A candidose bucal acomete grande número de pessoas mundialmente, sendo associada a condições como imunossupressão, radioterapia, tabagismo, higiene bucal, idade, xerostomia e uso de próteses removíveis. Uma importante abordagem terapêutica para essas infecções consiste nos medicamentos antifúngicos, que podem apresentar efeitos colaterais e resultar na resistência dos patógenos. Nesse contexto, a terapia fotodinâmica (PDT) faz-se interessante como alternativa capaz de minimizar essas limitações. Protocolos de PDT poderão ser mais facilmente assimilados à prática clínica se empregarem materiais já aprovados para uso odontológico. Sendo assim, este estudo propõe avaliar o uso de PDT com eritrosina como fotossensibilizador, irradiada por um LED azul, usando-se um modelo animal. Quarenta camundongos tiveram candidose induzida sobre o dorso da língua por meio de imunossupressão e inoculação com Candida albicans. Após estabelecimento da lesão durante cinco dias, os animais receberam um dentre quatro tratamentos possíveis: aplicação da eritrosina 5% seguida de irradiação pelo LED (E+L+); aplicação de eritrosina, somente (E+L-); salina seguida pela irradiação (EL+); e somente salina (E-L-). A fim de distinguir possíveis efeitos colaterais, os mesmos tratamentos foram aplicados em 12 camundongos sem a indução de candidose. O número de unidades formadoras de colônia de C. albicans foi contado após o tratamento, e a mucosa foi submetida à análise histológica para determinar o grau de inflamação. Os dados dos grupos foram comparados por meio de ANOVA e teste de Kruskal-Wallis, (α=0,05). Não foram detectadas diferenças significativas entre os grupos testados quanto à contagem de colônias de C. albicans e o grau de inflamação. O infiltrado inflamatório foi classificado como discreto na maioria dos casos. Os animais com candidose bucal induzida e os saudáveis que foram submetidos aplicação de eritrosina 5% e irradiação pelo LED apresentaram infiltrado inflamatório mais acentuado e lesões mais evidentes na camada epitelial, sugerindo que este protocolo ocasionou danos aos tecidos orais. / Oral candidosis affects many people worldwide and is associated with conditions such as immunosuppression, radiation, smoking, oral hygiene, age, xerostomia and use of removable prostheses. An important therapeutic approach for these infections consists of antifungal drugs, which have side effects and can result in the resistance of pathogens. In this context, photodynamic therapy (PDT) is an interesting alternative able to overcome those limitations. PDT protocols can be more easily assimilated in clinical practice if they employ materials already approved for use in dentistry. Thus, this study evaluate the PDT with the use of erythrosine as a photosensitizer, irradiated by a blue LED light, using an animal model. Forty mice had candidosis induced on the tongue by the immunosuppression and inoculation with Candida albicans. After five days that the lesion is established, the animals received one of four possible treatments: application of 5% erythrosine and irradiation by the LED (E+L+); erythrosine application, only (E+L- ); saline followed by irradiation (E-L+); and only saline (E-L-). In order to distinguish potential side effects, the same treatments were applied in 12 mice without induced candidosis. Colony-forming units (CFU) of C. albicans were counted after treatment, and the mucosa was subjected to histological analysis to determine the degree of inflammation. The data of the groups were compared using ANOVA and Kruskal-Wallis test (α=0.05). No significant difference was detected among the groups tested for the number of CFU of C. albicans and the degree of inflammation. The inflammatory infiltrate was classified as mild in most cases. Animals with induced oral candidosis and the healthy ones exhibited more pronounced inflammatory infiltrate and lesions in the epithelial layer following PDT by 5% erythrosine and irradiation by the LED light. Such findings suggest that this protocol resulted in damage to oral tissues.

A ocorrência de leveduras do gênero Candida spp. constitui uma ameaça a saúde bucal de pacientes oncológicos submetidos ao tratamento antineoplásico. Diante do exposto,objetivou-se no estudo avaliar as variáveis clínicas de pacientes oncológicos portadores ou não de Candida spp. na saliva; estimar a prevalência dessas cepas, avaliar a atividade antimicrobiana dos antissépticos bucais e, determinar o perfil de sensibilidade aos antifúngicos. Foram coletadas amostras de salivas de pacientes oncológicos, com e sem mucosite. A saliva foi submetida a diluição decimal seriada até 10-3 e semeada em meio de cultura (CHROMagarTM Candida) para quantificação das unidades formadoras de colônias por mililitro de saliva (UFC/mL). Também, realizaram-se provas bioquímicas específicas para identificação das espécies. Na avaliação da atividade antimicrobiana dos antissépticos bucais (Periogard®, Cepacol® Cool Ice e Clorexidina a 0,12%) utilizouse a Diluição Inibitória Máxima (DIM). O perfil de sensibilidade destas cepas a anfotericina B e fluconazol foi realizado pela Concentração Inibitória Mínima (CIM) por meio das fitas Etest®. Na análise estatística utilizou-se os testes não paramétricos de McNemar e Wilcoxon, com nível de significância (=0,05). Totalizou-se 34 pacientes dos quais 79,4% eram masculinos e 19(55,9%) estavam com mucosite. Das amostras de saliva 9(26,5%) eram positivas para Candida spp.. Evidenciou-se 12 cepas distintas de Candida spp., sendo 7(20,6%) C. albicans, 3(8,8%) C. glabrata e 2(5,9%) C.tropicalis. A mucosite foi mais freqüente 66,7% nos portadores de Candida. Comparando os resultados da DIM foi possível verificar que o Cepacol® Cool Ice apresentou os melhores resultados. A Clorexidina a 0,12% teve a pior atividade, sendo que 4 (11,8%) das cepas não foram inibidas na diluição de 1:10. Com relação ao perfil de sensibilidade, todas cepas foram sensíveis a anfotericina B e 2 (5,9%) das cepas de Candida glabrata apresentaram sensibilidade dose dependente ao fluconazol. Pesquisas adicionais são necessárias sobre o uso de antissépticos na manutenção da saúde bucal desses pacientes, especialmente, considerando o elevado risco de mucosite. / The occurrence of Candida spp. is a threat to the oral health of cancer patients undergoing antineoplastic treatment. This study described the clinical variables of cancer patients with or without Candida spp. in the saliva; determined the prevalence of these strains, and assessed mouthwashes antimicrobial activity and the sensitivity profile to antifungals. Saliva samples of cancer patients, with or without mucositis, were collected. Saliva was subject to serial decimal dilution up to 10-3 and sowed in culture (CHROMagarTM Candida) to quantify the number of colony forming units per milliliter of saliva (CFU/mL). Specific biochemical tests were also done to identify the species. The Maximum Inhibitory Dilution (MID) was used to assess the antimicrobial activity of the mouthwashes (Periogard®, Cepacol® Cool Ice and 0.12% Chlorhexidine). The sensitivity profile of the strains as to amphotericin B and fluconazole was done by the Minimum Inhibitory Concentration (MIC), using Etest® strips. Non-parametric McNemar and Wilcoxon tests were used for statistical analysis, with level of significance (= 0.05). Of the 34 patients, 79.4% were male and 19 (55.9%) had mucositis. 9(26.5%) tested positive for Candida spp. in the saliva. Regarding the diversity of species, the study evidenced 12 different strains of Candida spp., 7 (20.6%) C. albicans, 3(8.8%) C. glabrata and 2 (5.9%) C. tropicalis. Mucositis was more common in patients with Candida, 66.7%. Comparing the MID results, it was verified that Cepacol® Cool Ice presented better results than other products. The worst activity was presented by 0.12% Chlorhexidine, 4(11.8%) of the strains were not inhibited at 1:10 dilution. As to the sensitivity profile, all strains were sensitive to amphotericin B and 2 (5.9%) strains of Candida glabrata were Dose-Dependent Sensitive to fluconazole. Additional research is needed to broaden the scientific evidences of the use of antiseptics in the maintenance of these patients oral heath, especially considering the high risk of mucositis.

Despite therapeutic advances, opportunistic fungal infectious diseases have increased in prevalence and have become a universal public health problem. Candida albicans (CA) is a commensal fungus that under certain environmental conditions can act as an opportunistic pathogen and colonize mucous membranes and tissues causing local and systemic infections. The emergence of drug resistant strains, as well as the increase of immunosuppressed patients, has limited therapeutic options. Therefore the aim of this study was to evaluate 1) The antifungal activity of Punicalagin (P), alone or in combination with Nystatin (N), against two CA strains. 2) The cytotoxicity effect of P and N, as well as the combination of both, on human primary cells. In the first step, yeasts of CA ATCC 90028 and SC5314 were exposed to P and N for 24 hours. The Minimal Inhibitory Concentration (MIC) of P (50 g/mL) and N (3.9 g/mL) were determined by the broth microdilution assay. The Checkerboard Assay was performed to verify the synergism between the combinations (8: PN, P8 N/4, P/8 N/2, P/8 N, P/4 N/2, P/4 N, P/2 N/4 and P/2 N/2), which were selected from the 56 combinations initially tested. The fungal metabolism was assessed by the metabolic reduction assay XTT (24h) and Minimum Microbicidal Concentration (MMC) was determined by Colony-forming unit (CFU/mL, 24h). The evaluation of virulence factors gene expression was amplified and quantified by PCR real time (Polymerase Chain Reaction-RT-qPCR, only for P/8 N/4 in 24h). The analysis of proteins related to essential biological processes of the fungus was performed by LC-MS/MS (24h). MIC and MMC of P were significantly reduced in the presence of N, indicating synergism between both. Once the antifungal potential of P was verified, we proposed to evaluate whether this drug acts through the same mechanism of action of N, altering the permeability of the cell membrane of the fungus (binding ergosterol). The evaluation of gene expression has demonstrated upregulation of some genes that may be related to a defense mechanism associated with stress or cell death. The proteomics analysis revealed alterations in the expression of several proteins in the fungi exposed to P/8 N/4 in relation to negative control, correlated with important biological processes, such as, energy metabolism, stress response, drug metabolism, among others. In the second step, cytotoxicity assays involving P and N, as well as the combination of both, were undertaken on human palate epithelial cells (HPEC) and human gingival fibroblasts cells (HGF) by Alamarblue dye. Similarly, P cytotoxicity was reduced when used in combination with N. Based on these in vitro results, the synergistic antifungal activity produced between P and N suggested that the combination of drugs, at the concentrations tested, may be a topical therapeutic or preventive alternative to be used in cases of superficial candidiasis, such as denture stomatitis. / Apesar dos avanços terapêuticos, doenças infecciosas por fungos oportunistas têm aumentado em prevalência e tornaram-se um problema universal de saúde pública. Candida albicans (CA) é um fungo comensal que, sob certas condições ambientais, pode atuar como um patógeno oportunista e colonizar mucosas e tecidos causando infecções locais e sistêmicas. O surgimento de cepas resistentes às drogas convencionalmente utilizadas, assim como aumento de pacientes imunodeprimidos, tem limitado as opções terapêuticas. Portanto o objetivo deste estudo foi avaliar: 1) a atividade antifúngica de Punicalagina (P), com ou sem a associação de Nistatina (N), contra duas cepas de CA. 2) O efeito citotóxico de P e N, assim como suas combinações, em culturas primárias humanas de células epiteliais de palato (CEPH) e de fibroblastos gengivais (FGH). Na primeira etapa, leveduras de CA ATCC 90028 e SC5314 foram expostas a P e N, por 24 horas. As concentrações inibitórias mínimas (CIMs) de P (50 g/mL) e N (3,9 g/mL) foram determinadas pelo método de diluição em caldo. O Ensaio Checkerboard foi realizado para verificar o sinergismo entre as combinações (8: PN, P8 N/4, P/8 N/2, P/8 N, P/4 N/2, P/4 N, P/2 N/4 e P/2 N/2), as quais foram selecionadas a partir de 56 combinações inicialmente testadas. O metabolismo fúngico foi avaliado pelo método do XTT (24h) e a Concentração Mínima Microbicida (CMM) foi realizada através de Unidades formadoras de colônias (UFC/mL, 24h). A avaliação da expressão gênica de fatores de virulência foi amplificada e quantificada por PCR em tempo real (Reação em Cadeia da Polimerase-RT-qPCR, apenas para P/8 N/4 em 24h). A análise proteômica para identificação de proteínas alteradas foi realizada por LC-MS/MS (24h). A MIC e MMC de P foram significativamente reduzidas na presença de N, indicando sinergismo entre ambas. Confirmado o potencial antifúngico, o Ensaio de mecanismo de ação (teste do ergosterol) foi realizado e não foi confirmada a ação de P através da ligação ao ergosterol. A avaliação da expressão gênica demonstrou regulação positiva de alguns genes que pode estar relacionado a um mecanismo de defesa associado ao estress ou a morte celular. A análise proteômica revelou proteínas diferencialmente expressas nos fungos expostos a P/8 N/4 em relação ao controle negativo (sem tratamento), as quais estão relacionadas ao processo de metabolismo energético, resposta ao estress e metabolismo de drogas, dentre outros. Na segunda etapa, CEPH e FGH foram expostas a P e N e suas combinações por 24h para realização dos ensaios de viabilidade por Alamarblue. Combinada à N, a Punicalagina apresentou-se menos citotóxica do que de forma isolada. Com base nesses resultados in vitro, o sinergismo antifúngico produzido entre P e N sugere que a combinação das drogas pode ser uma alternativa terapêutica tópica para ser utilizada nos casos de candidose localizada, como por exemplo, a estomatite protética.

Espécies microbianas, em especial as leveduras, são de grande importância para a produção de xilitol. A produção de xilitol envolve uma complicada regulação metabólica, incluindo o transporte de D-xilose, produção de enzimas fundamentais e cofator de regeneração. Assim, a triagem de microorganismos que consomem naturalmente D-xilose se torna uma maneira viável e eficaz para se obter organismos com possível aplicação industrial para a produção de xilitol. Neste trabalho foram isoladas vinte e oito leveduras provenientes do ambiente industrial da produção de etanol (torta de filtro) com habilidade de consumir D-xilose. O seqüenciamento e a identificação pela análise da região D1/D2 do gene do rDNA 26S demonstraram que todas pertencem ao gênero Candida, sendo 24 linhagens (85.71%) C. tropicalis e 4 linhagens (14.29%) C. rugosa. Das 28 linhagens isoladas, cinco linhagens de leveduras foram escolhidas aleatóriamente para o ensaio de bioconversão de D-xilose em xilitol devido ao fato das mesmas apresentarem velocidade de crescimento em D-xilose semelhantes. As linhagens selecionadas para o ensaio foram: Candida tropicalis MVP 03, Candida tropicalis MVP 16, Candida rugosa MVP 17, Candida rugosa MVP 21, Candida tropicalis MVP 40, pois representam bem a amostragem. Três leveduras pertencentes à coleção do Departamento de Ciências Biológicas da ESALQ / USP (kluyveromyces marxianus IZ 1339, Candida tropicalis IZ 1824 e Candida guilliermondii FTI 20037) foram utlizadas nos ensaios para obtenção de xilitol a partir da bioconversão da D-xilose como controle positivo. Para a formação de xilitol em meio sintético utilizando D-xilose como única fonte de carbono. Foram realizados ensaios da cinética de crescimento durante 96 horas de fermentação. Na primeira triagem, para a avaliação da melhor condição nutricional para o ensaio, as leveduras foram cultivadas em três meios quimicamente definidos: YNB 6.7 g L-1, UPX (uréia 2.3 g L-1 e peptona 6.6 g L-1) MCX (KH2PO4 0,62 g L-1; K2HPO4 2,0 g L-1; (NH4)2SO4 1,0 g L-1 MgSO4 1,1 g L-1, extrato de levedura 0.5 g L-1) acrescidos de 20 g L-1 de D-xilose, a 30°C e 120 rpm. O meio UPX apresentou o melhor rendimento, com uma produtividade volumetrica (Qp) entre 0,004 a 0,09, fator de conversão de xilose em xilitol (Yp/s) entre 0,23 a 0,28 g g-1, fator de conversão de D-xilose em biomassa (Yx/s) entre 0.20 a 0.24 g g-1, com uma eficiência de 10 conversão (h) entre 21% a 26%.As leveduras C. tropicalis MVP 03; C. tropicalis MVP 16; C. rugosa MVP 17; C. rugosa MVP 21; C. tropicalis MVP 40 foram avaliadas em uma triagem, em meio UPX, com padronização do inóculo inicial. Para os cinco isolados, a produção de xilitol variou de 5,76 a 32,97 g L-1, a partir de 50 g L-1 de D-xilose com produtividade (Qp) de 0,06 a 0,35 g L-1 h-1, fator de conversão de xilose em xilitol (Yp/s) de 0,14 a 0,65 g g-1, fator de conversão de D-xilose em biomassa (Yx/s) de 0,08 a 0,29 g g-1 e a eficiência de conversão (h) entre 6% e 61% que foi calculado segundo Barbosa et al 1988. Destacou-se a levedura C. tropicalis 16, produzindo 32,97 g L-1 de xilitol com um Qp de 0,35 g L-1 h-1, Yp/s de 0,65 g g-1, Y x/s de 0,11 g g-1 e eficiência de conversão (h) de 61 %. / Microbial species, particularly yeast, are of great importance for the production of xylitol. The xylitol production involves complicated metabolic regulation, including the transport of D-xylose, production of key enzymes and cofactor regeneration. Thus, screening of microorganisms that consume D-xylose naturally becomes a viable and effective way to obtain organisms with industrial application for the production of xylitol. In this work we isolated twenty-eight yeasts from the environment of the industrial production of ethanol (filter cake) with capacity to consume D-xylose. The sequencing and identification by analysis of the D1/D2 region of 26S rDNA gene showed that all belong to the genus Candida, and 24 strains (85.71%) C. tropicalis and 4 strains (14.29%) C. rugosa. Of the 28 isolates, five strains of yeast were selected randomly to test the bioconversion of D-xylose to xylitol due to the fact that they present rate of growth in D-xylose similar. The lines selected for testing were: Candida tropicalis MVP 03, Candida tropicalis MVP 16, Candida rugosa MVP 17, Candida rugosa MVP 21, Candida tropicalis MVP 40, and they represent a sampling. Three yeasts from the collection of the Department of Biological Sciences, ESALQ / USP (Kluyveromyces marxianus IZ 1339, Candida tropicalis IZ 1824 and Candida guilliermondii FTI 20037), used were the tests to obtain xylitol from the bioconversion of D-xylose as positive control, for the formation of xylitol in a synthetic medium using D-xylose as sole carbon source. Assays were performed in the kinetics of growth during 96 hours of fermentation. In the first evaluation, the evaluation of the best nutritional condition in the test, yeast cells were grown in three chemically defined media: YNB 6.7 g L-1, UPX (urea 2.3 g L-1 peptone and 6.6 g L-1) MCX ( KH2PO4 0.62 g L-1, K2HPO4 2.0 g L-1, (NH4)2SO4 1.0 g L-1 MgSO4 1.1 g L-1, yeast extract 0.5 g L-1) plus 20 g L-1 D-xylose at 30°C and 120 rpm. Mean UPX showed the best performance with a volumetric productivity (Qp) from 0.004 to 0.09, the conversion factor of xylose to xylitol (Yp/s) between 0,23 to 0,28 g g-1 conversion factor D-xylose in biomass (Yx/s) between 0.20 to 0.24 g g-1 Yeasts 0,20 to 0,24 g g-1, with a conversion efficiency (h) between 21% to 26%. C. tropicalis MVP 03, C. tropicalis MVP 16, C. rugosa MVP 17, C. rugosa MVP 21, C. tropicalis MVP 40 were evaluated in a screening, in media UPX, with standardization of initial inoculation. For 12 five isolates, the production of xylitol varied from 5.76 to 32.97 g L-1, from 50 g L-1 Dxylose with productivity (Qp) of 0.06 to 0,35 g L-1 h-1, the conversion factor of xylose to xylitol (Yp/s) 0.14 to 0.65 g g-1, the conversion factor of D-xylose in biomass (Yx/s) from 0.08 to 0.29 g g-1 and conversion efficiency (h) between 6% and 61% which was calculated according to Barbosa et al 1988. They outlined the yeast C. tropicalis MVP16, yielding 32.97 g L-1 of xylitol with a Qp of 0.35 g L-1 h-1, Yp/s to 0.65 g g-1, Y x/s of 0.11 g g -1 and conversion efficiency (h) of 61%.

Os tecidos pulpar e periodontal são frequentemente agredidos por fatores ambientais como calor, trauma mecânico e micro-organismos, sendo estes considerados o fator etiológico principal das periodontopatias e periapicopatias. Dentre as células residentes desses tecidos, especial atenção tem sido dada ao papel dos fibroblastos no desenvolvimento da resposta imune. Fibroblastos são células que respondem à estímulos microbianos e existem evidências do papel de receptores do tipo Toll (TLR) no reconhecimento desses estímulos. Dessa forma, o presente trabalho teve como objetivo principal avaliar o reconhecimento de Candida albicans por fibroblastos gengivais e pulpares. Para tal, fibroblastos isolados a partir de tecido gengival e pulpar de camundongos do grupo controle e deficientes de TLR2, CD14 e MyD88 foram avaliados quanto à expressão de TLRs e moléculas de superfície, resposta proliferativa e produção de citocinas (TGF-β, IL-1β, TNF-α, IL-13 e IL-6), após a estimulação com agonistas de TLR2, TLR4 e C. albicans. Fibroblastos gengivais e pulpares, apesar de provenientes de tecidos diferentes, apresentaram características morfológicas semelhantes. Contudo, a cinética de crescimento dos fibroblastos gengivais deficientes de MyD88 foi mais lenta, e fibroblastos pulpares demoraram mais tempo para surgir a partir dos fragmentos de tecido. A ausência de TLR2 e da molécula adaptadora MyD88 não afetaram a produção de colágeno Tipo I pelos fibroblastos gengivais. Entretanto, fibroblastos deficientes de CD14 apresentaram baixa produção de colágeno. Ademais, os fibroblastos gengivais expressaram TLR2, TLR3, TLR4, assim como as moléculas de adesão ICAM-1 e CD44. A ausência de TLR2 e CD14 interferiu na resposta proliferativa de fibroblastos gengivais e pulpares, respectivamente. O reconhecimento de C. albicans por fibroblastos gengivais e pulpares modulou a produção das citocinas. A produção de TNF-α foi dependente da sinalização via MyD88, CD14 e TLR2, enquanto que a produção de IL-1β e IL-13 foi dependente de TLR2. / Pulpal and periapical tissue are frequently injured by heat, mechanical trauma and microorganisms, which are considered the main etiological factor of periodontal and endodontic diseases. Among these tissue resident cells, special attention has been given to fibroblasts in the immune response. Fibroblasts are cells that recognize pathogens through Toll like receptors (TLR). The aim of this study was to evaluate the recognition of Candida albicans by pulpal and gingival fibroblasts from TLR2, CD14, MyD88 knockout mice and control group mice. The results were analyzed concerning the expression of TLR(s) and surface molecules, proliferative response and citokynes production (TGF-β, IL-1β, TNF-α, IL-13 e IL-6) after the cells stimulation with TLR2, TLR4 and C.albicans agonists. Gingival and Pulpal fibroblasts, even isolated from different tissue, showed morphological similarities; however, gingival fibroblast deficient of MyD88 show lower proliferative response and pulpa l fibroblasts needed more time to detach from tissue fragments. The production of Type I collagen was affected in gingival cells deficient of CD14. Gingival fibroblasts expressed TLR2, TLR3, TLR4, and the adhesion molecules (ICAM-1 and CD44). The absence of TLR2 and CD14 interfered with the proliferative response of pulpal and gingival fibroblasts, respectively. The recognition of C. albicans by gingival and pulpal fibroblasts modulated the citokynes production. TNF-α production after the recognition of C. albicans was dependent from MyD88, CD14 and TLR2 molecules, whereas the production of IL-1β and IL-13 was dependent of TLR2.

O objetivo deste trabalho foi quantificar a formação de biofilme de Candida albicans e avaliar a integridade da superfície de uma resina acrílica termopolimerizável tratada com os sistemas de polimento líquido Biscover LV (Bisco, Schaumburg, USA) e Surface Coat (Kuraray, Tokyo, Japan), após 30 e 90 ciclos de desinfecção química. Um total de 280 corpos de prova (10 X 10 X 2 mm) foram confeccionados, esterilizados e aleatoriamente divididos em 20 grupos (n=14), de acordo com o tipo de polimento (mecânico de 0,3 ou 3 m, Surface Coat e Biscover LV), número de ciclos testados (0, 30 e 90) e solução utilizada: Nenhuma (controle negativo), Hipoclorito de sódio 1% (experimental) e água destilada (controle positivo). Após exposição às respectivas soluções de acordo com o protocolo adotado, as amostras foram imersas em saliva artificial por 2 h para a formação da película adquirida salivar e então inoculadas com 2 mL de suspensão de C. albicans (1.107 cel/mL) para fase de adesão durante 90 min. Após esta fase, as amostras foram lavadas e imersas em TSB estéril por 24 h para crescimento do biofilme em estufa a 37ºC sob agitação. Para quantificação do biofilme, foi utilizado o método de coloração por Cristal Violeta, em 240 espécimes divididos em 20 grupos de 12 amostras cada. Esta análise foi realizada por espectrofotômetro com comprimento de onda de 595 nm para mensuração do nível de absorbância do sobrenadante obtido após a descoloração do biofilme. Para análise qualitativa da integridade da camada de polimento liquido, 2 amostras de cada grupo (uma contaminada e outra não) tiveram suas superfícies fotografadas em seis campos distintos através do microscópio eletrônico de varredura (MEV). Os resultados foram submetidos o teste paramétrico ANOVA, seguido de teste de Tukey (p<0,05). Comparando os tipos de tratamentos de superfície avaliados dentro do mesmo tempo e soluções testadas não pode-se notar diferença estatisticamente significante entre os grupos de 0,3 m e Biscover LV ou 3 m e Surface Coat quando comparados entre si. Porém quando comparados os grupos de 0,3 m e Biscover LV aos grupos de 3 m e Surface Coat, estes apresentaram diferença estatisticamente significante. A análise em MEV dos corpos de prova colonizados demostrou a presença de C. albicans na superfície do corpo de prova sob a forma de leveduras e hifas em todos os grupos, enquanto que nos não colonizados foi observada uma degradação progressiva em todos os tipos de tratamento de superfície a medida que os números de ciclos e os desafios químicos eram aumentados. Apesar disso, o grupo Biscover LV apresentou uma quantidade de biofilme formada compatível com uma superfície lisa (0,3 m), enquanto que Surface Coat apresentou quantidade de biofilme formada compatível com a superfície rugosa (3,0 m). / The aim of this study was to quantify Candida albicans biofilm formation and evaluate the surface integrity of an denture base resin treated with liquid-polish Biscover LV (Bisco, Schaumburg, USA) and Surface Coat (Kuraray, Tokyo, Japan), after 30 and 90 cycles of chemical disinfection. A total of 280 specimens (10 x 10 x 2 mm) were prepared, sterilized and randomly divided into 20 groups (n = 14), according to the type of polishing (mechanical 0.3 or 3 m, Surface Coat and Biscover LV), number of cycles tested (0, 30, 90) and the solution used: none (negative-control), 1% sodium hypochlorite (experimental) and distilled water (positive-control). After exposure to the respective solutions according to the protocol adopted, the samples were immersed in artificial saliva for 2 h to form the acquired salivary pellicle and then inoculated with 2 mL of C. albicans (1.107 cel / mL) for 90 min to adhesion. After this, samples were washed and immersed in TSB for 24 h to biofilm growth at 37°C. For biofilm quantification, the method of crystal violet staining was used in 240 specimens, divided into 20 groups of 12 samples each. This analysis was performed by a spectrophotometer at a wavelength of 595 nm by measuring the level of supernatants absorbance obtained after the biofilms stain release. For qualitative analysis of the integrity of the liquid-polish layer, two samples from each group (one colonized and one not) had their surfaces photographed in six different fields through the scanning electron microscope (SEM). The results were submitted to ANOVA followed by Tukey\'s test (p<0.05). Comparing the types of surface treatments evaluated, within the same time and tested solutions, can not be noted statistically significant difference between groups of 0.3 m and Biscover LV or 3 m and Surface Coat. But when comparing the groups of 0.3 m and Biscover LV to groups of 3 mm and Surface Coat, there was a statistically significant difference. SEM analysis of the colonized specimens demonstrated the presence of C. albicans in the form of yeast and hyphae in all groups. In not colonized surfaces a progressive degradation was observed that was bigger when the number of cycles and chemical challenges were increased. Nevertheless, the group Biscover LV showed a amount of biofilm similar to a smooth surface (0.3 m), while Surface Coat presented an amount compatible with the roughened surface (3.0 m).

A candidose bucal acomete grande número de pessoas mundialmente, sendo associada a condições como imunossupressão, radioterapia, tabagismo, higiene bucal, idade, xerostomia e uso de próteses removíveis. Uma importante abordagem terapêutica para essas infecções consiste nos medicamentos antifúngicos, que podem apresentar efeitos colaterais e resultar na resistência dos patógenos. Nesse contexto, a terapia fotodinâmica (PDT) faz-se interessante como alternativa capaz de minimizar essas limitações. Protocolos de PDT poderão ser mais facilmente assimilados à prática clínica se empregarem materiais já aprovados para uso odontológico. Sendo assim, este estudo propõe avaliar o uso de PDT com eritrosina como fotossensibilizador, irradiada por um LED azul, usando-se um modelo animal. Quarenta camundongos tiveram candidose induzida sobre o dorso da língua por meio de imunossupressão e inoculação com Candida albicans. Após estabelecimento da lesão durante cinco dias, os animais receberam um dentre quatro tratamentos possíveis: aplicação da eritrosina 5% seguida de irradiação pelo LED (E+L+); aplicação de eritrosina, somente (E+L-); salina seguida pela irradiação (EL+); e somente salina (E-L-). A fim de distinguir possíveis efeitos colaterais, os mesmos tratamentos foram aplicados em 12 camundongos sem a indução de candidose. O número de unidades formadoras de colônia de C. albicans foi contado após o tratamento, e a mucosa foi submetida à análise histológica para determinar o grau de inflamação. Os dados dos grupos foram comparados por meio de ANOVA e teste de Kruskal-Wallis, (&alpha;=0,05). Não foram detectadas diferenças significativas entre os grupos testados quanto à contagem de colônias de C. albicans e o grau de inflamação. O infiltrado inflamatório foi classificado como discreto na maioria dos casos. Os animais com candidose bucal induzida e os saudáveis que foram submetidos aplicação de eritrosina 5% e irradiação pelo LED apresentaram infiltrado inflamatório mais acentuado e lesões mais evidentes na camada epitelial, sugerindo que este protocolo ocasionou danos aos tecidos orais. / Oral candidosis affects many people worldwide and is associated with conditions such as immunosuppression, radiation, smoking, oral hygiene, age, xerostomia and use of removable prostheses. An important therapeutic approach for these infections consists of antifungal drugs, which have side effects and can result in the resistance of pathogens. In this context, photodynamic therapy (PDT) is an interesting alternative able to overcome those limitations. PDT protocols can be more easily assimilated in clinical practice if they employ materials already approved for use in dentistry. Thus, this study evaluate the PDT with the use of erythrosine as a photosensitizer, irradiated by a blue LED light, using an animal model. Forty mice had candidosis induced on the tongue by the immunosuppression and inoculation with Candida albicans. After five days that the lesion is established, the animals received one of four possible treatments: application of 5% erythrosine and irradiation by the LED (E+L+); erythrosine application, only (E+L- ); saline followed by irradiation (E-L+); and only saline (E-L-). In order to distinguish potential side effects, the same treatments were applied in 12 mice without induced candidosis. Colony-forming units (CFU) of C. albicans were counted after treatment, and the mucosa was subjected to histological analysis to determine the degree of inflammation. The data of the groups were compared using ANOVA and Kruskal-Wallis test (&alpha;=0.05). No significant difference was detected among the groups tested for the number of CFU of C. albicans and the degree of inflammation. The inflammatory infiltrate was classified as mild in most cases. Animals with induced oral candidosis and the healthy ones exhibited more pronounced inflammatory infiltrate and lesions in the epithelial layer following PDT by 5% erythrosine and irradiation by the LED light. Such findings suggest that this protocol resulted in damage to oral tissues.

Este estudo visou comparar as leveduras do gênero Candida encontradas em fontes de infecção com as leveduras colonizantes de diversos locais de superfície e ambiente, tendo como critérios os fatores associados à virulência. Houve um predomínio de Candida albicans (32%) seguido de C. parapsilosis (20%), C. lusitaniae (20%), C. krusei (8%) e C. guilliermondii (4%) em fontes de infecção. Em relação às espécies colonizantes, observaram-se C. tropicalis (33,4%), C. lusitaniae (21,2%), C. parapsilosis (18,2%), C. albicans (15%), C. famata (6,1%) e C. guilliermondii (6,1%). Quanto aos fatores associados à virulência observou-se ß hemólise em 19,7% dos isolados, α hemólise em 21,3% e não foi observada atividade hemolítica em 70% dos isolados. Dentre as amostras, houve sensibilidade para Anfotericina B em 100% das mesmas e em 98,57% para fluconazol. Das leveduras de C. albicans provenientes de fontes de infecção 100% demonstraram potencial de formação de biofilme. As espécies não-albicans com maior produção de biofilme foram C. krusei (100%), C. parapsilosis (75%), C. tropicalis (75%). Nas amostras oriundas de colonização, 100% de C. albicans desenvolveram biofilme e dentre as não-albicans destacaram-se C. parapsilosis (80%), C. tropicalis (77,78%). Elevadas capacidade de formação de biofilme e atividade metabólica foram observadas em 35,3% das espécies de Candida spp. Em Candida spp provenientes de fontes de colonização 33,3% apresentaram capacidade intermediária de produção de biofilmes mas com atividade metabólica alta. / This study aims to compare the Candida species recovered from sources of infection with ones that are colonizing various sites and surface at the environment, having as criteria the factors associated with virulence. There was a predominance of C.albicans (32%) followed by C. parapsilosis (20%), C. lusitaniae (20%), C. krusei (8%) and C. guilliermondii (4%) at sources of infection. For the colonizing species we observed C. tropicalis (33.4%), C. lusitaniae (21.2%), C. parapsilosis (18.2%), C. albicans (15%), C. famata (6.1%) and C. guilliermondii (6.1%). Regarding the factors associated with virulence β hemolysis was observed at 19.7% of the isolates and α hemolysis at 21.3% and it wasn’t seen hemolytic activity at 70% of the isolates. Among the isolates it was observed susceptibility for amphotericin B at 100% of the ones and at 98.57% for fluconazole. Among C. albicans from sources of infection 100% demonstrated the potential of biofilm formation. The non-albicans species with increased biofilm production were C. krusei (100%), C. parapsilosis (75%), C. tropicalis (75%). In isolates from colonization, 100% of C. albicans developed biofilm and among non-albicans species, predominated C. parapsilosis (80%), C. tropicalis (77.78%). High capacity for biofilm formation and metabolic activity were observed at 35,3% of the isolates. In Candida spp from sources of colonization 33.3% showed intermediate capacity to produce biofilms but with high metabolic activity.

O gênero Candida abriga várias espécies de importância médica e embora algumas venham adquirindo interesse crescente, Candida albicans continua sendo a mais importante e responsável pelo maior número de infecções. Encontrada na microbiota de seres humanos saudáveis, é responsável pela infecção oral fúngica mais comum, em relação bastante estreita com a estomatite sob prótese (EP). Esta é um processo inflamatório da mucosa oral, comum em portadores de próteses dentárias, parciais ou totais subjacentes a uma prótese, onde também podem estar outros microrganismos, interagindo com diversos fatores, ligados ao hospedeiro e aos próprios microrganismos presentes no biofilme da superfície interna da prótese. A maioria dos casos é assintomática e alguns pacientes relatam dor, prurido ou sensação de ardência. O diagnóstico é clínico, complementado por exames tais como o citológico e o micológico direto. O tratamento é quase sempre empírico, sem a clara certeza se o indivíduo é portador da levedura e se outras espécies, estão envolvidas. Os meios cromogênicos possibilitaram avanço no diagnóstico das candidíases orais. Sua utilização facilita a identificação destas leveduras, com resultados em menor tempo que os dos métodos já padronizados para outras espécies de Candida. O CHROMagar Candida (CC) é a referência, fornecendo resultados em 48 horas após semeadura direta do material coletado. O meio denominado Candida Chromogenic Agar (CCA), foi recentemente lançado em nosso mercado e tendo em vista o seu baixo custo parece ser mais uma ferramenta para o diagnóstico da candidíase, embora não haja, ainda, literatura disponível sobre o seu emprego. O objetivo do presente trabalho, foi comparar esse novo meio ao CHROMagar Candida, quanto à sensibilidade e especificidade no isolamento de espécies do gênero Candida da mucosa oral de portadores de próteses totais superiores, com ou sem sintomas de EP. Participaram do estudo, 61 pacientes, de ambos os gêneros, portadores de próteses totais (45,9%) ou uni maxilares superiores (54,1%). Dentre as 61 amostras coletadas, 45 (73,77%) foram positivas para leveduras em CC, sendo C. Albicans (38 amostras, 24 únicas e e 14 (36,84%) mistas. Destas, 8 de C. Albicans + C. Tropicalis (21,05%); 3 de C. Albicans + C. glabrata (7,89%); 3 de C. albicans + C. tropicalis + C. glabrata (7,89%). Outras espécies presentes foram, 15 C. tropicalis (33,33%). Duas únicas (13,33%), duas mistas, C. tropicalis + C. glabrata (13,33%) e uma C. tropicalis + C. parapsilosis (6,66%). Em CCA, das 45 amostras, 39 foram positivas (86,6%). C. albicans, foi a mais frequente, com 33 isolados (84,6%), sendo, 25 únicas (75,75%) e 8 mistas (24,25%). Assim, C. albicans + C. tropicalis (5 12,82%); C. albicans + C. glabrata (2 5,13%); C. albicans + C. tropicalis + C. glabrata (uma 2,56%). Outras espécies isoladas foram: C. tropicalis (3 7,7%), e C. glabrata, C. krusei e C. parapsilosis (uma de cada 2,56%). Foi possível concluir que o CHROMagar Candida foi mais sensível (100% x 65%) e mais específico para albicans (84,4% x 73,3%); tropicalis (33,3% x 20,0%) e glabrata (17,7 % x 8,8%). Ambos apresentaram a mesma especificidade (2,2%), para krusei e parapsilosis. / The genus Candida includes several species of medical importance and although some will acquire increasing interest, Candida albicans remains the most important and responsible for more infections. Found in the microbiota of healthy humans, is responsible for the most common oral fungal infection in very close relation with denture stomatitis (EP). This is a frequent inflammation of the oral mucosa in complete or partial dentures wearers, where may also be present other microorganisms, interacting with several factors linked to the host and the microorganisms present themselves, in the inner surface of the biofilm of the prostheses. Most cases are asymptomatic and some patients report pain, itching or burning sensation. The diagnosis is clinical, supplemented by tests such as cytological and mycological. Treatment is often empiric, with no clear certainty whether the individual is only a carrier of yeast and if other species are involved. The chromogenic media enabled advances in the diagnosis of oral candidiasis. Its use facilitates the identification of these yeasts, resulting in less time than those of already standardized methods for other species of Candida. The CHROMagar Candida (CC) is the reference, providing results in 48 hours from the material collection. The medium called Chromogenic Candida Agar (CCA) was recently launched in our market and in view of its low cost seems to be one more tool for the diagnosis of candidiasis, although there is a lack of literature available on it. The objective of this study was to compare this new medium to CHROMagar Candida for sensitivity and specificity in the isolation of species of genus Candida from the oral mucosa of patients with upper dentures with or without symptoms of EP. Sixty one patients of both genders were recruited wearing complete dentures (45.9%) or uni upper jaw (54.1%) prostheses. Among the 61 samples, 45 (73.77%) were positive for yeasts in CC, and C. albicans (38 samples, 24 unique and 14 (36.84%) mixed. From these, 8 of C. albicans + C. tropicalis (21.05%), 3 of C. albicans + C. glabrata (7.89%), 3 of C. tropicalis + C. albicans + C. glabrata (7.89%). Other species were present, being 15 C. tropicalis (33.33%). Two unique isolates (13.33%), two mixed: C. tropicalis + C. glabrata (13.33%) and C. tropicalis + C. parapsilosis (6.66%). In CCA, from the 45 samples, 39 were positive (86.6%). C. albicans was the most frequent, with 33 isolates (84.6%), being unique in 25 (75.75%) and eight in mixed cultures (24.25%). Thus, C. albicans + C. tropicalis (5 - 12.82%); C. albicans + C. glabrata (2 - 5.13%), C. tropicalis + C. albicans + C. glabrata (1- 2.56%). Other species isolated were C. tropicalis (3 7.7%) and C. glabrata, C. krusei and C. parapsilosis (one of each - 2.56%). It was possible to conclude that CHROMagar Candida was more sensitive (100% vs. 65%) and more specific for C. albicans (84.4% vs. 73.3%), C. tropicalis (33.3% vs. 20.0%) and C. glabrata (17.7% vs. 8.8%). Both media showed the same specificity (2.2%), for C. krusei and C. parapsilosis.

O aumento na incidência de infecções fúngicas e a alta toxicidade ou elevado índice de resistência associado aos antimicóticos comerciais, criou um mercado carente de novas drogas. Neste contexto, os peptídeos antimicrobianos (AMPs) surgem como uma alternativa promissora ou fonte de conhecimento por desempenhar ação inibidora de crescimento e/ ou letal contra bactérias Gram-positivas e Gram-negativas, fungos, parasitas e/ ou vírus, além de atividade antitumoral e efeito imunomodulador. Como os mecanismos pelos quais eles o fazem são diferentes daqueles das drogas não peptídicas, os AMPs estão pouco associados ao desenvolvimento de resistência microbiana. A hemoglobina (Hb) é uma fonte de peptídeos com funções biológicas diversas. O fragmento 33-61 (Hb33-61) da cadeia &#945; da Hb bovina foi o primeiro AMP descrito a ser gerado in vivo no trato gastrointestinal do carrapato Boophilus microplus. Nossos estudos posteriores usando CD e H1-RMN revelaram que a amidação C-terminal deste fragmento o tornava ainda mais ativo que o primeiro e que em presença de micelas de SDS o Hb33-61a apresenta uma dobra &#946; na porção N-terminal (Lys40-Phe43) e outra (Ser49- Ser52) seguida de &#945;-hélice no C-terminal (Ala53-Ala60), bem como um segmento Pro44-Leu48 capaz de mover-se independentemente e agir como uma dobradiça. Nossas investigações usando análogos sintéticos truncados do Hb33-61a mostraram que o Hb40-61a poderia ser sua porção mínima ativa por apresentar comportamento conformacional idêntico. Nossos estudos subsequentes enfocando as suas propriedades evidenciaram a sua capacidade de causar morte rápida de cepas de Candida, incluindo C. albicans resistentes ao fluconazol e extravasamento de conteúdo e formação de poros em LUVs, revelando sua ação permeabilizante de membrana. Em continuidade ao estudo do Hb40-61a, investigamos no presente trabalho as suas propriedades e o seu mecanismo de ação contra C. albicans. Para isso, sintetizamos, purificamos e caracterizamos esta hemocidina, o seu análogo inteiro composto por D aminoácidos (ent-Hb40-61a) e o seu análogo marcado com 5 (6) carboxifluoresceína (FAM-Hb40-61a). Ensaios com eritrócitos humanos confirmaram a baixa atividade hemolítica desses AMPs em meio de alta e baixa força iônica. O análogo ent-Hb40-61a apresentou a mesma atividade antifúngica que o análogo L, evidenciando um mecanismo de ação não-estereoespecífico. Análises de células de Candida tratadas com FAM-Hb40-61a por microscopia confocal mostraram que em ½ MIC e MIC o peptídeo deposita-se na membrana plasmática e é internalizado, respectivamente. Citometria de fluxo demonstrou que na MIC cerca de 97% das células encontram-se marcadas pelo peptídeo, confirmou a influência negativa da alta força iônica em sua atividade, mostrou que a internalização celular na MIC é independente da temperatura e que a alteração no metabolismo energético da célula afeta de maneira negativa a internalização do peptídeo. Ensaios de permeabilidade celular com Syto 09 e iodeto de propídeo confirmaram danos progressivos à membrana plasmática de C. albicans com o aumento da concentração do Hb40-61a. Experimentos usando DiBAC4(5) e de DPH revelaram que o Hb40-61a altera o potencial de membrana e afeta sua fluidez, respectivamente. Imagens preliminares das células tratadas e não tratadas com Hb40-61a por microscopia de força atômica (AFM) sugeriram alterações nas células de C. albicans após tratamento com a hemocidina. Medidas preliminares do diâmetro médio das células de C. albicans revelaram que elas diminuem após o tratamento com o peptídeo, o que pode ser mais um indício de dano à membrana plasmática por formação de poros e extravasamento de conteúdo intracelular. Assim, obtivemos fortes indícios de que o alvo do Hb40-61a é, de fato, a membrana plasmática das células de Candida, de que ele apresenta potencial de uso tópico para tratamento de candidíase e pode servir como modelo para o desenho de novas drogas antimicrobianas, peptídicas ou não, com propriedades ainda mais valiosas e índices terapêuticos mais elevados. Testes preliminares mostraram que é possível a adsorção do Hb40-58a à nanopartículas de PSS e que, em relação ao peptídeo livre, este arranjo mantém a atividade antifúngica com MIC superior e apresenta menor atividade hemolítica. / The increased incidence of fungal infections and the high toxicity or high level of resistance associated with conventional antimycotics created a demand for new drugs. Antimicrobial peptides (AMPs) constitute a promising alternative and/or an important source of knowledge due to their growth inhibitory action and/or lethality against Gram-positive and Gram-negative bacteria, fungi, parasites and/or viruses. Besides, AMPs display antitumoral and immunomodulator effects. As their mechanisms of action are different from those of non-peptide drugs, AMPs are less associated with the development of antimicrobial resistance. Hemoglobin (Hb) is a source of peptides with diverse biological functions. The fragment 33-61 (Hb33-61) of bovine Hb &#945; chain was the first AMP reported to be generated in vivo in gastrointestinal tract of Boophilus microplus. Our studies of Hb33-61 using CD and H1-NMR showed that amidation of its C-terminal (Hb33-61a) increases its activity; in the presence of SDS micelles, Hb33-61a is characterized by a central hinge joining the C-terminal region (containing a &#946; turn followed by a helical element) to the N-terminal region (that presents only a &#946; turn). Our previous investigations using synthetic truncated analogues of Hb33-61a suggested that Hb40-61a could be its minimal active portion as it presented equal biological and structural properties. Our subsequent studies focusing on its properties showed its ability to quickly kill Candida albicans strains (including those resistant to fluconazole) and to cause leakage of the contents of LUVs and pore formation in GUVs, revealing its membrane permeabilizing action. We further investigated the properties of Hb40-61a and its possible mechanism of action against C. albicans. To do it, we synthesized, purified and chemically characterized it, its all-D analogue (ent-Hb40-61a) and its analogue labeled with 5 (6) carboxyfluorescein (FAM-Hb40-61a). Tests using human erythrocytes confirmed the low toxicity of these hemocidins at high or low ionic strength. The ent-analogue was as active as the all-L compound suggesting a non stereospecific mechanism of action. Confocal microscopy analysis of Candida cells treated with FAM-Hb40-61a showed that at ½ MIC and MIC, the peptide deposits on the plasma membrane and is internalized, respectively. Flow cytometry results showed that at the MIC about 97% of the cells are marked by the peptide, confirmed the negative influence of high ionic strength on its antifungal activity and showed that the cellular internalization at the MIC is partially dependent on ATP, but independent on the temperature. Cell permeabilization assays using Syto 09 and propidium iodide confirmed progressive damage of the membrane as a function of Hb40-61a concentration. Experiments employing DiBAC4 (5) and DPH revealed that the Hb40- 61a alters the membrane potential and affects its fluidity, respectively. Preliminary atomic force microscopy (AFM) images of C. albicans cells before and after treatment with Hb40-61a suggested morphological changes in the plasma membrane. Preliminary measurements of the average diameters of the fungal cells indicated size reduction after treatment with the Hb40-61a probably resulting from pore formation and leakage of cell contents. Thus, we obtained strong evidences that the target of this peptide is indeed the plasma membrane of Candida cells. Thus, this hemocidin have the potential to be used topically for treating candidiasis and/or serve as model for the design of new antimicrobial drugs, peptide or non-peptide, with even more valuable properties and improved therapeutic indexes. Preliminary tests confirmed the possibility of adsorbing Hb40-58a to nanoparticles of polystyrene sulfate (PSS) and that resulting assembly is still active and less hemolytic than the free peptide.