Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2016-06-07T10:17:56Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 6010143 bytes, checksum: 17ea0355849d60b92bc6d90854eac3ef (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-07T10:17:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 6010143 bytes, checksum: 17ea0355849d60b92bc6d90854eac3ef (MD5) Previous issue date: 2016-02-29 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / As leishmanioses compreendem um amplo espectro de doenças parasitárias causadas por protozoários do gênero Leishmania. No hospedeiro vertebrado estes parasitos infectam principalmente os macrófagos, onde conseguem escapar dos mecanismos de defesa e se proliferam. Muitos trabalhos relatam que a sinalização purinérgica é modulada durante o desenvolvimento e ativação das células do sistema imune. Para obterem sucesso na infecção, vários patógenos conseguem subverter a resposta imune através da modulação da sinalização purinérgica, promovendo uma diminuição dos níveis de ATP (molécula pró-inflamatória) e levando a um aumento dos níveis de adenosina (molécula imunossupressora). Este desfecho resulta da atividade conjunta de algumas ecto- nucleotidases, das E-NTPDases e da 5’-ecto-nucleotidase, tema que é abordado no segundo capítulo desta tese. Em Leishmania, as E-NTPDases são consideradas importantes porque participam da via de salvação de purinas, além de serem citadas em diversos artigos como responsáveis por aumento de virulência e infectividade em diferentes espécies. Em trabalhos desenvolvidos por nosso grupo de pesquisa, as E- NTPDases 1 e 2 de L. infantum foram caracterizadas em sistema bacteriano, demonstrando resultados promissores. A possibilidade de expressar essas proteínas em sistema de expressão Leishmania (Leishmania Expression System – LEXSY – Jena Bioscience) nos impulsionou a desenvolver o presente projeto, com o intuito de caracterizar essas enzimas em um organismo bem mais próximo ao original e avaliar o seu potencial uso como vacina viva. Portanto, a clonagem das Lic-E-NTPDases sistema LEXSY é o tema abordado no primeiro capítulo desta tese. / Leishmaniasis comprises a broad spectrum of parasitic diseases caused by protozoa of the genus Leishmania. In vertebrate host, these parasites mainly infect macrophages, where they can escape of defense mechanisms and proliferate. Several works have reported that the purinergic signaling is modulated during development and activation of immune cells. To achieve successful infection, many pathogens can subvert the immune response through modulation of purinergic signaling by promoting a reduction in ATP levels (pro- inflammatory molecule) and leading to increased adenosine levels (immunosuppressive molecule). This outcome results from the joint activity of some ecto-nucleotidases, the E- NTPDase and 5'-ecto-nucleotidase, a topic that is discussed in the second chapter of this thesis. In Leishmania, the E-NTPDases are considered important because they participate in purine salvage pathway, and are cited in various articles to be responsible for increased infectivity and virulence in different species. In work carried out by our research group, the E-NTPDase 1 and 2 of L. infantum were characterized in bacterial system, demonstrating promising results. The ability to express these proteins in Leishmania expression system (Leishmania Expression System - LEXSY - Jena Bioscience) prompted us to develop this project, in order to characterize these enzymes in an organism similar to the original and evaluate its potential use as a live vaccine. Therefore, the cloning of Lic-E-NTPDases in LEXSY system is the subject discussed in the first chapter of this thesis.

Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2012-06-25T20:55:47Z No. of bitstreams: 1 Cristiane Garboggini Pinheiro Avaliação da resposta imune em camnundongos....pdf: 3469982 bytes, checksum: 4041d40a1d0e55867e25c7be92f3dd02 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-06-25T20:55:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Cristiane Garboggini Pinheiro Avaliação da resposta imune em camnundongos....pdf: 3469982 bytes, checksum: 4041d40a1d0e55867e25c7be92f3dd02 (MD5) Previous issue date: 2011 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz. Salvador, Bahia, Brasil / A leishmaniose visceral é uma doença parasitária causada por Leishmania chagasi. Os cães são considerados como principais reservatórios do parasito. Uma vacina efetiva para o cão pode contribuir para o controle da LV tanto no homem como no cão. Em um estudo prévio, antígenos recombinantes, obtidos a partir de uma biblioteca de cDNA da forma amastigota de Leishmania chagasi, foram selecionados a fim de serem avaliados como candidatos a componente de uma vacina contra leishmaniose visceral canina. No presente trabalho, a resposta imune humoral e celular de camundongos foi avaliada após injeção de alguns desses antígenos recombinantes, em cinco diferentes protocolos de imunização. Grupos de camundongos BALB/c foram injetados com as proteínas rLci4A-NH6 ou rLci2B-NH6, isoladamente ou associadas aos adjuvantes saponina, ODN 1826 ou diferentes doses de um plasmídeo codificando IL-12 murina. Além disso, animais foram sensibilizados com plasmídeo codificando Lci2B e receberam reforço com a proteína rLci2B-NH6 associada à saponina. Por último, os animais foram injetados com plasmídeos codificando novos antígenos, Lci2-NT-5R-CT ou Lci2-NT-CT, e recebram reforço com as respectivas proteínas recombinantes rLci2-NT-5R-CT-NH6 ou rLci2-NT-CT-NH6 associadas à saponina. Nesse último protocolo, os plasmídeos utilizados continham o gene para uma proteína transmembrana associada a lisossomos, LAMP, visando à produção in vivo de quimeras de dos antígenos de Leishmania com LAMP, a fim de direcionar a apresentação dos peptídeos para linfócitos T CD4+ via moléculas de MHC-II. Em um dos protocolos, os animais foram desafiados com 1 x 107 Leishmanias para avaliação da carga parasitária no baço após imunização. Os resultados encontrados mostraram que animais que receberam rLci4A-NH6, isoladamente ou com diferentes doses de plasmídeo codificando IL-12, apresentaram níveis signficantes de IgG e IgG1, ao passo que o uso do antígeno com os adjuvantes saponina ou ODN 1826 induziu a produção de IgG, IgG2a e IgG1, além de produção de IL-5 pelo grupo que recebeu saponina. Animais que receberam rLci2B-NH6, isoladamente ou associado aos plasmídeos contendo inserto de IL-12, produziram IgG e IgG1 antígeno específicos e falharam também na produção de citocinas e proliferação celular. A utilização de saponina com esse antígeno induziu produção de IgG, IgG2a e IgG1, assim como de IFN-γ. Já o uso de ODN 1826, induziu a produção de IgG e IgG1, favoreceu a produção de IgG2a, mas falhou na indução de resposta imune celular significante. Por outro lado, animais que receberam plasmídeo codificando Lci2B e reforço com a proteína associada à saponina apresentaram uma resposta imune com predominância de anticorpos IgG2a e produção de IFN-γ por alguns animais, a qual não conferiu proteção contra infecção pelo parasito. Por fim, a utilização de quimeras de LAMP/Lci2-NT-5R-CT ou LAMP/Lci2-5R-CT induziu uma fraca resposta imune humoral, com produção de IgG, IgG1 e IgG2a por alguns animais. No entanto, a utilização da quimera LAMP/Lci2-NT-CT induziu proliferação celular e tendência a produção de IFN-γ. Em conclusão, nenhum dos cinco protocolos utilizados foi capaz de induzir uma resposta imune específica predominantemente celular do tipo Th1 ou capaz de conferir proteção contra infecção dos animais. / Visceral leishmaniasis is a disease caused by Leishmania chagasi. Dogs are the main reservoir of the parasite. A canine vaccine may contribute to the desease control in humans and dogs. In a previous study, recombinant antigens were selected from a cDNA library of Leishmania chagasi amastigotes in order to be evaluated as components of a vaccine against canine visceral leishmaniasis. In this study, five immunization protocols were assessed in mice with some of these antigens. BALB/c mice were injected with either rLci4A-NH6 or rLci2B-NH6 proteins, associated or not with the adjuvants saponin, ODN 1826 and different doses of a plasmid encoding murine IL-12 (pIL-12). Moreover, animals were primed with a plasmid encoding Lci2B (pLci2B) and boosted with rLci2B combined with saponin. Finally, all mice were primed with new antigens, Lci2-NT-5R-CT or Lci2-NT-CT, and they were boosted with the following recombinant proteins rLci2-NT-5R-CT-NH6 or rLci2-NT-CTNH6 associated with saponin. In this late experiment, the used plasmids had an insert of a lisossome associated membrane protein, LAMP, to produce in vivo chimeras composed of LAMP with the antigens and to direct the presentation of the peptides to CD4+ T cell through MHC-II molecules. The humoral immune response was assessed by antibodies production (IgG, IgG1 and IgG2a) in animal serum samples and the cellular immune response by cellular proliferation and cytokine production (IFN-γ and IL-5). The results showed that animals that were injected with rLci4A-NH6 alone or combined with pIL-12 generated IgG and IgG1 specific antibodies, while others that received saponin and ODN 1826 as adjuvants produced IgG, IgG2a and IgG1. Furthermore, IL-5 was detected in rLci4A-NH6/saponin group, but only in one of two experiments. Animals that were injected with rLci2B-NH6, alone or associated with pIL-12, presented IgG and IgG1 antibodies but no cellular immune response. The saponin used as adjuvant induced IgG, IgG2a and IgG1 antibodies, as well as IFN-γ. The use of ODN 1826 induced IgG and IgG1, and favored IgG2a production, but failed in inducing IFN-γ. On the other hand, animals that were primed with pLci2B and boosted with the protein associated with saponin produced IgG IgG1 and more intensively IgG2a, and only some animals produced IFN-γ. Nevertheless, such immune response did not protect the animals against the parasite infection. At last, LAMP/Lci2-NT-5R-CT or LAMP/Lci2-5R-CT chimeras induced a weak humoral immune response, in which IgG, IgG1 and IgG2a antibodies were detected in only a few animals. However, mice that were injected with LAMP/Lci2-NT-CT presented cellular proliferation and some animals produced IFN-γ. In conclusion, in spite of the fact that the antigens are immunogenic in a murine model, none of the used protocols elicited an intense Th1 cellular immune response or a protective one.

Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto. / Submitted by Oliveira Flávia (flavia@sisbin.ufop.br) on 2014-08-28T15:20:52Z No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO_AnáliseImunogenicidadeEficácia.pdf: 1364971 bytes, checksum: a989e5ba2831ca2c1404a7c4ee79ac51 (MD5) / Approved for entry into archive by Gracilene Carvalho (gracilene@sisbin.ufop.br) on 2014-08-29T16:32:22Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO_AnáliseImunogenicidadeEficácia.pdf: 1364971 bytes, checksum: a989e5ba2831ca2c1404a7c4ee79ac51 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-08-29T16:32:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO_AnáliseImunogenicidadeEficácia.pdf: 1364971 bytes, checksum: a989e5ba2831ca2c1404a7c4ee79ac51 (MD5) Previous issue date: 2013 / É consenso que a estratégia mais racional para o controle da leishmaniose visceral, que tem como agente etiológico a Leishmania chagasi (sinonímia L. infantum), seria o emprego de uma vacina que proteja o cão impedindo o seu papel de reservatório doméstico do parasito. Assim, considerando o camundongo como modelo experimental amplamente utilizado em ensaios pré-clínicos vacinais anti-Leishmania, é de extrema importância analisar, neste modelo, candidatos vacinais de forma pareada e simultânea. Neste sentido, este projeto avaliou um ensaio pré-clínico vacinal, para análise comparativa de aspectos relacionados a imunogenicidade e eficácia dos candidatos vacinais contra leishmaniose visceral, entre os quais: Leish-Tec® (LT), Leishmune® (LM) e vacina LBSap (composta de antígeno bruto de L. braziliensis e saponina). Dessa forma, camundongos BALB/c foram imunizados com três doses de cada vacina e, após trinta dias da última dose vacinal, os animais foram desafiados experimentalmente com promastigotas de L. chagasi. Trinta dias após o desafio, os animais foram submetidos a eutanásia. Nos tempos antes da 1° dose vacinal (T0), 14 dias após a 3° dose (T1) e antes da eutanásia (T2), amostras de sangue foram coletadas do plexo orbital para realização do leucograma e avaliação do perfil imunofenotípico, ex vivo, de leucócitos circulantes. O baço e o fígado foram coletados no tempo T2 para avaliação da carga parasitária pela técnica de PCR em tempo real. Os resultados obtidos indicam que todas as vacinas são incócuas e seguras para a administração. Dentre as principais alterações relacionadas ao estabelecimento de mecanismos imunoprotetores destaca-se o aumento dos níveis de células NK CD3-CD49b+ observado em T2 para os diferentes grupos vacinais (LT, LM, LBSap). Além disto, ao se avaliar a imunidade adaptativa, foi observado no grupo LT aumento de linfócitos T totais CD3+ em T2, que pode ser associado ao aumento da subpopulação de linfócitos T CD3+CD4+ no mesmo período. De forma interessante, a imunização com vacina LBSap induziu aumento da população de linfócitos T totais CD3+ tanto após o protocolo vacinal (T1) como após o desafio experimental (T2). Este aumento relatado no grupo LBSap parece ser reflexo da expansão da população de linfócitos T CD4+ nos mesmos tempos (T1 e T2). Semelhantemente, o grupo LM apresentou este mesmo perfil de reposta imune com aumento de linfócitos T CD4+ tanto em T1 como em T2. Este perfil imunofenotípico parece ter favorecido o controle do parasitismo tecidual tanto no baço como no fígado para as diferentes vacinas avaliadas. Neste contexto, foi observada redução da carga parasitária esplênica de 36% (LT), 63% (LM) e 42% (LBSap). Além disto, a análise da carga parasitária hepática revelou redução do parasitismo de 48% (LT), 71% (LM) e 62% (LBSap). Estes resultados parecem indicar o estabelecimento de mecanismos imunoprotetores pelos diferentes imunobiológicos avaliados, compatível com a redução da carga parasitária no baço e figado de camundongos imunizados com as vacinas LT, LM e LBSap. Buscando ampliar a identificação de biomarcadores associados a indução de imunoproteção, será realizada como perspectiva a dosagem de imunoglobulinas anti-Leishmania (IgG, IgG1, IgG2a e IgG2b), bem como a análise do perfil de citocinas. ___________________________________________________________________________ / ABSTRACT: The most rational strategy to control visceral leishmaniasis, that presented Leishmania chagasi (syn. L. infantum) as etiological agent, would be the vaccine for protecting the dog and blocking the domestic parasite reservoir status. Thus, considering the experimental mouse model is widely used in anti-Leishmania vaccine pre-clinical trials, it is extremely important to analyze, in this model, vaccine candidates in a simultaneous approach. In this sense, a vaccine pre-clinical trial was performed, including analysis of immunogenicity and protection levels, in different groups, as follows: Leish-Tec®, Leishmune® and LBSap (composed by L. braziliensis antigens plus saponin). Thus, BALB/c mice were inoculated with three doses of each vaccine and challenged with L. chagasi. Thirty days post-challenge all animals were submitted to euthanasia. At the time points before the first dose (T0), after third dose (T1; 14 days after the last dose) and 30 days after L. chagasi challenge (T2) the blood was collected in order to evaluate the hemogram and ex vivo immunophenotyping in whole blood leukocytes. The spleen and liver were collected at T2 for analyzing parasite load quantified by real time PCR. Results displayed that all vaccines are safe and innocuous to the administration in mice. Among the major changes related to the establishment of imunoprotetor mechanisms NK cells (CD3-CD49b+) presented increased levels at T2 in the different vaccine groups (LT, LM, LBSap). Furthermore, the induction of adaptive immunity was observed in LT group showing higher CD3+ T-lymphocytes at T2, which can be associated with CD3+CD4+ T-subset at same time. Interestingly, LBSap immunizations induced higher CD3+ T-lymphocytes in both after vaccine protocol (T1) and experimental challenge (T2). This data would be associated in LBSap group to increased levels in the CD3+CD4+ T-subsets at the same time (T1 and T2). Similarly, LM group presented the same immune profile, displaying increased levels in CD3+CD4+ T-lymphocytes in both T1 and T2. This immunophenotypic profile seems to act in the spleen and liver parasitism control considering the different evaluated vaccines. In this context, the reduction in the spleen parasite load was 36% (LT), 63% (LM) and 42% (LBSap). Moreover, analysis in the liver parasite load demonstrated reduction of 48% (LT), 71% (LM) and 62% (LBSap). These results suggest the establishment of immunoprotection mechanisms in the different evaluated vaccines as related by control in the spleen and liver parasite burden considering LT, LM and LBSap immunized mice. Aiming to further analyze the additional biomarkers associated with immunoprotection, analyzes of anti-Leishmania immunoglobulins (IgG, IgG1, IgG2a and IgG2b) and the cytokine profile will be performed as perspective.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:31:11Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-02-18Bitstream added on 2014-06-13T21:02:22Z : No. of bitstreams: 1 garcia_fai_dr_jabo.pdf: 798787 bytes, checksum: cc4872fa6b42f7f6ec29fb841ea304bd (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / O presente estudo teve como objetivos comparar a resposta da imunoglobulina G e de suas subclasses nos seguintes grupos de animais; cães hígidos (n=45), animais sintomáticos naturalmente infectados por Leishmania sp. (n=45), animais assintomáticos naturalmente infectados por Leishmania sp. (n=45), cães portadores de leishmaniose visceral submetidos à tratamento (n=27) e animais hígidos submetidos à vacinação contra a doença (n=37). Inicialmente foram avaliadas IgG1 e IgG2 utilizando anticorpos policlonais e posteriormente as quatro subclasses de IgG (IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4) com anticorpos monoclonais na tentativa de identificar um perfil de resposta para cada grupo de cães. As determinações sorológicas foram realizadas por meio da técnica de ELISA. A avaliação das subclasses de IgG com anticorpos policlonais não permitiu diferenciar os grupos de cães estudados. Por outro lado, com os anticorpos monoclonais observou-se que o grupo sintomático apresentou estimulação de todas as subclasses de IgG enquanto nos animais assintomáticos apenas a fração IgG1 foi estimulada. Nos cães submetidos a tratamento todas as frações encontravam-se elevadas e nos vacinados ocorreu estimulação de IgG1, IgG3 e IgG4. Desta forma, a avaliação das quatro subclasses permitiu a diferenciação entre animais portadores de leishmaniose visceral com e sem quadro clínico; entre cães vacinados e cães assintomáticos acometidos pela doença; e entre cães com leishmaniose visceral submetidos a tratamento e cães infectados assintomáticos. / The present study aimed to compare immunoglobulin G subclasses in the following groups of animals: healthy dogs (n=45); symptomatic Leishmania sp. naturally infected dogs (n=45); asymptomatic Leishmania sp. naturally infected dogs (n=45); dogs with visceral leishmaniasis submitted to treatment (n=27) and healthy dogs vaccinated for visceral leishmaniasis (n=37). First of all IgG1 and IgG2 were evaluated using polyclonals antibodies, and later the four subclasses of IgG (IgG1, IgG2, IgG3 and IgG4) were evaluated with monoclonals antibodies, in order to identify a profile of reply for each group of dogs. Serological tests were carried out using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). The evaluation of the subclasses with polyclonals antibodies did not allow to differentiate the groups of studied dogs. On the other hand, with monoclonals antibodies it was possible to verify that symptomatic dogs presented stimulation of all subclasses of IgG, while in asymptomatic animals only IgG1 was stimulated. In dogs submitted to treatment all fractions increased, and in vaccinated ones occurred stimulation of IgG1, IgG3 and IgG4. In such a way, the evaluation of the four subclasses allowed the differentiation between symptomatic and asymptomatic infected dogs; between vaccinated dogs and asymptomatic infected dogs; and between infected dogs submitted to treatment and asymptomatic infected dogs.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:59Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-06-05Bitstream added on 2014-06-13T20:36:42Z : No. of bitstreams: 1 jacintho_app_me_jabo.pdf: 1171496 bytes, checksum: ca4de86d788a08d2a03efb6f93a4a52b (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Os cães infectados pelo protozoário Leishmania (Leishmania) chagasi podem ou não apresentar sinais clínicos dessa zoonose e são a principal fonte de infecção para o homem. A pele é o primeiro órgão infectado pelo parasito na LVC. As enzimas metaloproteinases da matriz (MMPs) atuam na degradação da matriz extracelular (MEC) e na modulação da resposta inflamatória, frente a vários tipos de injúrias. O objetivo deste estudo foi avaliar a expressão de MMP-2 e MMP-9, por meio da técnica de imuno-histoquímica e zimografia na pele de cães naturalmente acometidos por LVC e comparar estes resultados com a imunodetecção das citocinas TNF- e TGF- e do protozoário Leishmania, com as possíveis alterações da matriz extracelular dermal. A alteração da composição de fibras colágenas da derme foi avaliada pela coloração PicroSirius. O método foi usado para diferenciar fibras colágenas dos tipos I e III, nas regiões do focinho, orelha e abdômen. A carga parasitária, intensidade de inflamação e a produção de MMP 2 e 9 foram maiores nas regiões cutâneas da orelha e focinho. Os macrófagos, linfócitos e plasmócitos predominaram no infiltrado inflamatório da derme superficial, formando granulomas, associados a degradação do colágeno maduro (tipo I) e a discreta deposição de colágeno jovem (tipo III), com maior intensidade nos cães com elevada carga parasitária cutânea. O TGF-β foi detectado nos três grupos de cães infectados (assintomático, oligossintomático e sintomático), sem diferenças significativas entre eles. O TNF-α não foi detectado na maioria dos animais infectados e no grupo controle. Conclui-se que quanto maior a carga parasitária e a intensidade de inflamação na pele, maior a degradação do colágeno maduro, produção de MMPs 2 e 9 e produção de TGF-β. A MMP-9 ativa poderia ser utilizada... / Dogs infected by Leishmania (Leishmania) chagasi may or may not show clinical signs of the zoonosis and they are the main source of infection for man. The skin is the first organ infected by the parasite in the LVC. The enzyme matrix metalloproteinases (MMPs) act on the degradation of extracellular matrix (ECM) and in the inflammatory response modulation against many kinds of injuries. The aim of this study was to evaluate the expression of MMP-2 and MMP-9 by immuno-histochemistry and zymography in the skin of dogs naturally affected by LVC and the immunodetection of TNF- and TGF- and of Leishmania and compare these results with the possible alterations of dermal extracellular matrix. The method was used to differentiate collagen fibers in the dermis was evaluated by Picrosirius red staining to differentiate collagen types I and III, in regions of the nose, ear and abdomen. The parasite load, intensity of inflammation, increased production of MMP 2 and 9 were higher in regions of the ear and muzzle. Macrophages, lymphocytes and plasma cells predominated in the inflammatory infiltrate of the superficial dermis, forming granulomas, associated with degradation of mature collagen (type I) and the discrete deposition of the young collagen (type III), with greater intensity in dogs with high parasite load skin. The TGF-β was detected in all groups of infected dogs (asymptomatic, oligosymptomatic and symptomatic), no significant differences among them. The TNF-α was not detected in most infected animals and the control group. It follows that the greater is the intensity of parasitic load and inflammation of the skin, the greater is the degradation of mature collagen, the production of MMPs and 2 and 9, production of TGF-β. Active MMP-9 could be used as a marker of inflammation in infected dogs. This profile of the... (Complete abstract click electronic access below)

Submitted by Amanda Silva (amanda.osilva2@ufpe.br) on 2015-03-12T14:41:00Z No. of bitstreams: 2 DISSERTAÇÃO Carina Helena da Silva.pdf: 1754766 bytes, checksum: 65f8ac225735636a23fd7d8a68633a7a (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-12T14:41:00Z (GMT). No. of bitstreams: 2 DISSERTAÇÃO Carina Helena da Silva.pdf: 1754766 bytes, checksum: 65f8ac225735636a23fd7d8a68633a7a (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2014-02-25 / CAPES / As leishmanioses são doenças endêmicas que constituem sérios problemas de saúde pública podendo levar a uma extensa mortalidade e morbidade. São classificadas em leishmanioses tegumentar (LT), e visceral (LV),provocadas por protozoários do gênero Leishmania e no Brasil as principais espécies envolvidas em sua propagação são a Leishmania amazonensis e a Leishmania chagasi para LT e LV respectivamente. Antimoniais pentavalentes são as drogas de primeira escolha, no entanto a recidiva devido à resistência dos parasitas, e os efeitos colaterais, ocasionadospela elevada toxicidade destes medicamentos tem revelado a necessidade da busca pelo tratamento adequado das leishmanioses. Cramoll 1,4, uma lectina extraída das sementes de Cratylia mollis, uma planta forrageira da família das Leguminoseae encontrada no sertão do Nordeste brasileiro, em estudos anteriores tem demonstrado o seu perfil biotecnológico, como propriedades antimicrobiana, antitumoral e antiparasitária. Diante das importantes aplicações biológicas de Cramoll 1,4 a presente pesquisa teve por objetivo analisar os mecanismos de ação desta lectina sobre L. amazonensis e L.chagasi. Os seguintes testes foram realizados: Atividade leishmanicida, análise da citotoxidade, produção de Óxido Nítrico e análise em microscopia eletrônica de transmissão. A atividade leishmanicidada de Cramoll 1,4 foi determinada através da IC50, que revelou a grande efetividade da lectina para as formas promastigotas das duas espécies de Leishmania. Cramoll 1,4 não apresentou citotoxidade frente às células de mamíferos, possuindo alto grau de seletividade para os promastigotas. A lectina induziu a síntese de Óxido Nítrico (molécula importantíssima para a resposta imunológica às infecções causadas por Leishmanias) por macrófagos, mostrando seu perfil imunomodulatório. A análise por microscopia eletrônica de transmissão revelou alterações severas causadas nos parasitas após tratamentos com Cramoll 1,4, como mudanças na morfologia, surgimento de vacúolos e desintegração das membranas celular e nuclear. Estas alterações são compatíveis com a perda de viabilidade e morte celular. Nossos resultados sugerem a Lectina Cramoll 1,4 como agente promissor no desenvolvimento de novo fármaco para o tratamento das leishmanioses visceral e tegumentar.

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:54:26Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo5232_1.pdf: 6314022 bytes, checksum: 6d483dcd851885e89a9ca20a1e572b4a (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2006 / Neste trabalho foram desenvolvidos e otimizados métodos diagnósticos para dois agentes patogênicos com uma alta incidência no Brasil e cujos diagnósticos se baseiam principalmente em métodos invasivos como são o Helicobacter pylori e Leishmania chagasi (L. chagasi). A bactéria gram (-) Helicobacter pylori e a principal causa de ulcera péptica e gastrite maligna no mundo. Seu diagnostico e realizado preferencialmente por meio de endoscopia e biopsia de tecido gástrico. A bactéria e eliminada pelas fezes o que permitiria um diagnostico não invasivo e de controle de cura se implementar PCR de amostras de pacientes antes e durante o tratamento de doença. Não entanto as fezes possuem uma serie de inibidores o que tem dificultado o desenvolvimento de métodos de PCR para seu diagnostico. Aqui comparamos métodos de obtenção de DNA de fezes baseados em fervura das amostras descritos anteriormente por Holland (2000), com método de Lise Alcalina , modificado com o uso de Triton X-100 melhorando a obtenção de DNA eliminando a presencia de inibidores. Posteriormente DNAs provenientes de amostras de fezes de 10 pacientes foram utilizados em reações de PCR com alvos específicos descritos anteriormente para Helicobacter pylori (urec, RNAr e vac); 5 das amostras amplificaram de maneira especifica concordando com o diagnostico Giemsa (+) de biopsia de tecido gástrico de pacientes com dispepsia. L. chagasi, protozoário responsável de causar a leishmanioses visceral, no Brasil apresenta uma alta incidência e ampla distribuição, com formas graves e letais quando associada a quadros de ma nutrição e infecções concomitantes. O diagnostico e realizado principalmente por punção aspirativa de baço, fígado, medula óssea ou linfonodos permitindo a visualização do parasita no material. No presente trabalho desenvolvemos PCR simples usando diferentes DNAs parasitários de tripanosomatideos e oligonucleotideos PIA 3 e DEB 8 específicos para L. chagasi.. Os dois pares de oligonucleotideos resultaram serem específicos para L.chagasi, sendo a sensibilidade de 10 pg para PIA3 e de 1 pg para DEB8. Com o objetivo de diferenciar o diagnostico de Leishmaniose visceral e Leishmanioses tegumentar foi desenvolvida PCR múltipla utilizando alvos específicos para leishmania subgênero Viannia, denominados LV1 junto com os alvos específicos para L. chagasi . Os 4 oligonucleotideos não competeram entre sim na reação e mantiveram a especificidade e sensibilidade das PCR simples. Posteriormente um analise de bioinformática dos bancos de dados dos genes de Tripanosomatideos do portal GeneDB do Sanger Centre foi realizado na procura de um gene órfão de L. infantum para ser usado no diagnostico de L chagasi. 7.078 proteinas hipotéticas de L. infantum, foram comparados com 11.812 de T cruzi, 7557 de T brucei e 5.364 de L major. Através das ferramentas omni blast e Protogim, conseguimos seleccionar 93 proteinas hipotéticas de L infantum. Por critérios de tamanho, localização celular e outros, 5 putativos alvos foram escolhidos para serem testados in vitro. O gene Linj 20074, resultou ser altamente especifico e com sensibilidade de 1pg. Genes órfãos se apresentam como promissores alternativas para diagnostico ou alvo quimioterapicos em doenças parasitarias

As espécies do gênero Leishmania parasitam mamíferos do Novo e Velho Mundo e possuem ciclos de vida com alternância entre vertebrados e invertebrados. A maioria das espécies se desenvolve em artrópodes hematófagos, que podem pertencer a diversas ordens e famílias. A Leishmaniose visceral é uma importante zoonose e possui canídeos silvestres e domésticos como importantes reservatórios conhecidos na diversidade genética de Leishmania infantum chagasi no Brasil ainda não é conhecida. Leishmaniose é uma doença severa com ampla distribuição geográfica com uma incidência de dois milhões de casos por ano e 350 milhões de pessoas em áreas de risco de infecção. O objetivo deste projeto foi avaliar a variação intraespecífica e biogeografia de isolados brasileiros de Leishmania infatum chagasi baseados em genes nucleares e mitocondriais. Os marcadores SSUrDNA, gGAPDH, Citocromo b, Hsp 70, Quitinase e ITS1rDNA foram amplificados, sequenciados e comparados filogeneticamente pelos métodos de parcimônia e bayesiana através de análises concatenadas. As sequencias obtidas apresentaram variabilidade entre 0 e 1% e a topologia gerada não evidenciou diferenças intraespecíficas entre os isolados brasileiros de Leishmania infantum chagasi e consequentemente padrões biogeográficos. Apesar dos resultados obtidos não refletirem a variabilidade esperada, as diversas sequencias obtidas darão subsídios para a determinação e padronização de novos testes diagnósticos da Leishmaniose visceral canina. / The Leishmania species parasite mammals in the New World and have life cycles with alternating between vertebrates and invertebrates. Most species develops in blood-sucking arthropods, which may belong to different orders and families. Visceral leishmaniasis is an important zoonosis and has wild and domestic canids as important known reservoirs and genetic diversity of Leishmania infantum chagasi in Brazil is not yet known. Leishmaniasis is a severe disease with wide geographical distribution with an incidence of two million cases per year and 350 million people at risk in endemic areas. The aim of this study was to evaluate the intraspecific variation and biogeography based on nuclear and mitochondrial genes. The SSUrDNA markers, gGAPDH, cytochrome b, hsp 70, chitinase and ITS1rDNA were amplified, sequenced and compared phylogenetically by maximum parsimony and Bayesian methods in concatenated analysis. The variability of sequences was 0 to 1%, and the topology generated showed no intraspecific differences between Brazilian strains of Leishmania infantum chagasi and consequently biogeographic patterns. Although the results do not reflect the expected variability, the various sequences obtained will provide subsidies for the establishment and standardization of new diagnostic tests of canine visceral leishmaniasis.

As espécies do gênero Leishmania parasitam mamíferos do Novo e Velho Mundo e possuem ciclos de vida com alternância entre vertebrados e invertebrados. A maioria das espécies se desenvolve em artrópodes hematófagos, que podem pertencer a diversas ordens e famílias. A Leishmaniose visceral é uma importante zoonose e possui canídeos silvestres e domésticos como importantes reservatórios conhecidos na diversidade genética de Leishmania infantum chagasi no Brasil ainda não é conhecida. Leishmaniose é uma doença severa com ampla distribuição geográfica com uma incidência de dois milhões de casos por ano e 350 milhões de pessoas em áreas de risco de infecção. O objetivo deste projeto foi avaliar a variação intraespecífica e biogeografia de isolados brasileiros de Leishmania infatum chagasi baseados em genes nucleares e mitocondriais. Os marcadores SSUrDNA, gGAPDH, Citocromo b, Hsp 70, Quitinase e ITS1rDNA foram amplificados, sequenciados e comparados filogeneticamente pelos métodos de parcimônia e bayesiana através de análises concatenadas. As sequencias obtidas apresentaram variabilidade entre 0 e 1% e a topologia gerada não evidenciou diferenças intraespecíficas entre os isolados brasileiros de Leishmania infantum chagasi e consequentemente padrões biogeográficos. Apesar dos resultados obtidos não refletirem a variabilidade esperada, as diversas sequencias obtidas darão subsídios para a determinação e padronização de novos testes diagnósticos da Leishmaniose visceral canina. / The Leishmania species parasite mammals in the New World and have life cycles with alternating between vertebrates and invertebrates. Most species develops in blood-sucking arthropods, which may belong to different orders and families. Visceral leishmaniasis is an important zoonosis and has wild and domestic canids as important known reservoirs and genetic diversity of Leishmania infantum chagasi in Brazil is not yet known. Leishmaniasis is a severe disease with wide geographical distribution with an incidence of two million cases per year and 350 million people at risk in endemic areas. The aim of this study was to evaluate the intraspecific variation and biogeography based on nuclear and mitochondrial genes. The SSUrDNA markers, gGAPDH, cytochrome b, hsp 70, chitinase and ITS1rDNA were amplified, sequenced and compared phylogenetically by maximum parsimony and Bayesian methods in concatenated analysis. The variability of sequences was 0 to 1%, and the topology generated showed no intraspecific differences between Brazilian strains of Leishmania infantum chagasi and consequently biogeographic patterns. Although the results do not reflect the expected variability, the various sequences obtained will provide subsidies for the establishment and standardization of new diagnostic tests of canine visceral leishmaniasis.

Leishmaniose visceral (LV) é uma doença crônica e potencialmente fatal causada pelas espécies Leishmania infantum/chagasi e Leishmania donovani. O desenvolvimento da resposta Th1 é classicamente associado à proteção contra esses parasitos, mas também há uma correlação positiva entre a produção de citocinas relacionadas com o padrão Th17 e a proteção contra LV por L. donovani em seres humanos. No entanto, a participação de Th17 durante a infecção por L. infantum/chagasi permanece desconhecida. O objetivo desse estudo foi avaliar a participação de Th17 e citocinas relacionadas, além do mecanismo pelo qual tais células operam durante a resposta imune do hospedeiro contra L. infantum/chagasi. Os resultados mostraram que o parasito é capaz de induzir grandes quantidades de TGF-, IL-1, IL-6 e IL-23 por células dendríticas derivadas da medula óssea (BMDC), citocinas envolvidas na indução e/ou manutenção do perfil Th17. Assim, co-cultivando células do baço de camundongos C57BL/6 naves com BMDCs infectadas com L. infantum/chagasi observou-se uma significativa produção de IL-17 por células T. Esses achados foram confirmados por experimentos in vivo onde se constatou a produção de IL-17 no fígado e no baço de camundongos WT infectados, sendo o pico de produção dessa citocina observado na 4ª e 6ª semanas após a infecção. O padrão de resposta do tipo Th17 é crítica para a imunidade protetora contra L. infantum/chagasi, uma vez que camudongos IL-17R-/-, IL-23p19-/- e IL-6-/- mostraram aumento da carga parasitária nos órgãos alvo da infecção, sendo que a susceptibilidade observada em camundongos IL-17R-/- foi associada com o aumento da produção de IL-10 por linfócitos, sugerindo que a IL-17 regula negativamente a produção de IL-10 levando ao controle da infecção causada pelo parasito. Ainda, a ausência da sinalização via IL-17R gerou uma diminuição da inflamação hepática, decorrente de uma menor capacidade proliferativa de linfócitos frente ao estímulo com conA. De maneira interessante, na ausência de IL-10 houve potencialização na produção de IL-17 por camundongos infectados, e esses foram mais resistentes à infecção, apresentando números reduzidos parasitos no baço e no fígado. Além de promover proteção através da modulação de IL-10, a IL-17 foi capaz de potencializar a produção de NO in vitro e in vivo. Juntos, nossos resultados demonstram que a L. infantum/chagasi é capaz de desencadear o padrão Th17 de resposta imune, o qual promove proteção do hospedeiro durante a infecção. / Visceral leishmaniasis (LV) is a chronic and potentially fatal disease caused by Leishmania donovani and Leishmania infantum/chagasi. The development of Th1 response is classically associated with protection against these parasites, but recent data also show that there is a positive correlation between the Th17-related cytokines production and the protection against LV by L. donovani in humans. However, the role of this CD4+ T cells subset during L. infantum/chagasi infection remains unknown. In this study, our aim was to evaluate the Th17 and related cytokines participation, besides the mechanism by which these cells playing during the L. infantum/chagasi infection.The results showed that the parasite induces high amounts of TGF-, IL-1, IL-6, and IL-23 by bone marrow-derived dendritic cells (BMDC), cytokines involved with Th17 induction and/or maintenance. Accordingly, naïve-C57BL/6 spleenocytes co-cultured with L. infantum/chagasi-infected BMDC produced significant amounts of IL-17 by TCD4+. Interestingly, IL-17 was produced in high amounts in the liver and spleen of WT infected-mice, being peaked at 4th and 6th weeks after infection. The Th17 is critical for protective immunity against L. infantum/chagasi, since that IL-17R-/-, IL-23p19-/- and IL-6-/- infected-mice showed increasing of parasite load associated with enhancement of IL-10 production in IL-17R-/- compared to WT infected-mice. Strictly, in the absence of IL-17 signaling, a smaller inflammatory infiltrate was observed in the liver. Interestingly, IL-17 production was potentiated in IL-10-/- infected-mice, and they were more resistant to infection, showing reduced parasites numbers in the spleen and liver. In addition to promoting protection through the downmodulation of IL-10, IL-17 enhanced the NO production. Together, our results demonstrate that L. infantum/chagasi trigger Th17 response that promotes the host protection during infection.