Em ratos, a amígdala medial póstero-dorsal (AMePD) é uma região sexualmente dimórfica e está envolvida com o controle da reprodução. Os hormônios gonadais masculinos e femininos possuem um papel epigenético importante sobre a morfologia e a função neuro-glial na AMePD. Nesse trabalho dois grandes tópicos inéditos e pertinentes na literatura para o entendimento das bases celulares de funcionamento da AMePD foram estudados: (1) a atividade da NADPHdiaforase (NADPH-d) e o número de neurônios NADPH-d-positivos de ratos adultos, fêmeas ao longo do ciclo estral (diestro, proestro, estro e metaestro) ou após ovariectomia (OVX) seguida por terapia substitutiva consistindo em veículo/óleo (controle), somente estradiol (BE), estradiol e progesterona (BE+P) ou somente progesterona (P) e, (2) a modificação do volume somático e nuclear de neurônios da AMePD de ratas OVX adultas submetidas ao mesmo tratamento substitutivo, com o objetivo de revelar possíveis influências dos hormônios gonadais sobre esses parâmetros morfológicos. A histoquímica para a NADPH-d foi utilizada para estudar a densidade regional e neuronal da atividade da NADPH-d, seguida por uma análise semi-quantitativa utilizando-se a densitometria óptica. Todos os animais foram submetidos ao mesmo protocolo experimental para obtenção dos resultados. Com base nisso, machos apresentaram maior densidade óptica regional e neuronal quando comparados as fêmeas ao longo do ciclo estral, com exceção da fase de diestro (P < 0,01). Nenhuma diferença foi encontrada nesses dois mesmos parâmetros durante o ciclo ovariano (P > 0,05). Quanto ao número de neurônios NADPH-dpositivos, não foram encontradas diferenças estatisticamente significativas entre machos e fêmeas, estas ao longo do ciclo estral (P > 0,05). Como os hormônios gonadais são capazes de gerar respostas supra-fisiológicas distintas daquelas observadas durante o ciclo ovariano normal na AMePD, foram testados também os efeitos da OVX nesses parâmetros. Não houve diferença estatisticamente significativa na densidade óptica regional, na densidade óptica neuronal e no número de neurônios NADPH-d-positivos quando se comparam fêmeas OVX tratadas com óleo ou com as três diferentes terapias hormonais (P = 0,07, P = 0,18 e P = 0,95, respectivamente). Para medir os volumes somático e nuclear dos neurônios da AMePD, uma semana após a OVX e ao final do tratamento hormonal, os encéfalos foram cortados em secções semi-finas (1 m) e corados com azul de toluidina a 1% para a estimação estereológica, utilizando-se o método de Cavalieri associado à técnica de contagem de pontos. Tanto o volume somático quanto o neuronal apresentaram diferença estatisticamente significante quando comparados os dados entre as fêmeas OVX tratadas com óleo, BE, BE+P ou somente P (P < 0,05). Ou seja, ratas OVX tratadas com BE+P apresentaram maior volume somático e nuclear quando comparadas às fêmeas OVX tratadas com óleo (P < 0,01) ou somente com BE (P < 0,01). Além disso, fêmeas OVX tratadas somente com P apresentaram maior volume somático e nuclear quando comparadas às fêmeas OVX tratadas com óleo (P < 0,05). Esses resultados sugerem que a atividade da NADPH-d é diferente entre os sexos, mas em fêmeas não é afetada pelas mudanças nos níveis de hormônios gonadais em condições fisiológicas ou suprafisiológicas. Além disso, os volumes somáticos e neuronais podem ser modulados pelos hormônios gonadais administrados em fêmeas OVX, onde a P gerou maiores resultados. Esses achados revelam ações adicionais dos esteróides sexuais na AMePD e novas características na morfologia neuronal em ratos machos e fêmeas adultos, complementando e avançando a literatura atual com resultados que ampliam o número de ações dos hormônios gonadais nesta área telencefálica de ratos. / In rats, the posterodorsal medial amygdala (MePD) is a sexually dimorphic area and it is implicated in the control of reproduction. The male and female gonadal hormones have an important epigenetic role upon neuro-glial morphology and function in the rat MePD. In this work two great unpublished and relevant topics in the literature for the understanding of the cellular bases of functioning of the MePD were discovered: (1) the NADPH-diaphorase (NADPH-d) activity and the number of NADPH-d-positive neurons of adult males, females across the estrous cycle (diestrus, proestrus, estrus, and metaestrus) or following ovariectomy (OVX) and substitutive therapy consisting of vehicle/oil (control), estradiol benzoate alone (EB), estradiol benzoate and progesterone (EB+P), or progesterone alone (P), and, (2) the modification of the somatic and nuclear from MePD neurons of OVXed female rats submitted to the same hormonal therapy, aiming to reveal possible influence of sex steroids in these morphological parameters. The NADPH-d histochemical technique was used to study the regional and neuronal NADPH-d activity, followed by a semi-quantitative analysis using optical densitometry. All animals were submitted to the same experimental protocol. Males showed a higher regional and neuronal optical density when compared to females across the estrous cycle, with the exception of the diestrus phase (P < 0.01). No differences were found in these two parameters during the ovarian cycle (P > 0.05). As for the number of NADPH-d-positive neurons, there were no statistically significant differences found among males and cycling females (P > 0.05). Since the gonadal hormones are able to provide supra-physiologic answers different from those observed during the normal ovarian cycle in the MePD, the effects of the OVX were tested also in these parameters. No statistically significant difference was found in the regional optical density, in the neuronal optical density, or in the number of NADPH-d positive neurons when comparing the data from OVXed females treated with vehicle or the three different hormonal therapies (P = 0.07, P = 0.18, and P = 0.95, respectively). To measure the somatic and nuclear volumes from MePD neurons, one-week following ovariectomy and at the end of hormonal treatments, brains were cut to semithin sections (1 mm) and stained with 1% toluidine blue for stereological estimations, carried out using the Cavalieri method and the technique of point counting. Both the somatic and neuronal volume showed a statistically significant difference when comparing the data among OVXed females treated with vehicle (V), EB, EB+P or P. This is, OVX with EB+P treated females had higher mean somatic and nuclear volume when compared to V (P < 0.01) or with EB (P < 0.01). Also, OVXed females treated with P showed larger mean somatic and nuclear volume when compared to V (P < 0.05). Results suggest that NADPH-d activity in the rat MePD is different between sexes but in females is not affected by changing levels of circulating gonadal hormones in physiological or supraphysiological conditions. Moreover, somatic and nuclear volume can be modulated by substitutive ovarian hormones administered to OVXed females, for which P can lead to higher results. These findings reveal additional actions of the sexual steroids in the MePD and new features for the neuronal morphology in adult male and female rats, complementing and advancing the current literature with results that enlarge the number of actions of gonadal hormones in this telencephalic area of rats.

O ácido fitânico (Fit) é um ácido graxo saturado de cadeia ramificada que se acumula em diversas doenças peroxissomais, como na síndrome de Zellweger (SZ) e particularmente na doença de Refsum (DR). Essas doenças podem ocorrer devido a defeitos na biogênese do peroxissomo ou em alguma proteína peroxisomal envolvida na β ou α-oxidação de ácidos graxos. Os pacientes afetados geralmente apresentam disfunções neurológicas, incluindo anormalidades cerebelares. Considerando que a patogênese das alterações cerebelares nas doenças peroxisomais onde o Fit se acumula ainda é pouco conhecida, o presente trabalho se propôs a investigar os efeitos ex vivo de injeção intracerebelar aguda do ácido Fit sobre a homeostase redox e imunohistoquímica em cerebelo de ratos jovens. Os parâmetros de estresse oxidativo determinados foram o dano oxidativo lipídico através dos níveis de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBA-RS), o dano oxidativo proteico através do conteúdo de sulfidrilas e da formação de carbonilas, as defesas antioxidantes através dos níveis de glutationa total (tGS) e glutationa reduzida (GSH) e da atividade das enzimas antioxidantes glutationa-peroxidase (GPx), glutationa-redutase (GR), glicose-6-fosfato-desidrogenase (G6PD), superóxido-dismutase (SOD) e catalase (CAT), bem como a produção de espécies reativas através da formação de nitratos e nitritos (produtos do óxido nítrico, NO•) e da oxidação de 2,7-diclorofluoresceína diacetato (DCF-DA). Além disso, foram feitas análises imunohistoquímicas para avaliar alterações morfológicas, bem como avaliar marcadores de estresse oxidativo no cerebelo dos animais. Nossos resultados demonstraram que o Fit aumentou significativamente a formação de TBA-RS em cerebelo, indicando dano oxidativo lipídico. Além disso, verificamos que os níveis de GSH diminuíram e a produção de óxido nítrico aumentou, demonstrando que esse ácido graxo diminui as defesas antioxidantes e aumenta os níveis de espécies reativas de nitrogênio. Verificamos ainda que a administração prévia de L-NAME preveniu o aumento de TBA-RS e de óxido nítrico, bem como a diminuição de GSH causados pelo Fit em cerebelo. As análises imunohistoquímicas indicaram que o Fit causa astrogliose e dano oxidativo por espécies reativas de nitrogênio, além de demonstrarem que o L-NAME diminui a astrogliose e o dano oxidativo causados pelo Fit. Em resumo, concluímos que o Fit induz dano oxidativo, diminuição das defesas antioxidantes e astrogliose, provavelmente através do aumento das espécies reativas de nitrogênio. Assim, presumimos que as alterações no estado redox celular podem representar um mecanismo patológico que contribui, pelo menos em parte, para a patofisiologia da DR e de outras desordens em que esse ácido graxo se acumula. / The phytanic acid (Phyt) is a branched chain saturated fatty acid that accumulates in various peroxisomal diseases such as Zellweger syndrome (ZS) and particularly in Refsum disease (RD). These diseases may occur due to defects in peroxisome biogenesis or some peroxisomal protein involved in β or α-oxidation of fatty acids. Affected patients usually present neurological disorders, including cerebellar abnormalities. Whereas the pathogenesis of cerebellar changes in peroxisomal diseases where Phyt accumulates is still unknown, the present study aimed to investigate the ex vivo effects of an acute intracerebellar injection of Phyt on redox homeostasis and immunohistochemistry in cerebellum of young rats. The oxidative stress parameters determined were the lipid oxidative damage through the levels of thiobarbituric acid (TBA-RS), the protein oxidative damage through the sulfhydryl content and carbonyl formation, antioxidant defenses through the levels of total (tGS) and reduced glutathione (GSH) and activity of the antioxidant enzyme glutathione peroxidase (GPx), glutathione reductase (GR), glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD), superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT), and the production of reactive species by forming nitrates and nitrites (nitric oxide product, NO) and the oxidation of 2,7-dichlorofluorescein diacetate (DCF-DA). In addition, immunohistochemical analyzes were performed to assess morphological changes and to assess oxidative stress markers in the animals cerebellum. Our results showed that Phyt significantly increased TBA-RS formation in the cerebellum, indicating lipid oxidative damage. In addition, we found that GSH levels decreased and nitric oxide production increased, demonstrating that this fatty acid decreases the antioxidant defenses and increases the levels of reactive nitrogen species. We also found that the prior administration of L-NAME prevented the increase of TBARS and nitric oxide, as well as the decrease of GSH caused by Phyt in cerebellum. Immunohistochemical analyzes indicated that Phyt caused astrogliosis and oxidative damage by reactive nitrogen species, and showed that L-NAME decreased astrogliosis and oxidative damage caused by Phyt. In summary, we conclude that the Phyt induces oxidative damage, decreased antioxidant defenses and astrogliosis, probably by increasing reactive nitrogen species. Thus, we assume that changes in the cellular redox state can represent a pathological mechanism that contributes at least in part to the pathophysiology of RD and other disorders where this fatty acid accumulates.

Autism spectrum disorder (ASD) is classified as a neurovelopmental disorder, presenting impairments in social communication and sociability, as well as stereotyped behavioral patterns. Although the etiology remains unknown, there is growing evidence suggesting a complex interplay between genetic and environmental risk factors during the gestational period. Many alterations are related to ASD, as multisensory alterations and recent data were pointing out the misbalance between excitation and inhibition, with high predominance in excitation compound, in cortical areas related to sensory processing. The valproic acid (VPA) exposure is an environmental risk to ASD and VPA is commonly used by our group to induce autistic-like behaviors in rodents. We previously showed that a prenatal subchronic treatment of the pregnant rats with resveratrol (RSV) prevented the social deficits induced by VPA in male offspring rats. The present work evaluated the influence of RSV and VPA interaction in the nest seeking behavior in 10 days old male rats and in the relative genic expression levels of synaptic proteins (Sinaptophysin) in excitatory (PSD95) and inhibitory synapses (Gephyrin) in amygdala region of 30 days old rats. We identified impairments in the number of correct choices to the nest in VPA group, which were in accordance to the literature data. Nevertheless, we showed, for the first time, that resveratrol were able to prevent these impairments In RSV+VPA group. Besides, the present work showed important significant alterations at the genic expression level of synaptic proteins related to excitatory and inhibitory synapses in the amygdala region, an important brain structure related to attachment behavior and altered in ASD. Therefore, these data highlights resveratrol as an important molecule for prevention of autistic-like sensory behaviors in the animal model of autism induced by prenatal exposure to VPA, as well as an important tool for seeking etiological targets and physiopathology studies in TEA.

A síndrome hiperornitinemia-hiperamonemia-homocitrulinúria (HHH) é um erro inato do metabolismo do ciclo da ureia, de caráter autossômico recessivo e caracterizada por um defeito no transporte mitocondrial de ornitina (Orn), levando a um acúmulo citosólico desse aminoácido, além do acúmulo de homocitrulina (Hcit) e amônia. Os sinais e sintomas clínicos são variáveis, dentre eles podemos citar coagulopatia, coma, letargia, retardo mental, atrofia cortical e ataxia cerebelar. Embora os sintomas neurológicos sejam frequentes, a fisiopatogenia dessa doença ainda é desconhecida. Nesse trabalho investigamos os efeitos in vitro e ex vivo da Orn e Hcit sobre importantes parâmetros de homeostase redox e energética em cerebelo de ratos de 30 dias de vida. Além disso, também investigamos os efeitos desses metabólitos sobre alguns parâmetros em astrócitos cultivados de córtex cerebral. Primeiramente investigamos os efeitos in vitro da Orn e Hcit sobre importantes parâmetros de homeostase redox e energética em cerebelo de ratos jovens. Ambos metabólitos aumentaram significativamente os níveis de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBA-RS). Além disso, esses níveis foram totalmente prevenidos pela melatonina e pela glutationa reduzida (GSH). Observamos também que os níveis da produção de nitratos e nitritos não foi alterada por nenhum dos metabólitos utilizados, por outro lado, a Hcit aumentou a produção de peróxido de hidrogênio Ao investigarmos os níves de GSH observamos que tanto a Orn quanto a Hcit reduziram esse parâmetro e que a Orn reduziu o conteúdo de grupamentos sulfidrila, indicando uma dimunioção nas defeas antioxidantes não enzimáticas. Com relação ao metabolism energetic, a Orn e Hcit diminuíram a atividade da enzima aconitase, porém não alteraram outros parâmetros estudados. Além disso, a redução causada pela Orn foi prevenida pela GSH, indicando que essa enzima é suscetível a oxidação causada por exxe aminoácido. Também investigamos os efeitos ex vivo da injeção intracerebelar de Orn e Hcit sobre importantes parâmetros de estresse oxidativo e sobre a ativdade da Na+, K+ ATPase. A Orn aumentou significativamente os níveis de TBA-RS e atividade da superóxido dismutase, catalase, glutationa peroxidase, glutationa redutase e glucose 6-fosfato desidrogenase e diminuiu a ativdade da Na+,K+-ATPase. Por outro lado, as concentrações de GSH não foram alteradas pelo tratamento com ornitina. Por fim, a Hcit não foi capaz de alterar nenhum dos parâmetros avaliados. Os efeitos da Orn e Hcit foram também investigados em astrócitos cultivados a partir de córtex cerebral de ratos neonatos. Observamos que Orn e Hcit diminuíram a viabilidade celular, a função mitocondrial e os níveis de GSH, porém não alteraram a produção de citocinas. Nossos resultados demonstram um prejuízo moderado na homeostase energética, porém, quando observamos a homeostase redox, observamos um dano mais pronunciado. Dessa forma, concluímos que alterações na homeostase energética, mas principalmente na homeostase redox podem estar envolvidos na fisiopatogenia do dano neurológico observado nos pacientes com a síndrome HHH. / Hyperornithinemia-hyperammonemia-homocitrullinuria (HHH) syndrome is an autosomal recessive disorder of urea cycle characterized by a defect in the transport of ornithine (Orn) into mitochondrial matrix leading to accumulation of Orn, homocitrulline (Hcit) and ammonia. The clinical signs and symptoms are variable, ranging from coagulopathy, coma, lethargy, mental retardation, cortical atrophy and cerebellar ataxia. Although neurological symptoms are frequent, the pathophysyology of this disorder is poorly known. In the present study, we investigated the in vitro and ex vivo effects of Orn and Hcit on important parameters of redox and energy homeostasis in cerebellum of 30-day-old rats. Besides that, we also investigated the effects of these metabolites on some parameters in cultured cortical astrocytes. We first studied the in vitro effects of Orn and Hcit on important parameters of redox and energy homeostasis in cerebellum of young rats. Orn and Hcit significantly increased thiobarbituric acid reative species (TBA-RS) levels that was totally prevented by melatonin and reduced glutathione (GSH). We also found that nitrate and nitrite production was not altered by any of the metabolites, in contrast to hydrogen peroxide production, which was significantly enhanced by Hcit. These results suggest that probably reactive nitrogen species were not involved on the observed results Furthermore, GSH concentrations were significantly reduced by Orn and Hcit and sulfhydryl content by Orn, implying an impairment of antioxidant defenses. As regards to energy metabolism, Orn and Hcit provoked a significant reduction of aconitase activity, without altering other parameters of energy metabolism. Furthermore, Orn-elicited reduction of aconitase activity was totally prevented by GSH, indicating that critical groups of this enzyme were susceptible to oxidation caused by this amino acid. We also investigated the ex vivo effects of intracerebellar administration of Orn and Hcit on important parameters of oxidative stress and on Na+, K+ ATPase activity. Similarly with our in vitro results, Orn significantly increased TBA-RS levels and the activities of superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), glutathione peroxidase (GPx), glutathione reductase (GR) and glucose 6-phosphate dehydrogenase (G6PDH), and reduced Na+,K+-ATPase activity. In contrast, GSH concentrations were not changed by Orn treatment. Furthermore, intracerebellar administration of Hcit was not able to alter any of these parameters. The effects of Orn and Hcit were also investigated in cultured cortical astrocytes. We observed that Orn and Hcit diminished cellular viability, mitochondrial function, GSH levels, without altering cytokine production. Our results demonstrate a mild impairment in energy metabolism, but mostly in redox homeostasis in cerebellum and cortical cultured astrocytes. Therefore, we conclude that alterations of energy metabolism and especially redox homeostasis may be involved in the pathophysiology of the neurological damage observed in patients with HHH syndrome.

O núcleo medial (Me) é parte superficial do complexo amigdaliano e ainda muito pouco se conhece de seus constituintes celulares em seres humanos. Neste estudo desenvolveu-se uma adaptação do método de Golgi do tipo “single-section” para tecido nervoso humano fixado e conservado em formalina por tempo variável. Além disso, descreveu-se a densidade de neurônios e células da glia no Me, sua morfologia geral, incluindo detalhes de espinhos dendríticos e terminações axonais, a imunorreatividade à proteína ácida fibrilar glial (GFAP) e a ultraestrutura sináptica local. Como resultados demonstrou-se que as células da glia são maioria neste núcleo (cerca de 72% do total de células) e que há significativamente mais neurônios no Me do hemisfério esquerdo (1.53 X 105 neurônios/mm3). Os somas neuronais impregnados pelo método de Golgi demonstraram-se redondos/ovais, fusiformes ou poligonais (diâmetros entre 10-30 μm), os dendritos estenderam-se por distâncias variadas e contiveram espinhos pleomórficos, caracterizando neurônios com menos e mais espinhos dendríticos (densidades de 1,5 até 5,2 espinhos/μm), e os axônios revelaram terminações desde simples até muito complexas. Os neurônios multipolares foram classificados em Tipos 1, 2 ou 3 de acordo com trabalhos prévios, ou ainda em tipos morfológicos ainda não classificados Observaram-se astrócitos protoplasmáticos com muitos prolongamentos reativos à GFAP, isolados ou em grupos. Esses, no estudo ultra-estrutural, compuseram sinapses “tripartites” e “tetrapartites”, considerando-se o quarto elemento o da matriz extracelular situada entre os elementos pré- e pós-sinápticos. As sinapses axodendríticas apresentaram-se tanto assimétricas (com vesículas redondas pequenas e elétron-lúcidas) como simétricas (com vesículas pleomórficas pequenas e claras e, adicionalmente, com vesículas redondas grandes ou pequenas de centro escuro). Terminais axonais estabelecendo múltiplas sinapses assimétricas, classificados como de tipo “glomérulo”, também foram observados. A presente tese contribui com dados descritivos e quantitativos inéditos sobre a morfologia das células do Me, o que pode servir de base para o entendimento e novas investigações sobre o funcionamento desse núcleo em situações normais ou patológicas em seres humanos. / The medial nucleus (Me) is a superficial component of the amygdaloid complex. Little is currently known about its cellular composition in humans. Here is reported an adaptation of the “single-section” Golgi method for formalin fixed and stored human brain for diversified periods. Furthermore, the density of neurons and glial cells in the Me, their general morphology including dendritic spines and axonal terminals details, the glial fibrillary acidic protein (GFAP) immunoreactivity, and features of local cells under electron microscopy are described. Our results show that Me had an estimated mean neuronal density around 1.53 X 105 neurons/mm3 (higher in the left hemisphere), more glia (72% of all cells) than neurons, and a nonneuronal/neuronal ratio of 2.7. Golgi-impregnated neurons had cell bodies with a round/ovoid, fusiform or polygonal shape (diameters ranging from 10 to 30 μm), dendrites with varying lengths and pleomorphic spines that characterized neurons more or less spiny (density varying from1.5 to 5.2 spines/μm), and ranging from simple to very complexes terminal axons. Neurons appeared as “bitufted” or stellate multipolar cells, or classified in “Types 1 to 3” according to previous immunohistochemical observations, or other still unclassified morphologies. Protoplasmic astrocytes, either isolated or forming small clusters, were observed and showed multiple branches immunoreactive for GFAP, being equally distributed between right and left hemispheres They were found composing tripartite synapses or, together with an evident extracellular matrix between pre- and postsynaptic elements, tetrapartite ones. Axo-dendritic synapses were both asymmetrical (with various small, round electron-lucent vesicles) and symmetrical (with small pleomorphic vesicles and, occasionally, few intermingled large dense-core vesicles). Terminal axons with a glomerular-like structure were also found forming various asymmetric contacts. The present thesis add novel descriptive and qualitative information about neuronal and glial population of the human Me, which provide a basic contribution to our understanding, and to further research, of the functional implications of the Me in the brain organization both in normal and pathological conditions .

Made available in DSpace on 2015-12-06T23:46:03Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Associação Fundo de Incentivo à Psicofarmacologia (AFIP) / O condicionamento de medo e um dos modelos animais de memoria emocional mais utilizados atualmente para se estudar mecanismos subjacentes aos processos mnemonicos. Neste modelo um pareamento de um estimulo neutro com um estimulo aversivo torna o primeiro preditor do segundo e, por sua vez, adquire caracteristicas aversivas tambem. Muitas evidencias tem mostrado uma participacao critica da amigdala nesse modelo, mais especificamente, seus nucleos lateral, basal e central. Na versao contextual do condicionamento de medo, no qual o ambiente e o estimulo neutro inicial, tem-se mostrado tambem um envolvimento do hipocampo, que geralmente esta envolvimento com memoria espacial. Recentes evidencias sugerem que, nesta tarefa, hipocampo e amigdala interagem, influenciando processos de plasticidade sinaptica um do outro, influenciando a expressao de genes de expressao imediata. Neste estudo, nos injetamos o antagonista do receptor NMDA, AP5, no hipocampo dorsal de ratos wistar logo antes do condicionamento de medo ao contexto. Apos o condicionamento, metade dos animais foi testada 48 horas depois e metade foi submetida a um processo de perfusao e processamento imunohistoquimico para CREB e pCREB. Nossos resultados mostraram que o condicionamento de medo o contexto aumenta a taxa de pCREB de maneira especifica ao aprendizado associativo, e que o bloqueio de receptores NMDA do hipocampo por AP5 nao so diminui o comportamento de medo dos animais como tambem diminui a taxa de pCREB nos nucleos lateral, basal e central da amigdala. Nossos resultados sugerem que a atividade dos receptores NMDA hipocampais influencia a inducao de plasticidade sinaptica na amigdala apos o condicionamento de medo ao contexto / BV UNIFESP: Teses e dissertações

As acidúrias D-2-hidroxiglutárica (D-2-HGA) e L-2-hidroxiglutárica (L-2-HGA) são doenças neurometabólicas hereditárias causadas pelas deficiências das atividades da D-2-hidroxiglutarato desidrogenase (D-2-HGA do tipo I) ou isocitrato desidrogenase 2 (D-2-HGA do tipo II) e L-2-hidroxiglutarato desidrogenase (L-2-HGA). Os pacientes afetados por essas doenças desenvolvem principalmente sintomas e sinais neurológicos como convulsões, coma e atrofia cerebral. As lesões cerebrais ocorrem majoritariamente nos gânglios da base (D-2-HGA e L-2-HGA) e no cerebelo (L-2-HGA). Bioquimicamente, a D-2-HGA e a L-2-HGA são caracterizadas pelo acúmulo tecidual e elevada excreção urinária dos ácidos D-2-hidroxiglutárico (D-2-HG) e L-2-hidróxiglutárico (D-2-HG), respectivamente. Tendo em vista que a fisiopatologia da disfunção cerebral encontrada nestes pacientes ainda é pouco conhecida, o presente trabalho investigou os efeitos da administração intracerebral in vivo em ratos jovens dos ácidos D-2-HG e L-2-HG sobre parâmetros de estresse oxidativo e sobre a histopatologia das principais estruturas afetadas nos pacientes com D-2-HGA (estriado) ou L-2-HGA (estriado e cerebelo). Inicialmente, avaliamos o efeito dos ácidos D-2-HG e L-2-HG sobre os níveis de malondialdeído (MDA) e sobre a formação de carbonilas em estriado e cerebelo. Verificamos que ambos os ácidos orgânicos aumentaram significativamente os níveis de MDA (dano oxidativo lipídico) no estriado (D-2-HG e L-2-HG) e no cerebelo (L-2-HG). Por outro lado, apenas o D-2-HG foi capaz de aumentar a formação de carbonilas (dano oxidativo proteico) no estriado. Além disso, o D-2-HG diminuiu as concentrações de glutationa reduzida (GSH) e as atividades enzimáticas da glutationa peroxidase (GPx) e da superóxido dismutase (SOD), além de aumentar as concentrações de glutationa oxidada (GSSG) no estriado. Já o L-2-HG foi capaz de diminuir as concentrações de GSH e de gutationa total (tGS), bem como a atividade da GPx e da glutationa redutase (GR). Por fim, o L-2-HG aumentou as concentrações de GSSG no estriado e no cerebelo. Também investigamos o efeito da administração intracerebral in vivo do D-2-HG e do L-2-HG sobre a oxidação de diclorofluorosceína (DCFH), produção de peróxido de hidrogênio (H2O2) e sobre o conteúdo de nitratos e nitritos, com o objetivo de verificar quais as principais espécies reativas envolvidas nos danos induzidos por estes ácidos orgânicos. O D-2-HG aumentou os níveis de nitratos e nitritos, mas não foi capaz de alterar a oxidação de DCFH e a produção de H2O2, indicando o envolvimento de espécies reativas de nitrogênio (ERN) nesses efeitos. Já o L-2-HG aumentou a oxidação de DCFH e a produção de H2O2, não alterando o conteúdo de nitratos e nitritos. Tais resultados sugerem que o L-2-HG provavelmente induz as alterações observadas através do aumento na geração de espécies reativas de oxigênio (ERO). Também demonstramos que os antioxidantes melatonina, creatina, ácido ascórbico mais α-tocoferol (Vit C + E), N-acetilcisteína (NAC), maleato de dizocilpina (MK-801) e Nω-nitro-L-arginina metil éster (L-NAME) foram capazes de prevenir o dano oxidativo lipídico e a diminuição das defesas antioxidantes induzidos pelo D-2-HG e pelo L-2-HG. Melatonina, creatina e a solução de Vit C + E preveniram vários efeitos induzidos pelo L-2-HG, enquanto o MK-801 e o L-NAME foram capazes de prevenir apenas os efeitos induzidos pelo D-2-HG e o NAC não preveniu os efeitos induzidos pelos dois ácidos orgânicos. Observamos ainda que os ácidos 3-metilglutacônico (3-MGT; estruturalmente similar ao D-2-HG) e L-2-hidróxi-3-metilvalérico (L-HMV; estruturalmente similar ao L-2-HG), não foram capazes de alterar esses parâmetros, sugerindo uma ação seletiva para as atividades pro-oxidantes induzidas pelos D-2-HG e L-2-HG. Finalmente, estudos histológicos mostraram que o D-2-HG e L-2-HG são capazes de alterar a morfologia tecidual no estriado (D-2-HG e L-2-HG) e no cerebelo (L-2-HG). O D-2-HG causou vacuolização e infiltrado linfocítico e macrofágico no estriado. Já o L-2-HG, além de causar vacuolização e infiltrado linfocítico e macrofágico, também induziu necrose, formação de corpos granulares eosinofílicos e astrogliose (aumento da proteína ácida fibrilar glial). Também observamos em ratos injetados com L-2-HG perda da população neuronal (diminuição da imunodetecção da proteína neuronal nuclear específica) no estriado, enquanto que no cerebelo o L-2-HG induziu vacuolização e infiltrado linfocítico e macrofágico. Concluindo, este trabalho foi o primeiro a demonstrar efeitos in vivo do D-2-HG e do L-2-HG (administração intracerebral) sobre parâmetros de estresse oxidativo e alterações histopatológicas em cérebro de ratos jovens. Presumimos que o comprometimento da homeostase redox possa estar associado às alterações histopatológicas observadas, podendo contribuir pelo menos em parte, para a neuropatologia encontrada nos pacientes afetados pela D-2-HGA e pela L-2-HGA. / D-2-hydroxyglutaric aciduria (D-2-HGA) and L-2-Hydroxyglutaric aciduria (L-2-HGA) are inherited neurometabolic disorders caused by enzymatic defects in D-2-hydroxyglutarate dehydrogenase (D-2-HGA type I) or isocitrate dehydrogenase 2 (D-2-HGA type II) and L-2-hydroxyglutarate dehydrogenase (L-2-HGA), respectively. Patients affected by these disorders develop severe neurological damage, which leads to seizures, coma and cerebral atrophy. Brain lesions occur mainly in the basal ganglia (D-2-HGA and L-2-HGA) and in cerebellum (L-2-HGA) Biochemically, D-2-HGA and L-2-HGA are characterized by tissue accumulation and high urinary excretion of D-2-hydroxyglutaric acid (D-2-HG) and L-2-hydroxyglutaric acid (L-2-HG), respectively. Since the pathophysiology of the tissue damage in these diseases is still poorly unknown, the present study investigated the effects of in vivo intracerebral administration of D-2-HG and L-2-HG in adolescent rats on important parameters of oxidative stress and on the histopathology of the principal cerebral structures damaged in patients with D-2-HGA (striatum) and L-2-HGA (striatum and cerebellum). Initially, we investigated the effects of in vivo intracerebral administration of D-2-HG and L-2-HG on malondialdehyde (MDA) levels and carbonyl formation in striatum and cerebellum. We verified that both organic acids significantly elevated MDA levels (lipid oxidative damage) in striatum (D-2-HG and L-2-HG) and cerebellum (L-2-HG), whereas only D-2-HG was able to elevate carbonyl formation (protein oxidative damage) in striatum. Furthermore, D-2-HG and L-2-HG significantly diminished reduced glutathione (GSH) concentrations, glutathione peroxidase (GPx) and superoxide dismutase (SOD) activities, besides increasing oxidized glutathione (GSSG) concentrations in striatum. Otherwise, L-2-HG reduced GSH, total glutathione (tGS) concentrations and the activities of GPx and reductase glutathione (GR). Finally, L-2-HG augmented GSSG concentrations in striatum and cerebellum. In the next step of this work, we investigated the effects of in vivo intracerebral administration of D-2-HG and L-2-HG on 2’,7’-diclorofluorescein oxidation (DCFH), hydrogen peroxide production (H2O2) and nitrate and nitrite content in order to elucidate the main reactive species involved in the oxidative damage induced by these organic acids. D-2-HG elevated nitrate and nitrite content, whereas it did not change DCFH oxidation and H2O2 production, suggesting the involvement of reactive nitrogen species (RNS) in these effects. On the other hand, L-2-HG injection increased DCFH oxidation and H2O2 production, but did not change nitrate and nitrite content. These results suggest that L-2-HG-induced alterations occur by an elevated generation of reactive oxygen species (ROS). We also demonstrated that antioxidants such as melatonin, creatine, a mixture of ascorbic acid plus α-tocopherol (Vit C + E), N-acethylcysteine (NAC), dizocilpine maleate (MK-801) and Nω-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME) were able to prevent D-2-HG- and L-2-HG-induced lipid oxidative damage and the reduction of the antioxidant defenses induced by D-2-HG and L-2HG. Melatonin, creatine and Vit C + E prevented some of the effects induced by L-2-HG, whereas MK-801 and L-NAME were only able to prevent the D-2-HG-elicited effects and NAC did not prevent D-2-HG and L-2-HG-induced alterations. We also observed that 3-methylglutaconic (3-MGT, structurally similar to D-2-HG) and L-2-hydroxy-3-methylvaleric (L-HMV, structurally similar to L-2-HG) acids were not able to change these parameters, suggesting a selective effect on the pro-oxidant activities induced by D-2-HG- and L-2-HG. Finally, histological studies demonstrated that D-2-HG and L-2-HG were able to cause histopathological alterations in the striatum (D-2-HG and L-2-HG) and cerebellum (L-2-HG). D-2-HG provoked vacuolation, lymphocytic and macrophage infiltration in the striatum. Furthermore, L-2-HG induced vacuolation, lymphocytic and macrophage infiltration, necrosis, granular eosinophilic bodies, astrogliosis (glial fibrillary acidic protein (elevated glial fibrillary acidic protein immunostaining) and neuronal loss (decreased neuron-specific nuclear protein (NeuN) immunostaining) in striatum. On the other hand, L-2-HG provoked only vacuolation and lymphocytic and macrophage infiltration in the cerebellum. To the best of our knowledge this is the first report that demonstrates the influence of in vivo intracerebral administration of D-2-HG and L-2-HG on oxidative stress parameters and histopathological alterations in brain of adolescent rats. We presumed that the disturbance of cell redox homeostasis was probably associated with the histopathological abnormalities observed, that possibly contribute at least in part to the neuropathology of the brain injury of patients affected by D-2-HGA and L-2-HGA.

Altas concentrações de β-alanina podem causar desordens metabólicas e aumento na produção de espécies reativas, alterações na homeostasia redox e energética, bem como depleção dos níveis de taurina e excreção aumentada de GABA. Essas alterações levam a distúrbios no desenvolvimento neurológico, contribuindo para as manifestações clínicas. O quadro de acúmulo de β-alanina no plasma é conhecido como β-alaninemia. Neste trabalho, investigamos os efeitos crônico da sobrecarga de β-alanina em córtex cerebral e cerebelo de ratos Wistar. Os animais receberam administração intraperitoneal de β-alanina (300 mg/kg) ou solução salina (NaCl 0,85%) no mesmo volume (10μl/kg de peso corporal) duas vezes ao dia com intervalo de 12 horas, durante 14 dias. Os resultados mostram que altas concentrações plasmáticas de β-alanina alteram o equilíbrio redox celular, observado no aumento de oxidação do diclorofluorescina em córtex cerebral e cerebelo de ratos Wistar. Observamos o mesmo resultado na determinação da atividade das enzimas antioxidantes glutationa peroxidase e superóxido dismutase, onde houve uma inibição das atividades Os níveis de tióis totais foram mensurados pela técnica de sulfidrilas, onde verificamos que cada tecido apresentou níveis diferenciados, elevação em córtex cerebral e diminuição em cerebelo. Investigamos também as atividades das enzimas da rede de fosforiltransferência. A atividade da hexoquinase foi aumentada em ambos os tecidos, diferentemente da enzima gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase, que se elevou em córtex cerebral e se inibiu em cerebelo. A inibição de atividade enzimática foi observada também na piruvato-cinase e lactato desidrogenase. Os complexos II, II-III, IV e a succinato desidrogenase foram mensurados a fim de melhor esclarecer as alterações metabólicas identificadas. No entanto, observamos um aumento do complexo IV e succinato desidrogenase e uma inalteração do complexo II-III em ambos os tecidos. Portanto, nossos resultados sugerem uma suscetibilidade dos tecidos quanto à alta carga de β-alanina, apresentando distúrbios na homeostasia redox e energética. Sendo assim, os achados podem contribuir, em parte, com as alterações neurológicas encontradas em pacientes com β-alaninemia. / High concentrations of β-alanine may cause metabolic disorders and increase the production of reactive species in the region of redox and energetic homeostasis, as well as depletion of taurine levels and increased excretion of GABA. These changes lead to neurodevelopmental disorders, contributing to clinical manifestations. The accumulation of plasma β-alanine is known as β-alaninemia. In this work, we investigated the chronic effects of β-alanine overload in the cortex cerebral and cerebellum of Wistar rats. The animals were given intraperitoneal administration of β- alanine (300 mg/kg) or saline (0.85% NaCl) in the same volume (10 μl/kg body weight) twice a day at 12-hour intervals for 14 days. The results show that high plasma concentrations of β-alanine alters the cellular redox balance reflected by the increase of oxidation of dichlorofluorescine in cerebral cortex and cerebellum of Wistar rats. We observed the same result in the determination of the activity of the antioxidant enzymes glutathione peroxidase and superoxide dismutase, where there was an inhibition of the activities. The levels of total thiols were measured by the sulfhydryl determination technique, where we verified that each tissue presented differentiated levels, elevation in cerebral cortex and decrease in cerebellum. We also investigate the activities of phosphoryl transfer network enzymes. The activity of hexokinase was increased in both tissues, unlike the enzyme glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, which was elevated in the cerebral cortex and inhibited in the cerebellum. Inhibition of enzymatic activity was also observed in pyruvate kinase and lactate dehydrogenase. Activities complexes II, II-III, IV and succinate dehydrogenase were measured in order to better clarify the identified metabolic aberrations. However, we observed an increase of the activity complex IV and succinate dehydrogenase and an unchanged II-III complex in both tissues. Therefore, our results suggest a susceptibility of tissues to the high β-alanine load, presenting disorders in redox and energetic homeostasis. Thus, the findings may contribute, in part, to the neurological findings found in patients with β-alaninemia.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / A Hipóxia-isquemia (HI) perinatal é um problema de saúde pública, e ocorrem aproximadamente 1,5 casos de encefalopatias por HI por 1000 nascidos vivos. Dos que sobrevivem 25-60% sofrem de deficiências permanentes do desenvolvimento neurológico, incluindo paralisia cerebral, convulsões, retardo mental, e dificuldade de aprender. Neurônios e oligodendrócitos, especialmente os progenitores, são os mais afetados pela HI. Existem vários modelos de HI, no entanto, poucos levam em consideração as intercorrências maternas, a importância da atividade placentária, e as trocas entre mãe-filho, que são clinicamente observadas em humanos. Robinson estabeleceu um modelo de HI sistêmica pré-natal transitório, onde o fluxo das artérias uterinas da rata grávida era obstruído por 45 minutos no décimo oitavo dia (E18) de gestação. Neste modelo foram observadas alterações que são similares às observadas em cérebros humanos que passaram por hipóxia perinatal, dentre as quais foram relatados aumento no nível de apoptose. Caspase-3 é descrita como uma enzima que atua na apoptose, e é amplamente utilizada como marcador para células apoptóticas. Vários autores vêm mostrando, entretanto, que a enzima caspase-3 pode estar ativada para fins não apoptóticos. No modelo de HI sistêmica pré-natal, foram observados astrogliose na substância branca, morte de oligodendrócitos, lesão em axônios tanto na substância branca como no córtex cerebral, e danos motores. Pouco se sabe da influencia do insulto HI no desenvolvimento do cerebelo, considerando que o cerebelo junto com o córtex motor, contribui para o controle motor. O objetivo desse trabalho foi avaliar a distribuição da caspase-3 clivada durante o desenvolvimento do cerebelo em um modelo de HI pré-natal. Os resultados deste trabalho demonstram que as células caspase-3 clivadas apresentaram duas morfologias distintas em ambos os grupos. Uma onde a caspase-3 foi observada apenas no núcleo, oscilando entre células com imunorreatividade fraca a intensa, e de células com a presença da caspase-3 no corpo celular, nos prolongamentos condensados e presença de fragmentos ao redor do soma, morfologia típica de célula em apoptose. A HI pré-natal, assim como nos hemisférios cerebrais, levou ao aumento de células caspase-3 clivadas com morfologia de progenitores de oligodendrócitos no cerebelo do grupo HI em P2, mas não em P9 e P23. Também foi demonstrado que a HI pré-natal não levou a uma ativação da apoptose em oligodendrócitos, neurônios e microglia (identificados por seus respectivos marcadores, CNPase, NeuN e ED1) apresentando marcação no núcleos de células GFAP+, na substância branca, camada granular e nas células da glia de Bergmann, em P9 e P23 no cerebelo. Podemos concluir que a HI pré-natal aumentou o número de células imunorreativas para a caspase-3 em um período crítico do desenvolvimento da oligodendroglia no cerebelo, e que a diminuição de progenitores de oligodendrócitos no cerebelo decorrente do insulto pré-natal visto em trabalhos anteriores, pode estar relacionada a morte celular por apoptose, embora não se possa descartar a hipótese da participação dessas células que apresentam caspase-3 clivada em outros eventos não apoptóticos desencadeados pela hipóxia-isquemia. / Perinatal hypoxia ischemia (HI) is a public health problem: about 1.5 cases of encephalopathy occurred per 1000 newborn alive. Those who survive 25-60% suffered permanent deficiencies in neurological development, including cerebral palsy seizures, mental retardation and learning difficulties. Neurons and oligodendrocytes, especially the progenitors were the more affected in an HI insult. There are many HI models; however, few of them taken in account the maternal status, the placental activity and the transport of substances between mother and fetus that are clinically observed in humans. Robinson described a model of transitory prenatal systemic HI, in that uterine arteries were clamped for 45 minutes in the eighteenth gestational day (E18). In this model many impairments very similar to those observed in human brain that suffered HI were showed, between them the increase in apoptosis levels. Caspase-3 is related to apoptosis and is largely used as a marker for apoptotic cells. However, many authors have shown that caspase-3 activation may be related not only with apoptosis. In the prenatal systemic HI model were observed white matter astrogliosis, oligodendroglial death, axonal lesion both in white matter as in cerebral cortex as also motor deficits. Little is known about the effects of HI insult in developing cerebellum, which is a region that, together with motor cortex, participates in motor control. The aim of this work was to evaluate cleaved caspase-3 distribution during cerebellar development in a model of prenatal HI. Our results showed that cleaved caspase-3 positive cells showed two different pattern of distribution in both groups. One of them where the caspase-3 was observed only in the nucleus, presenting both low or intense immunoreactivity, and another one presenting the caspase-3 distributed in the cell bodies and in the condensed processes as also the presence of fragments around the soma, a typical morphology of apoptotic cell. Prenatal HI, as also in the cerebral hemispheres leads to an increase in the number of cleaved caspase-3 positive cells that showed oligodendroglial progenitor cell phenotype in the P2 cerebellum, but not in P9 or P23, in HI group. It was also showed that prenatal HI do not leads to Caspase-3 distribution in oligodendrocytes, neurons or microglia (identified by their respective markers, CNPase, NeuN and ED1) however is present in the nucleus of GFAP+ cells, in the white matter, granular layer and in Bergmann Glia at P9 an P23. We may conclude that prenatal HI increased the number of caspase-3 imunorreactive cells in a critical period for oligodendroglial differentiation in developing cerebellum, and that the oligodendroglial progenitors decrease previously showed in the cerebellum as consequence of HI insult may be related to apoptotic cell death, although we may not discard the hypothesis of caspase-3 immunoreactive cells may be related with non apoptotic events triggered by hypoxia-ischemia.

Made available in DSpace on 2016-01-13T13:27:48Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-05-22. Added 1 bitstream(s) on 2016-01-13T13:33:18Z : No. of bitstreams: 1 000855558.pdf: 2496353 bytes, checksum: afab1cef7d337a1187a0d63fa17d398d (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Introdução: O cerebelo é suscetível aos efeitos lesivos do etanol em exposições agudas ou crônicas, em diferentes idades, podendo ocasionar alterações motoras, de aprendizado, cognitivas e favorecer a morte celular apoptótica. Nosso objetivo foi avaliar a apoptose nos neurônios de Golgi, Purkinje e células granulares do cerebelo de ratos adultos da variedade UChA. Metodologia: Os ratos foram divididos em dois grupos experimentais (20 ratos por grupo): um grupo controle, composto de animais UChA abstinentes e o grupo experimental, formado por ratos UChA, consumidores voluntários de etanol a 10% (˂ 2g etanol/Kg peso corpóreo/dia). Dos 65 dias aos 120 dias de idade, os animais receberam solução de etanol a 10%. Aos 120 dias, os animais foram anestesiados e preparados para eutanásia. O cerebelo foi então analisado por microscopia eletrônica de transmissão (MET), imunoistoquímica para apoptose, caspase-3 (próapoptótica), XIAP (antiapoptótica) e IGF-1R nos neurônios de Golgi, Purkinje e granulares. Avaliou-se também por RT-PCR os genes reguladores da caspase-3, XIAP e IGF-1R no córtex cerebelar dos grupos estudados. Resultados: Os animais UChA mostraram acúmulo de gotas lipídicas, presença de núcleos eletrodensos nos neurônios granulares e de Purkinje, desorganização do corpo medular do cerebelo com alterações na bainha de mielina no córtex cerebelar. Identificou-se também aumento significativo na imunomarcação de caspase-3 e XIAP nos neurônios de Purkinje e granulares. A fragmentação do DNA foi significativa nas células de Purkinje. O IGF-1R não apresentou alterações. Não houve diferenças significativas na expressão dos genes de caspase-3, XIAP, e o IGF-1R. Conclusão: O etanol induz apoptose nas células de Purkinje e granulares do cerebelo de ratos adultos UChA / Introduction: The cerebellum is susceptible to the harmful effects of ethanol in acute or chronic exposures at different ages, which may cause motor, learning and cognitive disorders and promote apoptotic cell death (PCD) as well. Our objective was to evaluate apoptosis in Golgi and Purkinje neurons and in granular cell disease of the cerebellum of adult rats of the type UChA. Methodology: The rats were divided in two experimental groups (20 rats per group): a control group, consisting of abstinent UChA animals and the experimental group, formed by UChA rats, volunteers consumers of 10% ethanol (˂ 2g ethanol / kg weight body / day). From 65 day-age to the 120 day-age, the animals received 10% ethanol solution. After 120 days, the rats were anesthetized and prepared for euthanasia. The cerebellum was then analyzed by transmission electron microscopy (TEM), immunohistochemistry to apoptosis, caspase-3 (pro-apoptotic), XIAP (anti-apoptotic) and IGF-1R in Golgi, Purkinje neurons and granular as well. It was also evaluated by RT-PCR (Reverse transcription polymerase chain reaction) the regulatory genes caspase-3, XIAP and IGF-1R in the cerebellar cortex of groups. Results: The UChA animals showed accumulation of lipid droplets, presence of electron-nuclei in granule neurons and Purkinje, disorganization of the medullary body of the cerebellum with some changes in the myelin sheath of the cortex. It was also identified significant increase in the Immunostaining caspase-3 and XIAP in Purkinje neurons and granular. The DNA fragmentation was significant in Purkinje cells. The IGF-1R didn't have any change though. There were no significant differences in the formulation of caspase-3 genes, XIAP and IGF-1R. Conclusion: Ethanol induces apoptosis in granular and Purkinje cells of the cerebellum of adult UChA rats / FAPESP: 2011/50466-0