Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2014-02-07T19:06:15Z No. of bitstreams: 1 Graziele Quintela de Caravalho... O Papel do Neme na infecção....pdf: 1591650 bytes, checksum: 3f661f0e0b742c04c4ad3e8907c1cf24 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-02-07T19:06:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Graziele Quintela de Caravalho... O Papel do Neme na infecção....pdf: 1591650 bytes, checksum: 3f661f0e0b742c04c4ad3e8907c1cf24 (MD5) Previous issue date: 2013 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisa Gonçalo Moniz. Laboratório de Engenharia Tecidual e Imunofarmacologia. Salvador, BA, Brasil / Universidade Federal da Bahia. Faculdade de Medicina. Salvador, BA, Brasil / A Leishmaniose é uma doença que atinge milhões de pessoas em todo o mundo, sendo endêmica em muitas áreas. A doença pode apresentar diferentes manifestações clínicas, tais como a Leishmaniose Visceral (LV), que é a forma mais grave e letal, caso não seja tratada. As manifestações hematológicas são comumente associadas à LV, onde os mecanismos relacionados à hemólise e a presença do heme livre, podem interferir no comportamento de neutrófilos. Já foi descrito que o heme livre é uma molécula pró-inflamatória, com a capacidade de induzir migração e ativação dos neutrófilos. No entanto, o efeito do heme sobre neutrófilos humanos durante a infecção por Leishmania chagasi, ainda não foi explorado. A nossa hipótese é que o heme induz ativação de neutrófilos humanos favorecendo o processo inflamatório na infecção por L. chagasi. Nossos resultados mostraram que o heme induz a ativação e apoptose em neutrófilos humanos infectados com L. chagasi, seguido pela sobrevivência do parasita. Moléculas presentes na composição do heme, como a protoporfirina IX (PPIX) e o Fe+2, não alteram o status de ativação dos neutrófilos, mas mantêm o aumento do crescimento parasitário como observado em presença do heme. Além disso, o heme e o Fe+2 aumentam a produção do TGF-β e a atividade da SOD. A inibição farmacológica da enzima SOD com dietilditiocarbamato (DETC) reduz a taxa de proliferação da L. chagasi em neutrófilos infectados. Em conjunto, esses dados indicam que o heme e o Fe+2 podem contribuir como fonte nutricional e controlar o ambiente inflamatório, com a indução de TGF-β e SOD, permitindo a sobrevivência da L. chagasi em neutrófilos humanos. Esse estudo poderá abrir novas perspectivas para o entendimento dos mecanismos imunopatogênicos envolvendo neutrófilos e suas implicações no processo inflamatório da LV. / The Leishmaniasis is a disease that affects millions of people worldwide, being endemic in many areas. The disease may present different clinical manifestations, such as Visceral Leishmaniasis (VL), which is the most severe form and fatal if left untreated. The hematologic manifestations are commonly associated with VL, where the mechanisms related to hemolysis and the presence of free heme may modify the behavior of neutrophils. It has been reported that the free heme is a pro-inflammatory molecule with the ability to induce migration and activation of neutrophils. However, the effect of the heme on human neutrophils during infection by Leishmania chagasi yet hasn't been explored. Our hypothesis is that the heme induces activation of human neutrophils favoring the inflammatory process on the infection by L. chagasi. The results showed that the heme induces activation and apoptosis in human neutrophils infected with L. chagasi, followed by parasite survival. Molecules present in the composition of heme, as protoporfirin IX (PPIX) and Fe+2, do not alter the activation status of neutrophils, but maintain the increased parasite growth as viewed in the presence of heme. Furthermore, the heme and Fe+2 increase the production of TGF-β and SOD activity. The pharmacological inhibition of SOD with diethyldithiocarbamate (DETC) reduces the rate of L. chagasi proliferation in infected neutrophils. Together, these data indicate that the heme and Fe+2 may contribute as a nutritional source and control the inflammatory environment with the induction of TGF-β and SOD, allowing the survival of the L. chagasi in human neutrophils. This study may open new perspectives for the understanding of the immunopathogenic mechanisms involving neutrophils and its implications in the inflammatory process of the VL.

Made available in DSpace on 2014-12-17T14:03:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DanielleSM.pdf: 1455943 bytes, checksum: 8efcc0f4d0f0ac8dfc93b332700f07cb (MD5) Previous issue date: 2008-02-29 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior / Four different sponge species were screened using Ouchterlony agarose gel and immunodiffusion tests to identify cross-reactivity with the polyclonal antibody IgG anti-deglicosilated CvL, a lectin from Cliona varians. Crude extract from the sponge Cinachyrella apion showed cross-reactivity and also a strong haemmaglutinating activity towards human erythrocytes of all ABO groups. Thus, it was submitted to acetone fractionation, IgG anti-deglicosilated CvL Sepharose affinity chromatography, and Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC-AKTA) gel filtration on a Superose 6 10 300 column to purify a novel lectin. C. apion lectin (CaL) agglutinated all types of human erythrocytes with preference for papainized type A and O erythrocytes. The haemagglutinating activity is independent of Ca2+, Mg2+ and Mn2+ ions, and it was strongly inhibited by the disaccharide D-lactose, up to a minimum concentration of 6.25 mM. CaL molecular mass determined by FPLC-AKTA gel filtration on a Superose 12 10 300 column and SDS gel electrophoresis was approximately 124 kDa, consisting of eight subunits of 15.5 kDa, assembled by hydrophobic interactions. The lectin was relatively heat- and pH-stable. Leishmania chagasi romastigotes were agglutinated by CaL, indicating that lactose receptors could be presented in this parasite stage. These findings are indicative of the physiological defense roles of CaL and its possible use in the antibiosis of pathogenic protozoa / Uma varredura de lectinas foi realizada em extratos prot?icos de quatro esp?cies de esponjas utilizando t?cnicas de imunodifus?o para identificar lectinas imunorreativas ao anticorpo policlonal gerado contra CvL, uma lectina de Cliona varians. O extrato bruto da esponja Cinachyrella apion foi imunorreativo e apresentou atividade hemaglutinante a eritr?citos humanos de todos os grupos do sistema ABO. Assim, ele foi submetido ao fracionamento com acetona, ? cromatografia de afinidade com IgG anti-CvL desglicosilada ligada a Sepharose e ? romatografia de gel filtra??o em uma coluna Superose 6 10 300 GL em istema FPLC-AKTA (Fast Protein Liquid Chromatography) para a purifica??o de uma lectina imunorreativa ao anticorpo IgG anti-CvL. A lectina de C. apion (CaL) aglutinou todos os tipos de eritr?citos humanos, com prefer?ncia por eritr?citos papainizados dos tipos A e O. A atividade hemaglutinante mostrou-se independente dos ?ons Ca2+, Mg2+ e Mn2+, e foi fortemente inibida pelo dissacar?deo D-lactose, at? a concentra??o m?nima de 6,25 mM. A massa molecular da CaL, determinada por gel filtra??o em uma coluna Superose 12 10 300 GL em sistema FPLC-AKTA e eletroforese em gel de poliacrilamida com SDS, foi de aproximadamente 124 kDa, consistindo de oito subunidades de 15,5 kDa, unidas por intera??es hidrof?bicas. A lectina foi relativamente est?vel em extensas faixas tanto de pH quanto de temperatura. Promastigotos de Leishmania chagasi foram aglutinados por CaL, indicando que receptores de lactose podem estar presentes nesse est?gio do parasita. Esses achados s?o indicativos do papel de defesa fisiol?gica da CaL e do seu poss?vel uso na antibiose de protozo?rios patog?nicos

Made available in DSpace on 2014-12-17T14:03:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 JoseFlavioVC.pdf: 1066045 bytes, checksum: 95695454c994be62f483dac7ee237cd8 (MD5) Previous issue date: 2005-02-28 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior / Canine Visceral Leishmania (CVL) is an important zoonotic disease that has a world wide distribution and has a large impact on public health on the American Continent, especially in Brazil, where the nature of endemic diseases in humans affects a large part of the nation. The influence of the prevalence of CVL in the increased rate of human cases in endemic areas and in the unleashing of epidemic outbreaks shows the need for a more profound understanding, that would generate significant advances in the current measures used to control the reservoirs of sickness that are practiced by the Programa Nacional de Vigil?ncia e Controle da Leishmaniose Visceral. The present work describes and compares the clinical-laboratorial and histopathological findings of twenty-three dogs that were naturally infected by Leishmania chagasi, from endemic areas in metropolitan Natal, Rio Grande do Norte, Brazil. These animals, that were selected and given physical and serological exams (IFI and ELISA rK-39), were classified according to the degree of clinical severity and had blood samples drawn (whole blood and serum) for a complete hemogram and a coagulogram to be done as well as biochemical tests for kidney and liver function. The confirmation of infection by L. chagasi was done after the euthanasia of the animals, through the direct demonstration of the parasite in the impression of the spleen and liver crowned with GIEMSA and through a cultivation by means of NNN/Schneider. According to the clinical evaluation, the animals were classified as asymptomatic (7), oligosymptomatic (7) and polysymptomatic (9). Among the animals that were chosen to be autopsied, there were 2 asymptomatic, 3 oligosymptomatic and 3 polysymptomatic, for the purpose of studying their histopathology, having collected fragments of the spleen, liver, kidneys and skin and were fixed in 10% tamponed formol. The comparison between the average parameters of the clinical-laboratory tested animals in the groups was done through the Student t test (a<0.05). The main clinical signals observed were lymphadenomegaly, alopecy, dermatitis, exfoliation, cutaneous ulcers, onicogriphosis and emaciation. The main clinical-laboratorial alterations established, mainly in the polysymptomatic group, were anemia, hyperproteinemia, hyperglobulinemia, alterations in the albumin/globulin ratio and increased ALT activity. Renal alterations were not verified (urea and creatinine levels were normal). Thrombocytopenia was observed in three clinical groups. However, the other indicators of coagulation function (TAP and TTPA) did not have abnormal variations. There were inflammatory infiltrations and leishmania amastigotes in the skin of polysymptomatic dogs, however, they were not found in the skin of asymptomatic animals. Hypertrophy and hyperplasia of the phagocyte mononuclear system, leishmania amastigote parasites were found in the macrophages, extramedullary hematopoiesis and degenerative alterations were detected in the spleen and liver of 8 of the animals submitted to histopathological exams. In accord with these results, it was demonstrated that the expected alterations in the hematological and biochemical parameters in function of their viscerotropic nature of CVL are mainly observed in the more advanced stages of the disease. The absence of inflammatory infiltration and parasite load in the skin suggest that infected animals without symptoms may have an importance irrelevant to the infectiousness of the vector / A leishmaniose visceral canina (LVC) ? uma importante zoonose de distribui??o mundial com grande impacto em sa?de p?blica no Continente Americano, especialmente no Brasil, onde a natureza end?mica da doen?a humana afeta boa parte do territ?rio nacional. A influ?ncia da preval?ncia da LVC na amplia??o da taxa de casos humanos em ?reas end?micas e no desencadeamento de surtos epid?micos ainda carece de um entendimento mais profundo, o que geraria avan?os significativos nas atuais medidas destinadas ao controle de reservat?rios da doen?a preconizadas pelo Programa Nacional de Vigil?ncia e Controle da Leishmaniose Visceral. O presente trabalho descreveu e comparou os achados cl?nico-laboratoriais e histopatol?gicos de vinte e tr?s c?es infectados naturalmente pela Leishmania chagasi, provenientes de localidades end?micas da ?rea metropolitana de Natal-RN. Estes animais, escolhidos a partir de exame f?sico e sorologia (IFI e ELISA rK-39), foram classificados de acordo com o grau de comprometimento cl?nico e submetidos a coleta de sangue (sangue total e soro) para realiza??o de hemograma completo, provas bioqu?micas de fun??o renal e hep?tica, e coagulograma. A confirma??o da infec??o por L. chagasi foi realizada ap?s a eutan?sia dos animais, pela demonstra??o direta do parasita em impress?o de ba?o e f?gado corado com GIEMSA e atrav?s de cultivo em meio NNN/Schneider. De acordo com a avalia??o cl?nica, os animais foram classificados em assintom?ticos (7), oligossintom?ticos (7) e polissintom?ticos (9). Dentre os animais necropsiados, foram selecionados 2 c?es assintom?ticos, 3 oligossintom?ticos e 3 polissintom?ticos para o estudo histopatol?gico, sendo colhidos fragmentos de ba?o, f?gado rins e pele e fixados em formol a 10% tamponado. A compara??o entre as m?dias dos par?metros cl?nico-laboratoriais testados nos grupos foi realizada atrav?s do teste t de Student (&#945;<0,05). Os principais sinais cl?nicos observados foram linfadenomegalia, alopecia, dermatite esfoliativa, ?lceras cut?neas, onicogrifose e emacia??o. As principais altera??es cl?nico-laboratoriais estabelecidas, principalmente no grupo polissintom?tico, foram anemia, hiperproteinemia, hipoalbuminemia, hiperglobulinemia, altera??es no ?ndice albumina/globulina e aumento da atividade da ALT. Altera??es renais n?o foram verificadas (ur?ia e creatinina normais). Trombocitopenia foi observada no tr?s grupos cl?nicos, contudo, os outros indicadores da fun??o de coagula??o (TAP e TTPA) n?o apresentaram varia??es anormais. Foi observado Infiltrado inflamat?rio e amastigotas de leishmania na pele de c?es polissintom?ticos, por?m n?o na pele de animais assintom?ticos. Hipertrofia e hiperplasia do sistema fagocit?rio mononuclear, macr?fagos parasitados por amastigotas de leishmania, hematopoiese extramedular e altera??es degenerativas foram detectadas no ba?o e f?gado dos 8 animais submetidos a exame histopatol?gicos. De acordo com esses resultados, foi demonstrada que as altera??es esperadas nos par?metros hematol?gicos e bioqu?micos em fun??o da natureza viscerotr?pica da LVC s?o observadas principalmente em est?gios mais avan?ados da doen?a. A aus?ncia de infiltrado inflamat?rio e carga parasit?ria na pele sugerem que animais infectados sem sintomatologia talvez tenham import?ncia irrelevante na infectividade para o vetor

Leishmaniose visceral (LV) é uma doença crônica e potencialmente fatal causada pelas espécies Leishmania infantum/chagasi e Leishmania donovani. O desenvolvimento da resposta Th1 é classicamente associado à proteção contra esses parasitos, mas também há uma correlação positiva entre a produção de citocinas relacionadas com o padrão Th17 e a proteção contra LV por L. donovani em seres humanos. No entanto, a participação de Th17 durante a infecção por L. infantum/chagasi permanece desconhecida. O objetivo desse estudo foi avaliar a participação de Th17 e citocinas relacionadas, além do mecanismo pelo qual tais células operam durante a resposta imune do hospedeiro contra L. infantum/chagasi. Os resultados mostraram que o parasito é capaz de induzir grandes quantidades de TGF-, IL-1, IL-6 e IL-23 por células dendríticas derivadas da medula óssea (BMDC), citocinas envolvidas na indução e/ou manutenção do perfil Th17. Assim, co-cultivando células do baço de camundongos C57BL/6 naves com BMDCs infectadas com L. infantum/chagasi observou-se uma significativa produção de IL-17 por células T. Esses achados foram confirmados por experimentos in vivo onde se constatou a produção de IL-17 no fígado e no baço de camundongos WT infectados, sendo o pico de produção dessa citocina observado na 4ª e 6ª semanas após a infecção. O padrão de resposta do tipo Th17 é crítica para a imunidade protetora contra L. infantum/chagasi, uma vez que camudongos IL-17R-/-, IL-23p19-/- e IL-6-/- mostraram aumento da carga parasitária nos órgãos alvo da infecção, sendo que a susceptibilidade observada em camundongos IL-17R-/- foi associada com o aumento da produção de IL-10 por linfócitos, sugerindo que a IL-17 regula negativamente a produção de IL-10 levando ao controle da infecção causada pelo parasito. Ainda, a ausência da sinalização via IL-17R gerou uma diminuição da inflamação hepática, decorrente de uma menor capacidade proliferativa de linfócitos frente ao estímulo com conA. De maneira interessante, na ausência de IL-10 houve potencialização na produção de IL-17 por camundongos infectados, e esses foram mais resistentes à infecção, apresentando números reduzidos parasitos no baço e no fígado. Além de promover proteção através da modulação de IL-10, a IL-17 foi capaz de potencializar a produção de NO in vitro e in vivo. Juntos, nossos resultados demonstram que a L. infantum/chagasi é capaz de desencadear o padrão Th17 de resposta imune, o qual promove proteção do hospedeiro durante a infecção. / Visceral leishmaniasis (LV) is a chronic and potentially fatal disease caused by Leishmania donovani and Leishmania infantum/chagasi. The development of Th1 response is classically associated with protection against these parasites, but recent data also show that there is a positive correlation between the Th17-related cytokines production and the protection against LV by L. donovani in humans. However, the role of this CD4+ T cells subset during L. infantum/chagasi infection remains unknown. In this study, our aim was to evaluate the Th17 and related cytokines participation, besides the mechanism by which these cells playing during the L. infantum/chagasi infection.The results showed that the parasite induces high amounts of TGF-, IL-1, IL-6, and IL-23 by bone marrow-derived dendritic cells (BMDC), cytokines involved with Th17 induction and/or maintenance. Accordingly, naïve-C57BL/6 spleenocytes co-cultured with L. infantum/chagasi-infected BMDC produced significant amounts of IL-17 by TCD4+. Interestingly, IL-17 was produced in high amounts in the liver and spleen of WT infected-mice, being peaked at 4th and 6th weeks after infection. The Th17 is critical for protective immunity against L. infantum/chagasi, since that IL-17R-/-, IL-23p19-/- and IL-6-/- infected-mice showed increasing of parasite load associated with enhancement of IL-10 production in IL-17R-/- compared to WT infected-mice. Strictly, in the absence of IL-17 signaling, a smaller inflammatory infiltrate was observed in the liver. Interestingly, IL-17 production was potentiated in IL-10-/- infected-mice, and they were more resistant to infection, showing reduced parasites numbers in the spleen and liver. In addition to promoting protection through the downmodulation of IL-10, IL-17 enhanced the NO production. Together, our results demonstrate that L. infantum/chagasi trigger Th17 response that promotes the host protection during infection.

Nas células eucariotas a maioria das proteínas citoplasmáticas não são degradadas nos lisossomas, mas em organelas altamente conservadas encontradas em humanos, arquibactérias, plantas e leveduras, os proteassomas. Esta estrutura multicatalítica é constituída por componentes menores, cujo núcleo funcional é o componente 20S, que contém várias atividades proteolíticas (tríptica, quimotríptica, de peptidilglutamil peptidase, BrAAP e SNAAP). Esse componente 20S, associado ao complexo regulatório 19S, que é composto de múltiplas ATPases, forma o complexo 26S, responsável pela degradação de proteínas conjugadas com a ubiquitina. Estas estruturas citosólicas certamente desempenham papel importante no desenvolvimento de protozoários parasitas e na sua interação com células dos hospedeiros permissivos. Nesta dissertação, apresentamos um estudo sobre o papel do proteassoma na interação e desenvolvimento de promastigotas de Leishmania chagasi em macrófagos murinos. Inicialmente, purificamos e caracterizamos parcialmente o proteassoma de promastigotas de L. chagasi. Observamos que o complexo presente na L. chagasi possui atividades proteolíticas frente a pelo menos dois substratos sintéticos, LLVY-AMC e LRR-AMC, que avaliam, respectivamente, as atividades quimiotripsina-símile e tripsina-símile. A atividade tripsina-simile é maior que a atividade quimiotripsina-simile; e além disso, esta última é totalmente inibida pela lactacistina, um inibidor específico do proteassoma, enquanto a atividade tripsina-simile é apenas parcialmente inibida. Utilizando a lactacistina foi possível analisar o papel desse complexo proteolítico durante a infecção e desenvolvimento intracelular da L. chagasi. Promastigotas mantidas em cultura na presença de 50&#956;M de lactacistina tiveram seu crescimento bloqueado. Essas promastigotas eram capazes de infectar macrófagos peritoneais de camundongos BALB/c, mas não conseguiam sobreviver dentro desses macrófagos. Esta incapacidade de sobrevivência foi específica para os parasitas tratados com a lactacistina, não sendo observado nos parasitas tratados com outros inibidores de proteases. Estes resultados sugerem que o proteassoma pode ter um papel importante no desenvolvimento intracelular e na replicação das promastigotas de L. chagasi no hospedeiro vertebrado. / Proteasomes are multicatalitic and multisubunit endopeptidase complexes widely distributed in eukaryotic cells. These enzymes are central proteases in the cytosol and nucleus and are involved in removal of abnormal, misfolded or incorrectly assembled proteins, in processing and degradation of transcriptional regulators in stress response and in the processing of protein antigens. This multicatalytic proteinase complex is composed of a catalytic core, 20S proteasome, which have multiple proteolytic activities (trypsin-like, chymotrypsin-like, peptidylglutamtyl-peptide hydrolyzing, BrAAP and SNAAP). The 20S proteasome associates with the multisubunit complex 19S to produce the 26S proteasome. The 26S proteasome has specificity for ubiquitinylated protein substrates and hydrolyses ATP during proteolysis of ubiquitinylated proteins. In the present work we have purified a 20S form of proteasome from Leishmania chagasi and partially characterized it. The purified 20S proteasome has activity towards fluorogenic substrates that are cleaved by trypsin or chymotrypsin, and is sensitive to lactacystin, a specific inhibitor of the proteasome. We show that the L.chagasi proteasome the trypsin-like activity is higher than the chymotrypsin-like. Therefore the chymotrypsin-like activity is inhibited by lactacystin and the trypsin-like it is only partially inhibited. We show here that lactacystin blocks in vitro L chagasi promastigote replication at a final concentration of 50 µM. To evaluate the effect of proteasome inhibition on the infectivity and intracellular development of L. chagasi, murine macropages were challenged with promastigotes from early stationary phase treated with lactacystin. Infectivity of macrophages was the same in lactacystin-treated parasites as in the untreated ones. Contrarywise, the intracellular development of the parasite is impaired by pretreating promastigotes with lactacystin. These promastigotes were able to infect BALB/c peritoneal macrophages but they did not survive inside macrophages. These data indicate the important role of the proteasomes of L. chagasi promastigotes on the intracellular development and replication in host cells in vitro.

Orientadora: Mary Marcondes / Banca: Raimundo Souza Lopes / Banca: Áureo Evangelista Santana / Banca: Vera Lúcia Fonseca de Camargo-Neves / Banca: Carlos Eduardo Larsson / Resumo: O presente estudo teve como objetivos comparar a resposta da imunoglobulina G e de suas subclasses nos seguintes grupos de animais; cães hígidos (n=45), animais sintomáticos naturalmente infectados por Leishmania sp. (n=45), animais assintomáticos naturalmente infectados por Leishmania sp. (n=45), cães portadores de leishmaniose visceral submetidos à tratamento (n=27) e animais hígidos submetidos à vacinação contra a doença (n=37). Inicialmente foram avaliadas IgG1 e IgG2 utilizando anticorpos policlonais e posteriormente as quatro subclasses de IgG (IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4) com anticorpos monoclonais na tentativa de identificar um perfil de resposta para cada grupo de cães. As determinações sorológicas foram realizadas por meio da técnica de ELISA. A avaliação das subclasses de IgG com anticorpos policlonais não permitiu diferenciar os grupos de cães estudados. Por outro lado, com os anticorpos monoclonais observou-se que o grupo sintomático apresentou estimulação de todas as subclasses de IgG enquanto nos animais assintomáticos apenas a fração IgG1 foi estimulada. Nos cães submetidos a tratamento todas as frações encontravam-se elevadas e nos vacinados ocorreu estimulação de IgG1, IgG3 e IgG4. Desta forma, a avaliação das quatro subclasses permitiu a diferenciação entre animais portadores de leishmaniose visceral com e sem quadro clínico; entre cães vacinados e cães assintomáticos acometidos pela doença; e entre cães com leishmaniose visceral submetidos a tratamento e cães infectados assintomáticos. / Abstract: The present study aimed to compare immunoglobulin G subclasses in the following groups of animals: healthy dogs (n=45); symptomatic Leishmania sp. naturally infected dogs (n=45); asymptomatic Leishmania sp. naturally infected dogs (n=45); dogs with visceral leishmaniasis submitted to treatment (n=27) and healthy dogs vaccinated for visceral leishmaniasis (n=37). First of all IgG1 and IgG2 were evaluated using polyclonals antibodies, and later the four subclasses of IgG (IgG1, IgG2, IgG3 and IgG4) were evaluated with monoclonals antibodies, in order to identify a profile of reply for each group of dogs. Serological tests were carried out using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). The evaluation of the subclasses with polyclonals antibodies did not allow to differentiate the groups of studied dogs. On the other hand, with monoclonals antibodies it was possible to verify that symptomatic dogs presented stimulation of all subclasses of IgG, while in asymptomatic animals only IgG1 was stimulated. In dogs submitted to treatment all fractions increased, and in vaccinated ones occurred stimulation of IgG1, IgG3 and IgG4. In such a way, the evaluation of the four subclasses allowed the differentiation between symptomatic and asymptomatic infected dogs; between vaccinated dogs and asymptomatic infected dogs; and between infected dogs submitted to treatment and asymptomatic infected dogs. / Doutor

Nas células eucariotas a maioria das proteínas citoplasmáticas não são degradadas nos lisossomas, mas em organelas altamente conservadas encontradas em humanos, arquibactérias, plantas e leveduras, os proteassomas. Esta estrutura multicatalítica é constituída por componentes menores, cujo núcleo funcional é o componente 20S, que contém várias atividades proteolíticas (tríptica, quimotríptica, de peptidilglutamil peptidase, BrAAP e SNAAP). Esse componente 20S, associado ao complexo regulatório 19S, que é composto de múltiplas ATPases, forma o complexo 26S, responsável pela degradação de proteínas conjugadas com a ubiquitina. Estas estruturas citosólicas certamente desempenham papel importante no desenvolvimento de protozoários parasitas e na sua interação com células dos hospedeiros permissivos. Nesta dissertação, apresentamos um estudo sobre o papel do proteassoma na interação e desenvolvimento de promastigotas de Leishmania chagasi em macrófagos murinos. Inicialmente, purificamos e caracterizamos parcialmente o proteassoma de promastigotas de L. chagasi. Observamos que o complexo presente na L. chagasi possui atividades proteolíticas frente a pelo menos dois substratos sintéticos, LLVY-AMC e LRR-AMC, que avaliam, respectivamente, as atividades quimiotripsina-símile e tripsina-símile. A atividade tripsina-simile é maior que a atividade quimiotripsina-simile; e além disso, esta última é totalmente inibida pela lactacistina, um inibidor específico do proteassoma, enquanto a atividade tripsina-simile é apenas parcialmente inibida. Utilizando a lactacistina foi possível analisar o papel desse complexo proteolítico durante a infecção e desenvolvimento intracelular da L. chagasi. Promastigotas mantidas em cultura na presença de 50&#956;M de lactacistina tiveram seu crescimento bloqueado. Essas promastigotas eram capazes de infectar macrófagos peritoneais de camundongos BALB/c, mas não conseguiam sobreviver dentro desses macrófagos. Esta incapacidade de sobrevivência foi específica para os parasitas tratados com a lactacistina, não sendo observado nos parasitas tratados com outros inibidores de proteases. Estes resultados sugerem que o proteassoma pode ter um papel importante no desenvolvimento intracelular e na replicação das promastigotas de L. chagasi no hospedeiro vertebrado. / Proteasomes are multicatalitic and multisubunit endopeptidase complexes widely distributed in eukaryotic cells. These enzymes are central proteases in the cytosol and nucleus and are involved in removal of abnormal, misfolded or incorrectly assembled proteins, in processing and degradation of transcriptional regulators in stress response and in the processing of protein antigens. This multicatalytic proteinase complex is composed of a catalytic core, 20S proteasome, which have multiple proteolytic activities (trypsin-like, chymotrypsin-like, peptidylglutamtyl-peptide hydrolyzing, BrAAP and SNAAP). The 20S proteasome associates with the multisubunit complex 19S to produce the 26S proteasome. The 26S proteasome has specificity for ubiquitinylated protein substrates and hydrolyses ATP during proteolysis of ubiquitinylated proteins. In the present work we have purified a 20S form of proteasome from Leishmania chagasi and partially characterized it. The purified 20S proteasome has activity towards fluorogenic substrates that are cleaved by trypsin or chymotrypsin, and is sensitive to lactacystin, a specific inhibitor of the proteasome. We show that the L.chagasi proteasome the trypsin-like activity is higher than the chymotrypsin-like. Therefore the chymotrypsin-like activity is inhibited by lactacystin and the trypsin-like it is only partially inhibited. We show here that lactacystin blocks in vitro L chagasi promastigote replication at a final concentration of 50 µM. To evaluate the effect of proteasome inhibition on the infectivity and intracellular development of L. chagasi, murine macropages were challenged with promastigotes from early stationary phase treated with lactacystin. Infectivity of macrophages was the same in lactacystin-treated parasites as in the untreated ones. Contrarywise, the intracellular development of the parasite is impaired by pretreating promastigotes with lactacystin. These promastigotes were able to infect BALB/c peritoneal macrophages but they did not survive inside macrophages. These data indicate the important role of the proteasomes of L. chagasi promastigotes on the intracellular development and replication in host cells in vitro.

p. 1-53 / Submitted by Santiago Fabio (fabio.ssantiago@hotmail.com) on 2013-04-22T20:51:31Z No. of bitstreams: 1 999999999.pdf: 500462 bytes, checksum: df41a66b3052220773f4a2067f76a6b9 (MD5) / Approved for entry into archive by Maria Creuza Silva(mariakreuza@yahoo.com.br) on 2013-05-04T17:22:57Z (GMT) No. of bitstreams: 1 999999999.pdf: 500462 bytes, checksum: df41a66b3052220773f4a2067f76a6b9 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-05-04T17:22:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 999999999.pdf: 500462 bytes, checksum: df41a66b3052220773f4a2067f76a6b9 (MD5) Previous issue date: 2008 / O estudo tem o objetivo de descrever a evolução da epidemia de leishmaniose visceral humana no município de Campo Grande, Mato Grosso do Sul e a distribuição temporal e espacial nas regiões urbanas. Foram analisados os casos notificados no Sistema de Informação de Agravos de notificação (SINAN), desde o ano 2002 quando se inicia a epidemia, até o ano 2006. No período de 2002 a 2006, ocorreram o total de 568 casos e 43 óbitos (Ietalidade de 7,6%). A distribuição anual dos casos foi de 22 casos no ano 2002, 97 em 2003, 131 em 2004, 158 em 2005 e 160 casos em 2006, correspondendo aos coeficientes de incidência de 31,1; 13,6; 18,2; 21,0 e 21,3 casos por 100 mil habitantes, respectivamente. A maioria dos casos ocorreu em crianças menores de 9 anos e atingiu também as demais faixas etárias. Predominou o sexo masculino, com 64% dos casos. A maior letalidade ocorreu em adultos na faixa etária de 60 anos e mais, na sua maioria associada à co-infecção com outras patologias. Três das sete regiões concentraram 70% dos casos. Conclusão: os dados secundários revelam uma epidemia que se iniciou em 2002 e permanece até 2006, apesar das medidas de controle desenvolvidas. Não tendo sido observada queda da incidência até o ano 2006. / Salvador

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2017-08-25T11:37:42Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 916025 bytes, checksum: 85faad5f8964dc85d9e69cc0251905ad (MD5) / Made available in DSpace on 2017-08-25T11:37:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 916025 bytes, checksum: 85faad5f8964dc85d9e69cc0251905ad (MD5) Previous issue date: 2017-07-06 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / A Leishmaniose Visceral (LV) está amplamente distribuída em 98 países, com mais de 350 milhões de pessoas em risco. Não existem vacinas licenciadas para uso em humanos e o antimônio pentavalente ainda é o fármaco de primeira escolha para o tratamento da doença, apesar de sua toxicidade. Em um estudo prévio foram realizados ensaios sobre a participação de proteína ligante de heparina de L. infantum chagasi (PLHLc) no processo infeccioso do parasito, considerando os processos de adesão, penetração e internalização em macrófagos, demonstrando que a proteína nativa está envolvida na interação entre parasito e hospedeiro. Também foram demonstrados níveis de imunogenicidade e de proteção contra L.infantum chagasi quando camundongos BALB/c foram imunizados com a PLHLc nativa. A partir disso, foi feito o sequenciamento dessa proteína e a produção da sua forma recombinante (rPLHLc). Nesse trabalho, utilizamos a rPLHLc em experimentos de imunização de camundongos BALB/c para avaliar se, assim como a proteína nativa, a forma recombinante também confere imunogenicidade e proteção após desafio com as formas promastigotas do parasito. Nossos resultados mostraram que no teste de imunogenicidade, os grupos imunizados com a rPLHLc, com AIF + rPLHLc e com SAP + rPLHLc produziram níveis altos de IgG1 e IgG2a anti-rPLHLc quando comparados aos seus grupos controles, caracterizando, de acordo com a razão IgG1/IgG2a, resposta mista nos grupos imunizados com rPLHLc e SAP + rPLHLce um perfil de resposta Th2 no grupo imunizado com AIF + rPLHLc. Já no teste de desafio, nossos resultados mostraram que houve redução da carga parasitária no baço e no fígado dos grupos imunizados com a rPLHLc, com AIF + rPLHLc e com SAP + rPLHLc. Os grupos imunizados com AIF + rPLHLc e com SAP + rPLHLc produziram as citocinas IFN-γ, TNF e IL-2, que direcionam o padrão de resposta imune para Th1, as citocinas IL-17 e IL-6 que direcionam para Th17 e a citocina reguladora IL-10, sendo que a média de produção dessas citocinas foi maior no grupo que tinha como adjuvante a SAP. Na produção de IgG1 e IgG2a anti-rPLHLcos grupos imunizados com a rPLHLc, com AIF + rPLHLc e com SAP + rPLHLc produziram níveis altos dos dois isotipos comparado aos seus grupos controles e de acordo com a razão IgG1/IgG2a conclui-se que encontramos perfil de resposta Th1 nos grupos imunizados com rPLHLc e com SAP + rPLHLc e perfil de resposta Th2 no grupo imunizado com AIF + rPLHLc. Portanto, concluímos que houve imunogenicidade e proteção contra L. infantum chagasi quando os grupos experimentais são imunizados com a proteína recombinante, mostrando a viabilidade de uso da mesma como vacina e que o grupo imunizado com SAP + rPLHLc foi o que apresentou resultados mais promissores, o que torna essa preparação uma possível vacina contra LV. / Visceral Leishmaniasis (VL) is widely distributed in 98 countries, with more than 350 million people at risk. There are no licensed vaccines for use in humans and the pentavalent antimony is still the drug of choice for treatment of this disease despite its toxicity. In a previous study, tests were performed on the involvement of the heparin binding protein of L.infantum chagasi (HBPLc) in the infectious process of the parasite, considering the processes of adhesion, penetration and internalization in macrophages, demonstrating that the native protein is involved in the interaction between parasite and host. Levels of immunogenicity and protection against L. infantum chagasi were also demonstrated when BALB/c mice were immunized with native HBPLc. From that, the sequencing of this protein and the production of its recombinant form (rHBPLc) was carried out. In this work, we used rHBPLc in experiments for immunization of BALB/c mice to evaluate whether, the recombinant protein form also confer immunogenicity and protection after challenge with the promastigote forms of the parasite. Our results showed that in the immunogenicity test, the groups immunized with rHBPLc, FIA + rHBPLc and ASP + rHBPLc produced high levels of anti-rHBPLc IgG1 and IgG2a when compared to their control groups, characterizing, according to the IgG1/IgG2a ratio, mixed response in the immunized groups with rHBPLc and ASP + rHBPLc and a Th2 response profile in the group immunized with FIA + rHBPLc. In the challenge test, our results showed that there was a reduction of the parasite load in the spleen and liver of the groups immunized with rHBPLc, with FIA + rHBPLc and with ASP + rHBPLc. The groups immunized with FIA + rHBPLc and ASP + rHBPLc produced the cytokines IFN-γ, TNF and IL-2, which direct the immune response pattern for Th1, the cytokines IL-17 and IL-6 directed for the Th17 and for the regulator cytokine IL-10, and the mean production of these cytokines was higher in the adjuvant group containing ASP. In the production of anti-rHBPLc IgG1 and IgG2a the groups immunized with rHBPLc, with FIA + rHBPLc and with ASP + rHBPLc produced high levels of the two isotypes compared to their control groups and according to the IgG1/IgG2a ratio we found that Th1 response profile in the group immunized with rHBPLc and with ASP + rHBPLc and Th2 response profile in the group immunized with FIA + rHBPLc. Therefore, we concluded that there was immunogenicity and protection against L.infantum chagasi when the experimental groups were immunized with the recombinant protein, showing the feasibility of using it as a vaccine and that the group immunized with ASP + rHBPLc presented the most promising results, which makes this preparation a potencial vaccine against VL.

Made available in DSpace on 2016-08-29T15:34:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_7846_DISSERTAÇÃO FINAL - CORREÇÕES + Ficha + Parecer _Reparado_2.pdf: 1750239 bytes, checksum: 6771fcd952a5a0a0f802782437acdc1c (MD5) Previous issue date: 2014-07-11 / O dimetil dioctadecil amônio (DDA) é um composto quaternário de amônio, formado por um lípido anfifílico sintético ligado a duas cadeias hidrofóbicas de alquilo de 18 carbonos, que mostrou efetivo efeito adjuvante, promovendo respostas imunes humoral e celular contra diversos agentes patogênicos, incluindo Mycobacterium tuberculosis e Chlamydia trachomatis. Neste presente trabalho, nós investigamos a capacidade do adjuvante CAF associado a antígenos totais de Leishmania amazonenses (LaAg) em induzir respostas imunogênicas e protetoras no desafio contra L. chagasi. Assim, camundongos BALB/c foram imunizados por via intranasal com 25 mg de LaAg livre ou associado a 150 mg de CAF em 2 doses intervaladas por 15 dias. A dosagem de transaminases e creatinina no soro dos animais demonstraram a biocompatibilidade e segurança da associação LaAg/CAF. Além disso, observamos significativas produções de IFN-g e NO por esplenócitos estimulados com antígenos do parasito, além de significativas respostas linfoproliferativas e maior percentagem de células de memória (TCD4+ CD44+ CD62L+). Níveis aumentados de IgG total e das subclasses específicas (IgG1 e IgG2a) também foram observadas no grupo vacinado com LaAg associado ao CAF, quando comparado aos controles. De forma semelhante, camundongos vacinados com a formulação e desafiados 15 dias após o reforço com L. chagasi, apresentaram uma significativa diminuição da carga parasitária no baço e fígado, associada a uma maior produção de IFN-g, respostas linfoproliferativas significativamente aumentadas. Juntos, nossos dados demonstraram pela primeira vez viabilidade da vacinação intranasal com LaAg associado ao CAF, como um efetivo mecanismo para a vacinação contra a leishmaniose visceral. Palavras chave: L. chagasi, imunização intranasal, LaAg, CAF, resposta imune.