência de C. tropicalis em ambos os sítios de coleta. Para contagem de UFC, o HS 0,25% e CT 0,5% causaram redução significativa para cepas clínicas e ATCC. O R. communis, in vitro, reduziu a quantidade de UFC de C. glabrata. O HS 0,25% obteve os melhores valores contra atividade metabólica, formação de hifas, manutenção de células vivas e remoção do biofilme das espécies de Candida. As soluções de RC 10% e CT 0,5% causaram diminuição da atividade metabólica. Não houve diferença significante na produção de proteinase por C. albicans e C. tropicalis após exposição às diferentes soluções desinfetantes, com exceção da C. glabrata, em que todas as soluções causaram aumento significativo da produção desta enzima. As soluções não influenciaram a produção de fosfolipase. A CT 0,5% e RC 10% apresentaram resultados intermediários para manutenção de células vivas. A Cloramina T foi mais eficiente que o R. communis para remoção do biofilme de C. albicans e C. tropicalis e menos eficiente para remoção de biofilme de C. glabrata. As soluções de Hipoclorito de sódio a 0,25% e Cloramina T a 0,5% apresentaram os melhores resultados como solução de imersão frente às variáveis estudadas, podendo ser indicadas para uso clínico como desinfetantes para próteses totais. / This clinical-laboratory study identified the Candida species from the palate and complete dentures of edentulous individuals with prosthesis-related stomatitis (PRS) and evaluated the effect of disinfectant solutions for denture hygiene on Candida spp. Sixty participants were randomly assigned in 04 parallel groups (n = 15); They were oriented to brush their prostheses and the palate 3 times a day and immerse them in saline solution (C-control), 0.25% Sodium hypochlorite (HS0.25%), 10% Ricinus communis (RC10%) or 0.5% Chloramine T (CT 0.5%) for 20 minutes. Biofilm samples were collected from the prosthesis and palate in the baseline, after 7 and 37 days of use of the solutions and seeded in CHROMagar Candida medium. After incubation period, the presumptive identification, incidence verification and quantification of Candida species growth (CFU count) were performed. ATCC strains of the most clinically incident species were evaluated in the laboratory study. C. albicans, C. tropicalis and C. glabrata biofilms were formed on heatpolymerised acrylic resin specimens and immersed in the solutions for 20 minutes. Distilled water was used as control. The response variables were colony growth (UFC count), cell metabolism (XTT method), production of hidrolytic enzymes (specific kits), formation of hyphae (counting cells in Newbauer\'s chamber) and quantification of live cells (epifluorescence microscopy). The ability of biofilm removal by the solutions was also evaluated by means of epifluorescence microscopy. For the clinical study, descriptive analyzes were used to interpret the data regarding the sociodemographic characteristics of the sample, identification and incidence of Candida spp. The cell growth results (CFU) were analyzed by the Kruskal-Wallis and Friedman tests. For the laboratorial study, the results were analyzed by the Anova (One-way) and Tukey test (growth capacity and cellular metabolism of C. albicans and C. tropicalis), Kruskal-Wallis test (cellular metabolism of C. glabrata; hidrolytic enzymes production; formation of hyphae; ability to remove biofilm) and Wilcoxon\'s test (comparison of the amount of live biofilm and total biofilm). A confidence level of 95% (&alpha; = 0.05) was used. The most incident species were C. albicans, followed by C. tropicalis, C. glabrata and C. krusei. HS 0.25% reduced the incidence of the three species on the prosthesis and palate in the periods of 7 and 37 days; CT 0.5% promoted reduction of Candida spp. only in dentures. R. communis decreased the incidence of C. tropicalis in both collection sites. For CFU counts, HS 0.25% and CT 0.5% caused significant reduction for clinical strains and ATCC. R. communis, in vitro, reduced the amount of CFU of C. glabrata. The HS 0.25% obtained the best values compared to the metabolic activity, hyphae formation, maintenance of living cells and removal of the biofilm of Candida species. The solutions of RC 10% and CT 0.5% caused the decrease in the metabolic activity. There was no significant difference in proteinase production by C. albicans and C. tropicalis after exposure to different disinfectant solutions, except C. glabrata, in which all solutions caused a significant increase in the production of this enzyme. The solutions did not influence phospholipase production. A CT 0.5% and RC 10% presented intermediate results for the maintenance of living cells. Chloramine T was more efficient than R. communis for biofilm removal from C. albicans and C. tropicalis; and less efficient for biofilm removal from C. glabrata. The solutions of 0.25% Sodium Hypochlorite and 0.5% Chloramine T presented the best results as immersion solution compared to the studied variables and can be prescribed for clinical use as disinfectants for total dentures.