L'inflammation systémique est une réaction qui implique l’ensemble de l’organisme suite une agression sévère, potentiellement mortelle, illustrée par le syndrome de réponse inflammatoire systémique (SIRS). De nombreux acteurs cellulaires et moléculaires contribuent au développement de cette cascade inflammatoire parmi lesquels les cellules NK jouent un rôle clé. Malgré l'accumulation de preuves sur l’existence de propriétés spécifiques à chaque organe en réponse à l'inflammation systémique, en termes de cellules NK, on sait peu de choses sur la dynamique compartimentalisée de l’activation des cellules NK pendant un SIRS. En outre, le statut immunitaire des cellules NK après la résolution d’un SIRS est également mal connu. Dans le présent travail, nous avons étudié les réponses des cellules NK provenant de différents organes en utilisant un modèle d’endotoxinémie murine. Nous avons caractérisé la réponse des cellules NK au sein de la rate, du poumon, de la moelle osseuse, de la cavité péritonéale, et dans la circulation. Nous avons trouvé que, malgré une dynamique similaire de la réponse dans les différents organes, les réponses des cellules NK sont compartimentalisées avec des seuils différent et spécifiques. A l’aide de transferts adoptifs, nous avons constaté que la réactivité des cellules NK spécifiques d'organes peut refléter le compartiment d’origine lors des phases initiales de l'inflammation. Cependant, les cellules NK ont la capacité de s’adapter rapidement à leur nouvel environnement et d'ajuster leurs niveaux de réponse à ceux des cellules NK résidentes. Ainsi, cette étude fournit une preuve de concept qui confirme la compartimentalisation de la réponse des cellules NK lors de l'inflammation systémique. Dans une deuxième partie, nous avons analysé le statut des cellules NK à différents moments après une endotoxinémie. Les réponses des cellules NK au sein d’une préparation de cellules de la rate sont fortement supprimées en réponse à une restimulation in vitro, 14 jours après l'endotoxinémie. Cependant, nous avons montré que la réactivité intrinsèque des cellules NK est en fait augmentée après l'injection d’endotoxine, aboutissant à des cellules NK présentant des caractéristiques de cellules NK mémoires. Des expériences de transfert adoptif ont confirmé les propriétés de mémoire des cellules NK après endotoxinémie. Nos résultats accroissent la connaissance concernant le rôle des cellules NK dans un contexte d'inflammation systémique, révélant des réponses compartimentalisés et l’induction d’une mémoire suite à l’endotoxinémie. L'observation selon laquelle les cellules NK développent des propriétés de mémoire après une inflammation systémique dans le contexte d'un environnement suppressif est d’une grande nouveauté et ce phénomène est rapporté pour la première fois. / Systemic inflammation is whole-body reaction to a triggering insult that often results in life threatening illness like systemic inflammatory response syndrome (SIRS). Contributing to the development of this inflammatory cascade are numerous cellular and molecular players, among which, NK cells have been shown to play a key role. Despite accumulating evidence on the organ-specific properties of both systemic inflammation and NK cells, little is known about the compartmentalized dynamics of NK cell activation during SIRS. Furthermore, the status of NK cells after the resolution of SIRS is also poorly characterized. In the present work, we investigated NK responses in different organs using a mouse model of endotoxinemia and characterized the compartmentalized response of spleen, lung, bone marrow, peritoneal and circulating NK cells. We found that despite similar dynamics of response in different organs, NK cells responses, are compartmentalized with seemingly specific thresholds of maximum activation. Using a series of adoptive transfers, we found that while organ-specific NK cell responsiveness can affect the initial phases of inflammation, these cells have the capacity to quickly adapt to a new environment and adjust their response levels to that of resident NK cells. Thus, this study provides proof of concept data on the compartmentalization of the NK cell responses during systemic inflammation. In a second part, we assessed the status of NK cells at different times after endotoxemia. NK cells responses in the context of whole spleen preparations were severely suppressed in response to in vitro restimulation at 14 days after endotoxemia. However, intrinsic NK cell responsiveness was increased after endotoxemia, showing characteristics of NK cell memory. Adoptive transfer experiments confirmed memory properties of NK cells after endotoxemia. Overall, these results expand on the role of NK cells in the context of systemic inflammation revealing compartmentalized responses during and memory properties following endotoxemia. The observation that NK cells develop memory properties after systemic inflammation in the context of a suppressive environment is of the highest novelty and the first one to report such a phenomenon.

L'inflammation chronique en réponse à l'accumulation de lipoprotéines dans la paroi artérielle est centrale dans le développement de l'athérosclérose. L’immunité innée et adaptée sont impliquées dans ce processus. Les cellules Natural Killer (NK), un des éléments clés de l'immunité innée, ont été identifiées dans les lésions athérosclérotiques humaines et murines. Bien que plusieurs études aient cherché à évaluer le rôle des cellules NK dans des modèles animaux expérimentaux d'athérosclérose, les résultats restent contradictoires, certaines rapportant des effets pro-athérogéniques, d’autres anti-athérogéniques. L'une des principales limites de ces études est le manque de spécificité dans le ciblage de la perte ou du gain de fonction des cellules NK. Nous avons utilisé deux approches génétiques sélectives pour étudier le rôle des cellules NK dans l'athérosclérose: 1) des souris Ncr1iCre/+R26lslDTA/+ dans lesquelles les cellules NK ont été déplétées 2) des souris Noé, dont les cellules NK sont hyper-réactives. Les cellules de la moelle osseuse (BM) de ces souris ont été utilisées pour reconstituer le système hématopoïétique de souris Ldlr -/- irradiées. Après une période de récupération de 4 semaines, les souris ont été mises sous un régime riche en matières grasses (HFD) pendant 8 semaines. L'analyse morphométrique de la taille des lésions ‘athérosclérose dans le sinus aortique et l'aorte thoracique n'a montré aucune différence statistiquement significative entre les 3 groupes. De plus, aucune différence n'a été observée dans la composition de la plaque en termes de teneur en collagène, d'infiltration de macrophages ou de profil immunitaire dans le sang et la rate des souris Ncr1iCreR26lsl-DTA, Noé ou contrôles. Nous avons ensuite étudié la sélectivité de des anticorps anti-asialo-GM1 dans la déplétion des cellules NK, qui avaient été utilisés précédemment pour démontrer le rôle pro-athérogène des cellules NK. Nous avons confirmé les effets non spécifiques de cet anticorps, qui déplète non seulement les cellules NK, mais aussi les lymphocytes NKT et CD8+. Enfin, pour déterminer si l'activation des cellules NK par un stimulus externe pouvait avoir des effets sur l’athérosclérose, nous avons traité les souris chimériques (souris Ldlr -/- irradiées reconstituées soit avec les cellules de moelle contrôle ou déficiente en cellules NK) avec du poly IC (un mimétique viral) pendant 8 semaines de HFD. Nous avons trouvé une réduction significative de la taille des lésions au niveau du sinus aortique et de l'aorte thoracique dans les souris déficientes en cellules NK. Nos résultats, à partir de modèles de souris spécifiques, contredisent les études antérieures et démontrent clairement que chez les souris hypercholestérolémiques, les cellules NK n'ont aucun effet direct sur l'athérosclérose, sauf si elles sont pré-stimulée, comme par exemple dans un contexte d’infection virale ou de présence de tumeurs. / Chronic inflammation is central in the development of atherosclerosis. Both innate and adaptive immunity are involved in this process. Although several studies have evaluated the functions of NK cells in experimental animal models of atherosclerosis, it is not yet clear whether NK cells behave as protective or pro-atherogenic effectors. One of the main caveats of previous studies was the lack of specificity in targeting loss- or gain-of-function of NK cells. Here, we used two selective genetic approaches to investigate the role of NK cells in atherosclerosis: 1) Ncr1iCre/+R26lslDTA/+ mice in which NK cells were depleted, 2) Noé mice in which NK cells are hyperresponsive. No difference in atherosclerotic lesion size was found in Ldlr-/- mice transplanted with bone marrow cells from Ncr1iCreR26Rlsl−DTA, Noé or WT mice. Also, no difference was observed in plaque composition in terms of collagen content, macrophage infiltration or the immune profile in blood and spleen, although Noé chimera had more IFN-y-producing NK cells in comparison with WT mice. Then, we investigated the NK cell selectivity of anti-asialo GM1 anti-serum, which was previously used to conclude to the pro-atherogenicity of NK cells. Anti-asialo GM1 treatment decreased atherosclerosis in both Ldlr-/- mice transplanted with Ncr1iCreR26Rlsl−DTA or WT BM, indicating that its anti-atherogenic effects are unrelated to NK cell depletion. Finally, to determine whether NK cells could contribute to the disease in conditions of pathological NK cell overactivation, we treated irradiated Ldlr-/- mice reconstituted with either WT or Ncr1iCreR26Rlsl−DTA BM with the viral mimic Poly(I:C) and found a significant reduction of plaque size in NK-cell deficient chimeric mice. Our findings, using state-of-the-art mouse models, clearly demonstrate that NK cells have no direct effect on the natural development of hypercholesterolemia-induced atherosclerosis, but may play a role when an additional systemic NK cell overactivation occurs.

Les cellules immunitaires infiltrant le foie (CD3+, CD4+, CD8+, CD20+, CD56+, TCRγδ+, FoxP3+ et CD123+) sont plus nombreuses (p<0.05) dans les zones cirrhotiques comparés aux zones tumorales dans les 2 cas d'hépatocarcinomes (induits par l'hépatite C (HCC-HCV) ou par l'alcool (HCC-OH)). Les niveaux d'expressions tumoraux de CD8β dans le groupe HCC-HCV et CD8α et IFN-γ dans le groupe HCC-OH sont plus élevés (p<0.05) que ceux des zones cirrhotiques. Les comparaisons des cirrhoses cancéreuses montrent que les cellules CD3+, CD4+, CD8+, CD20+, FoxP3+, CD123+ et TCRγδ+ (p=0.089) ainsi que les ratios CD3/CD20, FoxP3/CD4 sont plus élevés (p<0.05) dans la cirrhose HCV que dans celle OH. Les niveaux d'expression de l'IFN-γ, CD8α et de la perforine sont plus faibles (p<0.05) dans la cirrhose HCV que dans la cirrhose OH. De plus, le nombre de cellules CD8+ est corrélée avec celui de cellules FoxP3+ dans les nodules parenchymateux pour la cirrhose HCV alors qu'il l'est avec le niveau d'expression de l'IFN-γ et de la perforine pour la cirrhose OH. Les résultats concernant les HCC-HCV et les cirrhoses C sans cancer montrent que les cellules CD3+, CD4+, CD20+ et CD8+ sont plus nombreuses dans la cirrhose cancéreuse (p<0.05) mais que le nombre de cellules CD56+ (p=0.067) et le rapport CD3/CD20 (p<0.05) est plus bas dans la cirrhose cancéreuse. Le TGF-β et l'IFN-γ sont corrélés dans la cirrhose C. Aucune différence n'a été observée à l'intérieur des tumeurs dans les 2 groupes au niveau cellulaire et transcriptionnel, à l'exception du niveau de CD8α, plus bas dans le groupe HCC-HCV (p<0.05). Le nombre intra-tumoral de cellules FoxP3+ est corrélé positivement avec celui des cellules CD4 et CD8+ et négativement avec l'expression tumorale de la perforine. Dans les tumeurs, des corrélations positives entre le nombre de cellules CD4+ et CD8+, CD56+ et TCRγδ+, perforine avec IFN-γ et RANTES ont aussi été observées. Il est important de noter que les cellules CD3+ sont presque toujours corrélées avec les CD20+ dans toutes les zones et les groupes. Concernant la relation immunité-agressivité tumorale, les niveaux d'ALAT, d'AFP et le score METAVIR sont corrélés avec les cellules CD3+, CD4+ et TCRγδ+ dans le groupe HCC-HCV. La taille des tumeurs est corrélée avec l'age dans les 2 groupes et avec l'expression de FoxP3 dans le groupe HCC-HCV. La nécrose tumorale est plus importante (p<0.05) dans le groupe HCC-OH et inversement corrélée avec l'age et l'expression de RANTES dans les 2 groupes. Le marquage Ki67 est corrélé positivement avec les ALAT, AFP, PT et la virémie et inversement avec le niveau de perforine intra-tumoral. Dans les 2 groupes, le nombre de cellules FoxP3+ est inversement corrélé avec le taux de bilirubine. La rechute est plus fréquente (p<0.05) dans le groupe HCC-HCV. Pour les patients rechuteurs, le nombre de cellules CD3+, CD4+, CD8+, CD20+ et FoxP3+ est plus élevé (p<0.05) dans les zones cirrhotiques alors que le nombre de cellules CD123+ et le rapport FoxP3+/CD4+ sont plus élevés (p<0.05) dans la tumeur. De plus, une réduction significative de la fréquence des cellules NK et du rapport CD56bright/dim est observée pour l'hépatite C comparé à la B. La proportion intra-hépatique de cellules NK CD158a,h+ et CD158b,j+ est plus basse que dans le sang périphérique chez les patients HCV+ et que dans le foie des patients HBV+. La fréquence des NK NKG2A+ est plus basse dans le sang et le foie des patients HBV+ comparativement aux HCV+. Pour les patients HCV+, i) les cellules CD56+ intra-hépatiques se localisent préférentiellement hors des nécroses lorsque l'activité nécro-inflammatoire augmente et ii) les cellules circulantes CD3-CD56brightNKG2A+ corrèlent positivement avec l'extension de la nécro-inflammation et de la fibroses. De plus, chez les patients HCV+ chroniques, les cellules FoxP3+ situées dans les zones nécro-inflammatoires sont majoritairement associées aux cellules T CD8+ et positivement corrélées avec les cellules CD8+ et le score METAVIR de fibrose. Globalement, beaucoup de cellules infiltrant les tumeurs semblent être moins actives et associées avec la rechute et un mauvais pronostic. Les cellules NK et régulatrices dans l'hépatite C chronique pourraient donc être d'un grand intérêt dans le suivi de la maladie.

Aujourd’hui, il est clairement établi que les lymphocytes T (LT) du donneur stimulés chroniquement par les antigènes mineurs (mHAgs) du receveur sont responsables du développement de la maladie du greffon contre l’hôte (GVHD). Il devient dès lors primordial de mettre au point des mécanismes permettant de contrôler l’activité et la fonctionnalité des LT du donneur soumis à une stimulation antigénique persistante. Nous avons montré dans un modèle in vivo de GVHD chronique qu’il est possible de réguler par deux mécanismes différents l’activité des LT du donneur stimulés chroniquement par un mHAg du receveur. Premièrement, la stimulation chronique des LT CD4+ du donneur par l’mHAg modifie fortement leurs fonctions. Ceux-ci s’adaptent à la présence de l’mHAg et y deviennent insensibles. Les LT CD4+ adaptés se caractérisent par un nombre élevé d’ARNm ainsi qu’une importante augmentation à leur surface de l’expression du récepteur inhibiteur PD-1. Nous avons montré que le blocage de la voie de costimulation négative PD-1/PD-L1 inverse et supprime l’adaptation des LT CD4+, stimule fortement leur production d’IFN-γ, entraînant le développement d’une maladie sévère. Le blocage de la voie de costimulation négative PD-1/PD-L1 aggrave aussi le choc toxique causé par l’injection de Lipopolysaccharide (LPS) et active la réaction immunitaire responsable du rejet de peaux mâles greffées sur des souris contenant des LT CD4+ adaptés. Ces résultats suggèrent que les LT CD4+ s’adaptent à la persistance de l’antigène en élevant leur seuil d’activation via la voie de costimulation négative PD-1/PD-L1. D’un autre côté, nos résultats soulignent la capacité que possèdent les cellules NK du receveur à contrôler l’activité ainsi que la prolifération des LT CD4+ du donneur soumis à une stimulation antigénique persistante. Cette faculté de régulation que détiennent les cellules NK préserve le receveur du développement d’une GVHD chronique. La régulation de la prolifération et de l’activité des LT CD4+ par les cellules NK s’effectue via NKG2D, un récepteur activateur présent à la surface de ces cellules. En effet, l’expression de certains ligands de NKG2D est augmentée dans les LT CD4+ activés. L’injection d’anticorps bloquant NKG2D inhibe l’activité régulatrice des cellules NK. Celle-ci semble s’effectuer par un mécanisme indépendant de la perforine. Nos résultats montrent que la voie de costimulation négative PD-1/PD-L1 est le mécanisme moléculaire utilisé par les LT CD4+ adaptés à l’mHAg pour calibrer leurs activités et leurs fonctionnalités en réponse à une stimulation antigénique persistante. Ils soulignent aussi le rôle des cellules NK dans le contrôle de l’activité et de la prolifération des LT CD4+ responsables du développement de la GVHD chronique.

Les infections chroniques de l’Immunodéficience Humaine et de l’Hépatite C (VIH et VHC) sont à l’origine de pandémies. Malgré des traitements avancés, leurs relations avec le système immunitaire ne sont pas résolues et restent nécessaires pour établir de nouvelles stratégies thérapeutiques. Les cellules Natural Killer (NK) sont des effecteurs majeurs antiviraux et sont importants pour l’immunité innée et adaptative. Ils contrôlent leur cytotoxicité et leur fonction immunorégulatrice via de multiples récepteurs activateurs et inhibiteurs qui sont enclenchés par interaction avec leurs ligands respectifs. Parmi tous les récepteurs, je me suis particulièrement intéressé aux Natural Cytotoxicity Receptors NKp30 et NKp44. Il est intéressant de noter que le laboratoire a précédemment identifié un épitope conservé de la gp41 du VIH-1 qui induit l’expression du ligand de NKp44 sur des LT CD4+ les rendant susceptibles à la lyse par des cellules NK-NKp44+. Après plusieurs études, le laboratoire a mis en place une stratégie vaccinale basée sur un peptide de l’épitope conservé de la gp41 qui induit chez la souris des Anticorps Neutralisants (AcNs W614A-3S) contre l’infection VIH-1. Alors que le VIH-2 est considéré comme un modèle unique d’une infection VIH contrôlée, les données sur les cellules NK y sont très limitées. Nous avons observé une dérégulation du récepteur NKp30 et une augmentation de ses ligands qui conduisent à des déficiences de leurs fonctions et représentent un nouveau mécanisme de persistance virale. Ensuite, nous avons observé pendant l’infection chronique par le VHC une forte proportion de cellules NK intra-hépatiques exprimant NKp44 qui corrèle avec la fibrose et la charge virale. De plus, nous avons identifié un épitope conservé de la protéine Core du VHC qui induit le ligand de NKp44 sur des lignées hépatiques. Ces données suggèrent que la déplétion des hépatocytes passe par un mécanisme similaire à celui observé pendant l’infection VIH-1. Enfin, une étude sur des patients VIH-1 contrôleurs nous a permis d’identifier la présence d’AcNs W614A-3S qui sont associées au contrôle viral et au maintien de LT CD4+ fonctionnelles. Ces données ont confirmé le potentiel de ces AcNs et, dont leur production par vaccination, ont été confirmée chez le lapin et le singe. Ainsi, ces études apportent de nouvelles données dans les relations entre les cellules NK et le VIH ou le VHC ainsi que de nouvelles stratégies thérapeutiques. Ces études ont notamment confirmé le pouvoir des AcNs W614A-3S dans un vaccin contre le VIH-1. / Human Immunodeficiency and Hepatitis C (HIV and HCV) chronic infections are at the origin of pandemics. Despite advance drug treatments, their relationship with the immune system is not resolved and is still required to establish new therapeutic strategies. Natural Killer (NK) cells are major antiviral effectors of the immune system and are important for innate and adaptive immune processes. They mediate cytotoxicity and immunoregulation via various activator and inhibitor receptors that are triggered upon interaction with their cognate ligands. Among all receptors, I particularly took an interest in Natural Cytotoxicity Receptors NKp30 and NKp44. Interestingly, the lab previously identified a conserved HIV-1 gp41 épitope that induce expression of NKp44 ligand on CD4+ T cells making them susceptible to lyses by NK-NKp44+ cells. After various studies, the lab established a vaccine strategy based on a peptide from the conserved gp41 épitope that induced in mice Neutralizing Antibodies (Nab W614A-3S) against HIV-1 infection. Whereas HIV-2 infection could be considered as a HIV control infection unique model, data on NK cells are very limited. We found a down-modulation of NKp30 receptor and an increased of its ligands that lead to functional impairments of NK cells and could represent a new viral persistence mechanism. Then, during the HCV chronic infection we found a high proportion of intrahepatic NK cells expressing NKp44 that correlates with fibrosis and viral load. Furthermore we identified a conserved épitope of HCV core protein that induced NKp44 ligand on hepatic cell lines. These data suggest that destruction of hepatocyte might occur by a similar mechanism observed during HIV-1 infection. Finally, a study on HIV-1 controllers patients allow us to identify the presence of Nab W614A-3S that correlates with viral control and the preservation of functional CD4+ T cells. These data confirm the potency of this Nab and their induction by vaccination has been also confirmed in rabbit and macaques. Thus, these studies highlight new data regarding relationship between NK cells and HIV or HCV that could represent new therapeutic approaches. These studies especially confirm the potency of Nab W614A-3S to implement a vaccine against HIV-1.

Les cellules NK sont classiquement décrites comme des lymphocytes effecteurs du système immunitaire inné, dotées d’un jeu limité de récepteurs permettant la reconnaissance de cellules tumorales ou infectées par des pathogènes, et dépourvues de capacités de mémoire immunitaire. Des travaux récents montrent cependant que les cellules NK semblent douées de diverses propriétés « adaptatives » proches de celles des lymphocytes T (LT). L’étude princeps de ce nouvel aspect de la biologie des cellules NK a été réalisée dans un modèle murin d’hypersensibilité retardée (HSR) aux haptènes, et démontre qu’en l’absence des effecteurs classiques de ces réactions (LT), les cellules NK sont capablesd’induire des réactions d’HSR. La première partie de ce travail de thèse a consisté à étudier la contribution des cellules NK dans l’initiation et le développement des réactions d’HSR en présence des effecteurs classiques (LT). Nous montrons ainsi que bien que des cellules NK « mémoires » spécifiques de l’haptène soient retrouvées dans le foie des souris de type sauvage sensibilisées, leur contribution à la réaction d’HSR est mineure. Par contre, si ces cellules NK mémoires sont transférées à une souris receveuse dépourvues de LT nonsensibilisée, elles sont capables d’induire des réactions d’HSR lors d’un nouveau contact avec l’haptène. Dans la deuxième partie, nous avons comparé les réactions d’HSR induites par les cellules NK et les lymphocytes T mémoires dans ce système de transfert. Nous mettons en évidence que les réactions développées par les cellules NK sont d’une durée limitée et qu’elles impliquent un oedème avec peud’infiltration par les cellules immunitaires, au contraire des réactions induites par les cellules T mémoires. Enfin, dans la troisième partie de ce travail, nous avons analysé le compartiment cellulaire NK circulant chez des patients souffrant de pathologies inflammatoires cutanées dans lesquelles les LT ont un rôle clairement identifié à ce jour. Nous rapportons des modifications qualitatives et quantitatives de ces cellules, suggérant leur implication potentielle dans la physiopathologie de ces maladies. L’ensemble de ces données confirme donc l’existence de cellules NK « mémoires », dont le rôle physiologique en présence des effecteurs adaptatifs classiques reste encore aujourd’hui à démontrer. / NK cells are classically defined as lymphocytes of the innate immune system, equipped with a limited set of receptors involved in the recognition of tumoral or infected cells, and devoid of immune memory. However, recent studies showed that NK cells seem endowed with various "adaptive" properties similar to those of T lymphocytes (TL). The original description of this new aspect of NK cell biology was made in a murine model of delayed-type hypersensitivity (DTH) to haptens. In this model, NK cells were found to be able to induce DTH reactions in the absence of classical DTH effectors (TL). The aim of the first part of this PhD thesis was to study the contribution of NK cells in the initiation and development of HSR reactions in the presence of classical effectors (TL). We show that although hapten-specific "memory" NK cells are generated in the liver of hapten-sensitized wild type mice, their contribution to HSR reactions is minor. By contrast, if "memory" NK cells are transferred to unsensitized recipient mice lacking T cells, they can induce DTH reactions upon a new contact with the hapten. In the second part, we compared the DTH reactions induced by NK cells and memory T lymphocytes in thistransfer system. We showed that hapten-induced skin reactions mediated by NK cells are of limited duration and associated with a weak cellular infiltrate, in contrast to memory T cell-mediated reactions. Finally, in the third part of this work, we analyzed the circulating NK cell compartment in patients suffering from inflammatory skin diseases thought to be induced by T cells. We report qualitative and quantitative changes of NK cells in patients in comparison with healthy controls, suggesting the potential involvement of NK cells in the pathophysiology of these diseases. Altogether, our data confirm the existence of "memory" NK cells, whose physiological role in the presence of conventional adaptive effectors still remains to be assessed.

Les cellules NK sont des lymphocytes de l’immunité innée qui ont un rôle majeur dans le contrôle précoce des infections virales et dans l’immunosurveillance des tumeurs. Cependant, en cas de stimulation chronique, un état d’anergie, où les cellules NK n’exercent plus leur fonction a été mis en évidence. Les mécanismes conduisant à cette perte de fonction demeurent mal caractérisés et s’il s’agit d’une cause ou d’une conséquence de la chronicité n’est pas non plus déterminé. Cibler les cellules NK constitue une perspective thérapeutique de choix mais nécessite une meilleure compréhension de ces aspects. L’objectif de ce travail de thèse s’articule autour de trois points. Premièrement, nous avons généré un modèle tumoral murin sensible aux cellules NK permettant l’étude de la réponse anti-tumorale et l’établissement d’une stimulation chronique. Deuxièmement, l’utilisation de ce modèle a permis d’investiguer les mécanismes conduisant à la perte de fonctionnalité des cellules NK et de tester des stratégies de restauration. Enfin, nous avons mené une étude parallèle, chez l’homme, par analyse d’une cohorte de patients chroniquement infectés par le virus de l’Hépatite B dans le but de déterminer le phénotype des cellules NK et d’identifier les causes conduisant à leur perte de fonction dans ce contexte / NK cells are innate lymphocytes which play a crucial role in the early control of viral infection and in tumor immunosurveillance. However, a state of tolerance, where NK cells are poorly functional, occurs in the context of chronic stimulation. The mechanisms leading to this process remain poorly understood and whether this is a cause, or a consequence of chronicity is unknown. Targeting NK cells appears to be a potent therapeutic strategy but requires further investigation. With the lack of clarity in the field this work had three main objectives. First, we engineered a tumoral mouse model that was strongly immunogenic for NK cells and thus allowed us to study the anti-tumoral response of NK cells and to trigger chronic stimulation. Then, we used this model to investigate the mechanisms driving NK cell loss of function and to test potential therapeutic strategies to reverse this state. Finally, in the context of human chronic infection we analyzed samples from HBV infected patients in order to determine the phenotype, function and signaling capacity of NK cells to identify the drivers of NK cell dysfunction

Introduction : Les cellules souche mésenchymateuse (CSM) présentent une puissante activité immunomodulatrice sur les lymphocytes T et les Natural Killer (NK), impliquées dans les réactions allogéniques. Les propriétés immunomodulatrices des CSM dépendent de contacts cellulaires et des facteurs secrétés. Ainsi les exosomes produits par ces cellules pourraient constituer des nouveaux produits thérapeutiques.L’objectif de ce travail est d’étudier, in vitro, l’effet d’exosomes dérivés de CSM sur les lymphocytes B, T et les NK.Méthodologie : Les CSMs utilisées sont issues de foies fœtaux humains. Les exosomes ont été isolés à partir du milieu de culture des CSMs par une série d’ultracentrifugation à 100000g.Résultats : Contrairement aux CSMs qui inhibent la prolifération des lymphocytes T et B, leurs exosomes n'ont pas d'effet sur leur prolifération. Cependant ils inhibent la prolifération, l’activation et la cytotoxicité (expresion CD107a) des NK. Nous avons mit en évidence, par FACS, la présence de TGFbeta; à la surface des exosomes. De plus leur fonction inhibitrice est abrogé en présence d’un anticorps bloquants anti-TGFbeta;. Réciproquement l’exposition de cellules NK à du TGFbeta; inhibe la cytotoxicité et la prolifération de cellules. Enfin, en présence d'exososmes nous avons montré, par IF, une translocation de Smad 2/3 (messager du signal TGFbeta;) dans les noyaux des cellules NK, inhibé par l'ajout d'anticorps anti-TGFbeta;.Conclusion: Ces résultats suggère que les propriétés immunomodulatrices de CSMs sur NK pourraient dépendre de TGFβ présenté ou associé aux exosomes. / Introduction: Mesenchymal stem cells (MSCs) are powerful immunomodulators regulating the function of B and T lymphocytes and natural killers cells (NK) involved in allogeneic reactions. Their immunomodulatory properties depend on cell contact and secretion factors produced by MSCs. Thus exosomes produced by these cells could provide new therapeutic tools.Objective: The objective of this work is to study the effect of MSC derived exosomes in vitro on B and T lymphocytes and NK cells.Method: MSCs used for this study are isolated from human fetal liver. Exosomes were isolated from MSC culture medium by a serie of ultracentrifugation at 100000g.Results: MSCs inhibit the proliferation of T lymphocytes. Unlike MSCs, their exosomes do not abrogate the proliferation of T and B cells. However they inhibit the proliferation, activation and cytotoxicity (CD107a expression) of NK cells. By FACS analysis we showed a surface expression of TGFb; by exosomes. Inhibition of NK cells activation by exosomes is altered by a neutralizing anti-TGFb; antibody. Contrary when NK cells are cultured with TGFb; the same effect qs exosomes is demonstrated. By IF, we found a nuclear translocation of Smad 2/3 (TGFb; signal transducer) in NK cells cultured with exosomes, which is inhibited by the qddition of anti-TGFb; antibody.Conclusion: These results suggest that the immunomodulatory properties of MSCs on NK could depend on exosome presentation or association with TGFb;.

Les cellules Natural Killer (NK) sont des effecteurs de l’immunité innée qui jouent un rôle important dans la surveillance immunitaire anti-tumorale. Le concept d’immunothérapie basée sur l’activation des cellules NK a ainsi émergé comme une approche thérapeutique convaincante. Malgré les avancées spectaculaires réalisées ces dernières décennies, les connaissances concernant la biologie des cellules NK restent largement fragmentées. La mise en place de stratégies thérapeutiques anti-tumorales utilisant les cellules NK nécessite donc une compréhension approfondie des mécanismes de résistance développés au sein du microenvironnement tumoral. Les travaux menés au laboratoire ont révélé que certains mécanismes de résistance intrinsèque développés par les cellules tumorales dépendent de l’activation de l’autophagie en réponse à un stress hypoxique. Ces travaux ont démontré que l’activation de l’autophagie en condition de stress hypoxique, diminue la susceptibilité des cellules tumorales à la lyse par les cellules NK, qui peut être restaurée par l’inhibition de Beclin1. Ces mêmes travaux ont également démontré in vivo que l’inhibition de Beclin1 diminue la progression tumorale dans des modèles syngéniques murins de cancer de sein et de mélanome.Dans cette étude, nous avons montré dans un modèle murin de mélanome, que la régression des tumeurs déficientes en Beclin1 était corrélée à une augmentation significative d'infiltration des cellules NK. Nous avons établi que cette infiltration accrue est due à une augmentation d'expression et de sécrétion de la chémokine CCL5. De plus, dans les tumeurs déficientes en Beclin1, ayant une forte expression de CCL5, l’inhibition de CCL5 était suffisante pour diminuer l'infiltration des cellules NK et bloquer la régression tumorale.Ayant établi le rôle majeur de CCL5 dans l'infiltration des cellules NK dans les tumeurs de mélanome déficientes en Beclin1, nous avons étudié, dans la deuxième partie, le(s) mécanisme(s) moléculaire(s) impliqué(s) dans la régulation de CCL5. Nous avons démontré que l’inhibition génétique ou pharmacologique de l’autophagie induit la voie SAPK/JNK dans les cellules tumorales et active par conséquence le cofacteur de transcription c-Jun impliqué dans l'expression de CCL5. Plus précisément, nous avons établi que l'induction de SAPK/JNK est due à un défaut de l'activité phosphatase de la protéine phosphatase 2A (PP2A).Dans la dernière partie, nous avons étudié l'impact clinique de l’expression de CCL5 dans le cas du mélanome. L’analyse de différentes biopsies de mélanomes a montré une corrélation positive et significative de CCL5 avec l’expression du marqueur des cellules NK NKp46. Ce résultat a été validé sur une large collection de mélanomes, disponible dans la base de données TCGA (The Cancer Genome Atlas). La survie à long terme de patients atteints de mélanome ayant une expression élevée de CCL5 est significativement améliorée par rapport à ceux ayant une faible expression de cette chémokine.L'ensemble de nos résultats démontre pour la première fois que la diminution de la croissance tumorale suite l’inhibition de l'autophagie est étroitement liée à une amélioration de l'infiltration des cellules NK dans les tumeurs. Cette infiltration résulte d'une augmentation de l'expression la chémokine CCL5 par les cellules tumorales déficientes en Beclin1. Cette étude souligne l’intérêt de cibler l'autophagie afin d’établir un microenvironnement tumorale favorable à l'infiltration des cellules NK. Ainsi, l'inhibition sélective de l'autophagie dans les cellules tumorales pourrait améliorer les stratégies thérapeutiques anti-tumorales basées sur les cellules NK. / One of the major obstacles to define an efficient cancer immunotherapy protocol is the capacity of hypoxic tumor microenvironment to inhibit the host immune response. In line with this concept, we have shown that hypoxia impairs natural killer (NK) cell-mediated killing of cancer cells. This impairment was not related to a defect in NK cell function, but was strikingly dependent on the induction of the autophagic degradation process in hypoxic tumor cells. Genetic or pharmacological inhibition of autophagy restored NK-mediated killing of hypoxic tumor cells. . We have validated this concept in vivo by showing that targeting autophagy enhanced the NK-mediated regression of breast and melanoma tumors in mice. This regression was related to an increase in NK cells infiltrating autophagy defective tumor as demonstrated by immunohistochemistry staining of NK cells. The present project aims to investigate how autophagy inhibition increases tumor infiltration by NK cells leading to an improvement of NK-mediated anti-tumor immune response et to identify fectors which may be implicated in the infiltration of NK cells into the tumors.

Depuis ces 10 dernières années, l’immunothérapie est à l’avant-garde de la thérapie anticancéreuse. Les cellules Natural Killer (NK) font partie du système immunitaire inné et possèdent la capacité unique de lyser les cellules tumorales sans activation préalable par un antigène spécifique. Elles jouent un rôle majeur dans le contrôle de plusieurs cancers hématologiques et solides dont les tumeurs stromales gastrointestinales (GIST). Leur activation dépend de l’équilibre entre leurs récepteurs activateurs et inhibiteurs. Les Natural Cytotoxicity Receptors (NCR) font partis des récepteurs activateurs les plus importants dans leur reconnaissance des cibles et comprennent le NKp30, NKp44 et NKp46. Le NKp30 possède 3 isoformes: NKp30a et NKp30b sont immunostimulantes induisant la sécrétion d’Interféron (IFN) γ et de Tumor necrosis factor (TNF) α alors que NKp30c est immunosuppressive favorisant la production d’interleukine 10 (IL-10). L’IFNγ est un puissant activateur des cellules immunitaires tandis que l’IL-10 est une cytokine anti-inflammatoire. Le TNFα a été décrit initialement comme un facteur sérique induisant la nécrose des tumeurs, cependant son rôle a depuis été élargi à des fonctions homéostatiques. De nombreuses études laissent à penser que les fonctions antitumorales des cellules NK ne se limitent pas à l’élimination des cellules tumorales. Malgré les progrès importants réalisés dans la compréhension des cellules NK, de nombreux travaux sont encore à mener pour exploiter pleinement leur potentiel antitumoral.Notre équipe a démontré l’importance capitale des cellules NK dans les GIST. Ainsi l’infiltrat NK prédit la survie sans progression des patients. De plus nous avons montré que l’expression préférentielle de l’isoforme immunosuppressive NKp30c impactait négativement le pronostic des patients GIST. Suite à ces résultats, nous avons cherché à mieux caractériser l’impact des isoformes du récepteur NKp30 chez les patients GIST en réponse à l’IM. Dans un premier temps, nous avons démontré qu’un haut ratio d’expression entre NKp30b et NKp30c prédisait une meilleure réponse à l’imatinib mesylate (IM, un inhibiteur de tyrosine kinase, traitement de référence des GIST) et que l’expression des isoformes de NKp30 impactait l’environnement cytokinique de la tumeur. De plus, nous avons établi pour la première fois le lien entre la présence de ligands solubles de NKp30, B7 Homolog 6 soluble (sB7-H6) et BCL2 Associated Athanogene 6 soluble (sBAG6), et la diminution de la survie sans évènement des patients GIST traités à l’IM.Malgré l’infiltration immunitaire de nombreuses tumeurs, les fonctions antitumorales des lymphocytes sont inhibées par le microenvironnement tumoral. Ainsi, nous avons étudié quelles voies de signalisation étaient associées à l’inhibition des cellules NK présentes dans cet environnement. Pour cela, nous avons réalisé un microarray à partir des cellules NK infiltrant les GIST et avons mis en évidence le rôle délétère de la voie TNFα/TNF Receptor 2/Baculoviral IAP Repeat Containing 3 (BIRC3)/TNF Receptor Associated Factor 1 (TRAF1) dans la fonctionnalité des cellules NK. En effet, l’activation de cette voie dans les cellules NK entraine la diminution de la transcription du gène du récepteur activateur NKp46 ainsi que son expression membranaire. Cette diminution était corrélée avec l’expression de l’isoforme NKp30c. Par ailleurs, nous avons pu mettre en évidence chez la souris que le TNFα facilitait la dissémination métastatique de la lignée tumorale sensible aux cellules NK B16F10.Nos résultats sur les cellules NK ont renforcé leur grand potentiel en tant que cible thérapeutique pour l’immunothérapie anticancéreuse. En effet, l’importance du récepteur NKp30 et de ses isoformes dans la prédiction de la réponse à l’IM dans les GIST et la mise en évidence d’un nouveau mécanisme inhibiteur des cellules NK par la voie TNFα/TNFR2/BIRC3/TRAF1 ouvrent la voie à de nouvelles stratégies dans le traitement des cancers. / Over the last 10 years, immunotherapy has been at the forefront of cancer therapy. Natural Killer (NK) cells are part of the innate immune system and have the unique ability to lyse tumor cells without any antigen specific priming. They have a key prognostic role in several hematological and solid cancers including gastrointestinal stromal tumors (GIST). A balance between activating and inhibitory receptors triggers NK cell activation. Natural cytotoxicity receptors (NCR) are among the most clinically relevant activating receptors and include NKp30, NKp44 and NKp46. NKp30 can be expressed in 3 different isoforms: NKp30a and NKp30b are both immunostimulatory, inducing interferon (IFN) γ and tumor necrosis factor (TNF) α secretion whereas NKp30c is immunosuppressive, producing interleukin 10 (IL-10). IFNγ is a potent activator of immune cells whereas IL-10 is an anti-inflammatory cytokine. TNFα was first described as a serum factor, inducing tumor necrosis but its role has since been broadened to homeostatic functions. Ample evidence suggests that anti-tumor functions of NK cells are tightly regulated and expand far beyond the simple killing of malignant cells. Despite the tremendous progress in understanding NK cell biology, further work is warranted to fully exploit the anticancer potential of these cells.Our group demonstrated the crucial role that NK cells have in GIST. Indeed, NK cell infiltrate positively correlates with progression-free survival. Moreover, we showed that the preferential expression of the immunosuppressive isoform NKp30c, negatively impacts the clinical outcome of GIST patients. To further extend these observations, we explored the influence of various NKp30 isoforms in GIST patients.Firstly, we revealed that a high ratio between the expression of NKp30b and NKp30c isoforms predicted a stronger imatinib mesylate (IM) response (a tyrosine kinase inhibitor, TKI – first line standard of care in GIST) and that tumor cytokine milieu is modified following NKp30 isoform expression. Furthermore, we demonstrated a link between the presence of soluble ligands of NKp30, soluble B7 Homolog 6 (sB7-H6) and soluble BCL2 Associated Athanogene 6 (sBAG6), and a decrease in event-free survival in IM-treated GIST patients.Despite the presence of immune infiltration in many tumors, antitumor functions of lymphocytes are inhibited by the tumor microenvironment. Thus, we explored which signaling pathways were associated with NK cell inhibition in the tumor microenvironment. To do so, we performed a microarray from GIST infiltrating NK cells which highlighted the deleterious effect of TNFα/TNF Receptor 2/Baculoviral IAP Repeat Containing 3 (BIRC3)/TNF Receptor Associated Factor 1 (TRAF1) pathway on the function of NK cells. Next, we demonstrated that activation of this pathway in NK cells decreased gene transcription and protein expression of the activating receptor NKp46 (also called Natural Cytotoxicity Triggering Receptor 1 NCR1). This decrease positively correlated with NKp30c isoform expression. Moreover we showed that in mice, TNFα increases the metastatic dissemination of the NK sensitive tumor cell line, B16F10.Results from our research on NK cells strengthen the potential of NK cells as a therapeutic target for anti-tumor immunotherapy. Taken together, this thesis demonstrates the key role of the NKp30 receptor and its isoforms in the IM therapy as predictive marker in GIST response and describes for the first time a new NK cell inhibitory mechanism via the TNFα/TNFR2/BIRC3/TRAF1 pathway, paving the way for novel therapeutic strategies in cancer treatment.