Les complexes des pores nucléaires (NPCs) sont des assemblages protéiques ancrés dans l’enveloppe nucléaire (EN) qui permettent et régulent les échanges entre le cytoplasme et le noyau. Au-delà de leur fonction de transport, plusieurs sous unité des NPCs (les nucléoporines, Nups) jouent un rôle important dans d’autres processus cellulaire tels que la division cellulaire et la différenciation. Le complexe-Y, composé de 9 Nups distincte, dont Nup133, représente une sous unité structurale des NPCs. Cependant, une fraction de ce complexe est localisée aux kinétochores (KTs) durant la mitose, où il est requis pour la ségrégation des chromosomes. Cette localisation aux KTs dépend du complexe Ndc80 mais également de Cenp-F. Par ailleurs, l’interaction Nup133/Cenp-F s'effectue aussi au niveau de l'EN en prophase, ce qui permet le recrutement de la dynéine, étape requise pour l’ancrage des centrosomes à l’EN dans les cellules HeLa et pour la migration du noyau vers le centrosome dans les progéniteurs neuronaux de cerveau de rat. Des études développementales chez la souris ont précédemment identifié le mutant merm qui meurt en milieu de gestation (E10.5). Bien que la mutation merm entraine l’absence de Nup133, la prolifération des cellules souches embryonnaires (mESCs) dérivées de blastocystes merm (Nup133-/-) n’est pas altérée. Cependant l’absence de Nup133 altère la différenciation des mESCs, notamment en neurones post-mitotique. Ce projet de thèse visait à comprendre les mécanismes moléculaires par lesquels Nup133 contribue à la division et la différenciation cellulaire. Afin de caractériser le phénotype des mESCs Nup133-/-, nous avons utilisé deux protocoles de différenciation in vitro, vers une voie neuroectodermale ou mésoendodermale. Cette étude a montré que le nombre de cellules est fortement diminué chez le mutant Nup133-/- comparé aux cellules contrôles lors de la différenciation des mESCs. Cependant les mESCs Nup133-/- qui survivent montrent, comme les mESCs contrôles, une diminution de l’expression des marqueurs de pluripotence et une augmentation des marqueurs de différentiation. L’analyse par cytométrie de flux n’a pas révélé d'altération majeure dans la progression du cycle cellulaire mais à mis en évidence une augmentation de la mort cellulaire lors de la différenciation des mESCs Nup133-/-. Afin de déterminer les domaines de Nup133 requis pour la différenciation des mESCs, nous avons développé une stratégie de sauvetage en établissant des lignées mESCS Nup133-/- qui expriment de manière stable GFP-Nup133, différentes délétions de Nup133 qui n’altèrent pas sa localisation au NPCs (GFP-Nup133DN, DMid, et DC) ou la GFP seule comme contrôle. Des études fonctionnelles ont indiqué que le domaine N-ter (NTD) de Nup133 est requis pour la différenciation des mESCs.Le seul partenaire identifié de Nup133-NTD étant Cenp-F, j’ai décidé de déterminer si l’interaction Nup133/Cenp-F jouait un rôle dans la différenciation des mESCs. En collaboration avec l’équipe de R. Guerois, nous avons simulé in silico l’interaction de Nup133-NTD avec un peptide de Cenp-F que nous avions identifié dans des cribles en double hybride. Cette modélisaton nous a permis de concevoir des mutants affectant la surface d’interaction Nup133/Cenp-F. Nous avons montré que ces mutations empêchent la localisation de Cenp-F à l’EN sans altérer sa présence aux KTs. J’ai également utilisé la stratégie de sauvetage décrite plus haut, pour étudier un mutant de Nup133 qui empêche son interaction avec Cenp-F. Cette étude a montré que l’interaction Nup133/Cenp-F n'est pas requise pour la différenciation in vitro des mESCs. L’étude de Cenp-F a été complétée par la caractérisation d’une mutation de Cenp_F qui affecte sa localisation aux KTs. Nous avons montré que cette mutation altère l’interaction entre Cenp-F et Bub1 mais sans affecter celle avec Nup133. Cette étude a ainsi permis d'identifier Bub1 comme un partenaire direct de Cenp-F requis pour son ancrage aux KTs. / Nuclear pores complexes (NPCs) are macromolecular assemblies anchored in the nuclear envelope (NE) providing the gates that allow and regulate all exchanges between the nucleus and the cytoplasm. Beyond their function in transport, several NPC subunits, the nucleoporins (Nups), have been demonstrated to also play important roles in other cellular processes including cell division and differentiation.The Y-complex, composed of 9 distinct Nups, including Nup133, represents a major structural subunit stably bound to both the cytoplasmic and nuclear faces of the NPCs. Beyond its structural role at nuclear pores, the Y-complex localizes at kinetochores in mitosis, where it is required for chromosome segregation. This kinetochores localization relies on the Ndc80 complex, but also on Nup133/Cenp-F interaction. The Nup133/Cenp-F interaction also contributes to the recruitment of dynein to the NE, a process that is required for the correct centrosomes tethering at the NE in prophase HeLa and for the migration of the nucleus towards the centrosomes prior to mitotic entry in rat brain progenitor cells.Developmental studies previously identified the mouse merm mutant that dies in midgestation (E10.5). In collaboration with the team of E. Lacy, the team of V. Doye showed that the merm mutation leads to the absence of Nup133. Importantly this study further revealed that self-renewal is not impaired in embryonic stem cells (mESCs) derived from merm (Nup133-/-) blastocyst. However, the lack of Nup133 impairs mESC differentiation into postmitotic neurons. How Nup133 contributes to ESCs differentiation remains however unknown.This PhD project aimed at understanding the cellular mechanisms explaining Nup133 contribution to cell division and differentiation.To characterize Nup133-/- mESCs differentiation phenotype, we used two distinct in vitro differentiation protocols, towards either neuroectodermal or mesoendodermal fate. This study revealed that cell number was strongly decreased in Nup133-/- relative to WT in mESC differentiation. However, the few Nup133-/- mESCs that survived displayed, as WT mESCs, a decreased expression of pluripotency markers and acquired differentiated state based on marker expression. FACS analyses did not reveal any major alteration of cell cycle progression but showed increased cell death upon differentiation.To determine which domain of Nup133 is critical for mESC differentiation, we developed a “rescue strategy” using Nup133 alleles deleted for structurally defined domains. Therefore, we established Nup133-/- mESC lines stably expressing GFP-Nup133, GFP-Nup13-ΔN, different ΔC-ter domain (that did not impair the binding of Nup133 to the NPC) or GFP alone as control. Functional studies indicated that while full length and C-ter deleted Nup133 rescue Nup133-/- ESCs defect in differentiation, Nup133-ΔN does not.The only identified partner of Nup133-NTD is Cenp-F. In view of the role of Nup133-NTD in mESC differentiation, I decided to determine if Nup133/Cenp-F interaction contributes to mESC differentiation. In collaboration with R. Guerois' team we simulated in silico the interaction of Nup133-NTD with a short peptide of Cenp-F that we previously identified using yeast-2-hybrid (Y2H) screens. We could thereby design mutants affecting Nup133/Cenp-F contact and show that they prevent Cenp-F localization to the nuclear envelope without altering its kinetochore localization. I then used the “rescue strategy” described above to study a Nup133 mutant specifically impairing its interaction with Cenp-F. This analysis revealed that Nup133/Cenp-F interaction is dispensable for in vitro mESC differentiation. This study on Cenp-F was completed by the characterization of a mutation within an adjacent leucine zipper affecting Cenp-F targeting to kinetochores. We evidenced that this mutation impairs Cenp-F interaction with Bub1 but not with Nup133, identifying Bub1 as a direct kinetochore tether of Cenp-F.

La sclérose systémique (ScS) est une maladie auto-immune dont l’un des principaux auto-anticorps, dirigé contre la protéine centromérique B (CENP-B), est fortement associé à l’hypertension artérielle pulmonaire, l’une des causes majeures de décès dû à la ScS. L’hypertension résulte de l’occlusion progressive des vaisseaux suite à une hyperactivation des cellules musculaires lisses (CML) de la paroi vasculaire. Cependant, les facteurs responsables de ce remodelage vasculaire restent inconnus. Plusieurs études récentes ont démontré que certains auto-antigènes possèdent des fonctions biologiques additionnelles lorsqu'ils se retrouvent dans le milieu extracellulaire. En effet, une fois libérés par nécrose ou apoptose, ces auto-antigènes adoptent une activité biologique qui s'apparente à celles des cytokines et peuvent ainsi participer aux processus normaux de réparation de blessure et/ou acquérir une activité pathogène qui contribue au développement de certaines maladies auto-immunes. Nos résultats suggèrent que la CENP-B peut être ajoutée à cette liste de molécules bifonctionnelles. À l'aide des techniques d'immunofluorescence, d'ELISA cellulaire et de cytométrie en flux, nous avons démontré que la CENP-B se liait spécifiquement à la surface des CML vasculaire de l’artère pulmonaire avec une plus grande affinité pour le phénotype contractile que synthétique. Cette liaison provoquait la migration des cellules ainsi que la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires telles que l’interleukine 6 et 8. Les mécanismes par lesquels la protéine exerçait ces effets impliquaient la phosphorylation de FAK et Src ainsi que la voie des MAP kinases, avec ERK1/2 et p38. Des études de signalisation intracellulaire effectuées à l’aide de plusieurs inhibiteurs spécifiques ainsi que des études de désensibilisation nous ont permis d’identifier le récepteur de la CENP-B en plus d’identifier les mécanismes complets de sa signalisation membranaire. Nous avons démontré que la CENP-B se liait de manière spécifique aux CML vasculaire via le récepteur de chémokine 3 (CCR3) pour ensuite transactiver le récepteur EGF, selon un mécanisme métalloprotéase-dépendant qui implique le relargage du HB-EGF. Cette transactivation est un processus important dans l’activation de la voie des MAP kinases ainsi que dans la sécrétion d’IL-8 induite par la CENP-B. Finalement, nous avons démontré que les auto-anticorps anti-CENP-B pouvaient abolir cette cascade de signalisation, empêchant ainsi la CENP-B d’exercer son rôle de cytokine. L’identification de la CENP-B comme ligand du CCR3 ouvre donc plusieurs perspectives quant à l’étude du rôle pathogène des auto-anticorps anti-CENP-B dans la ScS. / CENP-B is a highly conserved, centromere associated protein and is a major autoantigen in systemic sclerosis (SSc). Anti-CENP-B autoantibodies are associated with prominent vascular manifestations such as pulmonary arterial hypertension (PAH) in the limited cutaneous subset of SSc. PAH occurs as a consequence of progressive obliteration of small arteries due to vascular smooth muscle cell dysfunction, migration and proliferation. However, the factors driving this obliteration are unknown. Earlier in vitro studies have demonstrated that some autoantigens have an additional role when they are released in the extracellular environment during the course of injurious insults resulting in cell death. Indeed, it was previously suggested that extracellular autoantigens participate in normal wound repair processes by acting like cytokines and/or chemokines and subsequently displaying pathogenic activities that contribute to the development of autoimmune diseases. Our present findings suggest that the nuclear autoantigen CENP-B can be added to this set of bifunctional molecules. The present study clearly indicates that exogenous CENP-B bound specifically to the surface of human pulmonary artery SMCs. Binding of CENP-B to SMC stimulated their migration during in vitro wound healing assays, as well as their secretion of interleukins 6 and 8. The mechanism by which CENP-B mediated these effects involved the focal adhesion kinase, Src, ERK1/2, and p38 MAPK pathways. Moreover, CENP-B released from apoptotic endothelial cells was found to bind to SMC, thus indicating a plausible in vivo source of extracellular CENP-B. Here, we also report several lines of evidence indicating that CENP-B, which has no obvious primary or secondary structural homology to chemokines, induced SMC activation by interacting with CCR3. Moreover, the present study clearly demonstrates the involvement of EGFR in CENP-B signaling leading to IL-8 secretion. Finally, anti-CENP-B autoantibodies were found to abolish this signaling pathway, thus preventing CENP-B from transactivating EGFR and exerting its cytokine-like activities toward vascular SMCs. The present study sheds new light on the possible role of extracellular CENP-B and its potent biological effects on human pulmonary artery SMCs. The identification of CENP-B as a CCR3 ligand opens up new perspectives for the study of the pathogenic role of anti-CENP-B autoantibodies.

Eukaryotic centromeres are the region upon which kinetochores assemble, directing attachment of spindle microtubules and faithful segregation of chromosomes during mitosis and meiosis. Except for a transient disruption in mitosis when chromosomes are segregated, centromeres of fission yeast Schizosaccharomyces pombe remain closely associated with the nuclear periphery. Similar to multicellular eukaryotic centromeres, they also maintain unique chromatin architecture, with a central core defined by the presence of the conserved centromeric histone H3 variant CENP-A, designated Cnp1 in S. pombe, that is flanked by histone H3 containing heterochromatin. While much progress has been made in understanding chromatin-associated factors important for proper centromere function, many questions remain. In order to gain a better understanding of the factors involved in centromeric chromatin structure, we affinity purified and defined by mass spectrometry interactions among select proteins that had been implicated in proper Cnp1 localization and centromere function. These biochemical purifications revealed several proteins that may be involved in Cnp1 localization. Purification and analyses of Cnp1 also led us to the identification of the Mlp1/Tpr nucleoporin homolog Nup211. We have found that Nup211 interacts with components of the inner nuclear basket of the nuclear pore, and co-purifies with centromeric chromatin proteins. Cells lacking Nup211 have substantial chromosome segregation defects, as observed by synthetic growth assay, flow cytometric analysis, and fluorescent microscopy. A series of immunoprecipitation experiments have revealed that Nup211 associates with centromeric DNA, and that, surprisingly, cells lacking Nup211 have increased histone H3 lysine 9 methylation, a marker of heterochromatin, and a reduction in Cnp1 levels at the central core. Moreover, cells lacking Nup211 have decreased transcription at centromeric loci, disruption of the stereotypical nucleosome structure found at the central core of S. pombe, and show striking changes in the distribution of heterochromatic foci in the nucleus. By demonstrating that Nup211 is essential for the maintenance of normal central core chromatin state, these studies have shed light on a novel role for Nup211 in proper centromere structure and function in S. pombe, and suggest that Nup211 may play a role in preventing the invasion of flanking pericentric heterochromatin into the central core of centromeres.

La sclérose systémique (ScS) est une maladie auto-immune dont l’un des principaux auto-anticorps, dirigé contre la protéine centromérique B (CENP-B), est fortement associé à l’hypertension artérielle pulmonaire, l’une des causes majeures de décès dû à la ScS. L’hypertension résulte de l’occlusion progressive des vaisseaux suite à une hyperactivation des cellules musculaires lisses (CML) de la paroi vasculaire. Cependant, les facteurs responsables de ce remodelage vasculaire restent inconnus. Plusieurs études récentes ont démontré que certains auto-antigènes possèdent des fonctions biologiques additionnelles lorsqu'ils se retrouvent dans le milieu extracellulaire. En effet, une fois libérés par nécrose ou apoptose, ces auto-antigènes adoptent une activité biologique qui s'apparente à celles des cytokines et peuvent ainsi participer aux processus normaux de réparation de blessure et/ou acquérir une activité pathogène qui contribue au développement de certaines maladies auto-immunes. Nos résultats suggèrent que la CENP-B peut être ajoutée à cette liste de molécules bifonctionnelles. À l'aide des techniques d'immunofluorescence, d'ELISA cellulaire et de cytométrie en flux, nous avons démontré que la CENP-B se liait spécifiquement à la surface des CML vasculaire de l’artère pulmonaire avec une plus grande affinité pour le phénotype contractile que synthétique. Cette liaison provoquait la migration des cellules ainsi que la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires telles que l’interleukine 6 et 8. Les mécanismes par lesquels la protéine exerçait ces effets impliquaient la phosphorylation de FAK et Src ainsi que la voie des MAP kinases, avec ERK1/2 et p38. Des études de signalisation intracellulaire effectuées à l’aide de plusieurs inhibiteurs spécifiques ainsi que des études de désensibilisation nous ont permis d’identifier le récepteur de la CENP-B en plus d’identifier les mécanismes complets de sa signalisation membranaire. Nous avons démontré que la CENP-B se liait de manière spécifique aux CML vasculaire via le récepteur de chémokine 3 (CCR3) pour ensuite transactiver le récepteur EGF, selon un mécanisme métalloprotéase-dépendant qui implique le relargage du HB-EGF. Cette transactivation est un processus important dans l’activation de la voie des MAP kinases ainsi que dans la sécrétion d’IL-8 induite par la CENP-B. Finalement, nous avons démontré que les auto-anticorps anti-CENP-B pouvaient abolir cette cascade de signalisation, empêchant ainsi la CENP-B d’exercer son rôle de cytokine. L’identification de la CENP-B comme ligand du CCR3 ouvre donc plusieurs perspectives quant à l’étude du rôle pathogène des auto-anticorps anti-CENP-B dans la ScS. / CENP-B is a highly conserved, centromere associated protein and is a major autoantigen in systemic sclerosis (SSc). Anti-CENP-B autoantibodies are associated with prominent vascular manifestations such as pulmonary arterial hypertension (PAH) in the limited cutaneous subset of SSc. PAH occurs as a consequence of progressive obliteration of small arteries due to vascular smooth muscle cell dysfunction, migration and proliferation. However, the factors driving this obliteration are unknown. Earlier in vitro studies have demonstrated that some autoantigens have an additional role when they are released in the extracellular environment during the course of injurious insults resulting in cell death. Indeed, it was previously suggested that extracellular autoantigens participate in normal wound repair processes by acting like cytokines and/or chemokines and subsequently displaying pathogenic activities that contribute to the development of autoimmune diseases. Our present findings suggest that the nuclear autoantigen CENP-B can be added to this set of bifunctional molecules. The present study clearly indicates that exogenous CENP-B bound specifically to the surface of human pulmonary artery SMCs. Binding of CENP-B to SMC stimulated their migration during in vitro wound healing assays, as well as their secretion of interleukins 6 and 8. The mechanism by which CENP-B mediated these effects involved the focal adhesion kinase, Src, ERK1/2, and p38 MAPK pathways. Moreover, CENP-B released from apoptotic endothelial cells was found to bind to SMC, thus indicating a plausible in vivo source of extracellular CENP-B. Here, we also report several lines of evidence indicating that CENP-B, which has no obvious primary or secondary structural homology to chemokines, induced SMC activation by interacting with CCR3. Moreover, the present study clearly demonstrates the involvement of EGFR in CENP-B signaling leading to IL-8 secretion. Finally, anti-CENP-B autoantibodies were found to abolish this signaling pathway, thus preventing CENP-B from transactivating EGFR and exerting its cytokine-like activities toward vascular SMCs. The present study sheds new light on the possible role of extracellular CENP-B and its potent biological effects on human pulmonary artery SMCs. The identification of CENP-B as a CCR3 ligand opens up new perspectives for the study of the pathogenic role of anti-CENP-B autoantibodies.

Submitted by THAMIRIS SLANZON DE CARVALHO null (thamirisslanzon@gmail.com) on 2018-03-24T18:38:57Z No. of bitstreams: 1 CARVALHO, Thamiris Slanzon. DISCURSOS CURRICULARES DE GEOGRAFIA EM ANÁLISE.pdf: 702974 bytes, checksum: e906b708894ff08b5563f4c610eb03f9 (MD5) / Approved for entry into archive by Satie Tagara (satie@marilia.unesp.br) on 2018-03-26T16:25:42Z (GMT) No. of bitstreams: 1 carvalho_ts_me_mar.pdf: 702974 bytes, checksum: e906b708894ff08b5563f4c610eb03f9 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-03-26T16:25:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 carvalho_ts_me_mar.pdf: 702974 bytes, checksum: e906b708894ff08b5563f4c610eb03f9 (MD5) Previous issue date: 2018-02-27 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Esta pesquisa se vale de dois documentos oficiais referentes ao ensino de Geografia, um estadual e outro federal, respectivamente, a Proposta Curricular para o Ensino de Geografia - 1° Grau e os Parâmetros Curriculares Nacionais: Geografia (Terceiro e Quarto Ciclos do Ensino Fundamental), aqui designados Proposta da CENP e PCN. Valendo-se do aporte teórico pós-estruturalista, este estudo teve como objetivo analisar os discursos curriculares de Geografia hegemonizados na Proposta da CENP e nos PCN. Para tanto, e reconhecendo que tais documentos se mostram sobremaneira díspares, investigou-se o contexto histórico-social em que foram produzidos, os atores sociais participantes e a perspectiva teórico-metodológica da ciência geográfica utilizada, sendo estas as categorias analíticas empregadas. O estudo na Proposta da CENP e nos PCN justifica-se por se tratarem de documentos pouco pesquisados na atualidade, assim, retomar o debate e colocá-los em evidência é reconhecer sua importância histórica e social. A Proposta da CENP e os PCN são tratados como currículos, os quais, por sua vez, são compreendidos como discursos. Ancorando-se no pós-estruturalismo, currículo é discurso hegemonizado, temporariamente, sendo passível de transformação e ressignificação, visto que é constituído pela linguagem, e esta retrata a realidade, sendo dinâmica e não linear. Desse modo, o discurso é sempre provisório e inacabado, por isso é inconcebível pensar a Proposta da CENP e os PCN desvinculados do momento histórico em que foram elaborados. Eles são o discurso hegemonizado em um dado período. A Proposta da CENP hegemonizou o materialismo histórico e a dialética, ao passo que os PCN fixaram uma pluralidade teórico-metodológica. Em suma, não se pode elencar qual desses currículos é mais verdadeiro ou representador da realidade. Ambos representaram a realidade em que estavam inseridos, pois os significados nunca são fixos, mas constantemente construídos. Em vista disso, não é possível julgar qual foi o mais importante, tampouco considerar apenas um dos currículos como detentor de saberes universais absolutos. / This research uses two official documents from Geography‟s area, one of them state and the other federal which are respectively Curricular Proposal for the Teaching of Geography - 1st Degree and National Curricular Parameters: Geography (Third and Fourth Cycles of Elementary Education), called here CENP‟s Proposal and PCN. Using the theoretical contributions of the post-structuralist perspective, the goal was analyze Geography‟s curricular discourses which were hegemoniac in CENP‟s Proposal and in the PCN. So that, and recognizing that these documents seem to be too different from each other, the social-historical context which they belong was analyzed, as well as the social agents involved and the theoretical-methodological perspective used by Geographic Science. These elements, mentioned before, constitute the analytical categories used. CENP‟s Proposal and the PCN were chosen as object of analysis in this research because they are not frequently researched nowadays, so recover the discussion as well put them in evidence show their social and historical concernment. These documents are understood here as discourse, and using the post-structuralist perspective it‟s possible to say that curriculum is a discourse which was hegemoniac momentarily, which means it become able to be transformed and get other meanings, once discourse is constituted by the language and it represents the reality, dynamically. This way, discourse is always temporary and unclosed, so it‟s unthinkable to think CENP‟s Proposal and the PCN disassociated from the historical context they belong. They are the hegemoniac discourse in a specific moment. CENP‟s Proposal hegemoniac the historical materialism and the dialectic, while the PCN determined a theoretical-methodological‟s pluralism. So, it‟s impossible to determine which of these curriculums are more true or which of them represent better the reality. Both of them represent the reality they belong because they are not stable, they are built constantly. Therefore, it‟s not possible to say which of them is more important neither consider one of them the only document with total knowledge.

Parmi les méthodes de super-résolution, la microscopie par localisation de molécules uniques se distingue principalement par sa meilleure résolution réalisable en pratique mais aussi pour l’accès direct aux propriétés des molécules individuelles. Les données principales de la microscopie par localisation sont les coordonnées des fluorochromes, un type de données peu répandu en microscopie conventionnelle. Le développement de méthodes spéciales pour le traitement de ces données est donc nécessaire. J’ai développé les logiciels SharpViSu et ClusterViSu qui permettent d’effectuer les étapes de traitements les plus importantes, notamment une correction des dérives et des aberrations chromatiques, une sélection des événements de localisations, une reconstruction des données dans des images 2D ou dans des volumes 3D par le moyen de différentes techniques de visualisation, une estimation de la résolution à l’aide de la corrélation des anneaux de Fourier, et une segmentation à l’aide de fonctions K et L de Ripley. En plus, j’ai développé une méthode de segmentation de données de localisation en 2D et en 3D basée sur les diagrammes de Voronoï qui permet un clustering de manière automatique grâce à modélisation de bruit par les simulations Monte-Carlo. En utilisant les méthodes avancées de traitement de données, j’ai mis en évidence un clustering de la protéine CENP-A dans les régions centromériques des noyaux cellulaires et des transitions structurales de ces clusters au moment de la déposition de la CENP-A au début de la phase G1 du cycle cellulaire. / Among the super-resolution methods single-molecule localization microscopy (SMLM) is remarkable not only for best practically achievable resolution but also for the direct access to properties of individual molecules. The primary data of SMLM are the coordinates of individual fluorophores, which is a relatively rare data type in fluorescence microscopy. Therefore, specially adapted methods for processing of these data have to be developed. I developed the software SharpViSu and ClusterViSu that allow for most important data processing steps, namely for correction of drift and chromatic aberrations, selection of localization events, reconstruction of data in 2D images or 3D volumes using different visualization techniques, estimation of resolution with Fourier ring correlation, and segmentation using K- and L-Ripley functions. Additionally, I developed a method for segmentation of 2D and 3D localization data based on Voronoi diagrams, which allows for automatic and unambiguous cluster analysis thanks to noise modeling with Monte-Carlo simulations. Using advanced data processing methods, I demonstrated clustering of CENP-A in the centromeric regions of the cell nucleus and structural transitions of these clusters upon the CENP-A deposition in early G1 phase of the cell cycle.

Au laboratoire du Dr. Bachand, l’orthologue chez la levure à fission de la protéine humaine PABPN1 qui est reliée à la dystrophie musculaire oculopharyngée a été découvert. Cette protéine se nomme Pab2. Elle a une localisation nucléaire, fait la navette entre le noyau et le cytoplasme, et les arginines de son domaine arginine riche sont asymétriquement diméthylées tout comme son orthologue humain. Bien que ces protéines aient une localisation nucléaire, aucune étude in vivo n’a été effectuée afin d’élucider leur mécanisme d’import nucléaire. Dans mon premier projet de recherche, la levure à fission a été utilisée pour caractériser le mécanisme d’import nucléaire de ces protéines liant les queues poly(A). Il a été démontré que Pab2 détient un signal de localisation nucléaire de type PY-NLS qui est suffisant et nécessaire à sa localisation nucléaire ainsi qu’à l’exécution de ses fonctions. De plus, il a été démontré que le PY-NLS de Pab2 provoque l’internalisation nucléaire de la protéine hétérologue GST-GFP-Pab2 (139-166). De concert avec un système d’import nucléaire de type PY-NLS, une délétion de la karyophérine Kap104, orthologue de la Kap?2 qui est le transporteur des cargos PY-NLS, engendre un défaut d’import nucléaire de Pab2. S’ensuit aussi par la démonstration d’une interaction physique directe entre Pab2 et Kap104. Il a été observé que la méthylation du domaine arginine riche en C-terminal, où se retrouve le PY-NLS, n’affecte pas la localisation de Pab2. Toutefois, dans un contexte où Pab2 détient un signal de localisation nucléaire sub-optimal ; la méthylation du domaine arginine riche réduit son efficacité d’import nucléaire. Finalement, une vérification in vivo de l’importance du mécanisme d’import de type PY-NLS de PABPN1 par un système d’inhibition spécifique de la Kap?2 a permis de confirmer que ce mécanisme d’import n’est pas nécessaire à sa localisation nucléaire. Suggérant la présence de systèmes d’imports nucléaires redondants ainsi que la possibilité d’une autre voie d’import nucléaire prioritaire pourPABPN1. Une analyse transcriptomique par micropuce d’ADN a permis d’identifier divers gènes surexprimés dans une cellule pab2?. Une des classes de gènes qui ont été identifiés se réfère à des éléments génétiques mobiles se dénommant Tƒ2 chez la levure à fission. La confirmation de l’accumulation d’environ deux fois des transcrits Tƒ2 dans une souche pab2? par buvardage Northern a fit naître mon deuxième projet de recherche. Plusieurs études ont démontré que Pab2 agit dans la même voie que Rrp6, une exonucléase 3’-5’, dans la maturation et la dégradation de divers transcrits de façon post-transcriptionnelle. Afin de corroborer une répression post-transcriptionnelle des Tƒ2 par Pab2; un essai génétique a été effectué en combinant sa délétion à celle d’une protéine, Abp1, connue pour réprimer de façon transcriptionnelle ces Tƒ2. Étonnamment, une diminution d’accumulation de transcrits Tƒ2 a été observée dans le double mutant comparativement au simple mutant abp1?. Une immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) par la Pol II a permis de confirmer que ce phénotype était d’ordre transcriptionnel. Les essais de ChIP ont aussi permis de corroborer un rôle post-transcriptionnel de répression des Tƒ2 par Pab2. Il a été démontré par un autre groupe de recherche qu’il y a activation du RNAi envers les Tƒ2 qui mènent à l’établissement d’une marque d’hétérochromatine dans un mutant rrp6?. Un dépistage de transcrits antisens aux Tƒ2 a permis d’en identifier un qui accumule dans un double mutant abp1?/pab2?. Il a aussi été observé que ce transcrit antisens accumule à des étapes spécifiques de la méiose. De plus, son accumulation dans des mutants génétiques ou bien en méiose corrèle négativement avec l’accumulation de l’ARNm des Tƒ2. [symboles non conformes]

La ségrégation fidèle des chromosomes est dirigée par le centromère, un locus chromosomique spécialisé qui est requis pour l'assemblage des kinetochores actifs. Les centromères sont marqués épigénétiquement par la présence d'un nucléosome unique qui contient un variant centromérique de l'histone H3 appelé Centromere protein A (CENP-A). Une question fondamentale est comment CENP-A est spécifiquement déposé aux centromères. L'objectif de ma thèse a été d'identifier les facteurs spécifiques de la déposition de CENP-A. Pour identifier les facteurs spécifiques impliqués dans la déposition de CENP-A aux centromères, j'ai utilisé la méthode de purification TAP-TAG à partir d'une fraction nucléaire soluble de cellules HeLa exprimant stablement une copie ectopique de CENP-A (e-CENP-A). J'ai ainsi pu identifié la protéine Holliday Junction Recognition protein (HJURP). En utilisant un siRNA spécifique de HJURP, j'ai montré que la localisation et la déposition de CENP-A étaient fortement affectées. La protéine recombinante HJURP lie de manière stoechiométrique le tétramère CENP-A/H4 mais il ne lie pas le tétramère H3/H4. La liaison se fait grâce à un petit domaine conservé en position N-terminal de HJURP, dénommé CBD (CENP-A binding domain). De plus, j'ai pu mettre en évidence in vitro que HJURP facilitait la déposition du tétramère CENP-A/H4 sur de l'ADN satellite. L'ensemble de mes résultats démontre très clairement que HJURP est la principale chaperone responsable de la déposition de CENP-A aux centromères.

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