A ocorrência de leveduras do gênero Candida spp. constitui uma ameaça a saúde bucal de pacientes oncológicos submetidos ao tratamento antineoplásico. Diante do exposto,objetivou-se no estudo avaliar as variáveis clínicas de pacientes oncológicos portadores ou não de Candida spp. na saliva; estimar a prevalência dessas cepas, avaliar a atividade antimicrobiana dos antissépticos bucais e, determinar o perfil de sensibilidade aos antifúngicos. Foram coletadas amostras de salivas de pacientes oncológicos, com e sem mucosite. A saliva foi submetida a diluição decimal seriada até 10-3 e semeada em meio de cultura (CHROMagarTM Candida) para quantificação das unidades formadoras de colônias por mililitro de saliva (UFC/mL). Também, realizaram-se provas bioquímicas específicas para identificação das espécies. Na avaliação da atividade antimicrobiana dos antissépticos bucais (Periogard®, Cepacol® Cool Ice e Clorexidina a 0,12%) utilizouse a Diluição Inibitória Máxima (DIM). O perfil de sensibilidade destas cepas a anfotericina B e fluconazol foi realizado pela Concentração Inibitória Mínima (CIM) por meio das fitas Etest®. Na análise estatística utilizou-se os testes não paramétricos de McNemar e Wilcoxon, com nível de significância (=0,05). Totalizou-se 34 pacientes dos quais 79,4% eram masculinos e 19(55,9%) estavam com mucosite. Das amostras de saliva 9(26,5%) eram positivas para Candida spp.. Evidenciou-se 12 cepas distintas de Candida spp., sendo 7(20,6%) C. albicans, 3(8,8%) C. glabrata e 2(5,9%) C.tropicalis. A mucosite foi mais freqüente 66,7% nos portadores de Candida. Comparando os resultados da DIM foi possível verificar que o Cepacol® Cool Ice apresentou os melhores resultados. A Clorexidina a 0,12% teve a pior atividade, sendo que 4 (11,8%) das cepas não foram inibidas na diluição de 1:10. Com relação ao perfil de sensibilidade, todas cepas foram sensíveis a anfotericina B e 2 (5,9%) das cepas de Candida glabrata apresentaram sensibilidade dose dependente ao fluconazol. Pesquisas adicionais são necessárias sobre o uso de antissépticos na manutenção da saúde bucal desses pacientes, especialmente, considerando o elevado risco de mucosite. / The occurrence of Candida spp. is a threat to the oral health of cancer patients undergoing antineoplastic treatment. This study described the clinical variables of cancer patients with or without Candida spp. in the saliva; determined the prevalence of these strains, and assessed mouthwashes antimicrobial activity and the sensitivity profile to antifungals. Saliva samples of cancer patients, with or without mucositis, were collected. Saliva was subject to serial decimal dilution up to 10-3 and sowed in culture (CHROMagarTM Candida) to quantify the number of colony forming units per milliliter of saliva (CFU/mL). Specific biochemical tests were also done to identify the species. The Maximum Inhibitory Dilution (MID) was used to assess the antimicrobial activity of the mouthwashes (Periogard®, Cepacol® Cool Ice and 0.12% Chlorhexidine). The sensitivity profile of the strains as to amphotericin B and fluconazole was done by the Minimum Inhibitory Concentration (MIC), using Etest® strips. Non-parametric McNemar and Wilcoxon tests were used for statistical analysis, with level of significance (= 0.05). Of the 34 patients, 79.4% were male and 19 (55.9%) had mucositis. 9(26.5%) tested positive for Candida spp. in the saliva. Regarding the diversity of species, the study evidenced 12 different strains of Candida spp., 7 (20.6%) C. albicans, 3(8.8%) C. glabrata and 2 (5.9%) C. tropicalis. Mucositis was more common in patients with Candida, 66.7%. Comparing the MID results, it was verified that Cepacol® Cool Ice presented better results than other products. The worst activity was presented by 0.12% Chlorhexidine, 4(11.8%) of the strains were not inhibited at 1:10 dilution. As to the sensitivity profile, all strains were sensitive to amphotericin B and 2 (5.9%) strains of Candida glabrata were Dose-Dependent Sensitive to fluconazole. Additional research is needed to broaden the scientific evidences of the use of antiseptics in the maintenance of these patients oral heath, especially considering the high risk of mucositis.

Made available in DSpace on 2015-04-22T22:14:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Cristina Pessoa Veloso Freire.pdf: 2819799 bytes, checksum: 8919fceb66aefa886139385d2b54aae1 (MD5) Previous issue date: 2010-06-09 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / the species most frequently at least seven species, has been associated with diseases in humans: Candida albicans, Candida. tropicalis, Candida stellatoidea, Candida pseudotropicalis (now called C. Kefyr), Candida parapsilosis, Candida guilliermondii and Candida krusei. There is an increased occurrence of infections by Candida species, caused by population growth that immunosuppression with high predisposition to develop infections. Also, there was an increased use of antifungal agents, where some Candida showed a decline in sensitivity to these agents. Increasing numbers of fungal strains are becoming resistant to the drugs available. As a result, there is a constant search for new antifungal drugs more effective and safer than existing ones. The naphthoquinones are widely distributed in nature, with the known activities, the antibacterial, antifungal and antitumor. Thus the objective of this study was to evaluate the antifungal activity and cytotoxicity of naphthoquinones semisynthetic in Candida strains isolated from the oral cavity. The strains studied were C. albicans, C. krusei, C. parapsilosis, C. kefyr, C. tropicalis and C. dubliniensis. The susceptibility of semi-synthetic naphthoquinones was tested initially by using the simple diffusion from the hole in the culture medium (hole plate), to obtain a quantitative analysis, and then for a quantitative analysis technique was used in broth. Patterns known antifungals were used, for comparison of antifungal activity. The semi-synthetic naphthoquinone that showed the best antifungal activity in the hole plate technique was NORALFA, followed by IVS322 with average of inhibition zone against C. albicans 21,26 mm and 16,62 mm respectively, and quantitative analysis of antifungal activity, substances NORALFA and IVS322 stood out with MIC against C. albicans 0,125 μg/ml and 0.5 μg/ml. It was found that none of the substances tested at a concentration of 50 μg/ml caused hemolysis and fibroblasts tested remained viable at a concentration of 12,5 μg/ml. This result is favorable, since the hemolysis test is a measure of toxicity and a positive result would preclude the therapeutic use of these substances. Through this work we determine the potential antifungal and cytotoxic profile of the compounds tested. / A candidíase é uma doença infecciosa causada pelo fungo Candida, sendo a espécie albicans a mais freqüentes. Sete espécies pelo menos, tem sido associadas a doenças no homem: Candida albicans, Candida. tropicalis, Candida stellatoidea, Candida peseudotropicalis (hoje chamada de C. Kefyr), Candida parapsilosis, Candida guilliermondii e Candida krusei. Há um aumento da ocorrência das infecções por espécies de Candida, causada pelo crescimento da população com imunodepressão que grande predisposição ao desenvolvimento de infecções.Números cada vez maiores de cepas fúngicas estão se tornando resistentes aos fármacos disponíveis no mercado. Em virtude disso, existe uma constante procura de novos fármacos antifúngicos mais eficazes, e mais seguros que os já existentes. As naftoquinonas são amplamente distribuídas na natureza, tendo como atividades conhecidas, a atividade antibacteriana, antifúngica e antitumoral. Desta forma o objetivo deste estudo foi avaliar a atividade antifúngica e citotoxicidade de naftoquinonas semi-sintéticas em cepas de Candida isoladas da cavidade oral. As cepas estudadas foram de C. albicans, C. krusei, C. parapsilosis, C. kefyr, C. tropicalis e C. dubliniensis. A suscetibilidade das naftoquinonas semisintéticas foi testada inicialmente, através do teste difusão a partir de orifício no meio de cultura (hole plate). Posteriormente para uma analise quantitativa foi utilizada a técnica de microdiluição em caldo. Padrões antifúngicos conhecidos foram usados, para comparação da atividade antifúngica. A citotoxicidade foi avaliada em hemácias de camundongos através do teste de hemólise e através do teste de viabilidade celular em fibroblastos, utilizando o Alamar Blue. A naftoquinona semisintética que apresentou melhor atividade antifúngica na técnica hole plate foi a NORALFA, seguida da IVS322 com médias do halo de inibição frente a C. albicans de 21,26 e 16,62 mm respectivamente, e na análise quantitativa da atividade antifúngica, as substâncias NORALFA e IVS322 se destacaram com CIM frente a C. albicans 0, 125 μg/ml e 0,5 μg/ml. Verificou-se que nenhuma das substâncias testadas a uma concentração de 50 μL/ml provocou hemólise e os fibroblastos testados permaneceram viáveis na concentração de 12,5 μL/ml. Este resultado é favorável, uma vez que o teste de hemólise é um parâmetro de toxicidade e um resultado positivo poderia impossibilitar o uso terapêutico dessas substâncias. Com a realização deste trabalho conseguimos determinar o potencial antifúngico e o perfil citotóxico das substâncias testadas.

Estomatite protética associada a Cândida (EPC), a lesão mais frequente em usuários de próteses removíveis, principalmente os idosos, caracteriza-se por uma inflamação da mucosa bucal que suporta a prótese. Está fortemente associada com Candida Albicans, bem como com fatores locais e sistêmicos, como a deficiência da resposta imune. Os monócitos são importantes na resposta protetora contra o fungo, produzindo citocinas que recrutam e ativam leucócitos. Existem alterações funcionais dessas células com o avanço da idade. Não foi possível encontrar na literatura dados referentes à função imunomodulatória dos monócitos de idosos com EPC. O presente trabalho pretendeu avaliar a produção de citocinas por essas células, estimuladas in vitro com C. albicans, obtidas do sangue periférico de idosos usuários de prótese total superior (PTS) com EPC, comparando-se com idosos usuários de PTS sem EPC, e com idosos e jovens não usuários de PTS. Os monócitos isolados foram cultivados em placas de cultura de 24 poços, na ausência ou presença de lipopolissacarídeo (LPS) ou C. albicans ATCC 90028 morta pelo calor. Após 18 horas, o sobrenadante foi coletado e submetido ao ensaio de imunoabsorção por ligação enzimática (ELISA) para dosagem das citocinas pró- inflamatórias fator de necrose tumoral- (TNF-), interleucina-6 (IL-6), IL-1, CXCL8 e proteína quimiotática de monócito (MCP-1), e anti-inflamatórias IL-10 e fator transformador de crescimento- (TGF-). Os resultados estão expressos como média ± desvio padrão dos valores obtidos para cada grupo, e foram analisados por meio de testes estatísticos não-paramétricos. Valores de p<0,05 foram considerados estatisticamente significativos. Os resultados demonstraram, de uma forma geral, alterações nos monócitos oriundos dos idosos com EPC, em comparação aos outros grupos: menor produção espontânea de CXCL8 e de MCP-1; menores níveis de TNF-, de IL-6, de IL-1, de CXCL8, de MCP-1 e de IL-10, após estímulo com LPS; e menor produção de TNF- e de IL-6, após estímulo com C. albicans. Comparando-se idosos e jovens, independente da presença de EPC, os resultados revelaram alterações nos monócitos dos idosos: uma menor produção de TGF-, espontânea e após estímulo com C. albicans. Em conclusão, a disfunção na produção in vitro de citocinas pró e anti-inflamatórias pelos monócitos de idosos com EPC pode representar um aspecto adicional associado à suscetibilidade ao desenvolvimento e à persistência da EPC. Ainda, a disfunção nos monócitos dos grupos de idosos, quanto à produção in vitro de TGF-, pode representar aspectos referentes à imunossenescência. / Candida-associated denture stomatitis (DS), the most frequent lesion among denture wearers, especially the elderly, is characterized by inflammation of the denture-bearing mucosa. It is strongly associated with Candida albicans, as well as with local and systemic factors, such as impaired immune response. Monocytes are important in the protective immune response against the fungus, by the production of cytokines that recruit and activate leukocytes. There are functional changes of these cells with advancing age. No data were found in the literature concerning the immunomodulatory function of these phagocytes in elderly patients with DS. This study aimed to evaluate the cytokine production by monocytes, challenged in vitro with C. albicans, obtained from peripheral blood of elderly denture wearers with DS, compared with elderly denture wearers without DS and elderly and young non-denture wearers. The isolated monocytes were cultivated in 24-well flat-bottomed culture plates, in the absence or presence of lipopolysaccharide (LPS) or heat-killed C.albicans ATCC 90028. After 18 hours, the supernatant was collected and submitted to the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for determination of the pro-inflammatory cytokines tumor necrosis factor-alpha (TNF-), interleukin-6 (IL-6), CXCL8, IL-1, monocyte chemotactic protein-1 (MCP-1) and anti-inflammatory cytokines IL-10 and transforming growth factor- (TGF-). The results are expressed as mean ± standard deviation of the values obtained for each group, and were analyzed using nonparametric statistical tests; p values <0.05 were considered statistically significant. The results demonstrated, in general, changes in monocytes from the elderly with DS, as compared to other groups: lower spontaneous production of CXCL8 and MCP-1; lower levels of TNF-, IL-6, IL-1, CXCL8, MCP-1 and IL-10 after stimulation with LPS; and reduced production of TNF- and IL-6 after stimulation with C. albicans. Comparing young and old, regardless of the presence of DS, the results revealed changes in the monocytes of the elderly: a lower production of TGF-, spontaneous and after stimulation with C. albicans. In conclusion, the dysfunctional in vitro production of pro- and anti-inflammatory cytokines by monocytes from elderly patients with EPC may represent an additional aspect associated with susceptibility to the development and to the persistence of DS. Still, the dysfunction in monocytes of elderly groups, regarding the in vitro production of TGF-, may represent aspects related to immunosenescence.

A Hiperplasia Papilar (HP) é considerada uma forma de candidose bucal, em especial uma forma de estomatite por dentadura, tipo III segundo a classificação de Newton (1962), a qual obedece a critérios clínicos e microscópicos. Sua etiologia é ainda pouco esclarecida, mas diversos fatores têm sido associados, tais como próteses dentárias mal adaptadas, má higiene oral, material utilizado na confecção das próteses resultando em hipersensibilidade, trauma, imunodeficiência e o fungo Candida albicans. A aderência e a invasão deste fungo no tecido epitelial já foram comprovadas e relatadas na literatura, entretanto ainda não há trabalhos que identifiquem a presença e a localização exata do fungo C. albicans no revestimento epitelial das lesões de HP. Os linfócitos T e os macrófagos são as principais células envolvidas no mecanismo de defesa do hospedeiro contra leveduras do gênero Candida, contudo é necessário estabelecer uma relação entre a presença do fungo e as alterações epiteliais, bem como o tipo e intensidade do infiltrado inflamatório presente nas HPs. O presente trabalho teve como objetivo avaliar a presença de Candida albicans no revestimento epitelial de lesões de HP, por meio de imunofluorescência, e correlacionar os valores quantitativos obtidos com as características demográficas, do epitélio e do infiltrado inflamatório subepitelial. Mucosa palatal normal foi utilizada como controle. A análise estatística comparativa múltipla entre o número médio de fungos nos diferentes grupos experimentais (Grupo HP e Grupo controle) foi obtida pelo teste de Mann Whitney, e a correlação do número médio de Candida albicans imunomarcadas com as características do revestimento epitelial e do infiltrado inflamatório subepitelial por meio do teste de Spearman. Em ambos os testes, foram adotados o nível de significância de 5% (p<0,05). Apenas as lesões de HP demonstraram a presença de C. albicans, e o número médio foi de 14 C. albicans/mm2. Não se observou correlação entre o número médio de C. albicans e as diferentes características epiteliais ou do infiltrado inflamatório subjacente ou ainda as características demográficas. / The papillary hyperplasia (PH) is considered a form of oral candidosis, in particular a form of denture stomatitis, type III according to the classification of Newton (1962), which fulfills the clinical and microscopic criteria. Its etiology is still unclear, but several factors have been associated, such as prostheses poorly adapted, poor oral hygiene, material used in the manufacture of prostheses resulting in hypersensitivity, trauma, immune and fungus Candida albicans. The adhesion and invasion of this fungus in the epithelial tissue have been demonstrated and reported in the literature, however there is not a work to identify the presence and exact location of the fungus C. albicans in the epithelial lining of the lesions of PH. T-lymphocytes and macrophages are the main cells involved in host defense mechanism against the yeast of Candida, however it is necessary to establish a relationship between the presence of the fungus and the epithelial changes, and the type and intensity of inflammatory infiltrate present in PHs. This study aimed to evaluate the presence of Candida albicans in the epithelial lining of lesion of PH, by immunofluorescence and to correlate the quantitative values obtained with the demographic characteristics, the epithelium and the subepithelial inflammatory infiltrate. Normal palatal mucosa was used as control. Comparative statistical analysis between the multiple number of fungi in different experimental groups (PH group and Control group) was obtained by Mann Whitney test, and correlation of the average number of Candida albicans immunomarked with the characteristics of the epithelial lining and subepithelial inflammatory infiltrate by Spearman test. In both tests were used a significance level of 5% (p <0.05). Only the lesions of PH demonstrated the presence of C. albicans, and the average number was 14 C. albicans/mm2. There was no correlation between the average number of C. albicans and the different characteristics of epithelial or underlying inflammatory infiltrate or demographic characteristics.

A Estomatite protética associada a Candida (EPC) acomete a mucosa bucal em contato com próteses removíveis e, clinicamente, caracteriza-se por eritema com diferentes graus de inflamação. Esta doença é considerada de etiologia multifatorial, isto é, uma associação de fatores como trauma, falta de higienização, uso contínuo da prótese, hipersensibilidade ao material usado na dentadura, diabetes, terapia imunossupressora e infecção por fungo, como diferentes espécies de Candida. Os principais fatores de virulência deste fungo são a formação de hifas, dimorfismo, alterações fenotípicas, aderência, persistência, sinergismo com as bactérias, interferências com o sistema de defesa do hospedeiro e a produção de enzimas hidrolíticas. Dentre as enzimas hidrolíticas, a proteinase aspartil secretada (SAP) é uma das mais importantes para a patogenia de C. albicans, sendo nociva para o tecido epitelial e para o sistema imune do hospedeiro. Não está totalmente compreendida a real penetração do fungo nos tecidos e sua correlação com a presença da SAP, na doença estomatite protética. Essa dificuldade de avaliação pode ser justificada pelas divergências intrínsecas e extrínsecas observadas em muitos aspectos, como diferentes costumes, hábitos sociais, estado emocional e fisiológico. A utilização de um modelo experimental em animais poderá minimizar essas divergências e fornecer condições mais padronizadas para o experimento. Neste trabalho, foram avaliadas, quantitativamente, a expressão gênica das enzimas SAP-2, SAP-5 e SAP-9, presentes no biofilme formado na superfície interna das placas acrílicas superiores de ratos e, microscopicamente, a invasão do fungo no tecido epitelial do palato. Para isso, foram selecionados 49 ratos Wistar, com 90 dias de vida, pesando em média 300g, os quais foram divididos em 3 grupos: Controle, Placa/Candida e Placa, acompanhados durante 2, 4 e 6 dias. Os resultados demostraram que, em 4 dias de uso da placa acrílica contaminada, houve, em alguns ratos, sinais clínicos de inflamação no palato duro; microscopicamente, hiperplasia epitelial, hiperqueratinização, invasão fúngica nas camadas superficiais do revestimento epitelial, microabscessos de Munro e hiperplasia papilar; e maior percentual de neutrófilos no Grupo Placa/Candida em relação aos Grupos Controle e Placa. Também no quarto dia de uso da placa acrílica superior, no Grupo Placa/Candida, o biofilme formado na sua superfície interna apresentou a mais alta expressão gênica relativa das enzimas SAP-2, SAP-5 e SAP-9 que os períodos de 2 e 6 dias de uso. Assim, a invasão fúngica no revestimento epitelial do palato duro pode estar correlacionada com a alta expressão de RNAm das SAPs -2, -5 e -9. / Denture stomatitis (D.S.) affects the oral mucosa in contact with removable dentures, and clinically characterized by erythema with varying degrees of inflammation. This disease is considered a multifactorial etiology, with a combination of factors such as trauma, lack of hygiene, continuous use of stents, hypersensitivity to the material used for dentures, diabetes, immunosuppressive therapy and fungal infection, such as different species of Candida. The main virulence factors of the fungus are the formation of hyphae, dimorphism, phenotypic changes, adherence, persistence, synergism with bacteria, interference with the host defense system and the production of hydrolytic proteins. Among the hydrolytic proteins, the secreted aspartyl proteinase (SAP) is one of the most important in the pathogenesis of C. albicans. SAP is harmful to both the epithelial tissue and to the host\'s immune system. It is not fully understood the real penetration of the fungus in the epithelium tissue and its correlation with the presence of SAP, in denture stomatitis. This difficulty in evaluation can be justified by the intrinsic and extrinsic differences observed in many aspects, different customs, social`s habits, emotional and physiological state. Using an experimental animal model may minimize these differences and provide more standardized conditions for the experiment. In the present work, the aim was to evaluate quantitatively the gene expression of enzymes SAP-2, SAP-5 and SAP-9 of the biofilm formed in internal surface of rat`s upper acrylic plates, and to analysis microscopically, the fungal invasion in palatal epithelial tissue. 49 Wistar rats were selected, 90 days old, weighing on average 300g. They were divided into three groups: Control Group, Plate/Candida and Plate, follow by 2, 4 and 6 days of the use of the plates. The results demonstrated, in four days of use of the acrylic plate, clinical signs of inflammation in the hard palate; microscopically epithelial hyperplasia, hyperkeratinization, fungal invasion in the superficial layers of the epithelial lining, Munro`s microabscess and papillary hyperplasia; and higher percentage of neutrophils in the Plate/Candida Group, compared to Control and Plate Groups. In the period of 4 days, the relative gene expression of the SAPs-2, -5 and -9 in biofilm also showed to be higher in Plate/Candida Group, compared with the periods of 2 and 6 days. Thus, the fungal invasion in the epithelial lining of the hard palate may be correlated with high mRNA expressionn of SAPs -2, -5 e -9.

As infecções sistêmicas causadas por Candida spp. representam importante causa de morbidade e mortalidade em pacientes pediátricos internados em unidades de cuidados intensivos. A utilização de fármacos imunodepressores em pacientes submetidos a transplantes, antibioticoterapia prolongada, nutrição parenteral, presença de cateter venoso central, entre outros fatores, contribuem para o aumento na freqüência destas infecções oportunísticas. Embora Candida albicans permaneça como a espécie mais freqüentemente isolada de episódios de candidemia, tem ocorrido aumento do número de infecções causadas por espécies não albicans. Os métodos convencionais de cultivo apresentam sensibilidade limitada, além de demandar tempo prolongado para a identificação das espécies infectantes. A Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) requer pequenos volumes de sangue para análise, situação ideal para crianças gravemente enfermas, propiciando diagnóstico rápido e identificação precisa das espécies de Candida. Este estudo teve como objetivos padronizar técnicas de PCR de dupla amplificação, para identificar cinco espécies de Candida em amostras de sangue de pacientes pediátricos com risco de desenvolver candidemias, e comparar os resultados com as hemoculturas. Foram analisadas amostras de sangue de 80 pacientes pediátricos internados na Unidade de Terapia Intensiva do Instituto da Criança do Hospital das Clínicas da FMUSP, alocados em dois grupos: 58 pacientes que apresentavam duas ou mais condições predisponentes que elevam o risco de infecção fúngica (Grupo 1); e 22 pacientes em condições clínicas de menor gravidade e risco mais baixo, que foram estudados para avaliação da freqüência de resultados falso-positivos por PCR (Grupo 2). A primeira amplificação identificou fragmento da região ITS do DNA ribossômico, e a segunda etapa amplificou fragmentos espécie-específicos para C.albicans, C.glabrata, C.parapsilosis, C.tropicalis e C.krusei. Para as amostras com detecção de Candida spp. somente por PCR, foram realizadas restrições enzimáticas e seqüenciamentos, para a confirmação da especificidade dos amplificados. A concordância entre os resultados das hemoculturas e das PCR foi avaliada pelo teste de McNemar, com nível de significância de 5%. As hemoculturas foram positivas em 15,5% dos pacientes do grupo 1, enquanto as amplificações por PCR detectaram DNA de Candida spp. em 25,9% dos casos, incluindo todos os pacientes com culturas positivas. Houve concordância na identificação das espécies em 88,9% dos casos. Em dois pacientes, a PCR identificou mais de uma espécie infectante, o que não ocorreu pelas hemoculturas. Nos seis casos em que somente a PCR detectou Candida spp. nas amostras de sangue, as restrições enzimáticas e os seqüenciamentos confirmaram a especificidade das amplificações. No grupo 2, as hemoculturas foram negativas em todos os 22 casos, e a PCR detectou C.glabrata em um paciente, cujos amplificados, após seqüenciamento, apresentaram 98% de homologia com o protótipo. O teste de McNemar mostrou que a discordância encontrada entre os métodos é estatisticamente significante e favorece a PCR (p = 0,031). Os resultados do presente estudo demonstraram que a técnica de PCR apresentou maior poder de detecção de Candida spp. em amostras de pacientes com risco de desenvolver candidemia, quando comparada às hemoculturas. A PCR foi ainda capaz de detectar mais de uma espécie infectante na mesma amostra de sangue / Disseminated candidiasis is an important cause of morbidity and mortality in immunocompromised and critically ill pediatric patients. Increased use of immunosupressive drugs, indwelling catheters, broad-spectrum antibiotics, parenteral nutrition and other predisposing conditions have contributed to the increment of Candida bloodstream infections. Although Candida albicans remains the leading species, a growing number of nonalbicans isolates has been reported. Laboratory diagnosis of candidemia is troublesome due to the lack of blood cultures sensitivity. Detection of Candida DNA by polymerase chain reaction (PCR) in tiny blood volumes may provide a more rapid and reliable candidemia detection in critically ill children. The present study aimed at standardizing nested-PCR amplifications for identification of five Candida species, comparing results with those obtained by blood cultures. Eighty patients admitted to the pediatric intensive care unit of the Instituto da Criança do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo were divided into two groups: 58 patients presenting with two or more predisposing conditions to develop candidemia (Group 1), and 22 patients with lower risk, enrolled to establish the frequency of PCR false-positive results (Group 2). Nested amplifications were targeted to Candida ITS sequence, the first round yielding a gender specific fragment, and the second round identified five Candida species corresponding to C. albicans, C. tropicalis, C. glabrata, C. parapsilosis and C. krusei. When PCR positive results were not confirmed by blood cultures, enzymatic restriction and DNA sequencing were performed. Agreement between both methods was assessed by the McNemar test, adopting a level of significance of 5%. Blood cultures were positive in 15.5% of group 1 patients, whereas nested-PCR identified Candida species in 25.9%, including all culture positive patients. PCR was 88.9% concordant with blood cultures species identification, but only the molecular technique identified dual candidemia in two patients. Amplification products of six patients with negative blood cultures submitted to enzymatic restriction and sequencing analysis showed high degree of homology with Candida reference strains, confirming the specificity of PCR. Blood cultures were negative in all patients of group 2, but PCR detected C.glabrata in one case whose amplification products resulted in 98% of homology with the reference strain. The McNemar test showed disagreement between both methods, favoring PCR (p=0.031). In the present study, PCR was more sensitive to detect Candida species in comparison to blood cultures, being also able to identify dual candidemia

Espécies microbianas, em especial as leveduras, são de grande importância para a produção de xilitol. A produção de xilitol envolve uma complicada regulação metabólica, incluindo o transporte de D-xilose, produção de enzimas fundamentais e cofator de regeneração. Assim, a triagem de microorganismos que consomem naturalmente D-xilose se torna uma maneira viável e eficaz para se obter organismos com possível aplicação industrial para a produção de xilitol. Neste trabalho foram isoladas vinte e oito leveduras provenientes do ambiente industrial da produção de etanol (torta de filtro) com habilidade de consumir D-xilose. O seqüenciamento e a identificação pela análise da região D1/D2 do gene do rDNA 26S demonstraram que todas pertencem ao gênero Candida, sendo 24 linhagens (85.71%) C. tropicalis e 4 linhagens (14.29%) C. rugosa. Das 28 linhagens isoladas, cinco linhagens de leveduras foram escolhidas aleatóriamente para o ensaio de bioconversão de D-xilose em xilitol devido ao fato das mesmas apresentarem velocidade de crescimento em D-xilose semelhantes. As linhagens selecionadas para o ensaio foram: Candida tropicalis MVP 03, Candida tropicalis MVP 16, Candida rugosa MVP 17, Candida rugosa MVP 21, Candida tropicalis MVP 40, pois representam bem a amostragem. Três leveduras pertencentes à coleção do Departamento de Ciências Biológicas da ESALQ / USP (kluyveromyces marxianus IZ 1339, Candida tropicalis IZ 1824 e Candida guilliermondii FTI 20037) foram utlizadas nos ensaios para obtenção de xilitol a partir da bioconversão da D-xilose como controle positivo. Para a formação de xilitol em meio sintético utilizando D-xilose como única fonte de carbono. Foram realizados ensaios da cinética de crescimento durante 96 horas de fermentação. Na primeira triagem, para a avaliação da melhor condição nutricional para o ensaio, as leveduras foram cultivadas em três meios quimicamente definidos: YNB 6.7 g L-1, UPX (uréia 2.3 g L-1 e peptona 6.6 g L-1) MCX (KH2PO4 0,62 g L-1; K2HPO4 2,0 g L-1; (NH4)2SO4 1,0 g L-1 MgSO4 1,1 g L-1, extrato de levedura 0.5 g L-1) acrescidos de 20 g L-1 de D-xilose, a 30°C e 120 rpm. O meio UPX apresentou o melhor rendimento, com uma produtividade volumetrica (Qp) entre 0,004 a 0,09, fator de conversão de xilose em xilitol (Yp/s) entre 0,23 a 0,28 g g-1, fator de conversão de D-xilose em biomassa (Yx/s) entre 0.20 a 0.24 g g-1, com uma eficiência de 10 conversão (h) entre 21% a 26%.As leveduras C. tropicalis MVP 03; C. tropicalis MVP 16; C. rugosa MVP 17; C. rugosa MVP 21; C. tropicalis MVP 40 foram avaliadas em uma triagem, em meio UPX, com padronização do inóculo inicial. Para os cinco isolados, a produção de xilitol variou de 5,76 a 32,97 g L-1, a partir de 50 g L-1 de D-xilose com produtividade (Qp) de 0,06 a 0,35 g L-1 h-1, fator de conversão de xilose em xilitol (Yp/s) de 0,14 a 0,65 g g-1, fator de conversão de D-xilose em biomassa (Yx/s) de 0,08 a 0,29 g g-1 e a eficiência de conversão (h) entre 6% e 61% que foi calculado segundo Barbosa et al 1988. Destacou-se a levedura C. tropicalis 16, produzindo 32,97 g L-1 de xilitol com um Qp de 0,35 g L-1 h-1, Yp/s de 0,65 g g-1, Y x/s de 0,11 g g-1 e eficiência de conversão (h) de 61 %. / Microbial species, particularly yeast, are of great importance for the production of xylitol. The xylitol production involves complicated metabolic regulation, including the transport of D-xylose, production of key enzymes and cofactor regeneration. Thus, screening of microorganisms that consume D-xylose naturally becomes a viable and effective way to obtain organisms with industrial application for the production of xylitol. In this work we isolated twenty-eight yeasts from the environment of the industrial production of ethanol (filter cake) with capacity to consume D-xylose. The sequencing and identification by analysis of the D1/D2 region of 26S rDNA gene showed that all belong to the genus Candida, and 24 strains (85.71%) C. tropicalis and 4 strains (14.29%) C. rugosa. Of the 28 isolates, five strains of yeast were selected randomly to test the bioconversion of D-xylose to xylitol due to the fact that they present rate of growth in D-xylose similar. The lines selected for testing were: Candida tropicalis MVP 03, Candida tropicalis MVP 16, Candida rugosa MVP 17, Candida rugosa MVP 21, Candida tropicalis MVP 40, and they represent a sampling. Three yeasts from the collection of the Department of Biological Sciences, ESALQ / USP (Kluyveromyces marxianus IZ 1339, Candida tropicalis IZ 1824 and Candida guilliermondii FTI 20037), used were the tests to obtain xylitol from the bioconversion of D-xylose as positive control, for the formation of xylitol in a synthetic medium using D-xylose as sole carbon source. Assays were performed in the kinetics of growth during 96 hours of fermentation. In the first evaluation, the evaluation of the best nutritional condition in the test, yeast cells were grown in three chemically defined media: YNB 6.7 g L-1, UPX (urea 2.3 g L-1 peptone and 6.6 g L-1) MCX ( KH2PO4 0.62 g L-1, K2HPO4 2.0 g L-1, (NH4)2SO4 1.0 g L-1 MgSO4 1.1 g L-1, yeast extract 0.5 g L-1) plus 20 g L-1 D-xylose at 30°C and 120 rpm. Mean UPX showed the best performance with a volumetric productivity (Qp) from 0.004 to 0.09, the conversion factor of xylose to xylitol (Yp/s) between 0,23 to 0,28 g g-1 conversion factor D-xylose in biomass (Yx/s) between 0.20 to 0.24 g g-1 Yeasts 0,20 to 0,24 g g-1, with a conversion efficiency (h) between 21% to 26%. C. tropicalis MVP 03, C. tropicalis MVP 16, C. rugosa MVP 17, C. rugosa MVP 21, C. tropicalis MVP 40 were evaluated in a screening, in media UPX, with standardization of initial inoculation. For 12 five isolates, the production of xylitol varied from 5.76 to 32.97 g L-1, from 50 g L-1 Dxylose with productivity (Qp) of 0.06 to 0,35 g L-1 h-1, the conversion factor of xylose to xylitol (Yp/s) 0.14 to 0.65 g g-1, the conversion factor of D-xylose in biomass (Yx/s) from 0.08 to 0.29 g g-1 and conversion efficiency (h) between 6% and 61% which was calculated according to Barbosa et al 1988. They outlined the yeast C. tropicalis MVP16, yielding 32.97 g L-1 of xylitol with a Qp of 0.35 g L-1 h-1, Yp/s to 0.65 g g-1, Y x/s of 0.11 g g -1 and conversion efficiency (h) of 61%.

Estudou-se a influência da concentração inicial de substrato no cultivo em fermentador para produção de biomassa de Candida utilis IZ-1840 em meio sintético tamponado contendo glicerol (1,2,3-propanotriol) como fonte exclusiva de carbono nas seguintes concentrações: 15, 25, 35, 45, 55, 65 e 75 g/L com ensaios em duplicata. Observou-se um comportamento cinético característico de fenômeno de inibição por substrato, tendo-se então ajustada uma equação de modelo de inibição baseada na literatura para os dados de velocidade específica máxima de crescimento celular em função da concentração inicial de substrato. A partir de tal equação determinou-se o valor da concentração inicial de substrato onde não ocorre inibição, definido como S* ( S*=17,511 g/L) e o valor teórico acima do qual a inibição é máxima definido como Sm, (Sm=175,4 g/L). O valor teórico de velocidade específica máxima de crescimento celular, definido como &#181;* correspondente ao valor S* como concentração de substrato inicial foi calculada em 0,225 1/h. / The influence of initial substrate concentration in the growth of Candida utilis IZ-1840 in a buffered synthetic mediurn was studied utilizing glycerol (1,2,3-propanetriol) as an exc1usive carbon source, in the following concentrations: 15, 25, 35, 45, 55, 65 and 75 of in double assays. Characteristic kinetic behavior of substrate inhibition was detected, then one model equation of inhibition based on literature was adjusted for the maximum specific growth rate in function of the initial substrate concentration. From this equation it was possible to determine the value of the initial substrate concentration that do not occur growth inhibition, defined as S* (S* = 17,511 g/L).and the theoretical value of limit concentration where above this the growth inhibition becomes maximum which was defined as Sm (Sm = 175,4 g/L). The theoretical value for maximum specific growth rate, defmed as &#181;* corresponding to determined S* as initial substrate concentration was calculated in 0,225 1/h.

A produção biotecnológica de xilitol e etanol mediante o cultivo de leveduras em hidrolisados hemicelulósicos obtidos a partir de resíduos agroindustriais é de grande interesse econômico. Isso porque, esse processo pode agregar valor aos resíduos lignocelulósicos, substituir o corrente e oneroso processo químico de obtenção de xilitol, além de promover um aproveitamento completo dos materiais, utilizando as frações celulósica e hemicelulósica, para a obtenção de etanol, biocombustível de grande interesse econômico e ambiental. O presente trabalho teve como objetivo ampliar os conhecimentos da produção biotecnológica de xilitol e etanol mediante o cultivo de Candida guilliermondii NRRL Y-2075 a partir de hidrolisado de casca de soja (SHH). A melhor condição de hidrólise testada (125 °C; 1,4 % (v/v) H2SO4; 1 h; 1/10 relação sólido/líquido) promoveu hidrólise de 76 % da hemicelulose da casca de soja, liberando, 85 e 62 % de manose e xilose, respectivamente. Dentre os tratamentos de detoxificação testados no hidrolisado de casca de soja quatro vezes concentrado (SHH-4C), o carvão ativado (10 % (p/v)) demonstrou os melhores resultados, apresentando alto índice de remoção de contaminantes, 95 e 76 % para furfural e compostos fenólicos, respectivamente. Os parâmetros cinéticos obtidos a partir do cultivo em SHH-4C demonstraram que a pressão osmótica desse meio é maior do que a suportada por leveduras osmofílicas, revelando a característica osmotolerante da C. guilliermondii NRRL Y-2075. Os cultivos realizados em frascos agitados empregando SHH duas vezes concentrado (SHH-2C) resultaram na produção de etanol com altos índices de rendimento, não havendo produção de xilitol, devido, provavelmente, a uma variação na preferência do cofator da xilose redutase nesta levedura. Os cultivos de SHH-2C em batelada, avaliando-se a influência do coeficiente de transferência de oxigênio em três diferentes níveis (kLa de 0, 8 e 46 h-1, respectivamente, anaeróbio, microearóbio e aeróbio), comprovaram a possibilidade de produção de xilitol a partir de hidrolisado de casca de soja desde que condições limitadas de oxigênio (kLa de 8 h-1) sejam empregadas, bem como, a boa fermentabilidade do meio dado o alto rendimento de formação de biomassa sob condições aeróbias (kLa de 46 h-1). Os resultados obtidos no presente trabalho revelam o potencial do hidrolisado de casca de soja em aplicações biotecnológicas. / The biotechnology production of xylitol and ethanol by yeasts in hemicellulosic hydrolysates from agro industrial residues has great economic interest. This process can add value to these materials; replace the expensive chemical processes currently used for xylitol production, and makes the bioconversion of lignocellulosic materials into ethanol using hemicellulose in addition to cellulose to obtain this biofuel of important economical and environmental interest. The aim of the present work was to improve the knowledge about the biotechnological production of xylitol and ethanol employing the cultivation of Candida guilliermondii NRRL Y-2075 in soybean hull hydrolysate (SHH). The best acid hydrolysis of soybean hull (125 °C; 1.4 % (v/v) H2SO4; 1 h; 1/10 solid/liquid ratio) produced a hydrolysis of 76 % of hemicellulose from soybean hull, liberating approximately, 85 and 62 % of the total xylose and manose, respectively. Four-fold soybean hull hydrolysate (SHH-4C) was submitted to different detoxification treatments, of which activated charcoal 10 % (w/v) showed the best results, removing 95 and 76 % of furfural and phenol, respectively. Kinetic parameters obtained from the cultivation of C. guilliermondii NRRL Y-2075 on detoxified SHH-4C have shown that the osmotic pressure of this medium is higher than that supported by most osmophilic yeasts, revealing the osmotolerant characteristic of C. guilliermondii NRRL Y-2075. When cultivations were carried out on two times concentrated SHH (SHH- 2C) in shake flasks, we obtained high yields of ethanol production. Although xylose was present in high concentrations, no xylitol was produced, probably due to some varying cofactor preference of xylose reductase in this yeast strain. Batch cultivation of SHH-2C employing as variable parameter the oxygen volumetric mass transfer coefficient (kLa), evaluating three different conditions of aeration (kLa of 0, 8 e 46 h-1, respectively, anaerobic, microerobic and anaerobic) revealed that it is possible to produce xylitol from soybean hull hydrolysate if conditions of oxygen limitation are applied. Furthermore, this hydrolysate readily metabolized under aerobic conditions (kLa of 46 h-1) rendering a high biomass yield. These results showed the prospect of SHH as a candidate for biotechnological process.

O cultivo de sorgo se encontra em grande ascensão no Brasil pelas características favoráveis deste cereal como um excelente substituto do milho na alimentação animal, pelo seu comparável valor nutritivo e melhor adaptação a climas secos. Considerando que o sorgo forrageiro é um tipo de sorgo empregado como cobertura de solo e produção de silagem, a sua característica como material lignocelulósico, sua constituição em açúcares nas suas frações celulósica e hemicelulósica, pesquisas para o seu aproveitamento biotecnológico poderão contribuir para a obtenção de produtos de interesse econômico e social, como o xilitol. A obtenção biotecnológica do xilitol, um álcool pentahidroxilado, comercialmente obtido por catálise química de xilose proveniente de materiais lignocelulósicos é uma opção de aproveitamento desta biomassa. Este produto possui características peculiares como poder adoçante comparável ao da sacarose, anticariogenicidade, indicado para diabéticos e obesos o que permite a sua ampla aplicação em diferentes segmentos industriais. Em função de seu elevado custo de produção por via química, pesquisas vêm sendo extensivamente realizadas na busca de uma tecnologia alternativa para sua obtenção por via biotecnológica. Porém, para a aplicação da biotecnologia para produção de xilitol a partir de biomassas lignocelulósicas é necessário a realização de hidrólise destes materiais para a solubilização dos açúcares constituintes da sua fração hemicelulósica. Esta fração é a de interesse, devido ao seu elevado teor de xilose, substrato para a produção de xilitol. Assim, no presente trabalho foram avaliadas 3 variedades (A, B e C) de biomassa de sorgo forrageiro para produção biotecnológica de xilitol empregando a levedura Candida guilliermondii. Foram realizadas diferentes etapas do processo como a caracterização química das variedades, hidrólise ácida, concentração à vácuo, destoxificação e fermentação dos hidrolisados. A performance fermentativa foi avaliada a partir da determinação dos parâmetros rendimento (YP/S) e produtividade (QP) de xilitol, bem como das atividades das enzimas xilose redutase (XR) e xilitol desidrogenase (XDH). Pela caracterização química das 3 variedades avaliadas constatou-se que não há diferenças relevantes quanto aos teores das frações celulose, hemicelulose e lignina, embora a variedade A tenha se mostrado mais promissora para a produção de xilitol, em função dos máximos parâmetros YP/S e QP obtidos. Neste caso os máximos valores de rendimento e produtividade de xilitol foram respectivamente correspondentes a 0,35 g/g e 0,16 g/L.h-1 para a variedade A, 0,25 g/g e 0,12 g/L.h-1 para a variedade B e 0,17 g/g e 0,063 g/L.h-1 para a variedade C. Consequentemente as máximas atividades enzimáticas para as enzimas XR (0,25 U/mgprot) e XDH (0,17 U/mgprot) ocorreram nas fermentações realizadas com a variedade A, embora não se observou diferenças marcantes em relação às demais variedades. / The culture of sorghum is in great ascension in Brazil due to the favorable characteristics of this cereal as an excellent substitute for the maize in the animal feeding, with comparable nutritional value and the better adaptation for dry climates. Considering forage sorghum as a type of sorghum that is used as covering of the ground and production of ensilage, its characteristics as lignocellulosic material which is constituted of sugars in its cellulosic and hemicellulosic fractions, researches for the biotechnological exploitation of this biomass will contribute for obtainment of economic and social interest products, like xylitol. The obtainment of xylitol, a pentahydroxilic alcohol, commercially obtained by chemical catalysis of xylose proceeding from lignocellulosic materials is an option of exploitation of this biomass. This product has peculiar characteristics like its sweetener power similar to that of saccharose, anticariogenicity, indicated for diabetic and obese people allowing its application in different industrial segments. Due to its raised cost of chemical production, researches have been extensively carried out in order to search a technological alternative for its obtainment by biotechnological way. However, for xylitol production from lignocellulosic biomasses by biotechnological way, the hydrolysis of these materials for the solubilization of the sugars present in its hemicellulosic fractions is necessary. This fraction is of interest, because it has large amount of xylose, substract for the production of xylitol. Then, in the present work 3 varieties (A, B and C) of forage sorghum biomass for biotechnological production of xylitol were evaluated using the Candida guilliermondii yeast. Different stages of the process were carried out: chemical characterization of the varieties, acid hydrolysis, vacuum concentration, detoxification and fermentations of the hydrolysates. The fermentative performance was evaluated from the determination of the xylitol yield (YP/S) and productivity (QP), and from the activities of the enzymes xylose reductase (XR) and xylitol dehydrogenase (XDH). For the chemical characterization of the 3 evaluated varieties, no relevant difference was verified in relation to amounts of the cellulose, hemicellulose and lignin fractions. However the variety A showed to be more promising for the production of xylitol as a function of the obtained YP/S and QP maximum parameters. In this case the maximum values xylitol yield and productivity were respectively 0,35 g/g and 0,16 g/L.h-1 for the variety A, 0,25 g/g and 0,12 g/L.h-1 for the variety B and 0,17 g/g and 0,063 g/L.h-1 for the variety C. Consequently the maximum enzymatic activities for enzymes XR (0,25 U/mgprot) and XDH (0,17 U/mgprot) occurred in the fermentations carried out with the variety A, and no notable difference was observed in relation to the other varieties.