A oviposição é um estágio vulnerável do ciclo de vida de carrapatos. Rhipicephalus microplus, como todos Ixodidae e Argasidae, possui uma glândula especializada, o órgão de Gené, que produz uma cera que é depositada na superfície do ovo durante a oviposição. Além de restringir a perda excessiva de água, a cera atua como uma barreira contra o ataque de organismos invasores. Em R.microplus, como em outros carrapatos, há poucos estudos demonstrando atividade antimicrobiana em ovos. Ainda mais, não há na literatura relato de atividade antibiofilme em ovos de carrapatos e nem mesmo em qualquer outro artrópode. O objetivo do presente trabalho foi avaliar a hipótese da existência de mecanismos de defesa em ovos de R. microplus contra biofilmes bacterianos. O extrato água/metanol da cera dos ovos apresentou atividade contra o biofilme de Pseudomonas aeruginosa sem afetar a sua viabilidade. Esse extrato também demonstrou efeito antibiótico contra Staphylococcus epidermidis. Nós identificamos a molécula com ambas atividades (antibiofilme e antibiótica) como N-(3-sulfooxy-25-cholest-5-en-26-oyl)-L-isoleucina (boophiline). Na busca por possíveis mecanismos responsáveis pelo efeito antibiofilme de boophiline contra P. aeruginosa, 14 genes foram analisados por qRT-PCR. Boophiline inibe a expressão de fliC (flagelo) e cdrA (componente estrutural da matriz), cujos produtos são necessários para a formação do biofilme de P. aeruginosa. Monosfosfato de guanosina dimérico cíclico (c-di-GMP) é um importante segundo mensageiro característico de bactérias Gram-negativas. Altos níveis intracelulares de c-di-GMP promovem o estilo de vida séssil enquanto baixos níveis induzem o comportamento móvel. De acordo com essa afirmação, nós encontramos que boophiline aumenta a motilidade swarming de P. aeruginosa. Desta forma, nos questionamos se o mecanismo de ação de boophiline estaria envolvido com c-di-GMP já que o sistema quorum sensing não foi afetado pela molécula. Interessantemente, quando os níveis de c-di-GMP foram aumentados pela superexpressão de uma diguanilato ciclase, boophiline não inibiu efetivamente a formação de biofilme. Uma explicação para esse resultado é que boophiline interfere em uma via específica regulada por c-di-GMP, o que explicaria não termos obtido um decréscimo no nível total deste segundo mensageiro. Contrariamente, boophiline foi bactericida contra S. epidermidis. Mudanças morfológicas significativas foram observadas em células tratadas com a molécula, as quais foram severamente danificadas. Boophiline levou a formação anormal de septo, rompimento da membrana bacteriana e extravasamento do material intracelular. Adicionalmente avaliamos o potencial antibiofilme e anti-protozoário de filtrados de cultura obtidos de bactérias isoladas de tecidos de R. microplus. Quatorze filtrados de cultura bacteriano apresentaram notável atividade contra o biofilme de P. aeruginosa e S. epidermidis e foram citotóxicos contra Tritrichomonas foetus. Nosso trabalho é pioneiro em demonstrar a existência de proteção contra biofilmes em ovos de carrapatos bem como de bactérias associadas a carrapatos como produtoras de moléculas bioativas. Além disso, nós demonstramos que boophiline é uma nova molécula antibiofilme, sendo a primeira vez relatado na literatura que um composto age inibindo cdrA. Os dados obtidos em nosso estudo poderiam estimular novas abordagens em áreas como fisiologia e controle de artrópodes, genética e fisiologia de microrganismos e controle de biofilmes. / The oviposition is a vulnerable stage of the tick life cycle. Rhipicephalus microplus, as all Ixodidae and Argasidae, has a specialized gland, the Gene’s organ, which produce a wax that is smeared on egg surface during oviposition. In addition to restricting excessive water loss, wax acts as a barrier to attack by invading organisms. In R. microplus, as in other ticks, there are few studies showing antimicrobial activity in eggs. Moreover, there is no report of antibiofilm activity in tick eggs nor in any other arthropod. The objective of our study was to evaluate the hypothesis of the existence of defense mechanisms against bacterial biofilms in R. microplus eggs. The eggs wax water/methanol extract showed activity against Pseudomonas aeruginosa biofilm without affecting its viability. This extract also presented an antibiotic effect against Staphylococcus epidermidis. We have identified the molecule anti-biofilm and antibiotic as N-(3-sulfooxy-25-cholest-5-en-26-oyl)-L-isoleucine (boophiline). In the search for possible mechanisms responsible by antibiofilm effect of boophiline against P. aeruginosa, 14 genes were evaluated by qRT-PCR. We showed that boophiline inhibits the expression of fliC (flagellum) and cdrA (matrix structural component), whose products are necessary for biofilm formation in P. aeruginosa. Bis-(3’–5’)-cyclic dimeric guanosine monophosphate (c-di-GMP) is an important second messenger, characteristic of Gram-negative bacteria. High intracellular levels of c-di-GMP promote a sessile mode of growth, while low levels promote motile behavior. In line with this, we found that boophiline increases swarming motility, which raised the question whether it acts by altering c-di-GMP levels. Interestingly, when c-di-GMP levels were increased by overexpression of a diguanilate cyclase, boophiline no longer inhibited biofilm formation. One explanation for these results is that boophiline interferes with a specific c-di-GMP-regulated pathway, which would explain we have not obtained a decrease in the total level of this second messenger. Conversely, boophiline had a bactericidal effect against S. epidermidis. Significant morphological changes were observed in the boophiline-treated cells, which appeared to be severely damaged. Boophiline was found to cause abnormal septum formation, bacterial membrane disruption, and extravasation of intracellular material. Additionally, our work also aimed to evaluate the potential antibiofilm and anti-protozoa of culture filtrates obtained from bacteria isolated of R. microplus tissues. Fourteen bacterial culture filtrates showed remarkable activity against of P. aeruginosa and S. epidermidis biofilms, and were cytotoxic against Tritrichomonas foetus. Our work is pioneer in demonstrating the existence of protection mechanisms in tick eggs against biofilms, and ticks-associated bacteria as producers of bioactive molecules. Furthermore, we demonstrated that boophiline is a new antibiofilm molecule, and is the first reported in the literature that a molecule inhibits cdrA. The data obtained in our study could stimulate new approaches in areas such as the physiology and control of arthropods, the genetics and physiology of microorganisms, and biofilm control.

Carrapatos são artrópodes hematófagos de distribuição cosmopolita que têm grande importância médica e veterinária devido ao efeito deletério direto causado por se fixarem e sugarem seus hospedeiros, como também por serem importantes vetores de doenças para o homem e para os animais domésticos. Sabendo que carrapatos permanecem fixos em seus hospedeiros por longos períodos de tempo sem serem rejeitados, é possível inferir que esses ácaros possuam um arsenal de mecanismos que atuem no controle da resposta imune do hospedeiro. De fato, diversos trabalhos têm demonstrado que carrapatos são capazes de modular a resposta imune de seus hospedeiros através de componentes presentes na saliva, que são inoculados durante o repasto sangüíneo. Assim, este trabalho procurou investigar se carrapatos exercem a modulação da resposta imune do hospedeiro através do recrutamento de células T regulatórias CD4+CD25+ (Tregs), com a intenção de conter uma resposta inflamatória / imune prejudicial à sua alimentação. Para isso, células isoladas de amostras de pele e linfonodos de camundongos BALB/c infestados com carrapatos Rhipicephalus sanguineus foram analisadas quanto à expressão das moléculas de superfície CD4, CD25, CTLA-4, CD45RB, GITR e CD103 (fenótipo de células Tregs), por citometria de fluxo. Adicionalmente, as células obtidas dos linfonodos foram avaliadas quanto à expressão de mensagem para o fator de transcrição Foxp3 (característico da função regulatória), por PCR quantitativo. Paralelamente, saliva de R. sanguineus foi inoculada na orelha de animais da mesma linhagem, a fim de se comparar o infiltrado celular com o obtido na pele dos camundongos infestados com carrapatos. Os resultados mostraram que as infestações não alteraram a percentagem de células T CD4+CD25+ nem a expressão de moléculas associadas ao fenótipo de células Tregs nas células infiltradas na lesão de fixação dos carrapatos ou nos linfonodos em comparação a camundongos controles. Também não se verificou aumento da expressão do gene para Foxp3 nos linfonodos em nenhum dos grupos analisados. Por outro lado, a inoculação de saliva na orelha de camundongos induziu um aumento significativo da população de células T CD4+, porém estas também não apresentavam fenótipo regulatório, sugerindo que o mecanismo de imunomodulação exercido pelos carrapatos sobre seus hospedeiros não é mediado por essas células. Resultados adicionais mostraram que a saliva de carrapatos reduziu significativamente a percentagem de células dendríticas nas orelhas dos camundongos, sugerindo que carrapatos podem estar modulando a resposta imune de seus hospedeiros por diminuírem o repovoamento da pele com células dendríticas, as quais são essenciais na vigilância imune dos tecidos periféricos. / Ticks are bloodsucking arthropods that feed on vertebrates and are responsible for serious global economic losses both through the effects of blood sucking and as vectors of pathogens. A tick?s bloodmeal lasts for several days, during which it remains fixed to the host and avoids rejection by local inflammatory and immunological reactions. This status is achieved by the escape mechanisms ticks have evolved. In fact, many studies have demonstrated that ticks modulate the host immune response through salivary compounds inoculated during their bloodmeals. This study investigated if during bloodfeeding ticks can recruit regulatory T cells in an attempt to modulate the host immune response and to control inflammatory responses that could be harmful to tick feeding. BALB/c mice were infested with Rhipicephalus sanguineus, the skin at feeding sites and the regional lymph nodes were collected, and the cells forming the local infiltrates were analyzed by flow cytometry for simultaneous expression of CD4, CD25, CTLA-4, CD45RB, GITR and CD103 molecules. Additionally, expression of mRNA for Foxp3 was measured in the lymph node cells. Tick saliva was also inoculated into the ears of BALB/c mice in order to compare the local cellular infiltrate with that elicited by artificial infestation. Control animals were sham infested. The results show that, relative to sham-infested tissues, tick infestations did not alter the percentage of CD4+CD25+ T cells present at the site of their attachment or in draining lymph nodes. Infestations also did not increase the expression of Foxp3 in skin and lymph nodes. On the other hand, saliva inoculated into the ear induced a significant increase in the number of CD4+ T lymphocytes recruited to the site of inoculation, although these cells did not express a regulatory phenotype. These results suggest that the modulation of the host immune response by ticks does not involve CD4+CD25+ T cells. Additional results showed that tick saliva reduced the percentage of dendritic cells in the skin of infested mice. This finding indicates that ticks may modulate the host immune response by diminishing the repopulation of skin with dendritic cells, which are essential for maintaining surveillance of peripheral tissues for incoming antigens.

A oviposição é um estágio vulnerável do ciclo de vida de carrapatos. Rhipicephalus microplus, como todos Ixodidae e Argasidae, possui uma glândula especializada, o órgão de Gené, que produz uma cera que é depositada na superfície do ovo durante a oviposição. Além de restringir a perda excessiva de água, a cera atua como uma barreira contra o ataque de organismos invasores. Em R.microplus, como em outros carrapatos, há poucos estudos demonstrando atividade antimicrobiana em ovos. Ainda mais, não há na literatura relato de atividade antibiofilme em ovos de carrapatos e nem mesmo em qualquer outro artrópode. O objetivo do presente trabalho foi avaliar a hipótese da existência de mecanismos de defesa em ovos de R. microplus contra biofilmes bacterianos. O extrato água/metanol da cera dos ovos apresentou atividade contra o biofilme de Pseudomonas aeruginosa sem afetar a sua viabilidade. Esse extrato também demonstrou efeito antibiótico contra Staphylococcus epidermidis. Nós identificamos a molécula com ambas atividades (antibiofilme e antibiótica) como N-(3-sulfooxy-25-cholest-5-en-26-oyl)-L-isoleucina (boophiline). Na busca por possíveis mecanismos responsáveis pelo efeito antibiofilme de boophiline contra P. aeruginosa, 14 genes foram analisados por qRT-PCR. Boophiline inibe a expressão de fliC (flagelo) e cdrA (componente estrutural da matriz), cujos produtos são necessários para a formação do biofilme de P. aeruginosa. Monosfosfato de guanosina dimérico cíclico (c-di-GMP) é um importante segundo mensageiro característico de bactérias Gram-negativas. Altos níveis intracelulares de c-di-GMP promovem o estilo de vida séssil enquanto baixos níveis induzem o comportamento móvel. De acordo com essa afirmação, nós encontramos que boophiline aumenta a motilidade swarming de P. aeruginosa. Desta forma, nos questionamos se o mecanismo de ação de boophiline estaria envolvido com c-di-GMP já que o sistema quorum sensing não foi afetado pela molécula. Interessantemente, quando os níveis de c-di-GMP foram aumentados pela superexpressão de uma diguanilato ciclase, boophiline não inibiu efetivamente a formação de biofilme. Uma explicação para esse resultado é que boophiline interfere em uma via específica regulada por c-di-GMP, o que explicaria não termos obtido um decréscimo no nível total deste segundo mensageiro. Contrariamente, boophiline foi bactericida contra S. epidermidis. Mudanças morfológicas significativas foram observadas em células tratadas com a molécula, as quais foram severamente danificadas. Boophiline levou a formação anormal de septo, rompimento da membrana bacteriana e extravasamento do material intracelular. Adicionalmente avaliamos o potencial antibiofilme e anti-protozoário de filtrados de cultura obtidos de bactérias isoladas de tecidos de R. microplus. Quatorze filtrados de cultura bacteriano apresentaram notável atividade contra o biofilme de P. aeruginosa e S. epidermidis e foram citotóxicos contra Tritrichomonas foetus. Nosso trabalho é pioneiro em demonstrar a existência de proteção contra biofilmes em ovos de carrapatos bem como de bactérias associadas a carrapatos como produtoras de moléculas bioativas. Além disso, nós demonstramos que boophiline é uma nova molécula antibiofilme, sendo a primeira vez relatado na literatura que um composto age inibindo cdrA. Os dados obtidos em nosso estudo poderiam estimular novas abordagens em áreas como fisiologia e controle de artrópodes, genética e fisiologia de microrganismos e controle de biofilmes. / The oviposition is a vulnerable stage of the tick life cycle. Rhipicephalus microplus, as all Ixodidae and Argasidae, has a specialized gland, the Gene’s organ, which produce a wax that is smeared on egg surface during oviposition. In addition to restricting excessive water loss, wax acts as a barrier to attack by invading organisms. In R. microplus, as in other ticks, there are few studies showing antimicrobial activity in eggs. Moreover, there is no report of antibiofilm activity in tick eggs nor in any other arthropod. The objective of our study was to evaluate the hypothesis of the existence of defense mechanisms against bacterial biofilms in R. microplus eggs. The eggs wax water/methanol extract showed activity against Pseudomonas aeruginosa biofilm without affecting its viability. This extract also presented an antibiotic effect against Staphylococcus epidermidis. We have identified the molecule anti-biofilm and antibiotic as N-(3-sulfooxy-25-cholest-5-en-26-oyl)-L-isoleucine (boophiline). In the search for possible mechanisms responsible by antibiofilm effect of boophiline against P. aeruginosa, 14 genes were evaluated by qRT-PCR. We showed that boophiline inhibits the expression of fliC (flagellum) and cdrA (matrix structural component), whose products are necessary for biofilm formation in P. aeruginosa. Bis-(3’–5’)-cyclic dimeric guanosine monophosphate (c-di-GMP) is an important second messenger, characteristic of Gram-negative bacteria. High intracellular levels of c-di-GMP promote a sessile mode of growth, while low levels promote motile behavior. In line with this, we found that boophiline increases swarming motility, which raised the question whether it acts by altering c-di-GMP levels. Interestingly, when c-di-GMP levels were increased by overexpression of a diguanilate cyclase, boophiline no longer inhibited biofilm formation. One explanation for these results is that boophiline interferes with a specific c-di-GMP-regulated pathway, which would explain we have not obtained a decrease in the total level of this second messenger. Conversely, boophiline had a bactericidal effect against S. epidermidis. Significant morphological changes were observed in the boophiline-treated cells, which appeared to be severely damaged. Boophiline was found to cause abnormal septum formation, bacterial membrane disruption, and extravasation of intracellular material. Additionally, our work also aimed to evaluate the potential antibiofilm and anti-protozoa of culture filtrates obtained from bacteria isolated of R. microplus tissues. Fourteen bacterial culture filtrates showed remarkable activity against of P. aeruginosa and S. epidermidis biofilms, and were cytotoxic against Tritrichomonas foetus. Our work is pioneer in demonstrating the existence of protection mechanisms in tick eggs against biofilms, and ticks-associated bacteria as producers of bioactive molecules. Furthermore, we demonstrated that boophiline is a new antibiofilm molecule, and is the first reported in the literature that a molecule inhibits cdrA. The data obtained in our study could stimulate new approaches in areas such as the physiology and control of arthropods, the genetics and physiology of microorganisms, and biofilm control.

No presente trabalho desenvolveu-se uma rota sintética em fase sólida para obter de forma rápida o esqueleto da hiacintacina 110 utilizando-se L-Boc-prolina 101 como bloco de construção. Não há relatos na literatura, até o momento, do uso da Lprolina como material de partida para a síntese de núcleos pirrolizidínicos, entretanto o estudo desta rota é uma alternativa interessante porque possibilita a síntese destes biciclos em apenas 4 etapas. A síntese iniciou com o acoplamento entre a L-Bocprolina 101 e a resina Merifield 41 em condições clássicas. Após a retirada do grupamento protetor com ácido cloridríco por 40 minutos em temperatura ambiente, procedeu-se à adição de Michael do produto 103 ao propiolato de etila 116 gerando o enaminodiéster 104. Na última etapa usou-se DBU sob irradição de microondas por 10 minutos, obtendo-se o azabiciclo 110 com redimento de 37%. Em solução, através da adição de Michael entre a L-prolina O-protegida 95 e alcinos e alceno ativados obtevese adutos cuja estereoquímica das olefinas foi sempre E, com bons rendimentos (60- 95%). Os enaminodiésteres 97 e 118 foram facilmente convertidos nos seus correspondentes aminodiésteres 124 e 126 com NaBH(OAc)3 com redimento de 65%. Na etapa da ciclização de Dieckmann obteve-se sucesso utilizando Na/THF/3h sob refluxo gerando o azabiciclo[3.3.0]octano desejado com rendimento de 50-60%. Os análogos das hiacintacinas foram sintetizados a partir da redução dos produtos 109, 132 e 133 com LiAlH4/THF e rendimentos de 52%. Os produtos 109, 132, 133, 135, 136 e 137 foram testados para atividades antiparasitárias e apresentaram bons resultados para a ação carrapaticida com doses até 0,625μg/ml em ovos e 1,25μg/ml em larvas. / We present here an original solid-phase approach to synthesize rapidly the hyacinthacine core 110 using L-proline N-Boc 101 as building block. There is no reference in the literature wich uses L-proline as building block to synthesize this pirrolizidine skeleton. The study of this possibility would be extremely interesting because it could be used to prepare structural systems related to hyacinthacine in only four steps. The synthesis initiates with the coupling of L-Boc-proline 101 to Merrifield resin 41 under classical conditions. The protection group was removed with hidrogen chloride and the Michael addition was proveeded with adduct 103 and ethyl propiolate 116, afording 104 in satisfactory yields. At least, the azabicycle 110 was obtained by reacting 98 using DBU as catalyst at MW irradiation for 10 min, in good yields (37 %). In solution, we have proceed to Michael addition of L-proline O-protected 95 to activated alkynoates/alkenes conducing to aducts where the stereochemistry of the olefins was always E, with excellent yield (60-95%). Enaminoesters 97 and 118 could be easily converted into the corresponding aminodiesters 124 and 126 by NaBH(OAc)3 in 65% yield. In the step of the Diekmann cyclization of aminodiesters the sistem Na/THF/3h at reflux afforded the derived azabicyclo[3.3.0]octanes in 50- 60% yield. The analogs of the hyacinthacines were synthesized with reduction of 109, 132 and 133 with LiAlH4/THF in 52% yield with the stereochemistry to be determined. The products 109, 132, 133, 135, 136 and 137 were tested for parasitic activity and showed good results. Compounds 109, 132, 135 and 136 killed 100% of the larvae at the concentrations of 5 μg/ml and 2.5 μg/ml being not toxic at the lower concentrations. Compounds 133 and 137 were more toxic being lethal to the larvae at concentrations of 1.25 μg/ml but did not case death at the lower concentrations.

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:13:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese_Marcio_Pereira_Martins.pdf: 660888 bytes, checksum: 070c9552e0ed53121a6615f34c32ec29 (MD5) Previous issue date: 2009-12-21 / Rocky Mountain spotted fever (FM), a zoonosis transmitted to humans through the bite of ticks infected with Rickettsia spp. Especially R. rickettsii, emerged in the United States in the late 19th century, been taking place in Brazil in the mid 20th century. Since then, in Brazil the disease, initially diagnosed in São Paulo, became identified focally in some cities, getting to the end of the 20th century restricted states in the Southeast. Already at the beginning of the 21st century FM was first identified in Southern states, focusing in Santa Catarina and also, occasionally, been observed in rare cases that occurred in states in other regions of the country: State Federal, Bahia, Rondônia and Amapá. Given the above, and aiming to collaborate with the service of Epidemiology in Goias, this unprecedented study throughout the Midwest Region, proposes and creates conditions for the first milestone for the monitoring of FM in this State, by means of serological screening with indirect immunofluorescence assay (IFA) in sera of animals and humans, in addition to the research of tick vectors. This study took place in the city of Quirinópolis-GO, and despite not having been detected in the chain reaction polymerase (PCR), ticks infected with Rickettsia spp., the principal vector of FM in Brazil, the tick Amblyomma cajennense, was observed. In previous pilot study conducted in February 2007 in Quirinópolis-GO, serology by IFAT reagents detected in 25% (7 / 28) of humans in a group of individuals cohabiting with a suspected case of FM, which was notified to the Ministry of Health (MOH) of Brazil in 2006, and in 0% (0 / 5) of dogs and 28.6% (12/42) of horses from 3 rural property where the suspect case was before the manifestation of signs of illness. There were two horses positive sera in these three farms. Unable to trace the likely source of infection, but the findings here obtained allowed to suspect that the suspected case of FM has been in one of these two farms the likely source of antigenic contact with bacteria or micro-FM group antigenically similar. Already in scale epidemiological study horses, held in March 2007 on 20 farms, found the prevalence of positive sera of 11.6% (39/335) among horses and the frequency of seropositive 36.6% (15/41 ) between the human and 16.7% (2 / 12) among the dogs from these properties to create horses. Humans here tested HIV positive were asymptomatic for FM at the time of sample collection. It was concluded that the FM, or antigenically similar disease, may be occurring in the State of Goiás, in the City of Quirinópolis / A febre maculosa (FM), zoonose transmitida ao homem por meio da picada de carrapatos infectados com Rickettsia spp., especialmente R. rickettsii, surgiu nos Estados Unidos no final do século 19, vindo a ocorrer no Brasil em meados do século 20. Desde então, no Brasil a enfermidade, inicialmente diagnosticada no Estado de São Paulo, passou a ser identificada focalmente em vários municípios, ficando até o final do século 20 restrita aos Estados da Região Sudeste. Já no inicio do século 21 a FM começou a ser identificada em Estados da Região Sul, concentrando-se em Santa Catarina e também, pontualmente, sendo observada em raros casos ocorridos em Estados das demais regiões do país: Distrito Federal, Bahia, Amapá e Rondônia. Diante do exposto, e visando colaborar com o serviço de Epidemiologia em Goiás, o presente Estudo inédito em toda a Região do Centro-Oeste, se propõe e cria condições de marco inicial para a vigilância da FM neste Estado, por meio de inquérito sorológico com a reação de imunofluorescência indireta (RIFI) em soros de animais e humanos, além da pesquisa de carrapatos vetores. O presente estudo se deu no Município de Quirinópolis-GO, e apesar de não terem sido detectados, na reação em cadeia pela polimerase (PCR), carrapatos infectados com Rickettsia spp., o principal vetor de FM no Brasil, o carrapato Amblyomma cajennense, foi observado. Em prévio estudo piloto realizado em fevereiro de 2007, em Quirinópolis-GO, a sorologia pela RIFI detectou reagentes em 25% (7/28) dos humanos de um grupo de indivíduos conviventes com um caso suspeito de FM, que foi notificado ao Ministério da Saúde (MS) do Brasil em 2006, e em 0% (0/5) dos cães e 28,6% (12/42) dos eqüinos oriundos de 3 propriedade rurais onde esse caso suspeito esteve antes da manifestação dos sinais de enfermidade. Houve eqüinos sororeagentes em duas dessas três propriedades rurais. Não foi possível rastrear a provável fonte de infecção, mas os achados aqui obtidos permitem suspeitar que o caso suspeito de FM tenha tido em uma dessas duas propriedades rurais a fonte antigênica do provável contato com bactérias do grupo da FM ou microrganismos antigenicamente semelhantes. Já no estudo dimensionado epidemiologicamente para eqüinos, realizado em março de 2007 em 20 propriedades rurais, foi encontrada a prevalência de sororeagentes de 11,6% (39/335) entre os eqüinos e a freqüência de soropositivos de 36,6% (15/41) entre os humanos e de 16,7% (2/12) entre os cães oriundos dessas propriedades de criação de eqüinos. Os humanos soropositivos aqui testados eram assintomáticos para FM no momento da coleta de amostras. Concluiu-se que a FM, ou doença antigenicamente semelhante, possa estar ocorrendo no Estado de Goiás, no Município de Quirinópolis

Para o sucesso das estratégias de manejo de Rhipicephalus (Boophilus) microplus (carrapato bovino) são necessários testes práticos, econômicos e confiáveis que possam detectar a presença de fenótipos resistentes a drogas em suas populações. O fipronil é um acaricida de uso relativamente recente não havendo testes padronizados para o diagnóstico de resistência do carrapato à molécula. No presente trabalho, foram padronizados bioensaios in vitro para esta finalidade: Teste de Imersão de Adultas, Teste de Imersão de Larvas e Teste de Pacote com Larvas. Os testes foram aplicados e, de forma inédita, populações resistentes foram diagnosticadas tanto no Brasil quanto no Uruguai. Ensaios com inibidores enzimáticos não evidenciaram participação importante de enzimas detoxificadoras no mecanismo de resistência. Foi demonstrada reação cruzada entre fipronil e lindano, não verificada para ivermectina. Em algumas situações, foi observado interferência do controle químico de pragas agrícolas no desenvolvimento de resistência dos carrapatos. / For the success of the strategies for the management of Rhipicephalus (Boophilus) microplus (cattle tick), practical, economical and reliable tests are needed to detect the presence of drug-resistant phenotypes in their populations. Fipronil is a relatively new acaricide with no standardized tests for the diagnosis of tick resistance to this molecule. In this study, were standardized in vitro bioassays for this purpose: Adult Immersion Test, Larval Immersion Test and Larval Packet Test. The tests were applied and for the first time, resistant populations were diagnosed in Brazil and Uruguay. Tests with enzymatic inhibitors showed no significant involvement of detoxification enzymes in the mechanism of resistance. Cross-resistance was demonstrated between lindane and fipronil but not with ivermectin. In some situations, it was observed interference of the chemical control of agricultural pests in the development of resistance in ticks.

Os carrapatos são artrópodes hematófagos, vetores de doenças. Vacinas são uma alternativa para o seu controle, já que esses parasitas durante a infestação, estimulam as respostas imunes do hospedeiro, as quais são implicadas em sua rejeição. As glândulas salivares do parasita são importantes para permitir a alimentação e para mediar os mecanismos de escape às defesas do hospedeiro. Diversas evidências indicam que ocorre reatividade cruzada entre espécies de carrapatos e que reações de hipersensibilidade cutânea tardia (DTH) são correlacionadas com resistência ao carrapato. A possibilidade de vacinar cachorros que são parasitados pelo R. sanguineus com antígenos do carrapato do boi, o R microplus, foi investigada por meio da análise in silico de 45 GIs de R microplus clonados em vetor plasmidial (TOPO VR2001), dentre os quais 14 Gls de R microplus se revelaram mais similares a sequências do R sanguineus, e foram empregados para avaliar: 1) A capacidade em elicitar reações cutâneas tardias em cobaias imunes a carrapatos por meio de infestações prévias com R sanguineus. 2) A capacidade de vacinas contendo GIs individuais em afetar infestações de camundongos com adultos de R sanguineus. 3) a capacidade do GI induzir anticorpos específicos após vacinação em camundongos. Dos 14 GIs testados, apenas dois não induziram reações cutâneas, quatro não afetaram nenhum parâmetro parasitológico da infestação, e três não induziram a produção de anticorpos nesses animais. Dentre os GIs, sete foram escolhidos para compor uma vacina multigênica contra o carrapato do cão R sanguineus. A vacina foi capaz de induzir resistência á infestação por R sanguineus em camundongos e em cachorros vacinados evidenciadoa pela diminuição do número de fêmeas que conseguiram colocar ovos, do peso médio da massa de ovos produzidos por essas fêmeas, do índice reprodutivo dessas fêmeas, e da taxa de eclosão das larvas, demonstrando que GIs de R microplus podem ser alvos para formulação de uma vacina contra o carrapato R sanguineus. / Ticks are arthropod vectors of disease. Vaccines are an alternative to chemicals for controlling ticks because during infestations these parasites stimulate host immune responses such as delayed hypersensitivity skin reactions (DTH), which are involved in their rejection and are correlated with resistance to ticks. Tick salivary glands are important for the parasite to acquire blood meals because their products mediate escape mechanisms from host defenses. The possibility of vaccinating dogs against infestations with the brown dog tick, Rhipicephalus sanguineus, with antigens derived from salivary glands of the cattle tick, R. microplus, was investigated by in silica analysis of 45 genes from R. microplus. These genes were targeted because of their putative biological function and had been cloned into the plasmid vector TOPO VR2001. Of them, 14 were chosen to be evaluated in a vaccine because their sequences were the most similar to several genes expressed in salivary glands of R. sanguineus. The plasmids containing the genes of interest (GIs) were used to assess: 1) The ability of the product of the genes to elicit delayed skin reactions in guinea pigs immune to ticks by previous infestations with R sanguineus. 2) The ability of individual GIs delivered as DNA vaccines to affect infestations of mice with adult R sanguineus. 3) The ability of the genes to induce specific antibodies after vaccination in mice. Only two of the 14 genes delivered to guinea pigs via intradermal injection of DNA did not elicit delayed skin reaction, four used in a vaccine did not affect any parameter of tick infestations, and three did not induce production of antibodies in these animals after DNA vaccination. Of the 14 genes, seven were chosen to formulate a multigene vaccine against the dog tick R. sanguineus. The vaccine was able to significantly affect several parameters of infestations by R sanguineus in vaccinated dogs and mice. This was reflected in the reduction of the number of females that were able to lay eggs, of the average weight of the egg mass produced by these females, of the reproductive rate of these females, and of hatching rate of larvae, demonstrating that GIs from R microplus may be targets for development of a vaccine against the tick R sanguineus.

Made available in DSpace on 2014-08-20T14:38:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_patricia_biegelmeyer.pdf: 576535 bytes, checksum: 210ef4efc6311207454f251dd80d5018 (MD5) Previous issue date: 2012-02-29 / The overall aim of this study was to analyze different perspectives of Rhipicephalus (Boophilus) microplus genetic resistance. Therefore, the present study was divided into three manuscripts. Firstly, a literature review was conducted to present some aspects of tick resistance, like results of previous studies of bovine resistance, environmental effects on this triat, and some findings in molecular biology that will help to identify resistant animals. The second trial was conducted to estimate genetic parameters for tick resistance measured by two assessment methods in Hereford and Braford cattle, and genetic correlations between tick resistance and growth of animals. The animals belonging to the Delta G Connection genetic improvement consortium, were raised on nature and artificial pastures in Southern Brazil, and the age at the evaluation period was about 18 months. Data were analyzed from 6,462 bovines naturally exposed to ticks. The number of ticks was counted at inner hind legs region (IHL) of 3,413 animals between 2001 and 2008, and was recorded up to three consecutive counts at one side of body (LAT) in 3,049 bovines between 2009 and 2010, a total of 7,813 records. In addition, the database contained data of 109,566 birth weights (BW), 112,815 records of weight gain from birth to weaning (ADG) and 54,843 data of weight gain from weaning to yearling (PWG). For the analyses, tick count data was transformed using a logarithmic function. Heritability estimates obtained by bivariate analysis were IHL = 0.152 ± 0.043 and LAT = 0.235 ± 0.063 and genetic correlation between both methods was 0.575 ± 0.220. Single-trait analysis of LAT indicated a repeatability of 0.312 ± 0.014. Genetics association analysis between IHL and LAT and the development characteristics evaluated indicated significant associations between IHL and BW (0.220 ± 0.102), and favorable negative correlations between LAT and ADG (-0.211 ± 0.099) and LAT and PWG (-0.650 ± 0.125) (P<0.05). The objective of third trial was to analyze the bovine genetic resistance effect on tick biological traits. The engorged female ticks analyzed were collected from 40 Braford heifers classified as genetically resistant (R) or susceptible (S), according to the breeding values for tick count, calculated based on a database with 9,036 records of Hereford and Braford bovines. After classification, the selected heifers were moved to an experimental area in Embrapa Pecuária Sul, located in the city of Bagé, in the Brazilian state of Rio Grande do Sul, and subjected to four artificial infestations, 14 days apart each one. Weights of engorged female ticks and of female ticks after oviposition did not differ between resistant and susceptible heifers. Female ticks engorged in genetically susceptible heifers showed higher capacity of posture (R = 0.097 ± 0.021g and S = 0.109 ± 0.030g) and higher values of reproductive efficiency index (R = 47.23 ± 5.85% and S = 53.27 ± 3.74%) The overall aim of this study was to analyze different perspectives of Rhipicephalus (Boophilus) microplus genetic resistance. Therefore, the present study was divided into three manuscripts. Firstly, a literature review was conducted to present some aspects of tick resistance, like results of previous studies of bovine resistance, environmental effects on this triat, and some findings in molecular biology that will help to identify resistant animals. The second trial was conducted to estimate genetic parameters for tick resistance measured by two assessment methods in Hereford and Braford cattle, and genetic correlations between tick resistance and growth of animals. The animals belonging to the Delta G Connection genetic improvement consortium, were raised on nature and artificial pastures in Southern Brazil, and the age at the evaluation period was about 18 months. Data were analyzed from 6,462 bovines naturally exposed to ticks. The number of ticks was counted at inner hind legs region (IHL) of 3,413 animals between 2001 and 2008, and was recorded up to three consecutive counts at one side of body (LAT) in 3,049 bovines between 2009 and 2010, a total of 7,813 records. In addition, the database contained data of 109,566 birth weights (BW), 112,815 records of weight gain from birth to weaning (ADG) and 54,843 data of weight gain from weaning to yearling (PWG). For the analyses, tick count data was transformed using a logarithmic function. Heritability estimates obtained by bivariate analysis were IHL = 0.152 ± 0.043 and LAT = 0.235 ± 0.063 and genetic correlation between both methods was 0.575 ± 0.220. Single-trait analysis of LAT indicated a repeatability of 0.312 ± 0.014. Genetics association analysis between IHL and LAT and the development characteristics evaluated indicated significant associations between IHL and BW (0.220 ± 0.102), and favorable negative correlations between LAT and ADG (-0.211 ± 0.099) and LAT and PWG (-0.650 ± 0.125) (P<0.05). The objective of third trial was to analyze the bovine genetic resistance effect on tick biological traits. The engorged female ticks analyzed were collected from 40 Braford heifers classified as genetically resistant (R) or susceptible (S), according to the breeding values for tick count, calculated based on a database with 9,036 records of Hereford and Braford bovines. After classification, the selected heifers were moved to an experimental area in Embrapa Pecuária Sul, located in the city of Bagé, in the Brazilian state of Rio Grande do Sul, and subjected to four artificial infestations, 14 days apart each one. Weights of engorged female ticks and of female ticks after oviposition did not differ between resistant and susceptible heifers. Female ticks engorged in genetically susceptible heifers showed higher capacity of posture (R = 0.097 ± 0.021g and S = 0.109 ± 0.030g) and higher values of reproductive efficiency index (R = 47.23 ± 5.85% and S = 53.27 ± 3.74%) / O objetivo geral do presente estudo foi abordar diferentes perspectivas sobre a resistência genética de bovinos ao carrapato Rhipicephalus (Boophilus) microplus. Para tanto, foi dividido em três trabalhos. Primeiramente, foi realizado um estudo de revisão que abrangeu alguns aspectos relacionados à resistência, como resultados de trabalhos que avaliaram a resistência de bovinos, fatores ambientais capazes de afetar os fenótipos de resistência e algumas descobertas na área da biologia molecular que poderão ser úteis no processo de identificação de animais geneticamente resistentes. O segundo trabalho objetivou estimar parâmetros genéticos para a resistência mensurada por dois métodos de avaliação em bovinos Hereford e Braford, e as correlações genéticas entre a resistência e características de crescimento dos animais. Os bovinos que participaram das avaliações foram provenientes de rebanhos controlados pelo programa de melhoramento da Conexão Delta G, localizados no estado do Rio Grande do Sul e criados a campo sobre pastagens naturais e artificiais. Foram avaliados dados de 6.462 bovinos com idade média de 18 meses, naturalmente infestados, sendo as contagens realizadas na região do entrepernas (ENT) em 3.413 animais entre 2001 e 2008, e 7.813 registros de contagens na lateral do corpo (LAT) de 3.049 bovinos realizadas entre 2009 e 2011. Foram utilizados também 109.566 dados de peso ao nascimento (PN), 112.815 registros de ganho de peso do nascimento à desmama (GPD) e 55.843 dados de ganho da desmama ao sobreano (GDS). Para as análises, os dados de contagens sofreram transformação logarítmica. As estimativas de herdabilidade dos métodos de avaliação obtidas por análise bicaracterística foram ENT = 0,152 ± 0,043 e LAT = 0,235 ± 0,063, e a correlação genética entre ambos foi de 0,575 ± 0,220. A análise unicaráter da LAT apontou uma repetibilidade de 0,312 ± 0,014. As associações genéticas entre a ENT e a LAT e as características de desenvolvimento avaliadas apontaram associações significativas entre ENT e PN (0,220 ± 0,102), e favoráveis correlações negativas e entre LAT e GPD (-0,211 ± 0,099) e LAT e GDS (-0,650 ± 0,125) (P<0,05). O terceiro trabalho objetivou analisar o efeito da resistência dos bovinos sobre características biológicas dos carrapatos. As teleóginas analisadas foram coletadas em 40 novilhas Braford classificadas como geneticamente resistentes (R) ou suscetíveis (S), de acordo com os valores genéticos obtidos para a característica de contagem de carrapatos, calculados com base em um banco de dados com registros de 9.036 animais das raças Hereford e Braford. Após a classificação, as novilhas selecionadas foram encaminhadas à Embrapa Pecuária Sul (Bagé, RS), onde foram submetidas a quatro infestações artificiais, com intervalos de 14 dias. Os pesos médios iniciais das teleóginas e os pesos das quenóginas não diferiram entre os grupos de novilhas resistentes e suscetíveis. Fêmeas ingurgitadas em novilhas geneticamente suscetíveis apresentaram maior capacidade de postura (R = 0,097 ± 0,021g e S = 0,109 ± 0,030g) e maiores índices de eficiência reprodutiva (R = 47,23 ± 5,85% e S = 53,27 ± 3,74%) e nutricional (R = 54,33 ± 4,36% e S = 65,62 ± 8,84%) que teleóginas ingurgitadas em novilhas resistentes.

The botanical acaricides are natural products derived from plant secondary metabolism. This metabolism produces a large variety of compounds with acaricidal action that can be exploited through the use of essential oils or as a template for synthesis of synthetic acaricides. The need for safer methods, less harmful to humans and the environment, has stimulated the search for new pesticides from plant products. Thus, the aim of this study was to i) select medicinal and aromatic plants with biological activity on the tick Rhipicephalus microplus and Amblyomma cajennense ii) test the sublethal effects of essential oil of Chrysopogon zizanioides (Poaceae) value of high acidity and acid value low on the stages of egg, larva and adult of A. cajennense and R. microplus iii) test the lethal effects of essential oils of C. zizanioides high acid value and amount of low acidity on larvae of A. cajennense and R. microplus iv) test the sublethal effects of essential oils from Pogostemon cablin (Lamiaceae), Croton sonderianus (Euphorbiaceae), Pelargonium graveolens (Geraniaceae) and Zingiber officinale (Zingiberaceae), on the stages of egg, larva and adult of R. microplus v) test the lethal effects of essential oils of P. cablin; C. sonderianus; P. graveolens on larvae of R. microplus iv) From the oil more toxic for the tick R. microplus, producing a formulation and testing the lethal and sublethal effects of this emulsion in ticks R. microplus. Essential oils were purchased through the company Raros, only the Z. officinale obtained by hydrodistillation of dry biomass in a Clevenger type apparatus at the Federal University of Sergipe. These oils were analyzed by gas chromatography coupled to mass spectrometry (GC-MS). The study was conducted at the Federal University of Sergipe, Saint Kitts-SE, Brazil. The essential oils were emulsified with Triton X-100 as surfactant agent, in the bioassay with adults and diluted in acetone to bioassay with larvae mortality. In bioassay with adult females were immersed in a final solution (oil with Triton X-100) for 2 minutes, oviposition calculated after 14 days. For the bioassay the larvae a solution (oil in acetone) was applied on filter paper envelopes closed with clips type |bulldog| in which these larvae were maintained for 48 hours. The formulation in both bioassays was diluted with water The paper was divided into three items. In the first article was made a literature review on the use of essential oils of medicinal and aromatic plants in controlling R.microplus, in the second it was demonstrated that the essential oils of C. zizanioides acid value and high value low acidity showed activity ticks on species A. cajannense and R. microplus and third article was observed that the essential oil P. cablin (Lamiaceae) and formulation made from this oil exhibit activity ticks on the tick R. microplus. / Os carrapaticidas botânicos são produtos naturais derivados do metabolismo secundário das plantas. Esse metabolismo produz uma grande diversidade de compostos com ação acaricida que podem ser explorados através do uso de óleos essenciais ou como modelo para síntese de carrapaticidas sintéticos. A necessidade de métodos mais seguros, menos agressivos ao homem e ao meio ambiente, tem estimulado a busca de novos pesticidas a partir de produtos vegetais. Assim, objetivou-se com este trabalho i) selecionar plantas medicinais e aromáticas com atividade biológica sobre os carrapatos Rhipicephalus microplus e Amblyomma cajennense; ii) testar os efeitos subletais do óleo essencial de Chrysopogon zizanioides (Poaceae) acidez alta e acidez baixa sobre os estádios de ovo, larva e adulto de A. cajennense e R. microplus; iii) testar os efeitos letais dos óleos essenciais de C. Zizanioides acidez alta e acidez baixa sobre larvas de A. cajennense e R. microplus; iv)testar os efeitos subletais dos óleos essenciais de Pogostemon cablin (Lamiaceae), Croton sonderianus (Euphorbiaceae), Pelargonium graveolens (Geraniaceae) e Zingiber officinale (Zingiberaceae), sobre os estádios de ovo, larva e adulto de R. microplus; v) testar os efeitos letais dos óleos essenciais de P. cablin; C. sonderianus; P. graveolens sobre larvas de R. microplus; iv) A partir do óleo mais tóxico para o carrapato R. microplus, produzir uma formulação e testar os efeitos subletais e letais dessa emulsão nos carrapatos R. microplus. Os óleos essenciais foram adquiridos através da empresa Raros, sendo apenas o Z. officinale obtido por hidrodestilação da biomassa seca em um aparelho do tipo Clevenger na Universidade Federal de Sergipe. Estes óleos foram analisados por cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massa (GC-MS). O estudo foi realizado na Universidade Federal de Sergipe, São Cristóvão-SE, Brasil. Os óleos essenciais foram emulsionados com Triton X-100, como agente surfactante, no bioensaio com os adultos e diluídos em acetona para o bioensaio de mortalidade com as larvas. No bioensaio com os adultos as fêmeas foram imersas em uma solução final (óleo com Triton X-100) por 2 minutos, calculado a oviposição depois de 14 dias. Para o bioensaio com as larvas uma solução (óleo com acetona) foi aplicada em envelopes de papel filtro fechados com clipes tipo buldogue , no qual estas larvas permaneceram por 48 horas. A formulação nos dois bioensaios foi diluída em água A dissertação foi dividida em dois artigos. No primeiro artigo foi demonstrado que os óleos essenciais de C. zizanioides acidez alta e acidez baixa apresentaram atividade carrapaticida sobre as espécies A. cajannense e R. microplus e no segundo artigo foi observado que O óleo essencial de P. cablin (Lamiaceae) e a formulação feita através deste óleo apresentam atividade carrapaticida sobre o carrapato R. microplus.

Este estudo objetivou estudar os carrapatos e a infecção por patógenos, e sua correlação com os vertebrados desta região entre 10/2007 e 09/2008 foram realizadas mensalmente doze visitas a uma área de floresta ombrófila densa da Amazônica na Estação Ecológica de Samuel. Foram coletados, 60 aves, 36 mamíferos, 14 répteis e 11 anfíbios. Em vida livre foram realizadas 80 coletas de carrapatos em um total de 39.600m em cerca de 2.640min (44h) e coletados 265 carrapatos adultos de quatro espécies, sendo elas: A. scalpturatum (81), A. latepunctatum (84), A. oblongogutattum (18), A. naponense (69) e 597 ninfas de Amblyomma sp. Dos 104 adultos (11,8% do total de carrapatos) foram testados para Anaplasmataceae, obtive-se 27 (25,9%) positivos e mais 36 adultos (total de 140) e 11 carrapatos foram positivos (1) A. scalpturatum, (4) A. latepunctatum, (3) A. naponense. É notável o impacto da hidrelétrica sobre a fauna de pequenos mamíferos. / This study was aimed to analyze the ticks and the pathogenic infections, and their correlation with the vertebrates of such a region from October 2007 to September 2008, 12 surveys were monthly carried out at the Samuel Ecological Station in an Amazonian dense ombrophilous forest. They were collected from 60 birds, 36 mammals, 14 reptiles, and 11 amphibians. Eighty(80) collections of free-living ticks were carried out within an area of about 39.000 meters, during 2.640 minutes (44 hours), and 265 adult ticks or four species were picked up as following: 81 A.scalpturatum, 84 A. latepunctatum, 18 A. oblongogutattum, 69 A. naponense , and 597 Amblyomma sp. nymphs. 104 the adults, which accounted for 11.8% of total of ticks collected, were tested for Anaplasmataceae, and 27 (25.9%) were positive. In the Rickettsia spp. sample, additionally to the above mentioned 104 ticks tested, 36 adult ticks (out of a total of 140) were positive. It is noteworthy the impact caused by the hydropower plant on the small mammal fauna.