O ácido fitânico (Fit) é um ácido graxo saturado de cadeia ramificada que se acumula em diversas doenças peroxissomais, como na síndrome de Zellweger (SZ) e particularmente na doença de Refsum (DR). Essas doenças podem ocorrer devido a defeitos na biogênese do peroxissomo ou em alguma proteína peroxisomal envolvida na β ou α-oxidação de ácidos graxos. Os pacientes afetados geralmente apresentam disfunções neurológicas, incluindo anormalidades cerebelares. Considerando que a patogênese das alterações cerebelares nas doenças peroxisomais onde o Fit se acumula ainda é pouco conhecida, o presente trabalho se propôs a investigar os efeitos ex vivo de injeção intracerebelar aguda do ácido Fit sobre a homeostase redox e imunohistoquímica em cerebelo de ratos jovens. Os parâmetros de estresse oxidativo determinados foram o dano oxidativo lipídico através dos níveis de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBA-RS), o dano oxidativo proteico através do conteúdo de sulfidrilas e da formação de carbonilas, as defesas antioxidantes através dos níveis de glutationa total (tGS) e glutationa reduzida (GSH) e da atividade das enzimas antioxidantes glutationa-peroxidase (GPx), glutationa-redutase (GR), glicose-6-fosfato-desidrogenase (G6PD), superóxido-dismutase (SOD) e catalase (CAT), bem como a produção de espécies reativas através da formação de nitratos e nitritos (produtos do óxido nítrico, NO•) e da oxidação de 2,7-diclorofluoresceína diacetato (DCF-DA). Além disso, foram feitas análises imunohistoquímicas para avaliar alterações morfológicas, bem como avaliar marcadores de estresse oxidativo no cerebelo dos animais. Nossos resultados demonstraram que o Fit aumentou significativamente a formação de TBA-RS em cerebelo, indicando dano oxidativo lipídico. Além disso, verificamos que os níveis de GSH diminuíram e a produção de óxido nítrico aumentou, demonstrando que esse ácido graxo diminui as defesas antioxidantes e aumenta os níveis de espécies reativas de nitrogênio. Verificamos ainda que a administração prévia de L-NAME preveniu o aumento de TBA-RS e de óxido nítrico, bem como a diminuição de GSH causados pelo Fit em cerebelo. As análises imunohistoquímicas indicaram que o Fit causa astrogliose e dano oxidativo por espécies reativas de nitrogênio, além de demonstrarem que o L-NAME diminui a astrogliose e o dano oxidativo causados pelo Fit. Em resumo, concluímos que o Fit induz dano oxidativo, diminuição das defesas antioxidantes e astrogliose, provavelmente através do aumento das espécies reativas de nitrogênio. Assim, presumimos que as alterações no estado redox celular podem representar um mecanismo patológico que contribui, pelo menos em parte, para a patofisiologia da DR e de outras desordens em que esse ácido graxo se acumula. / The phytanic acid (Phyt) is a branched chain saturated fatty acid that accumulates in various peroxisomal diseases such as Zellweger syndrome (ZS) and particularly in Refsum disease (RD). These diseases may occur due to defects in peroxisome biogenesis or some peroxisomal protein involved in β or α-oxidation of fatty acids. Affected patients usually present neurological disorders, including cerebellar abnormalities. Whereas the pathogenesis of cerebellar changes in peroxisomal diseases where Phyt accumulates is still unknown, the present study aimed to investigate the ex vivo effects of an acute intracerebellar injection of Phyt on redox homeostasis and immunohistochemistry in cerebellum of young rats. The oxidative stress parameters determined were the lipid oxidative damage through the levels of thiobarbituric acid (TBA-RS), the protein oxidative damage through the sulfhydryl content and carbonyl formation, antioxidant defenses through the levels of total (tGS) and reduced glutathione (GSH) and activity of the antioxidant enzyme glutathione peroxidase (GPx), glutathione reductase (GR), glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD), superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT), and the production of reactive species by forming nitrates and nitrites (nitric oxide product, NO) and the oxidation of 2,7-dichlorofluorescein diacetate (DCF-DA). In addition, immunohistochemical analyzes were performed to assess morphological changes and to assess oxidative stress markers in the animals cerebellum. Our results showed that Phyt significantly increased TBA-RS formation in the cerebellum, indicating lipid oxidative damage. In addition, we found that GSH levels decreased and nitric oxide production increased, demonstrating that this fatty acid decreases the antioxidant defenses and increases the levels of reactive nitrogen species. We also found that the prior administration of L-NAME prevented the increase of TBARS and nitric oxide, as well as the decrease of GSH caused by Phyt in cerebellum. Immunohistochemical analyzes indicated that Phyt caused astrogliosis and oxidative damage by reactive nitrogen species, and showed that L-NAME decreased astrogliosis and oxidative damage caused by Phyt. In summary, we conclude that the Phyt induces oxidative damage, decreased antioxidant defenses and astrogliosis, probably by increasing reactive nitrogen species. Thus, we assume that changes in the cellular redox state can represent a pathological mechanism that contributes at least in part to the pathophysiology of RD and other disorders where this fatty acid accumulates.

Autism spectrum disorder (ASD) is classified as a neurovelopmental disorder, presenting impairments in social communication and sociability, as well as stereotyped behavioral patterns. Although the etiology remains unknown, there is growing evidence suggesting a complex interplay between genetic and environmental risk factors during the gestational period. Many alterations are related to ASD, as multisensory alterations and recent data were pointing out the misbalance between excitation and inhibition, with high predominance in excitation compound, in cortical areas related to sensory processing. The valproic acid (VPA) exposure is an environmental risk to ASD and VPA is commonly used by our group to induce autistic-like behaviors in rodents. We previously showed that a prenatal subchronic treatment of the pregnant rats with resveratrol (RSV) prevented the social deficits induced by VPA in male offspring rats. The present work evaluated the influence of RSV and VPA interaction in the nest seeking behavior in 10 days old male rats and in the relative genic expression levels of synaptic proteins (Sinaptophysin) in excitatory (PSD95) and inhibitory synapses (Gephyrin) in amygdala region of 30 days old rats. We identified impairments in the number of correct choices to the nest in VPA group, which were in accordance to the literature data. Nevertheless, we showed, for the first time, that resveratrol were able to prevent these impairments In RSV+VPA group. Besides, the present work showed important significant alterations at the genic expression level of synaptic proteins related to excitatory and inhibitory synapses in the amygdala region, an important brain structure related to attachment behavior and altered in ASD. Therefore, these data highlights resveratrol as an important molecule for prevention of autistic-like sensory behaviors in the animal model of autism induced by prenatal exposure to VPA, as well as an important tool for seeking etiological targets and physiopathology studies in TEA.

Orientador: Maria Alice da Cruz-Hofling / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-10T03:10:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Carneiro_CatarinaRaposoDias_M.pdf: 5524356 bytes, checksum: 004e2cd5a35766528eaa3a890eef3854 (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: Recentemente foi demonstrado em nosso laboratório que o veneno bruto da aranha Phoneutria nigriventer (PNV), Keyserling (1891) (Ctenidae, Araneomorphae), é capaz de alterar a permeabilidade da barreira hematoencefálica (BHE), quando injetado sistemicamente em ratos (observações feitas das 18 horas aos 9 dias). Afora a presença de edema vasogênico e de pés astrocitários edematosos, não foram detectadas alterações nos neurônios e células gliais, que indicassem a ação do veneno no interior do parênquima cerebral. O presente trabalho se propôs a avaliar se, em fases agudas do envenenamento, o PNV afeta a BHE e o tecido neural. Os parâmetros observados por microscopia eletrônica de transmissão (através do uso de traçador extracelular injetado na circulação e estudo quantitativo) e microscopia de luz (imunohistoquímica e estudo quantitativo) foram: alterações de permeabilidade vascular na microcirculação cerebral, alterações na expressão da laminina na membrana basal endotelial, ativação neuronal através da expressão da proteína c-FOS, modulação da síntese de óxido nítrico, através da expressão da óxido nítrico sintase neuronal (nNOS). Ratos Wistar machos, jovens (200-300 g) foram injetados pela veia da caudal com solução salina estéril (0.9%), ou com veneno (850 µg/Kg). Para análise da integridade da BHE, após 15 min, 1, 2 e 5 h, cerebelo e hipocampo foram coletados. Os resultados mostraram que o PNV provocou extravasamento significativo do traçador nitrato de lantano a partir de 1 h após a injeção (p.i.) e teve o seu maior pico em 2 h p.i. (p< 0,05). O cerebelo mostrou-se bem mais resistente ao aumento de permeabilidade vascular do que o hipocampo. Por outro lado, freqüentemente observou-se entumecimento dos pés-vasculares astrocitários no cerebelo, mesmo em vasos sem extravazamento do traçador, o que não ocorreu no hipocampo. Houve desaparecimento total da expressão da laminina dos capilares já aos 15 min p.i., seguida por recuperação gradativa, até que às 2 h p.i., sua expressão assemelha-se à mostrada pelos controles e 5 h p.i., a expressão dessa proteína estava acima da fisiológica, na membrana basal. A ativação de neurônios, avaliada às 2 h p.i. pela expressão da c-FOS, ocorreu em áreas relacionadas com atividade motora (substância cinzenta periaqueductal ¿ partes ventral e dorso lateral, córtex frontal e parietal e núcleo talâmico periventricular) e em áreas envolvidas com stress agudo (córtex rinal e núcleo septal lateral) (p< 0,05). Todas as áreas com significativo aumento de neurônios imunoreativos, também apresentaram neurônios positivos para nNOS, porém apenas a substância cinzenta periaqueductal parte dorsolateral, o córtex parietal e o núcleo talâmico periventricular apresentaram aumento no número de neurônios marcados para essa enzima. Nós concluímos que o veneno de P. nigriventer possui componentes neurotóxicos capazes de alterar a permeabilidade da BHE em tempos agudos após a intoxicação, cujo mecanismo precisa ser esclarecido. O veneno pode ser uma ferramenta importante para analisar as respostas dos componentes estruturais da BHE, bem como mapear as áreas cerebrais reativas, possibilitando esclarecer as vias do SNC envolvidas no envenenamento por Phoneutria. O conhecimento de vias relacionadas com neurotoxinas específicas do veneno pode ser útil para estudos relacionados com estrutura-função / Abstract: It was recently demonstrated in our laboratory that the Phoneutria nigriventer spider venom (PNV), Keyserling (1891) (Ctenidae, Araneomorphae), is capable of altering the permeability of the blood brain barrier (BBB) when injected systemically in rats (observations done from 18 hours to 9 days). Apart from the presence of vasogenic edema and swollen atrocytic end-feet processes, no neuronal or glial cells alterations were detected, which would indicate the action of the venom within the cerebral parenchyma.The present work, intended to evaluate if at acute phases of the envenoming, the PNV affects the BBB. The parameters observed by transmission electron microscopy (by the use of electron opaque extracellular tracer injected in the circulation, and quantitative study) and by light microscopy (using immunohistochemistry and quantitative study) were: alterations of vascular permeability in the cerebral microcirculation, alterations of the expression of laminin at the endothelial basement membrane, neuronal activation seen through the expression of c-FOS protein, modulation of nitric oxide synthesis, trough the expression of the neuronal nitric oxide synthase (nNOS). Young male Wistar rats (200-300 g) were injected by the tail vein with sterile saline solution (0.9%), or with venom (850 µg/Kg). For BBB integrity analysis, after 15 min, 1, 2 and 5 h, cerebellum and hippocampus were collected. The results showed that the PNV provoked significant extravasation of LaNO3 tracer at 1 h post injection (p.i.) which peaked at 2 h p.i. (p< 0.05). The cerebellum showed to be more resistant to prevent vascular permeability increase than hippocampus. On the other hand, swollen vascular end-feet processes were more frequently seen in the cerebellum, even in vessels without vascular extravasation, what was not seen in hippocampus. There was complete vanishment of laminin immunolabeling of capillaries soon at 15 min p.i., followed by a gradual restoration to control levels at 2 h p.i. At 5 h p.i., the expression of the protein was upregulated in the basement membrane, compared to the physiologic control. The neuronal activation, evaluated through the expression of c-FOS at 2 h p.i., occurred at motor-related areas (periaqueductal gray matter pars ventral and dorsolateral, frontal and parietal cortex and paraventricular thalamic nuclei), and with acute stress-related areas (rhinal cortex and septal lateral nuclei) (p< 0.05). All cerebral areas with significant increase of c-FOS immunoreactive neurons, also exhibited nNOS-positive neurons, however only the pars ventral and dorsolateral of the periaqueductal gray matter, frontal and parietal cortex and paraventricular thalamic nuclei areas presented increase in the labeled-cells number. We conclude that P. nigriventer venom possesses neurotoxic components capable of altering the BBB permeability at acute stages of intoxication, whose mechanism needs clarification. The venom can be an important tool to analyse the responses of structural components of BBB, and to map the reactive cerebral areas, therefore shedding light to pathways involved with Phoneutria envenoming in CNS. The knowledge of the pathways related to specific venom containing neurotoxins may be useful for structure-function-related studies / Mestrado / Histologia / Mestre em Biologia Celular e Estrutural

Introdução: Há pouca informação a respeito do crescimento cerebelar em recém-nascidos de muito baixo peso (RNMBP). Tradicionalmente as funções cerebelares são relatadas como controle do tônus, postura e coordenação da atividade motora. Entretanto, há um incremento de evidências da implicação do cerebelo na cognição, linguagem, memória e aprendizagem motora. No pré-termo com seqüelas neurológicas, o cerebelo está relacionado com alterações cognitivas e distúrbios emocionais. Objetivo: Avaliar o crescimento cerebelar do nascimento até o termo em recém-nascidos de muito baixo peso (RNMBP). Comparar o diâmetro transverso cerebelar (DTC) de recémnascidos a termo com recém-nascidos de muito baixo peso na idade corrigida correspondente ao termo. Método: RNMBP foram incluídos seqüencialmente no estudo e seus DTCs foram medidos por ultrassonografia craniana nas primeiras 48 horas após o nascimento e no momento da alta hospitalar de todos. A fossa posterior foi examinada através da fontanela Mastóidea usando o aparelho de US GE LOGIC 5 e a medida do DTC realizada no plano coronal. O grupo controle foi formado por recém-nascidos a termo normais com idade gestacional pareada com a idade gestacional pós menstrual corrigida dos RNMBP,sendo seus DTCs medidos nas primeiras 48 horas após o nascimento. Idade gestacional, peso de nascimento, perímetro cefálico e idade da alta foram obtidos dos RNMBP; e idade gestacional, peso de nascimento e perímetro cefálico dos recém-nascidos controles. Teste T de Student’s e correlação de Pearson foram empregados.O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética da instituição. Resultados: Foram incluídos 24 RNMBP e 24 controles. Os RNMBP tiveram idade gestacional media de 30,5± 1,7 semanas, peso de nascimento de 1247± 190 gramas, perímetro cefálico de 27,3 ± 1,5 cm, DTC de 3,28 ± 0,28 cm e idade cronológica da alta de 45,9 ± 12,3 dias. Comparação entre os dois grupos: A idade gestacional corrigida dos RNMBP e a idade gestacional dos controles foram semelhantes (37,04 ± 1,73 semanas e 37,3 ± 1,8 semanas, respectivamente; p= 0,612).O peso dos RNMBP na alta foi significativamente inferior aos controles pareados (2,019 ± 209 g e 2631 ± 423 g; p‹0,0001). Perímetro cefálico dos RNMBP na alta e dos controles, foram respectivamente, 32,23 ± 1,39 centímetros e 33,0 ± 1,6 centímetros (p= 0,098) O DTC aumentou significativamente do nascimento até a alta nos RNMBP; sendo ainda significativamente inferior aos seus pares ao termo ( 4,19 ± 0,41cm e para os controles foi 4,5 ± 0,41 cm; p=0,008). Houve uma correlação positiva entre o perímetro cefálico e o crescimento cerebelar nos RNMBP. Dois RNMBP apresentaram leucomalácia cística e quatro leucomalácia peri-ventricular difusa na ressonância magnética do primeiro ano de vida. Avaliando-se apenas os RNMBP sem leucomalácia peri-ventricular, o crescimento cerebelar foi similar aos recém-nascidos controles (p= 0.135), mas foi menor nos recém-nascidos de muito baixo peso com leucomalácia peri-ventricular quando comparados com os controles (p= 0,005). Conclusões: O crescimento cerebelar foi similar nos recém-nascidos de muito baixo peso sem leucomalácia peri-ventricular e nos controles, e menor naqueles com leucomalácia periventricular em comparação aos controles. Nossos dados sugerem que o crescimento cerebelar é normal na ausência de dano supratentorial. / Introduction: There is little information on cerebellar growth in very low birth weight infants (VLBWI). The cerebellar functions are traditionally reported as tonus, posture and coordination of motricity activity. However, there is an evidence growth of the relation of the cerebellum in cognition, language, memory and motor learning. In VLBWI with neurologic injuries the cerebellum is related to cognitive alterations and emotional disturbance. Objective: Evaluate cerebellar growth from birth up to term in VLBWI. Compare transverse cerebellar diameter (TCD) of term infants and VLBWI at term corrected age. Design/Methods: VLBWI were sequentially included in the study. TCD was measured by cranial ultrasound in the first 48 hours after birth and at hospital discharge in all of them. The posterior fossa was examined through the Mastoid fontanelle using a General Eletric LOGIQ 5 scanner and TCD measurement was taken in the coronal plane. Control group was formed by normal term infants with gestational age that matched VLBWI corrected pos menstrual age. TCD was measured in the first 48 hours after birth. Data on gestational age, birth weight, head circumference, and age at discharge were collected from VLBWI; and gestational age, birth weight, and head circumference from controls newborns. Student’s T test and Pearson correlation were employed. Study was approved by institutional Ethic Committee. Results: We enrolled 24 VLBWI and 24 controls. VLBWI had mean gestational age 30.5±1.7 weeks, birth weight 1247±190 grams, head circumference 27.3 ±1.5cm,TCD 3.28± 0.28 cm, and chronological age at hospital discharge 45.9±12.3 days. Comparison between both groups: VLBWI corrected age at discharge and controls gestational age were similar: 37.4±1.73 weeks and 37.3±1,8 (p=0.612),VLBWI weight at discharge and controls birth weight was significantly inferior to controls: 2019±and 2631±423 grams (p‹ 0.0001),VLBWI head circumference at discharge and controls head circumference: 32.23±1.39 and 33.0 ±1.6 cm (p=0.098),VBWI TCD at discharge and controls TCD: 4.19±0.41 and 4.5±0.41 cm (p=0.008).TCD increased significantly form birth up to hospital discharge in VLBWI (p< 0.001); being still significantly inferior to its term infants matched. There was a significant positive correlation between head circumference and cerebellar growth in VLBWI. Two very low birth weight infants presented cystic and four diffuse peri-ventricular leukomalacia at magnetic resonance image in the first year. Evaluating only the VLBWI without periventricular leukomalacia the cerebellar growth was similar to controls (p=0.135), but it was smaller in VLBWI with peri-ventricular leukomalacia when compared with controls (p=0.005). Hence we divided the case group in with or without peri-ventricular leukomalacia. We compared the two groups with the control group. Conclusions: Cerebellar growth was similar in very low birth Wright infants without periventricular leukomalacia and controls, and smaller in cases with peri-ventricular leukomalacia than in controls. We suggest that cerebelar growth is normal in the absence of supratentorial injury.

O ácido fitânico (Fit) é um ácido graxo saturado de cadeia ramificada que se acumula em diversas doenças peroxissomais, como na síndrome de Zellweger (SZ) e particularmente na doença de Refsum (DR). Essas doenças podem ocorrer devido a defeitos na biogênese do peroxissomo ou em alguma proteína peroxisomal envolvida na β ou α-oxidação de ácidos graxos. Os pacientes afetados geralmente apresentam disfunções neurológicas, incluindo anormalidades cerebelares. Considerando que a patogênese das alterações cerebelares nas doenças peroxisomais onde o Fit se acumula ainda é pouco conhecida, o presente trabalho se propôs a investigar os efeitos ex vivo de injeção intracerebelar aguda do ácido Fit sobre a homeostase redox e imunohistoquímica em cerebelo de ratos jovens. Os parâmetros de estresse oxidativo determinados foram o dano oxidativo lipídico através dos níveis de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBA-RS), o dano oxidativo proteico através do conteúdo de sulfidrilas e da formação de carbonilas, as defesas antioxidantes através dos níveis de glutationa total (tGS) e glutationa reduzida (GSH) e da atividade das enzimas antioxidantes glutationa-peroxidase (GPx), glutationa-redutase (GR), glicose-6-fosfato-desidrogenase (G6PD), superóxido-dismutase (SOD) e catalase (CAT), bem como a produção de espécies reativas através da formação de nitratos e nitritos (produtos do óxido nítrico, NO•) e da oxidação de 2,7-diclorofluoresceína diacetato (DCF-DA). Além disso, foram feitas análises imunohistoquímicas para avaliar alterações morfológicas, bem como avaliar marcadores de estresse oxidativo no cerebelo dos animais. Nossos resultados demonstraram que o Fit aumentou significativamente a formação de TBA-RS em cerebelo, indicando dano oxidativo lipídico. Além disso, verificamos que os níveis de GSH diminuíram e a produção de óxido nítrico aumentou, demonstrando que esse ácido graxo diminui as defesas antioxidantes e aumenta os níveis de espécies reativas de nitrogênio. Verificamos ainda que a administração prévia de L-NAME preveniu o aumento de TBA-RS e de óxido nítrico, bem como a diminuição de GSH causados pelo Fit em cerebelo. As análises imunohistoquímicas indicaram que o Fit causa astrogliose e dano oxidativo por espécies reativas de nitrogênio, além de demonstrarem que o L-NAME diminui a astrogliose e o dano oxidativo causados pelo Fit. Em resumo, concluímos que o Fit induz dano oxidativo, diminuição das defesas antioxidantes e astrogliose, provavelmente através do aumento das espécies reativas de nitrogênio. Assim, presumimos que as alterações no estado redox celular podem representar um mecanismo patológico que contribui, pelo menos em parte, para a patofisiologia da DR e de outras desordens em que esse ácido graxo se acumula. / The phytanic acid (Phyt) is a branched chain saturated fatty acid that accumulates in various peroxisomal diseases such as Zellweger syndrome (ZS) and particularly in Refsum disease (RD). These diseases may occur due to defects in peroxisome biogenesis or some peroxisomal protein involved in β or α-oxidation of fatty acids. Affected patients usually present neurological disorders, including cerebellar abnormalities. Whereas the pathogenesis of cerebellar changes in peroxisomal diseases where Phyt accumulates is still unknown, the present study aimed to investigate the ex vivo effects of an acute intracerebellar injection of Phyt on redox homeostasis and immunohistochemistry in cerebellum of young rats. The oxidative stress parameters determined were the lipid oxidative damage through the levels of thiobarbituric acid (TBA-RS), the protein oxidative damage through the sulfhydryl content and carbonyl formation, antioxidant defenses through the levels of total (tGS) and reduced glutathione (GSH) and activity of the antioxidant enzyme glutathione peroxidase (GPx), glutathione reductase (GR), glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD), superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT), and the production of reactive species by forming nitrates and nitrites (nitric oxide product, NO) and the oxidation of 2,7-dichlorofluorescein diacetate (DCF-DA). In addition, immunohistochemical analyzes were performed to assess morphological changes and to assess oxidative stress markers in the animals cerebellum. Our results showed that Phyt significantly increased TBA-RS formation in the cerebellum, indicating lipid oxidative damage. In addition, we found that GSH levels decreased and nitric oxide production increased, demonstrating that this fatty acid decreases the antioxidant defenses and increases the levels of reactive nitrogen species. We also found that the prior administration of L-NAME prevented the increase of TBARS and nitric oxide, as well as the decrease of GSH caused by Phyt in cerebellum. Immunohistochemical analyzes indicated that Phyt caused astrogliosis and oxidative damage by reactive nitrogen species, and showed that L-NAME decreased astrogliosis and oxidative damage caused by Phyt. In summary, we conclude that the Phyt induces oxidative damage, decreased antioxidant defenses and astrogliosis, probably by increasing reactive nitrogen species. Thus, we assume that changes in the cellular redox state can represent a pathological mechanism that contributes at least in part to the pathophysiology of RD and other disorders where this fatty acid accumulates.

Autism spectrum disorder (ASD) is classified as a neurovelopmental disorder, presenting impairments in social communication and sociability, as well as stereotyped behavioral patterns. Although the etiology remains unknown, there is growing evidence suggesting a complex interplay between genetic and environmental risk factors during the gestational period. Many alterations are related to ASD, as multisensory alterations and recent data were pointing out the misbalance between excitation and inhibition, with high predominance in excitation compound, in cortical areas related to sensory processing. The valproic acid (VPA) exposure is an environmental risk to ASD and VPA is commonly used by our group to induce autistic-like behaviors in rodents. We previously showed that a prenatal subchronic treatment of the pregnant rats with resveratrol (RSV) prevented the social deficits induced by VPA in male offspring rats. The present work evaluated the influence of RSV and VPA interaction in the nest seeking behavior in 10 days old male rats and in the relative genic expression levels of synaptic proteins (Sinaptophysin) in excitatory (PSD95) and inhibitory synapses (Gephyrin) in amygdala region of 30 days old rats. We identified impairments in the number of correct choices to the nest in VPA group, which were in accordance to the literature data. Nevertheless, we showed, for the first time, that resveratrol were able to prevent these impairments In RSV+VPA group. Besides, the present work showed important significant alterations at the genic expression level of synaptic proteins related to excitatory and inhibitory synapses in the amygdala region, an important brain structure related to attachment behavior and altered in ASD. Therefore, these data highlights resveratrol as an important molecule for prevention of autistic-like sensory behaviors in the animal model of autism induced by prenatal exposure to VPA, as well as an important tool for seeking etiological targets and physiopathology studies in TEA.

Em ratos, a amígdala medial póstero-dorsal (AMePD) é uma região sexualmente dimórfica e está envolvida com o controle da reprodução. Os hormônios gonadais masculinos e femininos possuem um papel epigenético importante sobre a morfologia e a função neuro-glial na AMePD. Nesse trabalho dois grandes tópicos inéditos e pertinentes na literatura para o entendimento das bases celulares de funcionamento da AMePD foram estudados: (1) a atividade da NADPHdiaforase (NADPH-d) e o número de neurônios NADPH-d-positivos de ratos adultos, fêmeas ao longo do ciclo estral (diestro, proestro, estro e metaestro) ou após ovariectomia (OVX) seguida por terapia substitutiva consistindo em veículo/óleo (controle), somente estradiol (BE), estradiol e progesterona (BE+P) ou somente progesterona (P) e, (2) a modificação do volume somático e nuclear de neurônios da AMePD de ratas OVX adultas submetidas ao mesmo tratamento substitutivo, com o objetivo de revelar possíveis influências dos hormônios gonadais sobre esses parâmetros morfológicos. A histoquímica para a NADPH-d foi utilizada para estudar a densidade regional e neuronal da atividade da NADPH-d, seguida por uma análise semi-quantitativa utilizando-se a densitometria óptica. Todos os animais foram submetidos ao mesmo protocolo experimental para obtenção dos resultados. Com base nisso, machos apresentaram maior densidade óptica regional e neuronal quando comparados as fêmeas ao longo do ciclo estral, com exceção da fase de diestro (P < 0,01). Nenhuma diferença foi encontrada nesses dois mesmos parâmetros durante o ciclo ovariano (P > 0,05). Quanto ao número de neurônios NADPH-dpositivos, não foram encontradas diferenças estatisticamente significativas entre machos e fêmeas, estas ao longo do ciclo estral (P > 0,05). Como os hormônios gonadais são capazes de gerar respostas supra-fisiológicas distintas daquelas observadas durante o ciclo ovariano normal na AMePD, foram testados também os efeitos da OVX nesses parâmetros. Não houve diferença estatisticamente significativa na densidade óptica regional, na densidade óptica neuronal e no número de neurônios NADPH-d-positivos quando se comparam fêmeas OVX tratadas com óleo ou com as três diferentes terapias hormonais (P = 0,07, P = 0,18 e P = 0,95, respectivamente). Para medir os volumes somático e nuclear dos neurônios da AMePD, uma semana após a OVX e ao final do tratamento hormonal, os encéfalos foram cortados em secções semi-finas (1 m) e corados com azul de toluidina a 1% para a estimação estereológica, utilizando-se o método de Cavalieri associado à técnica de contagem de pontos. Tanto o volume somático quanto o neuronal apresentaram diferença estatisticamente significante quando comparados os dados entre as fêmeas OVX tratadas com óleo, BE, BE+P ou somente P (P < 0,05). Ou seja, ratas OVX tratadas com BE+P apresentaram maior volume somático e nuclear quando comparadas às fêmeas OVX tratadas com óleo (P < 0,01) ou somente com BE (P < 0,01). Além disso, fêmeas OVX tratadas somente com P apresentaram maior volume somático e nuclear quando comparadas às fêmeas OVX tratadas com óleo (P < 0,05). Esses resultados sugerem que a atividade da NADPH-d é diferente entre os sexos, mas em fêmeas não é afetada pelas mudanças nos níveis de hormônios gonadais em condições fisiológicas ou suprafisiológicas. Além disso, os volumes somáticos e neuronais podem ser modulados pelos hormônios gonadais administrados em fêmeas OVX, onde a P gerou maiores resultados. Esses achados revelam ações adicionais dos esteróides sexuais na AMePD e novas características na morfologia neuronal em ratos machos e fêmeas adultos, complementando e avançando a literatura atual com resultados que ampliam o número de ações dos hormônios gonadais nesta área telencefálica de ratos. / In rats, the posterodorsal medial amygdala (MePD) is a sexually dimorphic area and it is implicated in the control of reproduction. The male and female gonadal hormones have an important epigenetic role upon neuro-glial morphology and function in the rat MePD. In this work two great unpublished and relevant topics in the literature for the understanding of the cellular bases of functioning of the MePD were discovered: (1) the NADPH-diaphorase (NADPH-d) activity and the number of NADPH-d-positive neurons of adult males, females across the estrous cycle (diestrus, proestrus, estrus, and metaestrus) or following ovariectomy (OVX) and substitutive therapy consisting of vehicle/oil (control), estradiol benzoate alone (EB), estradiol benzoate and progesterone (EB+P), or progesterone alone (P), and, (2) the modification of the somatic and nuclear from MePD neurons of OVXed female rats submitted to the same hormonal therapy, aiming to reveal possible influence of sex steroids in these morphological parameters. The NADPH-d histochemical technique was used to study the regional and neuronal NADPH-d activity, followed by a semi-quantitative analysis using optical densitometry. All animals were submitted to the same experimental protocol. Males showed a higher regional and neuronal optical density when compared to females across the estrous cycle, with the exception of the diestrus phase (P < 0.01). No differences were found in these two parameters during the ovarian cycle (P > 0.05). As for the number of NADPH-d-positive neurons, there were no statistically significant differences found among males and cycling females (P > 0.05). Since the gonadal hormones are able to provide supra-physiologic answers different from those observed during the normal ovarian cycle in the MePD, the effects of the OVX were tested also in these parameters. No statistically significant difference was found in the regional optical density, in the neuronal optical density, or in the number of NADPH-d positive neurons when comparing the data from OVXed females treated with vehicle or the three different hormonal therapies (P = 0.07, P = 0.18, and P = 0.95, respectively). To measure the somatic and nuclear volumes from MePD neurons, one-week following ovariectomy and at the end of hormonal treatments, brains were cut to semithin sections (1 mm) and stained with 1% toluidine blue for stereological estimations, carried out using the Cavalieri method and the technique of point counting. Both the somatic and neuronal volume showed a statistically significant difference when comparing the data among OVXed females treated with vehicle (V), EB, EB+P or P. This is, OVX with EB+P treated females had higher mean somatic and nuclear volume when compared to V (P < 0.01) or with EB (P < 0.01). Also, OVXed females treated with P showed larger mean somatic and nuclear volume when compared to V (P < 0.05). Results suggest that NADPH-d activity in the rat MePD is different between sexes but in females is not affected by changing levels of circulating gonadal hormones in physiological or supraphysiological conditions. Moreover, somatic and nuclear volume can be modulated by substitutive ovarian hormones administered to OVXed females, for which P can lead to higher results. These findings reveal additional actions of the sexual steroids in the MePD and new features for the neuronal morphology in adult male and female rats, complementing and advancing the current literature with results that enlarge the number of actions of gonadal hormones in this telencephalic area of rats.

Submitted by Ramon Santana (ramon.souza@ufpe.br) on 2015-04-07T13:57:11Z No. of bitstreams: 2 José Antonio dos Santos Dissertação de Mestrado.pdf: 1686705 bytes, checksum: 52f3ff584f67c455596b75291f35a62d (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-07T13:57:11Z (GMT). No. of bitstreams: 2 José Antonio dos Santos Dissertação de Mestrado.pdf: 1686705 bytes, checksum: 52f3ff584f67c455596b75291f35a62d (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2012-02-14 / O objetivo do presente estudo foi avaliar os efeitos do treinamento de resistência sobre a morfologia dos músculos sóleo e extensor digital longo (EDL) e sobre a expressão gênica de BDNF e IGF-1 na medula espinal, córtex motor e cerebelo em ratos. Foram utilizados 31 ratos machos Wistar (267.3±36.7 gramas; 65±5 dias de idade). Os animais foram divididos aleatoriamente em dois grupos: Não-Treinado (NT, n=13) e treinado (T, n=18). Animais do grupo T foram submetidos a um protocolo de treinamento físico de resistência diário, 5 dias por semana, durante 8 semanas, com 80% da sobrecarga máxima acessada semanalmente. O sacrifício foi realizado 48 horas após a última sessão de treinamento e os tecidos removidos e congelados imediatamente. Foi avaliado a histologia dos músculos sóleo e EDL (n=6 por grupo) através da técnica da ATPase miofibrilar. Para análise da expressão gênica (n=5 por grupo) de BDNF e IGF-1 no córtex motor, medula espinal e cerebelo foi utilizada a técnica do PCR em tempo real. O percentual de aumento de sobrecarga máxima dos animais treinados foi maior que o grupo Não-Treinado (NT: 101,1± 13,6; T: 232,1 ± 14,3). Com relação ao peso corporal não houve diferença entre os grupos ao longo das semanas. No músculo sóleo, o treinamento de resistência diário não alterou a proporção de fibras tipo I (NT: 85,5± 2,7%; T: 84,7± 2,2%) e tipo II (NT: 14,5±2,7%; T: 15,2± 2,1%). O mesmo foi observado no músculo EDL: fibras tipo I (NT: 3,4± 0,47%; T: 5,4± 0,82%) e tipo II (NT: 96,6± 0,47%; T: 94,6± 0,82%). O treinamento físico de resistência não afetou a proporção dos subtipos de fibras no músculo sóleo: tipo I (NT: 84,9±2,06; T: 83,6± 2,68); tipo IIa (NT: 10,9±1,32%; T: 13,4±2,53%); tipo IIb (NT: 4,1±0,82%; T: 2,9±0,47%). No músculo EDL, embora não haja diferença na proporção de fibras tipo I, o treinamento de resistência aumentou a proporção de fibras tipo IIb (NT: 19,8± 2,14%; T: 35,7±2,1%) e diminuiu a proporção de fibras tipo IIa (NT: 77,5±2,4%; T: 59,6±2,2%). No córtex motor, o treinamento de resistência não alterou a expressão gênica relativa de BDNF (NT: 1,08±0,21; T: 1,10±0,12) e de IGF-1 (NT:1,03±0,13; T: 0,98±0,12). O mesmo foi observado com relação à medula espinal (BDNF: NT: 1,02±0,09; T: 0,92±0,15; IGF-1: NT: 1,14±0,24). No cerebelo não houve diferença na expressão gênica de BDNF (NT: 1,05±0,17; T: 0,88±0,07). Entretanto, a expressão gênica de IGF-1 no cerebelo foi diminuída (NT: 1,02±0,12; T: 0,57±0,11). O treinamento de resistência diário aumenta a força em ratos, mas não altera seu peso corporal. Nossos dados sugerem que treinamento de resistência, mesmo alterando a proporção de fibras musculares, exerce pouca influência, de forma crônica, sobre a expressão de genes para fatores neurotróficos no sistema nervoso central.

O presente trabalho objetivou explorar a eventual variação da expressão do mRNA e da proteína S100b no hipocampo, cerebelo e córtex cerebral de ratos neonatos em condições de anóxia, comparativamente à condições controle. Este estudo foi desenvolvido em ratos albinos, divididos em dois grupos: o grupo Experimental Anóxia (EA) e o grupo Experimental Controle (EC), que por sua vez foram subdivididos em tempos de 2, 4, 6, 12 e 24 horas no que se refere à coleta de amostras após a aplicação dos estímulos pré-estabelecidos para cada grupo. Dos períodos avaliados, nossos resultados indicaram que a anóxia proporcionou um pico na expressão gênica de S100b após duas horas e proteica após 4 horas nas áreas do hipocampo e cerebelo. O córtex cerebral do grupo EA quando comparado ao grupo EC, não apresentou nenhum aumento significante de S100b nos períodos avaliados. Os resultados obtidos contribuem de forma crucial para elucidação do papel da proteína S100b como biomarcadora na EHI, bem como no esclarecimento parcial da função deste gene com relação à fisiopatologia da doença. / The aim of the present study was to investigate the temporal variation in the expression of S100b mRNA and protein in the hippocampus, cerebellum, and cerebral cortex of newborn rats under conditions of anoxia compared with control rats. The study was performed using two groups albino rats: Experimental Anoxia (EA) and Experimental Control (EC). The animals in both EA and EC were distributed in the following subgroups relative to the time elapsed since the application of the stimuli predefined for each group: two, four, six, 12, and 24 hours. Anoxia induced a peak in the S100b gene expression after two hours and protein expression after 4 hours in the hippocampus and cerebellum. With respect to the cerebral cortex, S100b never exhibited a significant increase in the EA group compared with the EC group. The results of the present study represent a crucial contribution to the elucidation of the role protein S100b plays as a biomarker in HIE, as well as a contribution to the elucidation of the role the corresponding gene plays in the physiopathology of the disease.

A melatonina, um derivado da serotonina, é o principal produto da glândula pineal. Pode ser produzida também por diversas células e tecidos extrapineais, como retina, trato gastrointestinal, células do sistema imunológico, entre outros. Nos mamíferos exerce diferentes papéis, sendo que, classicamente, é conhecida por atuar como mediadora química da fase escura. A liberação rítmica desse hormônio para a corrente sanguínea e para o líquido cefalorraquidiano marca o ciclo claro-escuro e as estações do ano para os órgãos internos. Além disso, a melatonina atua como moduladora do sistema imunológico e da inflamação, agente citoprotetora e antioxidante. Os mecanismos de ação também são diversos e variam desde receptores de membrana às interações intracelulares. No presente trabalho mostramos que a melatonina inibe a produção de NO ativado por ACh ou BK em cultura de células granulares de cerebelo. Esses agonistas ativam as NOS constitutivas, que são dependentes do aumento de Ca2+ intracelular. A melatonina também bloqueia o aumento de Ca2+ intracelular induzido por ACh, sugerindo que, o efeito dessa indolamina sobre a produção de NO ativado por ACh é, provavelmente, um efeito sobre o aumento de Ca2+ intracelular. Lipopolissacarídeo da parede de bactéria gram-negativa ativa a transcrição da isoforma induzida NOS. A melatonina inibe a expressão dessa enzima e a produção de NO induzidas pela endotoxina bacteriana. Nossos resultados indicam que esses efeitos são dependentes da inibição da via do fator de transcrição NFKB. Em resumo, o presente trabalho mostra que a melatonina inibe a atividade da NOS constitutiva e a expressão da NOS induzida. Esses efeitos são dependentes de mecanismos específicos e devem estar relacionados às diferentes funções celulares. / Melatonin, a serotonin derivative, is the main product of the pineal gland. Can also be produced by various extra¬pineal sites as retina, gastrointestinal tract, immune cells, among others. In mammals it has different roles, and, classically, is known to act as a chemistry mediator of the darkness. The rhythmic release of this hormone into the blood and cerebrospinal fluid marks the light¬dark cycle and the seasons to the internal organs. Moreover, melatonin acts as a modulator of the immune system and inflammation, a cytoprotective agent and reduces free radicals formation. The mechanisms of action are also diverse and vary from membrane receptors to intracellular interactions. Here we show that melatonin inhibits the production of NO activated by ACh or BK in cultured cerebellar granule cells. These agonists activate constitutive NOS, which are dependent on increased intracellular Ca2+. Melatonin also blocks acetylcholine-induced Ca2+ intracellular increase, suggesting that, this indolamine effects on NO production activated by ACh is, probably, an effect on the increase of intracellular Ca2+. Lipopolysaccharide of gram¬negative bacteria wall activates the transcription of inducible NOS isoform. Melatonin inhibits the enzyme expression and NO production in granule cerebellar cells activated with the bacterial endotoxin. Our data shows that these effects are dependent on inhibition of nuclear factor kappa B pathway. In summary, the present work shows that melatonin inhibits constitutive NOS activity and inducible NOS expression. These effects are dependent on specific mechanisms and should be related to different cellular functions.