O complexo esclerose tuberosa (CET) e as doenças renais policísticas autossômica dominante (DRPAD) e autossômica recessiva (DRPAR) são doenças monogênicas associadas a cistogênese renal. Os produtos dos genes mutados nessas enfermidades, respectivamente tuberina e hamartina para CET, policistina-1 (PC1) e policistina-2 para DRPAD, e poliductina/fibrocistina para DRPAR, modulam proliferação, diferenciação, apoptose, crescimento e/ou migração celular. Neste estudo empregamos um sistema tridimensional de cultura de células IMCD para caracterizar os perfis de expressão dessas proteínas durante a tubulogênese. Usando uma matriz de colágeno tipo I/Matrigel e fator de crescimento de hepatócito (HGF), a formação de estruturas alongadas se iniciou dois dias após o plaqueamento in vitro (2 DIV), ao passo que o desenvolvimento de lúmen ocorreu entre 10-14 DIV. A marcação para caspase-3 ativa foi mais intensa nas fases iniciais da tubulogênese, enquanto a marcação para Ki-67 foi uniformemente pronunciada em estágios mais tardios. A tuberina e a hamartina apresentaram expressão citoplasmática e co-localização acentuada em 6 e 12 DIV. A PC1 apresentou maior expressão nas porções ramificadas dos túbulos que nas não ramificadas no 12 DIV, um padrão não verificado para a PC2. Estas proteínas exibiram expressão citoplasmática, assim como expressão ocasional e pontual na membrana plasmática. PD1 também apresentou expressão citoplasmática. Nossos dados sugerem que a apoptose e a ciclagem celular sincrônica durante a tubulogênese in vitro são mais acentuadas, respectivamente, em fases mais precoces e mais tardias da formação tubular. Nossos achados demonstram, além disso, que as proteínas relacionadas ao CET e às DRPs são expressas in vitro durante a tubulogênese, apoiando um papel importante para a interação tuberina-hamartina na formação tubular, e são consistentes com o padrão de expressão diferencial da PC1 observado durante a nefrogênese / Tuberous sclerosis complex (TSC) and autosomal dominant and recessive polycystic kidney diseases (ADPKD and ARPKD) are monogenic diseases associated with renal cystogenesis. The products of the genes mutated in these disorders, respectively tuberin and hamartin for TSC, and polycystin-1 (PC1), polycystin-2 (PC2) and polyductin/fibrocystin (PD1) for PKD, modulate cell proliferation, differentiation, apoptosis, growth and/or migration. We have employed an IMCD tridimensional cell culture system to characterize their expression profiles along tubulogenesis. Using a type I collagen/Matrigel matrix and hepatocyte growth factor (HGF), the formation of elongated structures initiated 2 days after in vitro plating (2 DIV) while lumen developed between 10-14 DIV. Active caspase-3 labeling was more intense in initial phases of tubulogenesis while Ki-67 staining was uniformly pronounced in later stages. Tuberin and hamartin showed cytoplasmic expression and marked co- localization at 6 and 12 DIV. PC1 displayed higher expression in branching than non- branching portions of the tubules at 12 DIV, a pattern not verified for PC2. These proteins presented cytoplasmic and occasional, punctate membrane expression. PD1 also showed cytoplasmic expression. Our data suggest that apoptosis and synchronous cell cycling during in vitro tubulogenesis are more remarkable, respectively, in early and later steps of tubule formation. In addition, our findings demonstrate that the TSC and PKD proteins are expressed in vitro during tubulogenesis, supporting an important role for tuberin-hamartin interaction in tubular formation, and are consistent with the differential PC1 expression pattern observed during nephrogenesis

A exocitose de grânulos secretórios é o principal mecanismo efetor de células TCD8+. No entanto, pouco se sabe sobre a composição dos grânulos líticos dessas células. Resultados prévios do nosso grupo identificaram algumas dezenas de novas proteínas desses grânulos. Dentre elas foi identificada Gal-1. A literatura relata que Gal-1 age por via exógena através de sua secreção por via não convencional. Dados iniciais do nosso grupo apontam um novo cenário para esta proteína no qual ela está presente em grânulos citotóxicos. Através das técnicas de microscopia eletrônica e confocal e de ensaios de citotoxicidade, nossos resultados sugerem que Gal-1 participa do papel citotóxico das CTLs modulando a via dos receptores de morte FAS-FASL. Nós também mostramos que Gal-1 interfere com o tempo de contato entre APCs e linfócitos TCD8+, com a ativação dessas células e com o controle da proliferação dos linfócitos. Nossos resultados apontam um novo cenário para Gal-1, no qual ela está presente em grânulos líticos das CTLs e está relacionada a resposta efetora dessas células. / Exocytosis of secretory granules is the main effector mechanism of CD8+ T cells. In particular, little is known about CTLs lytic granules composition. Previous results from our group identified a few dozens of new proteins associated with these granules. Among them, we identified galectin-1. Literature reports the extracellular action of Gal-1. Initial data from our group suggested a new scenario for this protein, since Gal-1 was found inside cytotoxic granules. Here, we show by transmission electron and confocal laser scanning microscopy and cytotoxicity assays that Gal-1 has a role on CTL killing probably mediating the FAS-FASL pathway. We also show that Gal-1 is regulates the time of contact between APCs and TCD8+ lymphocytes, the activation of APCs and the proliferation of CD8 T cells. Taken together, our findings suggest a new scenario, in which Gal-1 is present in CTL granules and participates in cytotoxic effector response.

A maior parte dos casos de doença renal policística autossômica dominante (DRPAD) é causada por mutações no gene PKD1 (Polycystic Kidney Disease 1). O insulto por isquemia/reperfusão (IR) constitui-se em uma causa freqüente de lesão renal aguda, incluindo a população de pacientes com DRPAD, mas a relação entre policistina-1 e IR é essencialmente desconhecida. Uma vez que a policistina-1 modula proliferação, diferenciação celular e apoptose em sistemas de cultura de células, sua menor atividade biológica na DRPAD poderia favorecer um maior grau de lesão renal. Utilizamos uma linhagem endogâmica de camundongos 129Sv com uma mutação nula em Pkd1 para testar esta hipótese. Camundongos Pkd1+/- não apresentam cistos renais até 12 semanas de vida, constituindo-se em um modelo puro de haploinsuficiência para este gene. Um insulto IR bilateral de 32 min foi induzido em camundongos machos de 10-12 semanas de idade, heterozigotos e selvagens, por meio do clampeamento reversível de ambos os pedículos renais. Os animais foram analisados 48 h, 7 dias (d) e 14 d após o insulto. Camundongos Pkd1+/- apresentaram FENa, FEK e SCr mais elevadas que animais Pkd1+/+ 48 h após IR. O dano cortical residual foi mais severo em heterozigotos que em selvagens em todos os tempos avaliados. A marcação para PCNA também foi mais alta em camundongos Pkd1+/- que Pkd1+/+ 48 h e 7 d pós-IR, enquanto a taxa de apoptose e a infiltração inflamatória intersticial foram maiores em heterozigotos que em selvagens nos seguimentos de 48 h, 7 d e 14 d pós-IR. A expressão renal de p21 foi menor nos camundongos Pkd1+/- que Pkd1+/+ no tempo de 48 h pós-insulto, tanto no nível transcricional como traducional. Análises adicionais realizadas 6 semanas após o insulto IR revelaram dilatação tubular e formação de microcistos nos camundongos haploinsuficientes para Pkd1, assim como fibrose renal aumentada nesses animais, comparados aos camundongos selvagens. Por fim, um insulto de 35 min de isquemia/reperfusão acompanhou-se de uma mortalidade precoce substancialmente maior nos animais Pkd1+/-. Esses achados sugerem que isquemia/reperfusão induza uma lesão mais severa em rins de camundongos haploinsuficientes para Pkd1, um processo aparentemente dependente de uma deficiência relativa da atividade de p21, assim como dilatação tubular e formação de microcistos. Em conjunto, nossos resultados sugerem que a heterozigose para mutação nula em Pkd1 em camundongo (e talvez em humanos) esteja associada a um risco aumentado para lesão renal por isquemia/reperfusão e a um pior impacto desse insulto sobre a progressão da doença renal. / The majority of autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD) cases are caused by mutations in the PKD1 gene. Ischemia/reperfusion is a frequent cause of acute kidney injury, including the ADPKD patient population, but the relationship between polycystin-1 and ischemia/reperfusion is essentially unknown. Since polycystin-1 modulates cell proliferation, cell differentiation and apoptosis in cell culture systems, its lower biological activity in ADPKD might amplify the degree of renal injury. Using an inbred 129Sv mouse line with a Pkd1-null mutation, 32-min renal ischemia/reperfusion was induced in 10-12 week-old male non-cystic mice, heterozygotes and wild types. The animals were analyzed at 48h, 7 days (d) and 14d after the insult. Pkd1+/- mice showed higher FENa, FEK and SCr than Pkd1+/+ animals at 48h of follow-up. The residual cortical damage was more severe in heterozygotes than wild types at all evaluated time points. The PCNA staining was also higher in Pkd1+/- than Pkd1+/+ mice at 48h and 7d, while cell apoptotic rates and the interstitial inflammatory infiltration were higher in heterozygotes than wild types at 48h, 7d and 14d postischemia/ reperfusion. The expression of p21 was lower in Pkd1+/- than Pkd1+/+ kidneys at 48h, both at the transcriptional and translational levels. Additional analyses performed 6 weeks after the insult showed tubular dilatation and microcyst formation in the haploinsufficient mice, and increased renal fibrosis in these animals compared to wild types. Thirty-fivemin ischemia/reperfusion, at last, was accompanied by a substantially higher early mortality of Pkd1+/- animals. These findings suggest that ischemia/reperfusion induces a more severe injury in kidneys of Pkd1- haploinsufficient mice, a process that is apparently dependent on a relative deficiency of p21 activity, as well as tubular dilatation and microcyst formation. Altogether, our results suggest that mouse Pkd1-null heterozygosity (and maybe human) is associated with a higher risk for renal ischemia/reperfusion injury and with a worse impact of this insult upon renal disease progression.

O butirato é um importante ácido graxo de cadeia curta proveniente da fermentação bacteriana de vários tipos de fibras no cólon. Diversos estudos têm demonstrado que o butirato desempenha um papel importante na prevenção do câncer e na manutenção da homeostase colônica, por meio da regulação da proliferação celular, diferenciação e apoptose. A acetilação das histonas tem sido proposta como um dos possíveis mecanismos de ação responsável pelo efeito quimiopreventivo do butirato. O objetivo desse trabalho foi avaliar o papel da tributirina (TB), um pró-fármaco do ácido butírico, na fase de pós-iniciação da carcinogênese de cólon induzida por dimetilhidrazina (DMH), enfatizando a expressão das histonas acetiladas (H3K9 e H4K16) e das proteínas pró e anti-apoptóticas da família Bcl-2 (Bak, Bcl-xL). Durante 5 semanas consecutivas, ratos Wistar receberam diariamente TB (200 mg/100 g peso corpóreo; grupo TB) ou maltodextrina (MD; 300 mg/100 g peso corpóreo; grupo MD; controle isocalórico). Focos de Criptas Aberrantes (FCAs) são lesões pré-neoplásicas e biomarcadores da carcinogênese de cólon. Esses foram analisados nos cólons corados com azul de metileno a 0,02%, porém, nenhuma diferença estatística foi encontrada entre os grupos, TB e MD (p>0,05). A mucosa colônica foi utilizada para analisar a expressão de H3K9 e H4K16 por western blot, contudo, não houve diferença significativa entre os grupos TB e MD. A expressão da proteína pró-apoptotica Bak também foi semelhante nos grupos TB e MD; todavia, a expressão da proteína anti-apoptótica Bcl-XL foi menor no cólon distai dos ratos tratados com TB sugerindo participação dessa na indução de apoptose. Portanto, apesar de trabalhos apontarem para os resultados benéficos do butirato, são necessários mais estudos in vivo para o melhor entendimento dos efeitos mediados pelo butirato na carcinogênese de cólon. / Butyrate is an important short-chain fatty acid, product of intestinal bacterial fermentation of mainly dietary fiber. Several studies have shown that butyrate has an important role in the maintenance of colonic homeostasis as regulator of colonocyte proliferation, differentiation and apoptosis. Thus may play a role in cancer prevention. Histone deacetylation has been proposed to be one of the possible mechanisms of action of butyrate mediated effects on colon carcinogenesis. The aim of this study was to evaluate the role of tributyrin (TB), a butyric acid pro-drug, on post-initiation phase of colon carcinogenesis induced by dimethylhydrazine (DMH), emphasizing the expression of acetylated histones (H3K9, H4K16) and BeI-2 family proteins (Bak, Bcl-XL) mediated apoptosis. During 5 consecutive weeks, Wistar rats received daily TB (200 mg/100 9 body weight; TB group) or maltodextrin (MD; 300 mg/100 9 body weight; MD group; isocaloric control). Aberrant Crypt Focus (ACFs) are considered pre-neoplastic cells and biomarker of colon carcinogenesis. ACFs were counted on colons stained with 0,02% methylene blue, under a light microscope. No statistic differences were found for ACF when compared both groups receiving TB or MD (p>0,05). Colonic mucosa scraping was used for analysis of H3K9 and H4K16 by Western Blot. No significant differences were demonstrated between TB and MD groups. Bak expression were similar between TB and MD groups, but Bcl-XL expression seems to be reduced only on distal colon of the TB group, suggesting that TB may induce apoptosis Although most studies point towards beneficial results of butyrate, more in vivo studies are needed to contribute to our current understanding of butyrate-mediated effects on colon carcinogenesis.

Diversos estudos epidemiológicos mostram que nutrientes e outros compostos bioativos presentes nos alimentos (CBA) apresentam atividade quimiopreventiva contra o câncer. Assim, destaca-se o estudo dos isoprenóides devido a sua ação promissora tanto na prevenção quanto na terapia do câncer. Todavia, apesar dessas evidências, pouco se sabe a respeito da ação dessas substâncias nos processos de proliferação celular e apoptose in vivo. Assim, 141 ratos Wistar foram tratados durante duas semanas consecutivas com farnesol (grupo FR, 25 mg/100 g de peso corporal) ou óleo de milho (grupo OM; controle, 0,25 mL/100 g de peso corporal) e sacrificados em diferentes momentos após a hepatectomia parcial (HP; 0 h, 30 min, 2 h, 4 h, 8 h, 12 h, 18 h e 24 h). Os parâmetros hepáticos analisados foram a proliferação celular (núcleos marcados para PCNA/mm2), apoptose (corpúsculos apoptóticos [CA\'s] por mm2) e expressão de p65, ciclina D1 (\"western blot\") e HMG-CoA redutase (\"dot-blot\"). Os animais tratados com o isoprenóide, assim como o grupo controle, apresentaram reduzida taxa de proliferação celular até 8h após a cirurgia. No entanto, a partir desse momento, o grupo FR passou a apresentar taxa de proliferação celular inferior ao grupo OM, diferença esta que atingiu significância estatística (p<0,05) 24h após a HP. Com relação a apoptose, animais tratados com FR apresentaram maior número de CA\'s (p<0,05) do que o grupo OM 30 min após a HP. Já em relação à ação do FR em âmbito molecular, houve uma redução de 40% e 50% na expressão de p65 e ciclina D1 30min e 24h após a HP, respectivamente, embora essas diferenças não tenham atingido significância estatística (p>0,05). Além disso, animais tratados com o isoprenóide apresentaram maior (p<0,05) expressão do gene que codifica para HMG-CoA redutase 2 h e 12 h após a cirurgia. Assim, tanto a inibição da proliferação celular quanto a indução de apoptose podem ser reflexo das alterações da expressão hepática dos genes para HMG-CoA redutase, p65 e ciclina D1 por parte do isoprenóide. / Epidemiological data have shown that nutrients and others bioactive compounds in food have chemopreventive activities against cancer. Among these compounds, isoprenoids are suggested either as a chemopreventive or chemotherapy agents. However, despite these evidences, studies focused on the isoprenoids activities on cell proliferation and apoptosis in vivo are rare. Thus, the effect of the 15-carbon isoprenoid farnesol on liver regeneration after partial hepatectomy was evaluated. Wistar rats were treated for two consecutive weeks with farnesol (FR group, 25 mg/100 g body weight) or corn oil (OM group, control, 0,25 mL/100 g body weight) and killed at different time points after partial hepatectomy (HP; 0 h, 30 min, 2 h, 4 h, 8 h, 12 h, 18 h and 24 h). Still, hepatic cell proliferation (PCNA lebeled nuclei), apoptosis (quantification of apoptotic bodies), p65 and cyclin D1 protein expression (western blot) and HMG-CoA reductase mRNA expression (dot blot) were also evaluated. Comparing to OM group, farnesol treatment significantly inhibited (p<0,05) hepatic cell proliferation 24 h after HP. Regarding apoptosis, also compared to controls, farnesol treated rats presented more (p<0,05) apoptotic bodies at 30 min. Besides, there were a suggestion of a higher number of apoptotic bodies 2 and 12 hours after HP in FR group comparing to OM group. According to western blot analysis, comparing to controls, this 15-carbon isoprenoid reduced 40% and 50% p65 and cyclin D1 hepatic protein expression, 30 min and 24 h after partial hepatectomy, respectively, although the differences did not also reach the statistical significance. Furthermore, farnesol treated rats had higher (p<0,05) HMG-CoA reductase mRNA levels than controls 2 h and 12 h after the surgery. Theses data suggest that the alterations on p65, cyclin D1 and HMG¬-CoA reductase gene expression observed in FR group might be associated with the inhibition of cell proliferation and the induction of apoptosis by farnesol.

O estudo da reprodução sexual de plantas e uma área de crescente interesse devido a importância de sementes e frutos em nossa dieta diária, ambos resultantes do desenvolvimento de partes do pistilo, apos fertilização. O objetivo deste trabalho foi caracterizar um novo gene F-box expresso no pistilo de N. tabacum. Proteínas F-box atuam na interação proteína-proteína, geralmente direcionando proteínas alvo para degradação pela via ubiquitina-proteassomo. Foram identificados cinco genes de função desconhecida que codificam putativas proteínas F-box, em duas bibliotecas de cDNAs de estigmas/estiletes de N. tabacum (DEPAOLI, 2006; QUIAPIM et al., 2009) previamente construídas em nosso laboratório. A expressão de cada um destes genes foi analisada nos diferentes órgãos de N. tabacum, por qRT-PCR. O clone 085H05 da biblioteca TOBEST (QUIAPIM et al., 2009) apresentou expressão preferencial nos órgãos florais. Este clone foi selecionado para uma caracterização funcional mais detalhada. O padrão de expressão deste gene foi avaliado no estigma/estilete durante os 12 estádios do desenvolvimento floral de N. tabacum (KOLTUNOW et al., 1990). O resultado revelou que sua expressão e regulada durante o desenvolvimento, atingindo o maior nível de expressão na antese (estádio 12). Isto sugere que este gene esteja envolvido no desenvolvimento do estigma/estilete. A sequência codificadora do gene correspondente a 085H05 foi determinada e, apos amplificação e clonagem, este gene foi denominado S/S_F-box (Stigma/Style_F-box). Para compreender a função da proteína de S/S_F-box, plantas transgênicas de superexpressao e de silenciamento (por RNAi) deste gene foram geradas. As plantas de RNAi apresentaram o estilete e o ovário reduzidos quando comparados ao controle SR1. Em concordância, as plantas de superexpressao produziram flores com o estilete mais alongado do que o controle, alem do estigma e do ovário de maior tamanho. Altas concentrações de exudato foram observadas na superfície do estigma destas plantas, a partir do estádio 7 tardio. No controle SR1, concentrações equivalentes apenas são observadas nos estádios finais do desenvolvimento. Os fenótipos observados nas plantas transgênicas sugerem que a proteína codificada por S/S_F-box esteja envolvida com o desenvolvimento do pistilo e com o controle do tamanho deste órgão. Adicionalmente, as plantas de RNAi apresentaram o fenótipo de perda da dominância apical. Os níveis de expressão do gene S/S_F-box foram avaliados em plantas que tiveram aumento na produção de auxina no estigma/estilete (plantas STIG1prom::iaaM), revelando que este gene não e regulado, a nível transcricional, por este hormônio. Experimentos de localização subcelular, realizados por expressão transitória da sequência de S/S_F-box fusionada a sequência dos genes repórteres GFP e YFP (S/S_F-box::GFP; S/S_F-box::YFP), indicaram que a proteína S/S_F-box esta localizada no citoplasma e no núcleo celular. Adicionalmente, foi realizado o screening de uma biblioteca de cDNAs de estigma/estilete, construída no sistema de duplo-hibrido, para investigar proteínas candidatas a interagirem com a proteína de S/S_F-box. Os resultados indicaram interação da proteína S/S_F-box com SKP1, confirmando a participação de S/S_F-box no complexo SCF, que promove a degradação de proteínas alvo pela via ubiquitina-proteassomo. Duas proteínas candidatas a alvo foram identificadas: os fatores de transcrição VOZ1 e SIP1, ambos envolvidos com a proliferação celular. Em suma, e possível propor que a proteína codificada por S/S_F-box tenha função relacionada a proliferação celular e ao desenvolvimento dos órgãos vegetais, incluindo o pistilo. / The study of sexual reproduction in plants is an area of increasing interest due to the importance of seeds and fruits in our daily diet, both resulting from the development of parts of the pistil, after fertilization. The aim of this study was to characterize a new F-box gene expressed in the N. tabacum pistil. F-box proteins act in protein-protein interactions, generally directing target proteins to degradation via ubiquitin-proteasome. Five genes of unknown function coding for putative F-box proteins were identified at two cDNAs libraries from N. tabacum stigmas/styles (DEPAOLI, 2006; QUIAPIM et al., 2009), previously constructed in our laboratory. The expression of each of these genes was analyzed in the different N. tabacum organs, by qRT-PCR. The 085H05 clone from the TOBEST library (QUIAPIM et al., 2009) showed preferential expression in floral organs. This clone was select for a more detailed functional characterization. The expression pattern of this gene was evaluated in the stigma/style during the 12 N. tabacum flower developmental stages (KOLTUNOW et al., 1990). The result revealed that its expression is regulated during development, reaching the highest expression level at anthesis (stage 12). It suggests that this gene is involved in the stigma/style development. The coding sequence of the gene corresponding to 085H05 was determined and, after amplification and cloning, the gene was named S/S_F-box (Stigma/Style_F-box). To understand the S/S_F-box protein function, transgenic plants either overexpressing or silencing (by RNAi) the S/S_F-box gene were generated. The RNAi plants showed reduced style and ovary when compared to the control SR1. In accordance, the overexpressing plants produced flowers with a style more elongated than the control, besides an ovary and a stigma of larger size. High concentrations of exudate were observed on the stigma surface of these plants, since the later stage 7. In the control SR1, equivalent concentrations are only observed at the later stages of development. The phenotypes observed in the transgenic plants suggest that the protein encoded by S/S_F-box is involved with pistil development and with the control of pistil size. Additionally, the RNAi plants showed the phenotype of loss of apical dominance. The expression levels of the S/S_F-box gene were evaluated in plants with increased auxin production in the stigma/style (plants STIG1prom::iaaM), showing that this gene is not transcriptionally regulated by this hormone. Subcellular localization experiments, carried out by transient expression of the S/S_F-box sequence fused to the reporter genes GFP and YFP V (S/S_F-box::GFP; S/S_F-box::YFP), showed that the S/S_F-box protein is localized in the cytoplasm and in the nucleus. Additionally, the screening of a stigma/style cDNA library constructed on the yeast two hybrid system was performed, to investigate candidate proteins for S/S_F-box protein interaction. The results indicated interaction between S/S_Fbox and the SKP1 protein, confirming the involvement of the S/S_F-box protein in the SCF complex, which promotes degradation of target proteins via ubiquitin-proteasome. Two candidates for target proteins were identified: the transcription factors VOZ1 and SIP1, both involved in cell proliferation. In summary, it is possible to propose that the protein encoded by S/S_F-box has functions related to cell proliferation and organ development, including the pistil.

No description available.

La variante lymphocytaire du syndrome hyperéosinophilique (L-SHE) est une pathologie extrêmement rare caractérisée par une prolifération monoclonale de lymphocytes T surproduisant l’interleukine IL-5, responsable d’une hyperéosinophilie persistante. En outre, un immunophénotype aberrant CD3−CD4+ est fréquemment observé à la surface des cellules T clonales. Cette pathologie se distingue par une lymphoprolifération chronique indolente habituellement révélée par une hyperéosinophilie sanguine et une infiltration éosinophilique des tissus cutanés. Toutefois, l’évolution vers un lymphome T observée chez certains patients suggère la présence d’un potentiel malin des cellules T. Ce modèle représente donc une rare opportunité d’identifier les changements moléculaires liés aux différentes étapes du processus transformant lymphoïde T.<p>Dans le cadre de ce travail, nous avons cherché à établir les caractéristiques cytogénétiques et moléculaires des cellules T CD3−CD4+ d’une cohorte de patients L-SHE. L’analyse cytogénétique de cellules T CD3−CD4+ isolées au moment du diagnostic chez deux patientes (P1 et P2) a révélé la présence d’une délétion similaire 6q13-q22.1. En étudiant les stades cliniques successifs de P1 et P2, nous avons montré la persistance des cellules porteuses de la délétion 6q au cours de la progression chronique et leur prédominance lors du développement d’un lymphome T chez P1. Ces résultats suggèrent l’implication précoce et potentiellement critique de la délétion 6q dans cette pathologie lymphoproliférative T. L’analyse des dérégulations transcriptionnelles résultant de ce remaniement a montré une réduction de l’expression des gènes pro-apototiques BACH2 et PA26 dans les cellules T CD3−CD4+ de P1 et P2. En particulier, BACH2, dont l’expression diminue continuellement au cours de l’évolution de P1, jouerait un rôle oncosuppresseur dans la lymphogenèse T.<p>Afin d’identifier les modifications moléculaires des cellules T clonales, nous avons analysé l’expression de 95% des gènes humains dans les cellules T CD3−CD4+ de trois patients en phase chronique (P1, P2 et P3). La grande homologie des changements transcriptionnels chez les trois patients indique une altération des mêmes mécanismes moléculaires. Ainsi, un profil immunophénotypique exhaustif, validé chez trois patients supplémentaires, a pu être établi. En outre, les dérégulations des voies apoptotiques, TGFβ ou<p>9<p>encore de signalisation intracellulaire altèrent l’homéostasie des cellules T CD3−CD4+ pouvant favoriser la perte de la capacité apoptotique et/ou la croissance cellulaire. Cette signature moléculaire a été étendue par l’identification de 20 microARNs dont l’expression est dérégulée dans les cellules T CD3−CD4+ d’une cohorte de 6 patients. Par ailleurs, la modification de l’expression des récepteurs impliqués dans la migration leucocytaire au cours de l’évolution de P1 pourrait expliquer l’infiltration ganglionnaire des cellules T clonales et la progression du lymphome.<p>La caractérisation des désordres cytogénétiques et moléculaires des cellules T CD3−CD4+ chez les patients L-SHE permettrait à terme d’identifier de nouveaux marqueurs diagnostiques et contribuer ainsi au développement de nouvelles cibles thérapeutiques dans une grande diversité de pathologies lymphoprolifératives de type Th2. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

La crête neurale (CN) est une structure transitoire apparaissant en bordure de la plaque neurale chez les embryons de vertébrés. Au cours du développement embryonnaire, les cellules de la CN prolifèrent, subissent une transition épithélio-mésenchymateuse, migrent et se différencient en de nombreux types cellulaires tels que des neurones et cellules gliales du système nerveux périphérique, des mélanocytes, des cellules musculaires lisses ou des élements du squelette cranio-facial. Afin de mieux comprendre les mécanismes moléculaires contrôlant la prolifération et la spécification des cellules de la CN, nous avons étudié le rôle de deux facteurs de transcription, Hairy2 et Stat3, via des expériences de perte et gain de fonction chez l’embryon de xénope. <p>Le gène Hairy2 code pour un facteur de transcription bHLH-O répresseur. Il est exprimé précocement au niveau de la bordure de la plaque neurale incluant la CN présomptive. Nous avons montré que Hairy2 est requis pour la prolifération des cellules de la CN en aval de signaux FGFs et qu’il maintient les cellules dans un état indifférencié en réprimant l’expression précoce des gènes spécifiques de la CN. Hairy2 réprime aussi la transcription du gène Id3 codant pour un facteur HLH essentiel à la prolifération des cellules de la CN. Id3 affecte également Hairy2. Nous avons observé que la protéine Id3 interagit physiquement avec Hairy2 et bloque son activité, démontrant que les interactions entre Hairy2 et Id3 jouent un rôle important dans la prolifération et la spécification des cellules de la CN. <p>\ / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Magister Scientiae (Medical Bioscience) - MSc(MBS) / Introduction: Eurycoma longifolia (Tongkat Ali; TA) is a Malaysian shrub used to treat various illnesses including male infertility. Considering that TA is also used to improve male fertility and no report regarding its safety has been published, this study investigated the effects of a patented, aqueous TA extract on various sperm and testicular functions. Materials and Methods: This study encompasses two parts (part 1: on spermatozoa; part 2: on TM3-Leydig and TM4-Sertoli cells). Part 1: Semen samples of 27 patients and 13 fertile donors were divided into two groups, washed and swim-up prepared spermatozoa, and incubated with different concentrations of TA (1, 10, 20, 100, 2000 μg/ml) for 1 hour at 37°C. A sample without addition of TA served as control. After incubation with TA, the following parameters were evaluated: viability (Eosin-Nigrosin test), total and progressive motility (CASA), acrosome reaction (triple stain technique), sperm production of reactive oxygen species (ROS; dihydroethidium test; DHE), sperm DNA fragmentation (TUNEL assay) and mitochondrial membrane potential (Δψm) (Depsipher kit). Part 2: TM3-Leydig and TM4-Sertoli cells incubated with different concentrations of TA (0.4, 0.8, 1.6, 3.125, 6.25, 12.5, 25, 50 μg/ml) and control (without extract) for 48 and 96 hours. After incubation with TA, the following parameters were evaluated: viability (XTT), cell proliferation (protein assay), testosterone (testosterone ELISA test) and pyruvate (pyruvate assay). Results Part 1: For washed spermatozoa, significant dose-dependent trends were found for viability, total motility, acrosome reaction and sperm ROS production. However, these trends were only significant if the highest concentrations were included in the calculation. In the swim-up spermatozoa, ROS production of spermatozoa showed a biphasic relationship with its lowest percentage at 10 μg/ml, yet, no significance could be observed (P=0.9505). No influence of TA could be observed for sperm DNA fragmentation nor Δψm. Part 2: The viability rates and protein production of TM3-Leydig and TM4-Sertoli cells at 48-hour exposure to TA showed increases whereas at 96-hour incubation periods viability and protein production declined especially as from concentration 25 μg/ml TA. Similar results could be seen for TM4-Sertoli cells pyruvate production. The testosterone production at 48-hour exposure marginally increased (P=0.0580) at the highest (50 μg/ml) concentration of TA. However, at 96-hour exposure to TA the testosterone production significantly (P=0.0065) increased. It is also apparent that after 96 hours the concentration of testosterone has increased [12 x 10-4 ng/ml] when compared to 48-hour exposure [6 x 10-7ng/ml] of Tongkat Ali. Conclusion: Part 1: Results indicate that the Tongkat Ali extract has no deleterious effects on sperm functions at therapeutically used concentrations (<2.5 μg/ml). Part 2: The cytotoxic effect of TA are only presented at higher concentration from 25 μg/ml. TM3-Leydig cells appears to be more resilient than TM4-Sertoli cells in viability and protein production yet at prolonged periods of exposure it is detrimental. Testosterone production only increases after 96 hours exposure to TA.