Orientador: Prof. Dr. Marcelo Augusto Christoffolete / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biotecnociência, 2014. / A obesidade é um problema global alarmante, sendo um fator desencadeador de outras enfermidades, como doenças cardiovasculares e diabetes do tipo II. Para que ocorra a proliferação do tecido adiposo, responsável pelo acúmulo de gordura característico da obesidade, é preciso que as células que o compreendem se diferenciem de pré-adipócitos em adipócitos maduros, passando por drásticas mudanças morfológicas, reguladas pela expressão gênica de fatores de transcrição, até que estejam prontos para estocar triglicerídeos e liberar ácidos graxos além de responder a hormônios como a insulina e glicocorticóides. A regulação da expressão de alguns desses fatores já é conhecida, porém há muito ainda para se desvendar sobre o processo de adipogênese. Sabe-se que as catepsinas K, L e S são alguns desses fatores que regulam o processo da formação do tecido adiposo. Além de estudos já relacionarem estas enzimas com a clivagem da leptina, hormônio que é responsável por sinalizar ao Sistema Nervoso Central (SNC) sobre o status energético, promovendo a saciedade e o aumento do gasto energético, este hormônio, ainda está ligado à inibição da adipogênese. Desta forma, este trabalho propõe a análise da expressão das enzimas CatK, CatL e CatS durante o processo de diferenciação de células 3T3-L1, relacionando a expressão detectada nos dias de diferenciação com fatores de transcrição envolvidos no processo e marcadores de diferenciação já reconhecidos pela literatura. / Obesity is a global problem alarming, as a trigger for other cardiovascular diseases and type II diabetes factor. For the proliferation of adipose tissue responsible for this accumulation of fat occurs it is necessary that the cells that comprise to differentiate from preadipocytes into mature adipocytes undergoing drastic morphological changes of gene expression regulated by transcription factors until they are ready to store triglycerides and free fatty acids , as well as respond to hormones such as insulin and glucocorticoids . The regulation of expression of some of these factors is already known, but there is still much to uncover about the process of adipogenesis. It is known that cathepsin K, L and S are some of the factors that regulate the process of formation of adipose tissue. In addition to studies already relate these enzymes with cleavage of leptin, a hormone that is responsible for signaling the Nervous System on the energy status, promoting satiety and increased energy expenditure, this hormone is still on the inhibition of adipogenesis. Thus, this paper proposes the analysis of the expression of CatK, CatL and CatS enzymes during the differentiation of 3T3 - L1 cells, correlating expression detected on days of differentiation with transcription factors involved in the process and differentiation markers already recognized by literature

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2008. / Submitted by Kelly Marques (pereira.kelly@gmail.com) on 2009-10-21T18:46:59Z No. of bitstreams: 1 2008_AlessandraMenezesCampos.pdf: 1238572 bytes, checksum: dab07da7d1c9342e2084f202e412302b (MD5) / Approved for entry into archive by Tania Milca Carvalho Malheiros(tania@bce.unb.br) on 2009-10-30T12:18:22Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2008_AlessandraMenezesCampos.pdf: 1238572 bytes, checksum: dab07da7d1c9342e2084f202e412302b (MD5) / Made available in DSpace on 2009-10-30T12:18:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2008_AlessandraMenezesCampos.pdf: 1238572 bytes, checksum: dab07da7d1c9342e2084f202e412302b (MD5) Previous issue date: 2008 / A renina é uma aspartil protease sintetizada in vivo pela remoção proteolítica do prósegmento amino-terminal de seu precursor, a pró-renina. A catepsina B, uma tiol protease, tem sido sugerida como candidata à enzima conversora de pró-renina devido à sua colocalização com a renina nos grânulos secretórios e também pela sua capacidade de processar a pró-renina em renina in vitro e em cultura de células. Vetores de expressão de pró-renina selvagem (WT) e mutantes foram co-transfectados com catepsina B em células hipofisárias de ratos GH4C1, que naturalmente não converte pró-renina em renina. Mutações pontuais foram utilizadas para identificar quais aminoácidos presentes no sítio de clivagem da pró-renina são reconhecidos pela catepsina B. Experimentos de pulse-chase foram realizados para rastrear se a pró-renina radiomarcada é capaz de seguir para os grânulos secretórios das células GH4C1. Para investigar se a pró-renina humana poderia ativar o promotor do Peptídeo Natriurético Cerebral (BNP) em cardiomiócitos de ratos neonatos, essas células foram co-transfectadas com o plasmídeo repórter BNP-luciferase com (ou sem) angiotensinogênio humano. Os cardiomiócitos foram co-incubados com as células não-aderentes U937 transfectadas com pró-renina humana WT ou mutantes (-1-2 ou +5). Os cardiomiócitos foram lisados 96 horas após a eletroporação para a análise de geração de luciferase. Células não-transfectadas U937 foram usadas como grupo controle. Captopril e Losartan (10-7 M) foram usados para testar a participação da enzima conversora de angiotensina (ECA) e dos receptores AT1. Os resultados demonstraram que mutações pontuais na metionina -3(M/A), lisina -2(K/A) e leucina +2(L/A) reduzem o processamento da pró-renina pela catepsina B. Além disso, a remoção da cadeia glicosídica na asparagina +5 aumenta a conversão de pró-renina, sugerindo que a glicosilação poderia impedir o processamento enzimático da pró-renina. Nos experimentos de pulse-chase, a pró-renina não foi direcionada aos grânulos secretórios e a presença de catepsina B não alterou esse resultado, indicando que o processamento de pró-renina provavelmente ocorre fora dessas organelas. A pró-renina WT secretada pelas células U937 é capaz de ativar o promotor do BNP em cardiomiócitos de ratos transfectados com angiotensinogênio humano. O par de aminoácidos básicos arginina-lisina e a cadeia glicosídica +5 parecem ser tão importantes quanto a atividade enzimática da ECA e os receptores AT1 para a ativação do promotor do BNP em cardiomiócitos de ratos neonatos. ____________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Renin is an aspartyl protease synthesized in vivo by proteolytic removal of amino-terminal prosegment of its precursor, prorenin. Cathepsin B, a thiol protease, has been proposed to be a good candidate for prorenin processing enzyme because of its co-localization with renin in secretory granules and also by its ability to activate prorenin in vitro and in cell culture. It was co-transfected vectors expressing wild type and mutant prorenins with cathepsin B in rat pituitary GH4C1 cells, which normally do not activate prorenin into renin unless cotransfected with a prorenin processing enzyme. Scanning mutagenesis was used to identify which amino acids at prorenin cleavage site are specifically recognized by cathepsin B. Pulsechase experiments were performed to follow whether radiolabeled prorenin is sorted to secretory granules. To investigate whether human prorenin could activate the Brain Natriuretic Peptide promoter (BNP) in neonatal rat cardiomyocytes, these cells were cotransfected with a reporter gene BNP-luciferase associated or not with a human angiotensinogen. The cardiomyocytes were co-incubated with no adherent U937 cells transfected with human prorenin wild type (WT) or mutants (-1-2 or +5). Cardiomyocytes were lysated 96 hours after electroporation for luciferase generation analysis. No transfected U937 cells were used as a control group. Captopril and Losartan at 10-7 M were used to test angiotensin converting enzyme (ACE) and AT1 receptors participation in this process. The results demonstrated that single mutations at - 3 methionine (M/A), -2 lysine (K/A) and +3 leucine (L/A) reduced prorenin processing by cathepsin B. Moreover, removal of N-linked oligosaccharides at +5 asparagine enhanced prorenin conversion by cathepsin B, showing that glycosylation seems impair enzymatic prorenin processing. In pulse-chase experiments, prorenin was not targeted to secretory granules and cathepsin B co-transfection did not changed this sorting, indicating that prorenin processing probably occurs outside these organelles. These findings suggest that cathepsin B removes prorenin prosegment at correct cleavage site and this proteolysis occurs outside the dense core granules. Prorenin WT secreted by U937 cells could activate the BNP promoter in rat cardiomyocytes transfected with human angiotensinogen. Dibasic arginine-lisine prorenin amino acids and N-linked glycosilation seems to be important as well as ACE enzymatic activity and AT1 receptors for BNP promoter activation.

Orientador: Humberto de Araujo Rangel / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-14T14:51:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dawood_FawziAhmedMoustafa_D.pdf: 5960601 bytes, checksum: ad350f5d12f35367c953c86bdbcb6cc5 (MD5) Previous issue date: 1979 / Resumo: Este trabalho foi realizado com a finalidade de purificar e caracterizar a cat D do baço de coelho e determinar as células que a sintetisam no baço. Os estudos apresentados mostraram que: Com técnicas de precipitação com acetona, cromotogradica de troca iônica em DEAE-Celulose e filtração em sephadex G-100, foi possível obter a car D do baço de coelho com alto grau de pureza (315 U/mg prot). Com dupladifusão e imunoeletroforese, a enzima purificada apresenta apenas um arco de procipitação, contra imune-soro polivalente preparado com cat parcialmente purificada. Co, a eletroforese em acetato-celulose e em gel de amido, a car D purificada se apresenta em 6 componentes que tem a mesma atividade proteinásica sobre BSA, HSA e hemoglobina. Com a isoeletrofocalização, esta enzima apresentou 11 componentes de diferentes pontos isoelétricos, que mostram a mesma atividade proteínásica da cat D sobre a hemoglobina. 77% desta atividade se encontra concentrada em apenas 3 componentes,com atividades especifica de: 740, 640 e 300 U/mg prot e pontos isoelétricos de: 5,9 , 8,2 e 4,5 respectivamente. Os componentes isolados por issoeletrofocalização preparativa, apresentam a mesma indentidade antigênica, quando testados com antisoro polivalente preparado contra enzima parcialmente purificada e hidrolisam as mesmas ligações da cad D insula, hidrolisáveis pela car purificada, indicando que são isoenzimas ...Observação: O resumo, na íntegra, poderá ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: Not informed. / Doutorado / Doutor em Ciências Biológicas

Orientador: Humberto de Araujo Rangel / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-14T14:00:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dawood_FawziAhmedMoustafa_M.pdf: 2521546 bytes, checksum: 97d2cb21773d0a2beacb5885ac3aa0ac (MD5) Previous issue date: 1973 / Resumo: Os estudos apresentados nesse trabalho mostraram que: 1. A cat D, extraída a partir de baço de coelho, pode ser obtida em alto grau de pureza, utilizando-se as técnicas de precipitação ao ponto isoelétrico e cromatografia em celulose modificada. 2. A imunização de cobaias com a cat D purificada permitiu a obtenção de um soro monoespecífico anti-cat D de coelho / Abstract: Not informed. / Mestrado / Mestre em Ciências Biológicas

Trabajo de Investigación Requisito para optar al Título de Cirujano Dentista / Autor no autoriza el acceso a texto completo de su documento / Introducción: En la actualidad no existe un método clínico no invasivo que refleje la progresión de los procesos de destrucción y reparación de los tejidos periapicales una vez finalizado el tratamiento endodóntico en dientes con diagnóstico de Periodontitis Apical asintomática (PAa). El objetivo del presente trabajo de investigación es determinar los niveles de catepsina K en el Fluido Gingival Crevicular (FGC) de dientes con PAa antes y después de la terapia endodóntica convencional y compararlo con el FGC de dientes contralaterales sin PAa. Materiales y métodos: Se obtuvieron muestras de FGC de dientes en sujetos con diagnóstico de PAa y de dientes control, contralaterales sin PAa (n=11). También se obtuvieron muestras de exudado periapical (EP) de los dientes con PAa. Las muestras de FGC de dientes enfermos se obtuvieron al momento del diagnóstico y a los 7 y 30 días tras finalizar el tratamiento endodóntico. Se determinaron los niveles de catepsina K mediante test de EIA y se realizó el análisis estadístico de los resultados con la ayuda del programa Stata v10. Resultados: Los resultados no mostraron aumentos significativos en los niveles de catepsina K en el FGC de dientes enfermos v/s controles, antes y después del tratamiento endodóntico. Tampoco se observó una correlación con respecto a los niveles de catepsina K en EP, ni con los parámetros radiográficos de los dientes con PAa. Conclusiones: En el presente estudio los niveles de catepsina K en el FGC y EP no parecen reflejar el estado de salud de los tejidos periapicales de dientes con PAa.

A catepsina L é uma cisteína proteinase da família da papaína (clã CA, família C1), sendo esta família a mais conhecida entre as cisteína proteinase. A catepsina L, como outras proteinases da família C1, é sintetizada como uma pró-enzima inativa que é ativada através da remoção do pró-peptídeo. Os pró-peptídeos das catepsinas da subfamília catepsina L apresentam um motivo consenso, denominado motivo ERFNIN. A catepsina L corresponde a principal proteinase digestiva em Tenebrio molitor. No nosso laboratório 3 pró-catepsinas L (pCALs) foram clonadas e seqüenciadas a partir de uma biblioteca de cDNA de intestino médio de larvas de T. molitor: pCAL1 (CAL lisossomal), pCAL2 e pCAL3 (enzimas digestivas). Estas proteinases apresentam o motivo ERFNIN e os resíduos envolvidos na catálise: Cys25, His169, e Asn175 com Gln19 (numeração da papaína). Neste trabalho descrevemos a clonagem em vetores de expressão e a expressão em bactérias das sequências codificadoras de pCAL1, pCAL2 e pCAL3. As pró-catepsinas L recombinantes foram purificadas por cromatografia de afinidade e a incubação em pH ácido resultou na formação das enzimas maduras CAL1, CAL2 e CAL3 com atividade sobre o substrato Z-FR-MCA. O anticorpo policlonal anti-pCAL2 foi produzido em coelho e reconheceu pCAL2 e CAL2 em immunoblots. Experimentos de immunoblots com diferentes tecidos de T. molitor mostraram que o anticorpo policlonal anti-pCAL3 reconheceu pCAL3 e CAL3 nos dois terços anteriores do intestino médio de larvas de T. molitor. Estudos de imunocitolocalização indicam que a catepsina L 3 ocorre em vesículas no intestino médio anterior e em microvilosidades no intestino médio posterior. Para os experimentos de cristalização, nós expressamos pCAL1, pCAL2 e pCAL3 como mutantes Cys25→Ser inativos. pCAL3Cys26Ser foi cristalizada por difusão de vapor (gota sentada) contra 0,1-1,6M de dihidrogênio fosfato de amônio. Os cristais são monoclínicos com grupo espacial C2 e parâmetros de célula: a=57,634 Å, b=89,322 Å, c=70,076 Å, α=γ=90°, β=92,502° e uma molécula na unidade assimétrica. A e strutura foi determinada por substituição molecular usando a estrutura de Fasciola hepatica (42% de identidade) como modelo. O modelo foi refinado a 2,1 Å com fator R final de 16,19% (Rfree=20,5%). pCAL2Cys25Ser foi cristalizada por difusão de vapor (gota sentada) contra acetato de sódio 0,2M, cacodilato de sódio 0,1M pH6,6-6,7 e 20% de PEG 8000. Os cristais são triclínicos com grupo espacial P1 e parâmetros de célula: a=51,669 Å, b=52,37 Å, c=59,716 Å, α= 91,278°, γ=109,586°, β=91,547° e duas moléculas na unidade assimétrica. A estrutura foi determinada por substituição molecular usando a estrutura da pCAL3 (44% de identidade) como modelo. O modelo foi refinado a 2,0 Å com fator R final de 17,61% (Rfree=22,48%). A estrutura terciária da pró-catepsinas L digestivas é muito similar as estruturas de cisteína proteinases da família da papaína / Cathepsin L is a cysteine proteinase of the papain family (clan CA, family C1), which is the most known among the cysteine proteinases. Cathepsin L, like other proteinases of family C1, is synthesized as an inactive proenzyme that is activated by propeptide removal. The propeptide of cathepsin L-like subfamily contain a highly conserved motif, the so called ERFNIN motif. Cathepsin L corresponds to the major digestive proteinase in Tenebrio molitor. In our laboratory, 3 procathepsins L (pCALs) were cloned and sequenced from a cDNA library prepared from T. molitor larval midguts: pCAL1 (lysosomal CAL), pCAL2 and pCAL3 (digestive enzymes). These proteinases have ERFNIN motif and 3 residues directly involved in catalysis: Cys25, His169, Asn175 with Gln19 (papain numbering). In this work we report the cloning into the expression vector and bacterial expression of the sequences coding pCAL1, pCAL2 and pCAL3. The recombinant procathepsins L were purified by affinity chromatography and activation of these enzymes occurs under acidic conditions. The cathepsins L (CAL1, CAL2 and CAL3) were able to hydrolyse Z-FR-MCA. The polyclonal antibody anti-pCAL2 was produced in rabbit and recognized pCAL2 and CAL2 on immunoblots. Immunoblot analyses of different T. molitor larval tissues demonstrated that the polyclonal antibody anti-pCAL3 recognised pCAL3 and CAL3 in the anterior two-thirds of midgut tissue of T. molitor larvae. Immunolocalization studies indicate that cathepsin L 3 occurs in vesicles in the anterior midgut and microvilli in posterior midgut. To crystallographic studies we expressed pCAL1, pCAL2 and pCAL3 as inactive Cys25→Ser mutants. pCAL3Cys26Ser was crystallized by vapor diffusion in sitting drops against 0.1-1.6 M mono-ammonium dihydrogen phosphate. The crystals are monoclinic, belonging to space group C2, with cell parameters: a = 57.634 Å, b = 89.322 Å, c = 70.076 Å, α = γ =90°, β = 92.502° and contain one molecule in the asymmetric unit. The structure was determined by molecular replacement using the structure of Fasciola hepatica procathepsin L (42.5% identity) as a model. The model was refined at 2.1 Å resolution with an R factor of 16.19% (Rfree = 20.5%). pCAL2Cys25Ser was crystallized by vapor diffusion in sitting drops against 0.2M sodium acetate, 0.1M sodium cacodylate pH 6.6-6.7 and 20% polyethylene glycol 8,000. The crystals are triclinic, belonging to space group P1, with cell parameters: a = 51.669 Å, b = 52.37 Å, c = 59.716 Å, α = 91.278° γ = 109.586°, β = 91.547° and contain two molecules in the asymmetric unit. The structure was determined by molecular replacement using the structure of procathepsin L 3 (44 % identity) as a model. The model was refined at 2.0 Å resolution with an R factor of 17.61% (Rfree = 22.48%). The tertiary structure ofdigestive procathepsins L is very similar to papain-like cysteine proteinases structures

A catepsina L é uma cisteína proteinase da família da papaína (clã CA, família C1), sendo esta família a mais conhecida entre as cisteína proteinase. A catepsina L, como outras proteinases da família C1, é sintetizada como uma pró-enzima inativa que é ativada através da remoção do pró-peptídeo. Os pró-peptídeos das catepsinas da subfamília catepsina L apresentam um motivo consenso, denominado motivo ERFNIN. A catepsina L corresponde a principal proteinase digestiva em Tenebrio molitor. No nosso laboratório 3 pró-catepsinas L (pCALs) foram clonadas e seqüenciadas a partir de uma biblioteca de cDNA de intestino médio de larvas de T. molitor: pCAL1 (CAL lisossomal), pCAL2 e pCAL3 (enzimas digestivas). Estas proteinases apresentam o motivo ERFNIN e os resíduos envolvidos na catálise: Cys25, His169, e Asn175 com Gln19 (numeração da papaína). Neste trabalho descrevemos a clonagem em vetores de expressão e a expressão em bactérias das sequências codificadoras de pCAL1, pCAL2 e pCAL3. As pró-catepsinas L recombinantes foram purificadas por cromatografia de afinidade e a incubação em pH ácido resultou na formação das enzimas maduras CAL1, CAL2 e CAL3 com atividade sobre o substrato Z-FR-MCA. O anticorpo policlonal anti-pCAL2 foi produzido em coelho e reconheceu pCAL2 e CAL2 em immunoblots. Experimentos de immunoblots com diferentes tecidos de T. molitor mostraram que o anticorpo policlonal anti-pCAL3 reconheceu pCAL3 e CAL3 nos dois terços anteriores do intestino médio de larvas de T. molitor. Estudos de imunocitolocalização indicam que a catepsina L 3 ocorre em vesículas no intestino médio anterior e em microvilosidades no intestino médio posterior. Para os experimentos de cristalização, nós expressamos pCAL1, pCAL2 e pCAL3 como mutantes Cys25→Ser inativos. pCAL3Cys26Ser foi cristalizada por difusão de vapor (gota sentada) contra 0,1-1,6M de dihidrogênio fosfato de amônio. Os cristais são monoclínicos com grupo espacial C2 e parâmetros de célula: a=57,634 Å, b=89,322 Å, c=70,076 Å, α=γ=90°, β=92,502° e uma molécula na unidade assimétrica. A e strutura foi determinada por substituição molecular usando a estrutura de Fasciola hepatica (42% de identidade) como modelo. O modelo foi refinado a 2,1 Å com fator R final de 16,19% (Rfree=20,5%). pCAL2Cys25Ser foi cristalizada por difusão de vapor (gota sentada) contra acetato de sódio 0,2M, cacodilato de sódio 0,1M pH6,6-6,7 e 20% de PEG 8000. Os cristais são triclínicos com grupo espacial P1 e parâmetros de célula: a=51,669 Å, b=52,37 Å, c=59,716 Å, α= 91,278°, γ=109,586°, β=91,547° e duas moléculas na unidade assimétrica. A estrutura foi determinada por substituição molecular usando a estrutura da pCAL3 (44% de identidade) como modelo. O modelo foi refinado a 2,0 Å com fator R final de 17,61% (Rfree=22,48%). A estrutura terciária da pró-catepsinas L digestivas é muito similar as estruturas de cisteína proteinases da família da papaína / Cathepsin L is a cysteine proteinase of the papain family (clan CA, family C1), which is the most known among the cysteine proteinases. Cathepsin L, like other proteinases of family C1, is synthesized as an inactive proenzyme that is activated by propeptide removal. The propeptide of cathepsin L-like subfamily contain a highly conserved motif, the so called ERFNIN motif. Cathepsin L corresponds to the major digestive proteinase in Tenebrio molitor. In our laboratory, 3 procathepsins L (pCALs) were cloned and sequenced from a cDNA library prepared from T. molitor larval midguts: pCAL1 (lysosomal CAL), pCAL2 and pCAL3 (digestive enzymes). These proteinases have ERFNIN motif and 3 residues directly involved in catalysis: Cys25, His169, Asn175 with Gln19 (papain numbering). In this work we report the cloning into the expression vector and bacterial expression of the sequences coding pCAL1, pCAL2 and pCAL3. The recombinant procathepsins L were purified by affinity chromatography and activation of these enzymes occurs under acidic conditions. The cathepsins L (CAL1, CAL2 and CAL3) were able to hydrolyse Z-FR-MCA. The polyclonal antibody anti-pCAL2 was produced in rabbit and recognized pCAL2 and CAL2 on immunoblots. Immunoblot analyses of different T. molitor larval tissues demonstrated that the polyclonal antibody anti-pCAL3 recognised pCAL3 and CAL3 in the anterior two-thirds of midgut tissue of T. molitor larvae. Immunolocalization studies indicate that cathepsin L 3 occurs in vesicles in the anterior midgut and microvilli in posterior midgut. To crystallographic studies we expressed pCAL1, pCAL2 and pCAL3 as inactive Cys25→Ser mutants. pCAL3Cys26Ser was crystallized by vapor diffusion in sitting drops against 0.1-1.6 M mono-ammonium dihydrogen phosphate. The crystals are monoclinic, belonging to space group C2, with cell parameters: a = 57.634 Å, b = 89.322 Å, c = 70.076 Å, α = γ =90°, β = 92.502° and contain one molecule in the asymmetric unit. The structure was determined by molecular replacement using the structure of Fasciola hepatica procathepsin L (42.5% identity) as a model. The model was refined at 2.1 Å resolution with an R factor of 16.19% (Rfree = 20.5%). pCAL2Cys25Ser was crystallized by vapor diffusion in sitting drops against 0.2M sodium acetate, 0.1M sodium cacodylate pH 6.6-6.7 and 20% polyethylene glycol 8,000. The crystals are triclinic, belonging to space group P1, with cell parameters: a = 51.669 Å, b = 52.37 Å, c = 59.716 Å, α = 91.278° γ = 109.586°, β = 91.547° and contain two molecules in the asymmetric unit. The structure was determined by molecular replacement using the structure of procathepsin L 3 (44 % identity) as a model. The model was refined at 2.0 Å resolution with an R factor of 17.61% (Rfree = 22.48%). The tertiary structure ofdigestive procathepsins L is very similar to papain-like cysteine proteinases structures

O remodelamento ósseo é um processo metabólico, dentro do qual os osteoblastos e os osteoclastos, participam ativamente. Portanto, qualquer alteração neste equilíbrio, pode provocar uma modificação na densidade mineral do osso, situação observada em certas doenças osteolíticas como osteoporose, artrite reumatóide e periodontite. Nos últimos anos, há um crescente interesse em avaliar o papel da glicólise na proliferação, sobrevivência e diferenciação dos diferentes tipos celulares. Em particular, tem sido evidenciado o efeito regulador da frutose 1,6-bisfosfato (FBP), um intermediário da via glicolítica de alta energia. Considerando que ainda não existem dados na literatura que correlacionem a FBP com o funcionamento dos osteoclastos, este trabalho tem por finalidade avaliar seu papel na osteoclastogênese e reabsorção óssea in vitro. Para isso, pré-osteoclastos murinos derivados da medula óssea foram diferenciados em osteoclastos na presença de M-CSF, RANKL e duas concentrações da FBP (100 e 300 ?M). Os resultados obtidos amostram que a FBP inibe a diferenciação osteoclástica em uma relação dose-dependente, sem afetar a viabilidade celular. Observa-se também, que o tratamento com FBP diminui a expressão de genes marcadores como, Nfatc1, Trap e Catepsina K (p < 0.01) e das proteínas NFATc1 e catepsina K. Como também, promove uma redução na atividade reabsortiva dos osteoclastos depois de 96 h de cultura. O efeito inibidor da FBP não depende da atividade da piruvato quinase M2 (PKM2). Em conjunto, estes dados sugerem que a FBP é um metabolito regulador importante da osteoclastogênese, demonstrando ser um agente potencial para o tratamento de doenças osteolíticas. / Bone remodeling is a coordinated metabolic process, where the osteoblasts and osteoclasts participate actively. Therefore, any alteration in this balance may cause a change in the bone mineral density, a condition observed in certain bone loss-associated diseases such as osteoporosis, rheumatoid arthritis and periodontitis. Recently, there has been a growing interest in assessing the role of the glycolysis on the proliferation, survival, and differentiation of the different cell types. In particular, it has been demonstrated the protective effect of the Fructose 1,6-bisphosphate (FBP), a high-energy glycolytic intermediate. Considering that there is no evidence in the literature that associate FBP with the function of osteoclasts, this work aims to evaluate its role in osteoclastogenesis and bone resorption in vitro. To this end, murine bone marrow derived pre-osteoclasts were differentiated into osteoclasts in the presence of M-CSF, RANKL and two concentrations of FBP (100 and 300 ?M). The results showed that FBP inhibits the differentiation of osteoclasts in a dose dependent manner, without affecting the cell viability. It was also observed that the treatment with the FBP decreases the expression of marker genes such as Nfatc1, Trap and Cathepsin K (p < 0.01) and the NFATc1 and cathepsin K protein levels. As well, the treatment with FBP resulted in markedly fewer osteoclast activity after 96 h of culture. FBP osteoclast inhibitory effect does not involve Pyruvate Kinase M2 (PKM2) activity. Together, these data denote the important regulatory role of the FBP on osteoclastogenesis, proving to be a potential agent for the treatment of bone loss-associated diseases.

O remodelamento ósseo é um processo metabólico, dentro do qual os osteoblastos e os osteoclastos, participam ativamente. Portanto, qualquer alteração neste equilíbrio, pode provocar uma modificação na densidade mineral do osso, situação observada em certas doenças osteolíticas como osteoporose, artrite reumatóide e periodontite. Nos últimos anos, há um crescente interesse em avaliar o papel da glicólise na proliferação, sobrevivência e diferenciação dos diferentes tipos celulares. Em particular, tem sido evidenciado o efeito regulador da frutose 1,6-bisfosfato (FBP), um intermediário da via glicolítica de alta energia. Considerando que ainda não existem dados na literatura que correlacionem a FBP com o funcionamento dos osteoclastos, este trabalho tem por finalidade avaliar seu papel na osteoclastogênese e reabsorção óssea in vitro. Para isso, pré-osteoclastos murinos derivados da medula óssea foram diferenciados em osteoclastos na presença de M-CSF, RANKL e duas concentrações da FBP (100 e 300 ?M). Os resultados obtidos amostram que a FBP inibe a diferenciação osteoclástica em uma relação dose-dependente, sem afetar a viabilidade celular. Observa-se também, que o tratamento com FBP diminui a expressão de genes marcadores como, Nfatc1, Trap e Catepsina K (p < 0.01) e das proteínas NFATc1 e catepsina K. Como também, promove uma redução na atividade reabsortiva dos osteoclastos depois de 96 h de cultura. O efeito inibidor da FBP não depende da atividade da piruvato quinase M2 (PKM2). Em conjunto, estes dados sugerem que a FBP é um metabolito regulador importante da osteoclastogênese, demonstrando ser um agente potencial para o tratamento de doenças osteolíticas. / Bone remodeling is a coordinated metabolic process, where the osteoblasts and osteoclasts participate actively. Therefore, any alteration in this balance may cause a change in the bone mineral density, a condition observed in certain bone loss-associated diseases such as osteoporosis, rheumatoid arthritis and periodontitis. Recently, there has been a growing interest in assessing the role of the glycolysis on the proliferation, survival, and differentiation of the different cell types. In particular, it has been demonstrated the protective effect of the Fructose 1,6-bisphosphate (FBP), a high-energy glycolytic intermediate. Considering that there is no evidence in the literature that associate FBP with the function of osteoclasts, this work aims to evaluate its role in osteoclastogenesis and bone resorption in vitro. To this end, murine bone marrow derived pre-osteoclasts were differentiated into osteoclasts in the presence of M-CSF, RANKL and two concentrations of FBP (100 and 300 ?M). The results showed that FBP inhibits the differentiation of osteoclasts in a dose dependent manner, without affecting the cell viability. It was also observed that the treatment with the FBP decreases the expression of marker genes such as Nfatc1, Trap and Cathepsin K (p < 0.01) and the NFATc1 and cathepsin K protein levels. As well, the treatment with FBP resulted in markedly fewer osteoclast activity after 96 h of culture. FBP osteoclast inhibitory effect does not involve Pyruvate Kinase M2 (PKM2) activity. Together, these data denote the important regulatory role of the FBP on osteoclastogenesis, proving to be a potential agent for the treatment of bone loss-associated diseases.

Trypanosamas de diversas espécies podem infectar mamíferos de interesse econômico em todo o mundo. Trypanosoma vivax, T. evansi, T. equiperdum, T. congolense, T. b. brucei e T. simiae geram importantes doenças em ungulados na África, Ásia e Américas Central e do Sul; enquanto T. theileri e espécies relacionadas são pouco patogênicas. Compreender a epidemiologia e as interações parasita-vector-hospedeiro requer estudos de estrutura populacional, filogeográficos e de diversidade e relações filogenéticas entre isolados. Sequências de microssatelites e dos genes SSUrRNA, gGAPDH, CatL, ITS, SL, 5S, Cytb e ESAG6 mostraram ampla diversidade biológica e diferenciaram genótipos com associação geográfica e restrição de hospedeiros em T. theileri e espécies relacionadas. T. evansi mostrou importante heterogeneidade de sequências no gene ESAG6, enquanto populações de T. vivax muito divergentes foram observadas em regiões preservadas e com transmissão cíclica quando comparadas com a microheterogeneidade biológica de áreas de transmissão mecânica. / Trypanosames can infect diverse species of mammals of economic interest worldwide. Trypanosoma vivax, T. evansi, T. equiperdum, T. congolense, T. brucei brucei and T. simiae cause important diseases in ungulates in Africa, Asia and Central and South America, while T. theileri and related species are of low pathogenicity. Understanding the epidemiology and host-parasite-vector interactions requires studies of population structure, phylogeography and diversity and phylogenetic relationships among isolates. Microsatellite loci and sequences from genes SSUrRNA, gGAPDH, CatL, ITS, SL, 5S, Cytb and ESAG6 revealed high biological diversity and allowed differentiation of genotypes with geographic structure and host-restriction event in T. theileri and related species. T. evansi showed significant heterogeneity in ESAG6 sequences, while populations of T. vivax widely divergent were observed in pristine regions and cyclical transmission compared to the microheterogeneity showed by isolates from mechanical transmission areas.